TỔNG QUAN
Đông trùng hạ thảo
1.1.1 Nguồn gốc Đông trùng hạ thảo được hình thành khi ấu trùng các loài bướm thuộc chi
Thitarodes bị nấm thuộc chi Ophiocordyceps và/hoặc Cordyceps ký sinh [42].
Sâu non của loài Thitarodes baimaensis và Thitarodes armoricanus là những loài thường gặp nhất bị ký sinh bởi Ophiocordyceps sinensis Ngoài ra, còn có 46 loài khác thuộc chi Thitarodes cũng bị nấm này tấn công Các loài nấm này phân bố rộng rãi ở châu Á và châu Úc, với Đông Á là trung tâm đa dạng, đặc biệt là ở các cao nguyên có độ cao từ 4000 đến 5000m như Tây Tạng, Tứ Xuyên, Thanh Hải, Cam Túc và Vân Nam.
Vào mùa đông, nấm ký sinh bắt đầu tấn công sâu non, tiêu thụ chất dinh dưỡng của chúng và dẫn đến cái chết Những con sâu này có thể nhiễm bào tử nấm qua đường hô hấp hoặc tiếp xúc trực tiếp Khi sợi nấm phát triển mạnh, chúng xâm nhập vào mô của sâu và chiếm đoạt hoàn toàn các chất dinh dưỡng Đến mùa hè, nấm phát triển thành dạng cây, mọc lên từ sâu và phát tán bào tử Hiện nay, nhiều loài nấm thuộc chi Ophiocordyceps và Cordyceps được nuôi trồng công nghiệp để chiết xuất các hợp chất dược tính quý giá.
1.1.2 Nghiên cứu và phát triển
Nấm dược liệu, đặc biệt là các loài trong giống Cordyceps, đã đóng vai trò quan trọng trong văn hóa và nền văn minh nhân loại nhờ vào chứa nhiều hợp chất dược liệu quý giá Hiện tại, có khoảng 680 loài nấm thuộc chi này được nghiên cứu và ứng dụng trong y học.
Cordyceps là hai loại nấm đông trùng hạ thảo nổi bật trong y học cổ truyền Trung Quốc, bao gồm Cordyceps sinensis (hay Ophiocordyceps sinensis) và Cordyceps militaris Hiện nay, hai loại nấm này đang được nghiên cứu sâu rộng về chiết xuất và sản xuất nhờ vào giá trị dược liệu và giá trị kinh tế cao của chúng.
Nấm đông trùng hạ thảo Ophiocordyceps sinensis (hay còn gọi là
Cordyceps sinensis là một loại nấm dược liệu hiếm, chủ yếu phân bố ở các vùng núi cao trên 4000 m, đặc biệt là ở Tây Tạng (Trung Quốc) và một số khu vực của Nepal và Bhutan Loại nấm này chỉ được thu hoạch trong điều kiện hoang dã và chưa thể nuôi trồng thành công trong môi trường nhân tạo, dẫn đến sản lượng không đủ đáp ứng nhu cầu thị trường.
Hình 1.1 Cordyceps sinensis tìm thấy trên đồng cỏ ở độ cao 4200 m trên mực nước biển tại Tây Tạng (Daniel Winkler, 2010)
Loài đông trùng hạ thảo Cordyceps militaris, hay còn gọi là nấm cam sâu bướm, chứa các hợp chất hóa học tương tự như O sinensis và thường được tìm thấy ở độ cao từ 2000 đến 3000 m tại các khu vực như Trung Quốc, Nhật Bản, Hàn Quốc và Đông Nam Á Loài nấm này có thể dễ dàng nuôi trồng trong môi trường nhân tạo, và hiện nay có nhiều nghiên cứu tập trung vào quy trình nuôi trồng C militaris nhằm thay thế O sinensis Các nghiên cứu này cũng khám phá gen, nhu cầu dinh dưỡng, môi trường nuôi cấy, cùng với các đặc tính sinh hóa và dược lý của nấm C militaris.
