TỔNG QUAN 3
RICIN 3
1.1.1 Ricin từ hạt Thầu Dầu
Ricin là một loại protein thuộc nhóm chimerolectin, chủ yếu được tìm thấy trong hạt cây Thầu Dầu (Ricinus communis.L), một loài cây có nguồn gốc từ Đông Phi nhưng hiện nay được trồng rộng rãi toàn cầu Hạt Thầu Dầu chứa khoảng 45-50% dầu, 25% albuminosid, cùng với các hợp chất khác như tinh dầu, nitrogen, axít malic, đường, muối, cellulose, ricin và ricinin, cũng như các enzyme thủy phân như lipase Nghiên cứu của Funatsu cho thấy tỷ lệ ricin trong hạt Thầu Dầu có thể đạt 0,2-0,3% khối lượng khô, và ricin có khả năng tồn tại lâu trong nước và đất mà không mất đi hoạt tính sinh học.
Hình 1.1: Cây Thầu Dầu (Ricinus communis.L) và hạt Thầu Dầu –
Một trong những nguồn cung cấp ricin từ tự nhiên [19]
Trong hạt Thầu Dầu, ricin được lưu trữ trong không bào dự trữ protein và chiếm khoảng 5% tổng lượng protein trong hạt trưởng thành Ricin được tổng hợp trong quá trình chín của hạt và bị thủy phân trong vài ngày đầu sau khi nảy mầm Ngoài ricin, còn có các dạng cấu trúc tương tự như ricin D, E và một loại lectin liên quan là agglutinin (RCA) cũng xuất hiện trong hạt Thầu Dầu.
Ricin, giống như các lectin thực vật khác, có khả năng liên kết đặc hiệu với một số loại đường và nhóm máu Nó có thể tương tác với các phân tử đường đơn hoặc các gốc đường trên bề mặt tế bào, chẳng hạn như galactose và N-acetyl-galactosamine Đặc biệt, chuỗi B của ricin gắn chặt với galactose thông qua các liên kết phân cực và không phân cực, bao gồm các liên kết giữa nhóm -OH của đường và các đầu phân cực của axit amin trên phân tử ricin.
1.1.2 Cấu trúc phân tử và cơ chế tác động của ricin
1.1.2.1 Cấu trúc phân tử của ricin
Ricin có khối lượng phân tử khoảng 65 kDa, bao gồm hai chuỗi polypeptide A và B liên kết qua cầu nối disulfide Chuỗi A nặng khoảng 30-32 kDa, chứa 267 axit amin và là thành phần chính gây độc cho tế bào, trong khi chuỗi B nặng khoảng 32-34 kDa, gồm 262 axit amin, giúp ricin liên kết với galactose trên bề mặt tế bào để xâm nhập vào tế bào Cấu trúc ba chiều của ricin đã được phân tích bằng tinh thể học tia X với độ phân giải 2,5 Å, cho phép mô tả chi tiết cấu trúc của cả hai chuỗi Một nghiên cứu khác đã phân tích cấu trúc của chuỗi A tái tổ hợp với độ phân giải 2,3 Å.
Nghiên cứu cho thấy chuỗi B có khả năng liên kết đặc hiệu với gốc đường galactose trên màng tế bào, tạo ra glycoprotein và giúp vận chuyển ricin qua màng Trong khi đó, chuỗi A gây độc cho tế bào bằng cách liên kết và làm bất hoạt ribosome.
Hình 1.2: Cấu trúc không gian của ricin [100]
Chuỗi màu đỏ: chuỗi A; Chuỗi màu xanh: chuỗi B; Màu vàng: cầu nối disulfide
Ricin được cấu tạo từ hai chuỗi A và B, nhưng chúng được tổng hợp cùng nhau như một phần của polypeptide tiền chất (preproricin) có 576 axit amin, với 26 axit amin đầu tiên là chuỗi peptide tín hiệu giúp định hướng protein đến mạng lưới nội chất Peptide tín hiệu này được theo sau bởi một propeptide gồm 9 axit amin, chuỗi A hoàn chỉnh, một propeptide nội phân tử và chuỗi B Trong mạng lưới nội chất, proricin được glycosyl hóa, và hai chuỗi A và B liên kết với nhau qua cầu nối disulfide trước khi được chuyển vào không bào thông qua thể Golgi Quá trình vận chuyển này đi kèm với một số biến đổi chưa rõ ràng, bao gồm cắt ngắn oligosaccharide và thêm fucose vào chuỗi A Khi đến không bào, chuỗi A và B kết hợp qua cầu nối disulfide nhờ sự loại bỏ các propeptide đầu N và các liên kết nội bộ, hình thành nên phân tử ricin hoàn chỉnh.