Trên thế giới đã có hơn 400 phân loài Cordyceps được phát hiện và mô tả, nhưng chỉ khoảng 36 loài được nuôi trồng trong môi trường nhân tạo nhằm mục đích sản xuất quả thể.
Trong số các loài nấm, C militaris nổi bật nhờ dược tính tốt và thời gian sản xuất ngắn, đã được trồng rộng rãi [27] Quả thể của nấm Cordyceps militaris (Hình 1.2) được sử dụng trong ẩm thực, bao gồm các món hầm, súp và trà tại các nước Đông Nam Á như Hongkong, Đài Loan, và Trung Quốc Liều dùng an toàn khuyến nghị là dưới 2,5 g/kg thể trọng [8] Ngoài ra, quả thể và sinh khối nấm còn được dùng làm thuốc và bổ sung sức khỏe, giúp duy trì chức năng thận, phổi, chống lão hóa, điều hòa giấc ngủ và hỗ trợ điều trị viêm phế quản mãn tính [10].
Hình 1.2 Quả thể nấm C militaris trên ký chủ nhộng
Hiện nay, thị trường có rất nhiều chế phẩm chứa đông trùng hạ thảo, thường được kết hợp với các dược liệu quý hiếm như nhân sâm, tam thất và tổ yến Các dạng bào chế phổ biến bao gồm dạng rắn như viên nang, viên hoàn, gói bột và dạng lỏng như nước uống, cao lỏng Một số chế phẩm nổi bật chứa đông trùng hạ thảo có thể kể đến.
- Dạng rắn: viên nang Pure cordyceps capsule, viên Đông trùng hạ thảo Tenken, bột Cordyceps extract…
Các sản phẩm đông trùng hạ thảo tại Việt Nam ngày càng đa dạng, bao gồm cao lỏng đông trùng hạ thảo tam thất, nước Yến Đông trùng hạ thảo, và nước uống Đông trùng hạ thảo He Yuan Tang – King of cordyceps Công ty Cổ phần Dược thảo Thiên Phúc nổi bật với quy mô sản xuất lớn nhất tại Hà Nội và Đà Lạt Các sản phẩm từ đông trùng hạ thảo như nấm sau thu hoạch được sấy khô, viên nén, viên nhộng, và kết hợp với linh chi đều có mặt trên thị trường Tuy nhiên, giá thành của các sản phẩm này thường khá cao.
Do giá trị kinh tế cao và tính quý hiếm của Đông trùng hạ thảo, thị trường Việt Nam và thế giới đã chứng kiến sự bùng nổ của các sản phẩm hàng giả và hàng kém chất lượng liên quan đến loại dược liệu này, cũng như thực phẩm chức năng có chứa Đông trùng hạ thảo.
1.1.3 Các thành phần hóa học của Đông trùng hạ thảo (Cordyceps militaris)
Nghiên cứu về thành phần hóa học của nấm C militaris cho thấy loại nấm này chứa protein chiếm 40,69%, cùng với các vitamin quan trọng như vitamin A (34,7 mg/g), vitamin B1 (13,0 mg/g), vitamin B6 (62,2 mg/g), vitamin B12 (70,3 mg/g) và vitamin B3 (42,9 mg/g) Ngoài ra, nấm còn chứa các nguyên tố khoáng như Se (0,44 ppm), Zn (130,0 ppm), Cu (29,15 ppm) và các hợp chất hóa học quan trọng như cordycepin (1,52%), acid cordycepic (11,8%) và polysaccharide (30%).
Nghiên cứu của Hur (2008) chỉ ra rằng quả thể nấm Cordyceps militaris chứa lượng acid amin tổng số cao hơn so với sinh khối nấm, với 69,32 mg/g trong quả thể và 14,03 mg/g trong sinh khối Sự chênh lệch khối lượng acid amin giữa các loại trong quả thể và sinh khối nấm dao động từ 1,15.
Thành phần acid amin trong quả thể nấm bao gồm lysin (15,06 mg/g), acid glutamic (8,79 mg/g), prolin (6,68 mg/g), threonin (5,99 mg/g), arginin (5,29 mg/g) và alanin (5,18 mg/g) Theo nghiên cứu của Chang và cộng sự (2001), sinh khối nấm chủ yếu chứa acid aspartic (2,66 mg/g), valin (2,21 mg/g) và tyrosin (1,57 mg/g).
Quả thể nấm Cordyceps militaris chứa 70% acid béo không no, với acid linoleic chiếm 61,3% trong quả thể và 21,5% trong sinh khối Ngoài ra, acid béo no chủ yếu là acid palmitic, chiếm 24,5% trong quả thể và 33,0% trong sinh khối.
Adenosine và cordycepin là hai hợp chất có dược tính cao của nấm
Cordycepin, Adenosine, Inosine trong Đông trùng hạ thảo
Các thành phần hoạt tính sinh học chính trong Đông trùng hạ thảo bao gồm nucleoside, polysacarit và sterol Trong đó, nucleoside như cordycepin, adenosine và inosine được công nhận là những thành phần quan trọng, được sử dụng làm chất đánh dấu hóa học để kiểm tra chất lượng và đảm bảo tính xác thực của đông trùng hạ thảo cũng như thực phẩm chức năng có chứa thành phần này.
Cordycepin (hay 3'-deoxyAdenosine) là một dẫn xuất của nucleoside adenosine, đặc trưng bởi việc thiếu nhóm hydroxy ở vị trí 3' của gốc ribose Ban đầu, cordycepin được chiết xuất từ nấm Cordyceps militaris, nhưng hiện nay có thể được sản xuất tổng hợp Ngoài ra, nó cũng được tìm thấy trong các loài Đông trùng hạ thảo khác và Ophiocordyceps sinensis.
Cordycepin Tên khoa học: 9-(3-deoxy-β-D-ribofuranosyl) adenin
Trọng lượng phân tử: 251,24 pKa1= 3,8; pKa2 = 12,3
Phân tử cordycepin tính kiềm, dạng bột hoặc tinh thể bông tuyết.
Tan trong DMSO, methanol, ethanol
Bước sóng hấp thụ cực đại 259,0 nm.
Cordycepin, một chất tương tự Adenosine, có khả năng tham gia vào các phản ứng sinh hóa do một số enzym không phân biệt được giữa hai loại Sự kết hợp của cordycepin vào phân tử mRNA có thể dẫn đến việc kết thúc sớm quá trình tổng hợp protein Ngoài ra, cordycepin, được chiết xuất từ một số loại Đông trùng hạ thảo, thể hiện nhiều hoạt động dược lý quan trọng, bao gồm kháng khuẩn, kháng u, chống viêm và điều hòa miễn dịch.
Cordycepin đã cho thấy khả năng độc tính tế bào đối với một số dòng tế bào bạch cầu trong môi trường ống nghiệm Ngoài ra, nó còn mang lại tác dụng chống trầm cảm nhanh chóng và mạnh mẽ thông qua cơ chế truyền tín hiệu AMPA.
Về tác dụng trị liệu của cordycepin, một nghiên cứu về cordycepin trong Đông trùng Hạ thảo cho thấy hợp chất này có hai tác dụng trên tế bào:
(1) Ở liều thấp, cordycepin ức chế tăng trưởng không kiểm soát và phân hóa tế bào.
(2) Ở liều cao, cordycepin chặn đứng tế bào không cho dính chặt với nhau nên sẽ ức chế tăng trưởng.
Cordycepin, một hợp chất từ Đông trùng Hạ thảo, can thiệp vào sự tổng hợp protein của tế bào, với tác dụng khác nhau tùy thuộc vào liều lượng Ở liều thấp, nó ảnh hưởng đến sản xuất ribonucleic acid messenger, trong khi ở liều cao, cordycepin tác động trực tiếp lên sự sản xuất protein Do đó, các nhà khoa học tin rằng Đông trùng Hạ thảo có khả năng chống ung thư mạnh mẽ Hợp chất này cũng thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật, kháng ung thư, ngăn ngừa di căn và điều hòa miễn dịch.