Hình 1.4: Cấu trúc ricin với các vị trí hoạt động [56].
Chuỗi A (màu trắng) có vị trí hoạt động gây độc, được biểu thị bằng phần màu xanh trong chuỗi Trong khi đó, chuỗi B (màu xanh) sở hữu hai vị trí gắn kết đặc hiệu với galactose, được đánh dấu bằng màu xanh lá cây.
Hình 1.5: Cơ chế sinh tổng hợp ricin trong tế bào [41]
Ricin được sản xuất hoàn chỉnh trong không bào nội nhũ và được lưu trữ tại đây, giúp nó không gây ảnh hưởng đến các chức năng bình thường của tế bào chứa nó Không bào nội nhũ cũng đóng vai trò là nơi lưu trữ lâu dài của ricin trong tế bào hạt Thầu Dầu.
1.1.2.2 Cơ chế tác động của ricin
Khi ricin được ủ với tế bào ở nhiệt độ 37 độ C, độc tố sẽ được hấp thụ vào tế bào thông qua quá trình nhập bào, diễn ra chậm với tỷ lệ khoảng 10% mỗi giờ Nghiên cứu của Doan cho thấy quá trình này không chủ yếu liên quan đến lớp đệm niêm mạc mà diễn ra qua con đường trung gian thụ thể sử dụng protein clarthin để hình thành các túi chứa ricin Sau khi được nhập bào, ricin sẽ được chuyển đến endosome, nơi xảy ra ba trường hợp khác nhau.
- Trường hợp 1: Ricin được giải phóng ra ngoài tế bào.
- Trường hợp 2: Ricin được vận chuyển đến lysosome và bị phân hủy;
- Trường hợp 3: Ricin được vận chuyển đến bộ máy Golgi (R3).
Khi ricin được vận chuyển đến thể Golgi, nó sẽ liên kết với glycoprotein và glycolipid trên bề mặt của mạng lưới nội chất, quá trình này được gọi là đường hóa và sunphate hóa, hay còn gọi là đánh dấu ricin Sau đó, chuỗi A của ricin sẽ tách ra và được vận chuyển vào nhân, nơi nó tác động đến ribosom bằng cách thay đổi cấu trúc rARN 28S của tiểu đơn vị lớn, cụ thể là thay thế một base adenine đơn (A4324) trên cấu trúc vòng sarcin-ricin (SRL).
Chuỗi A bám vào vị trí adenin 4324 (A4324) trong RNA ribosome 28S và loại bỏ adenin này khỏi vùng trình tự bảo tồn trong vòng sarcin-ricin Vòng sarcin/ricin là một trình tự ngắn lặp lại, nằm gần đầu 3’ của rARN, nơi chuỗi A thực hiện quá trình khử A4324 Sau khi gắn vào vòng sarcin/ricin, chuỗi A kẹp A4324 giữa hai vòng tyrosin của vùng xúc tác, dẫn đến thủy phân liên kết C-N glycosidic Kết quả của quá trình này là RNA ribosome 28S mất một adenin tại vị trí 4324.
Hình 1.6: Các con đường vận chuyển ricin trong tế bào [20]
Sự thay đổi này ngăn cản ribosome tương tác với eEF-1 và eEF-2, từ đó cản trở quá trình dịch mã và khiến tế bào đi vào con đường chết theo chương trình.