Nghiên cứu cho thấy cordycepin, khi thâm nhập vào tế bào, sẽ được chuyển hóa thành mono, di, hoặc tri-phosphate, từ đó ức chế các enzym tổng hợp purin Ngoài ra, cordycepin còn kích hoạt quá trình kết thúc tổng hợp DNA hoặc RNA bên trong tế bào.
Tên khoa học: 9 - β-D-ribofuranosyl adenin
Trọng lượng phân tử: 267,24 pKa1 = 3,6; pKa2 = 12,5
Adenosine dạng bột tinh thể màu trắng.
Tan trong Ethylen glycol, nước, methanol, ethanol…
Bước sóng hấp thụ cực đại 259 nm
Adenosine là một hợp chất hữu cơ phổ biến trong tự nhiên, bao gồm adenin gắn với ribose qua liên kết β-N9 - glycosidic Là một trong bốn khối cấu tạo nucleoside của RNA, adenosine cần thiết cho sự sống Hợp chất này đóng vai trò quan trọng trong các quá trình sinh hóa, đặc biệt là trong Đông trùng hạ thảo (Ophiocordyceps sinensis), nơi nó được công nhận là chất đánh dấu hóa học để kiểm tra chất lượng sản phẩm Adenosine còn có khả năng điều tiết các quá trình sinh lý trong cơ thể, bao gồm bảo vệ tim, chức năng tiểu cầu và giãn nở mạch máu.
Adenosine có vai trò quan trọng trong việc ổn định huyết áp và hỗ trợ điều trị các bệnh tim mạch Hoạt chất này hiện diện ở mọi tế bào trong cơ thể, tham gia vào quá trình điều hòa nhịp tim và cải thiện tuần hoàn máu Adenosine giúp khắc phục tình trạng loạn nhịp và chậm nhịp tim, đồng thời tăng cường lượng oxy trong máu Ngoài ra, adenosine còn ức chế hoạt động ngưng trệ tiểu cầu quá mức, góp phần phòng ngừa các bệnh về mạch máu như nhồi máu cơ tim, tắc mạch máu não và cải thiện tình trạng lưu thông máu.
Adenosine có trong đông trùng hạ thảo giúp duy trì quá trình tuần hoàn và tăng cường lượng oxy trong máu Chất này hỗ trợ sự giãn nở của các mạch máu, từ đó cung cấp dưỡng khí cần thiết cho tuần hoàn máu trong cơ thể.
Adenosine và các thành phần trong đông trùng hạ thảo có khả năng cung cấp năng lượng và dinh dưỡng cần thiết, giúp duy trì hoạt động sống của cơ thể Sản phẩm này cũng hỗ trợ hồi phục sức khỏe cho những người mới ốm dậy và những người có cơ thể suy nhược.
Adenosine có tác dụng tích cực trong việc cải thiện khả năng sinh lý bằng cách tăng cường tuần hoàn vi và lưu lượng máu đến thận, đồng thời điều tiết hàm lượng prostaglandin và các nội tiết tố liên quan đến chức năng sinh dục Ngoài ra, adenosine còn giúp ổn định tinh thần, giảm căng thẳng, mệt mỏi, và hỗ trợ hệ thần kinh, đồng thời cải thiện chất lượng giấc ngủ bằng cách ổn định và chống thiếu dưỡng khí, góp phần mang lại giấc ngủ sâu và ổn định Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã ghi nhận những lợi ích này của adenosine.
Inosine có tác dụng giảm kích thích thần kinh và thường có nồng độ thấp ở bệnh nhân động kinh Nghiên cứu trên chuột cho thấy hoạt chất này giúp giảm các cơn co giật liên quan đến căn bệnh này.
Adenosine là một hoạt chất có hàm lượng cao trong đông trùng hạ thảo, giúp cơ thể hấp thụ dưỡng chất hiệu quả Việc sử dụng đông trùng hạ thảo mang lại nhiều giá trị tích cực cho sức khỏe con người nhờ vào tác dụng của adenosine.
Inosine là một nucleoside được hình thành khi hypoxanthine được gắn vào vòng ribose (còn được gọi là ribofuranose) thông qua liên kết β-N9 -glycosidic.