Hình 1.7: Cơ chế hoạt động gây độc của ricin trong ribosome [125]
1.1.3 Độc tính và ứng dụng của ricin
1.1.3.1 Độc tính của ricin Độc tính của ricin và các triệu chứng ngộ độc phụ thuộc vào con đường xâm nhập vào cơ thể cũng như liều lượng hấp thụ Độc tính đã được chứng minh trên động vật thí nghiệm thông qua tiêm tĩnh mạch, hít phải, và hấp thụ qua đường uống. Bên cạnh đó, ricin cũng có thể gây nhiễm độc cho cơ thể bằng cách hấp thụ qua da bị tổn thương Các nghiên cứu trên động vật liên quan đến chuột đã chứng minh rằng liều gõy chết 50% (LD50) của ricin được sử dụng đường tiờm là 5-10 àg/kg trọng lượng cơ thể [97] LD50 đối với ricin qua đường hụ hấp là 5-20 àg/kg trọng lượng cơ thể nhưng phụ thuộc nhiều vào kích thước hạt mang ricin, với các hạt nhỏ hơn (< 5 àm) gõy tử vong cao hơn vỡ chỳng cú thể lắng sõu hơn vào phổi LD50 của ricin qua đường tiêu hóa ở chuột là 5-20 mg/kg trọng lượng cơ thể So sánh với đường tiêm và hô hấp thì giá trị LD50 đường tiêu hóa thấp hơn rất nhiều bởi qua đường tiêu hóa, ricin sẽ bị phân hủy nhiều trong quá trình xâm nhập vào đường máu để vận chuyển đến các cơ quan [76] Chưa có thử nghiệm độc tính của ricin đối với con người, tuy nhiên có thể dự đoán dựa trên dữ liệu độc tính của các nghiên cứu trên động vật (cũng như các nghiên cứu trường hợp về sự nhiễm độc do con người gây ra) Dựa trên các báo cáo này có thể dự đoán LD50 của người tiếp xúc qua đường tĩnh mạch hoặc hớt phải được ước tớnh là 5-10 àg/kg trọng lượng cơ thể và 1-
Liều lượng 20 mg/kg trọng lượng cơ thể khi sử dụng đường uống có thể gây ra ngộ độc Các trường hợp ngộ độc ngẫu nhiên đã được ghi nhận cho thấy việc tiêu thụ từ 0,5 đến 30 hạt Thầu Dầu có thể dẫn đến các triệu chứng lâm sàng từ nhẹ đến nghiêm trọng, thậm chí tử vong.
Ricin, với độc tính cao đối với tế bào động vật, đã được nghiên cứu như một liệu pháp điều trị cho nhiều loại ung thư, bao gồm ung thư phổi, cổ tử cung và da Nghiên cứu của Guyot và cộng sự chỉ ra rằng chuỗi A của phân tử ricin có thể được sử dụng như một kháng độc tố kết hợp với kháng thể để điều trị u ác tính ở người Gần đây, sự phát triển của công nghệ nano đã mở ra nhiều nghiên cứu mới về vai trò của ricin như một tác nhân chống ung thư, khi được đóng gói vào các chất mang nano hoặc liposome, nhằm cải thiện hiệu quả điều trị cho các loại ung thư khác nhau.
1.1.3.3 Ứng dụng trong quân sự
ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 34
Hạt Thầu Dầu, được cung cấp bởi Viện Dược liệu Trung ương, là loại hạt đã được làm khô tự nhiên Các loại lectin và abrin được sử dụng trong nghiên cứu này được cung cấp bởi Viện Hóa học Môi trường Quân sự thuộc Bộ Tư lệnh Hóa học.
Thư viện aptamer TV40, do phòng Công nghệ tế bào động vật thuộc Viện Công nghệ Sinh học cung cấp, bao gồm một trình tự trung tâm được tạo thành từ sự kết hợp ngẫu nhiên của 40 nucleotide Hai đầu cố định của thư viện được cấu trúc bởi hai đoạn nucleotide có trình tự đã biết.
5’- CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG-N40 - CGG GAG CCA ACA CCA AAG CTT-3’, trong đó N40 là vùng biến đổi
Cặp mồi dùng để nhân bản đoạn gen:
AptF2: 5’ – CGT CAC ACC TGC TCT CAT ATG – 3’;
AptR2: 5’ – CGG GAG CCA ACA CCA AAG CTT – 3’;
Luận án được thực hiện tại các cơ quan:
+ Viện Hóa học Môi trường quân sự: Nghiên cứu về tách, tinh sạch ricin, sản xuất thành phần bộ kít và thử nghiệm thực tế tại hiện trường.
+ Viện Công nghệ Sinh học: Nghiên cứu sàng lọc aptamer đặc hiệu ricin và phát triển phương pháp phát hiện ricin.
+ Khoa Sinh học/Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội: Nghiên cứu tinh sạch ricin, đánh giá kết quả thử nghiệm.
THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU VÀ HÓA CHẤT 34
2.2.1 Các thiết bị chính sử dụng trong nghiên cứu
The laboratory is equipped with advanced instruments including an Eppendorf centrifuge from Germany, a Jasco V530 UV-Vis spectrophotometer from Japan, a Hettich refrigerated centrifuge, and a Thermo Savant freeze dryer from the USA Additionally, it features Hanna pH meters, protein electrophoresis equipment, a Sanyo sterile workbench, a fume hood, and a Metter pH meter from Switzerland Other essential tools include a Pharmacia gel imager, an incubator, a PCR machine from the USA, a Rotolab OSI vortex mixer, an Aligent Real-time PCR system, and an LC-MS/MS for comprehensive analytical capabilities.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35
bộ điện di ADN (Nhật Bản), pipetman các loại (Gilson)…và một số thiết bị nghiên cứu khác.