Tên khoa học: 9-[(2R,3R,4S,5R)-3,4-dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]- 6,9-dihydro-3H-purin-6-one
Khối lượng phõn tử: 268.229 gãmol −1 pKa1 = 1,2; pKa2 = 8,9
Tan trong nước, methanol, ethanol.
Nghiên cứu trên động vật chỉ ra rằng inosine có khả năng bảo vệ thần kinh, làm cho nó trở thành một ứng cử viên tiềm năng trong việc điều trị chấn thương tủy sống và hỗ trợ phục hồi sau đột quỵ.
Inosine, một sản phẩm chuyển hóa của adenosine, trước đây được cho là không có tác dụng sinh học, nhưng các nghiên cứu gần đây đã chỉ ra rằng nó có khả năng điều hòa miễn dịch mạnh mẽ và bảo vệ thần kinh Inosine giảm sản xuất các chất trung gian gây viêm từ đại thực bào, tế bào lympho và bạch cầu trung tính, đồng thời bảo vệ trong các mô hình động vật đối với nhiễm trùng huyết, thiếu máu cục bộ và bệnh tự miễn Nó cũng bảo vệ tế bào thần kinh đệm và tế bào thần kinh trong điều kiện thiếu oxy, kích thích sự tái phát triển sợi trục sau chấn thương Các hoạt tính sinh học của inosine có thể liên quan đến tác động của các thụ thể adenosine, poly (ADP-ribose) polymeraza và mức năng lượng của tế bào.
Tổng quan các phương pháp phân tích adenosine, cordycepin và inosine
1.3.1 Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC
Sắc ký lỏng là một phương pháp tách chất, trong đó quá trình tách diễn ra trên cột với pha tĩnh là chất rắn và pha động là chất lỏng Mẫu phân tích được đưa vào pha động và chuyển tới cột tách Trong quá trình phân tích, các chất phân tích phân bố liên tục giữa pha động và pha tĩnh Sự khác biệt về cấu trúc phân tử và tính chất lý hóa của các chất này dẫn đến khả năng tương tác khác nhau với hai pha, khiến chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra tại cột.
Bảng 1.1 Một số phương pháp sắc ký lỏng phân tích adenosine, cordycepin và inosine Đối tượng phân tích Cột Pha động Detector Giới hạn phát hiện (àg/ml)
Bảy nucleoside Pha đảo Nước (A) và methanol (B)
Adenosine, (250 mm (MS) guanosine, x 4,6 uridine, mm, 5
Inosine, μm) thymidine và 2- deoxyAdenosi ne) và hai nuclebase
13 nucleoside Cột C18 Acetonitrile (A) Khối phổ nguồn ion hóa phun điện tử (UPLC- ESI- MS/MS)
Ade: Ade: và nuclebase (100 mm và nước (B) 0,20 108,7 59
(250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5 àm)
Hỗn hợp của acetonitril (ACN) và nước (5:95, v/v) có chứa 0,1
Tám Cột C18 Dung dịch 0,1% Đo Ade:
Ino: 89,35 nucleoside RRHD acid formic trong quang 22
(bao gồm (2,1 x nước (A) và phổ khối
Adenosine, 150 mm, acetonitrile chứa lượng cordycepin và 1,8 àm) 0,1% acid formic ion di
Adenosine và cordycepin Cột pha đảo Waters Symmet ry Shield
Methanol/nước tỉ lệ 92 : 8 (v/v) Dãy diod (HPLC- DAD)
Năm 2017, nghiên cứu của Juan Zou và cộng sự đã phân tích hàm lượng bảy nucleoside (bao gồm cordycepin, adenosine, guanosine, uridine, inosine, thymidine và 2-deoxyAdenosine) cùng hai nucleobase (adenine và uracile) trong sản phẩm đông trùng hạ thảo tự nhiên và nuôi cấy Phương pháp sử dụng HPLC pha đảo kết hợp với detector khối phổ (MS) với điều kiện phân tích gồm pha động là nước siêu tinh khiết và methanol, tốc độ dòng 1ml/phút, và cột pha đảo C18 Giới hạn phát hiện và định lượng cho adenosine, cordycepin và inosine lần lượt là 0,01 và 0,05 àg/ml, với hiệu suất thu hồi đạt 103,1%, 90,4% và 79,4%.