Essential chemicals used in research include dialysis membranes such as xelophan (ICN Biomedical), Sephadex G-100 (Amersham Biosciences), and DEAE Sepharose fast flow (GE Healthcare) Other important substances are Q Sepharose, Tris-HCl, glycerin, SDS, acetic acid, NaCl, yeast extract, tryptone, agar, ampicillin, (NH4)2SO4 (PA), kanamycin, chloroform, isoamyl alcohol, agarose, SDS, ethidium bromide, double distilled water, treated RNA and DNA water, methanol, tween-20%, skim milk (Nutifood), master mix (Pioneer), and 96-well ELISA plates coated with monoclonal antibodies against chain A (LifeSpan BioSciences) Additionally, streptavidin-horseradish peroxidase enzyme conjugate (Invitrogen), TMB (Invitrogen), Nanosep 5K Omega filtration columns (Pall Corporation), TBPS, PBS, Primer F, Primer R, and various other pure chemicals are also utilized.
2.3.1 Phương pháp tách chiết và tinh sạch ricin
2.3.1.1 Tách chiết ricin từ hạt Thầu Dầu
5 kg hạt Thầu Dầu khô được nghiền nhỏ và ép bằng máy thủy lực để thu được bã hạt Thầu Dầu sau khi loại bỏ dầu Bã này được để khô tự nhiên và ngâm trong axit acetic 5% với tỷ lệ 1:10 Dung dịch được lắc trong 6 đến 10 giờ và sau đó lọc để thu dịch S1 Kết tủa từ dịch S1 được thực hiện bằng dung dịch muối (NH4)2SO4 với nồng độ từ 30% đến 70% để xác định nồng độ tối ưu cho việc thu protein Kết tủa thu được bằng ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 15 phút và được hòa tan bằng đệm PBS 0,01M (pH = 7,2) Cuối cùng, thẩm tích loại muối (NH4)2SO4 bằng đệm PBS 0,01M cho ra dung dịch ricin thô, sẵn sàng cho các bước tinh sạch tiếp theo.
2.3.1.2 Tinh sạch ricin bằng sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel
Nghiên cứu này sử dụng DEAE Sepharose fast flow cho phương pháp sắc ký trao đổi ion và Gel Sephadex G-100 cho sắc ký lọc gel Quá trình tinh sạch ricin được thực hiện qua hai bước liên tiếp.
Bước 1: Chạy sắc ký trao đổi ion với gel DEAE Sepharose fast flow
DEAE được cân bằng ở pH 8,0 bằng dung dịch đệm Tris - HCl 0,05 M Sau đó, cho một lượng dung dịch đã chuẩn bị vào 100 ml gel và khuấy trong 15 phút để protein bám hoàn toàn vào gel Cuối cùng, toàn bộ gel được đưa lên cột thủy tinh có kích thước 2,5 × 30 cm và rửa cột bằng dung dịch thích hợp.
Để ổn định gel, sử dụng 100 ml đệm Tris - HCl 0,05 M Rửa cột bằng đệm Tris - HCl 0,05 M pH = 8,0, bổ sung NaCl với nồng độ tăng dần từ 0,05 - 1 M với tốc độ 0,2 ml/phút Tiến hành thu mẫu theo phân đoạn, mỗi phân đoạn có thể tích 2 ml.
Bước 2: Chạy sắc ký lọc gel với Sephadex G100
Gel Sephadex G-100 được hòa tan trong nước cất với tỷ lệ 1g Sephadex/10 ml H2O ở nhiệt độ phòng trong khoảng 4 đến 6 giờ để gel trương nở hoàn toàn Sau đó, gel được nạp vào cột thủy tinh có đường kính 1,0 cm và chiều cao 30 cm, đồng thời được ngâm trong dung dịch đệm phosphate 0,02 M với pH 7,2.
- Quá trình sắc ký trên cột theo tỉ lệ : mẫu/gel = 1/6 (tính theo thể tích) tốc độ dòng là 0,2 ÷ 0,3 ml/phút và thu 20 phân đoạn (5 ml/mỗi phân đoạn).