Năm 2015, Shi-Yu Zong và các cộng sự đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng cao kết hợp với detector khối phổ nguồn ion hóa phun điện tử (UPLC-ESI-MS/MS) để xác định nhanh 13 nucleoside và nuclebase trong Đông trùng hạ thảo tự nhiên, sử dụng chất nội chuẩn 2-chloroAdenosine Chế độ quét MS được thiết lập với khoảng m/z từ 50 đến 500, trong đó các thông số tối ưu hóa bao gồm nhiệt độ khí sấy 350 °C, dòng khí làm khô 10,0 l/phút, áp suất khí phun sương 35 psi và điện áp 4000 V Phân tích được thực hiện trên cột C18 (100 mm × 2,1 mm, 1,8 μm) với các thành phần pha động phù hợp.
Acetonitrile và nước được khử khí bằng siêu âm trước khi sử dụng, với tốc độ dòng pha động là 0,30 ml/phút Nhiệt độ cột duy trì ở 25 °C và nhiệt độ khay mẫu ở 4 °C, cùng với thể tích tiêm cố định là 2,0 μL Giới hạn phát hiện và định lượng cho adenosine (Ade), cordycepin (Cor), và inosine (Ino) lần lượt là 0,20; 0,04; 0,50 àg/ml và 0,50; 0,10; 2,5 àg/ml Hiệu suất thu hồi các chất phân tích được định lượng là Ade 108,7%, Cor 115,2% và Ino 116,7%, với RSD < 6,18%.
Năm 2019, Yasia Su và cộng sự đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector huỳnh quang (HPLC-FD) để đồng thời định lượng cordycepin, adenosine và 2-deoxyAdenosine (dA) Các điều kiện phân tích được tối ưu hóa với cột pha đảo ODS C18 kích thước 250 x 4,6 mm và kích thước hạt 5 µm Pha động sử dụng hỗn hợp acetonitrile (ACN) và nước theo tỷ lệ 5:95 (v/v), có chứa 0,1 M Triethylamine Acetat (TEAA), với tốc độ dòng 1 ml/phút và nhiệt độ cột duy trì ở 30 °C Thể tích bơm mẫu là 10 µl, đảm bảo độ chính xác trong quá trình phân tích.
275 và 411 nm Phương pháp có giới hạn phát hiện đối với Cor, dA và Ade lần lượt là 0,021 ng/ml, 0,024 ng/ml và 0,026 ng/ml [41].
Năm 2018, Robin Joshi và cộng sự đã phát triển phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng kết hợp với kỹ thuật đo quang phổ khối lượng ion di động (UPLC-IMS) để xác định đồng thời tám nucleoside trong đông trùng hạ thảo tự nhiên Quy trình sử dụng cột C18 RRHD (2,1 x 150 mm, 1,8 μm) với pha động A (0,1% acid formic trong nước) và B (acetonitrile chứa 0,1% acid formic) theo chương trình rửa giải gradient Tốc độ dòng chảy là 180 μl/phút và thể tích bơm mẫu là 1 μl, trong khi nhiệt độ cột được duy trì ở 30 °C Giới hạn phát hiện và định lượng cho adenosine, cordycepin và inosine lần lượt là 0,97; 0,24; 0,88 ng/ml và 3,20; 0,79; 2,90 ng/ml, với hiệu suất thu hồi từ 89,35 – 103,2%.
Năm 2009, Lei Huang và các cộng sự đã nghiên cứu hàm lượng adenosine và cordycepin trong sản phẩm đông trùng hạ thảo bằng phương pháp sắc ký lỏng ghép nối detector dãy diod quang (HPLC-DAD) Phân tích được thực hiện với pha động methanol/nước tỉ lệ 92:8 (v/v) và tốc độ dòng 1 ml/phút, sử dụng cột pha đảo Waters Symmetry Shield RP 18 / 4,6 mm x 150 mm, 5 µm, ở nhiệt độ cột 30°C Mẫu được chiết xuất bằng dung dịch methanol/nước tỉ lệ 50:50, với giới hạn phát hiện của adenosine là 0,3 µg/ml và của cordycepin là 0,25 µg/ml.