2.3.2 Các phương pháp xác định ricin
2.3.2.1 Xác định hàm lượng protein
Xác định hàm lượng protein trong các phân đoạn bằng phương pháp Lowry [9].
2.3.2.2 Xác định độ tinh sạch của ricin bằng phương pháp điện di Độ tinh sạch của ricin được xác định bằng cách điện di trên gel polyacrylamide theo phương pháp của Laemmli trên thiết bị của hãng Hoefer (Mỹ). Bản gel được nhuộm màu bằng Coomassie Blue và đọc kết quả trên hệ thống phân tích ảnh của Biorad [78].
2.3.2.3 Phân tích khối phổ xác định ricin (LC-MS/MS)
Protein sau tinh sạch được xác định thông qua phương pháp LC-MS/MS Hỗn hợp peptide, sau khi trải qua quá trình thủy phân bằng trypsin, được hòa trộn với dung dịch 0,1% FA để tiến hành phân tích trên hệ thống.
The Nano LC process is completed in just 90 minutes, utilizing Nano LC-ESI-MS/MS for analysis The Bruker Daltonics mass spectrometer performs single TOF MS scans for ions within the mass range of 100 amu.
Phân tích khối phổ liên tiếp (MS/MS) được thực hiện với 4000 amu, sử dụng phần mềm FlexAnalysis v3.4 để lựa chọn các ion peptide cho quá trình phân mảnh Kết quả của phổ khối MS/MS được xử lý và phân tích thông qua phần mềm Mascot v1.8 (Matrix Science Ltd., London, Anh) và Ngân hàng.
Dữ liệu Protein NCBI (Mỹ).
Các thông số cài đặt:
+ Cơ sở dữ liệu: NCBI.
+ Sai số khối peptide và MS/MS: 0,6 Da và 1,2 Da.
+ Cải biến cố định: carbamindomethyl (C).
+ Điện tích của peptide: +2, +3 hoặc+4.
+ Cải biến biến đổi: oxidation (methyonine, M).
2.3.2.4 Phương pháp sắc ký miễn dịch phát hiện ricin
Sử dụng test phát hiện nhanh độc tố ricin dựa trên nguyên lý sắc ký miễn dịch để đối chứng và so sánh với quy trình tách chiết, tinh sạch, cùng với việc phát hiện ricin qua phương pháp ELAA và real-time PCR Test này được cung cấp bởi Viện Hóa học Môi trường quân sự.
Mẫu môi trường có thể ở dạng dung dịch hoặc thể rắn (bột) Để kiểm tra sự hiện diện của ricin trong các mẫu, quy trình chuẩn bị mẫu cần được thực hiện theo các bước cụ thể.
1 Xác nhận lại hạn sử dụng của bộ Test phát hiện độc tố ricin in trên bề mặt túi nhôm vẫn trong hạn sử dụng.
2 Xé túi nhôm đựng bộ Test phát hiện ricin, lấy lọ nhựa chứa dung dịch hòa tan mẫu và que lấy mẫu có trong bộ Test.
3 Cho đầu tăm bông thấm ướt dung dịch mẫu kiểm tra rồi đưa vào lọ dung dịch hòa tan mẫu và khuấy đều (lặp lại 2 đến 3 lần) Dung dịch có nồng độ ricin lớn hơn 50 ng/ml đều được phát hiện.
4 Nếu mẫu độc là chất rắn, hãy thấm ướt que lấy mẫu bằng dung dịch hòa tan mẫu, sau đó cho vào lọ dung dịch hòa tan và khuấy đều (lặp lại 2 đến 3 lần).
Các dung dịch thu được nói trên sẵn sàng để kiểm tra sự có mặt ricin trong môi trường. Phần 2: Các bước thực hiện
- Bước 1: Lấy thanh strip từ trong túi nhôm được bảo vệ bằng silicagel ra ngoài để tiến hành kiểm tra độc tố ricin.
Để thực hiện bước 2, bạn cần sử dụng micropipet có sẵn trong túi để hút mẫu từ lọ dung dịch kiểm tra Sau đó, nhỏ 2-3 giọt mẫu vào giếng mẫu (S) trên thanh strip và đảm bảo đặt thanh strip ở vị trí thăng bằng.
- Bước 3: Đợi cho dung dịch thấm đều dọc thanh strip và đọc kết quả sau thời gian ít nhất là 10 phút.
- Bước 4: Kết thúc kiểm tra, thu toàn bộ các dụng cụ thử nghiệm cho vào túi đựng
TEST và dán nhãn báo “ Nguy hiểm sinh học”.