1.3.2 Phương pháp điện di mao quản
Năm 2009, Feng-Qing Yang và các cộng sự đã phát triển quy trình phân tích đồng thời 12 nucleoside và nucleobase trong đông trùng hạ thảo tự nhiên và nuôi cấy bằng phương pháp điện di mao quản kết nối với detector khối phổ (CE-MS), sử dụng 5-chlorocytosine arabinoside làm chất nội chuẩn Điều kiện tối ưu hóa bao gồm dung dịch điện ly nền là acid formic 100 mM chứa 10% (v/v) methanol Các thông số được tối ưu là 75% (v/v) methanol chứa 0,3% acid formic với tốc độ dòng chảy 3 µl/phút trước khi đến buồng phun điện tích, với tốc độ dòng chảy và nhiệt độ khí sấy lần lượt là 6 l/phút và 350 oC Phương pháp này có giới hạn phát hiện và định lượng nhỏ hơn 12,66 và 38,94 àg/ml, độ chính xác tốt với hiệu suất thu hồi từ 92,7 – 103,4%.
Vào năm 2006, Yerra Koteswara Rao và cộng sự đã phát triển một quy trình phân tích cordycepin trong đông trùng hạ thảo bằng phương pháp diện di mao quản với detector UV ở bước sóng 254 nm Phương pháp này có các điều kiện tối ưu như dung dịch đệm điện ly natri borat 20 mM kết hợp với 28,6% methanol ở pH 9,5, điện thế tách 20 kV, thời gian bơm mẫu 10 giây và nhiệt độ thích hợp.
25 o C Giới hạn phỏt hiện và giới hạn định lượng của phương phỏp 1 àg/ml và 4 àg/ml, hiệu suất thu hồi trờn nền mẫu thực khoảng 98% [35].
Năm 2004, Y X Gong và cộng sự đã xác định hàm lượng 6 nucleoside và nucleobase bằng phương pháp điện di mao quản kết hợp với detector diot quang tại bước sóng 254 nm, sử dụng adenosine monophosphat làm chất nội chuẩn Phương pháp này sử dụng dung dịch đệm gồm acid boric 500 mM và 12,2% axetonitril, được điều chỉnh pH đến 8,6 bằng natri hydroxit, với điện thế tách 20 kV Mẫu được chiết siêu âm ở nhiệt độ phòng trong 15 phút, đạt hiệu suất thu hồi khoảng 97% và độ chụm nhỏ hơn 0,62 và 0,81%.
1.3.3 Nhận xét và đề xuất phương pháp thích hợp
Các phương pháp phân tích nucleoside trong sản phẩm đông trùng hạ thảo chủ yếu sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp với các loại detector khác nhau HPLC là phương pháp phổ biến trong kiểm soát chất lượng tại các viện kiểm nghiệm an toàn thực phẩm và nhóm nghiên cứu nhờ khả năng tách chất tốt, xác định đồng thời nhiều hợp chất, cùng độ lặp lại và ổn định cao Khi kết hợp với detector MS, HPLC cho phép phát hiện với giới hạn rất tốt (100 ng/l đến vài àg/l) và xác định chính xác các hợp chất trong mẫu phức tạp Tuy nhiên, chi phí phân tích cao và yêu cầu chuyên môn kỹ thuật cao khiến HPLC không phù hợp cho việc sàng lọc nhanh chất lượng sản phẩm đông trùng hạ thảo tại các cơ sở địa phương.
Việc kết hợp thiết bị điện di mao quản (CE) với detector khối phổ hoặc UV đã được thực hiện, tuy nhiên, CE vẫn gặp phải những hạn chế tương tự như HPLC khi triển khai tại cơ sở Trong 10 năm qua, nghiên cứu về phân tích nucleoside bằng CE rất hạn chế, đặc biệt là chưa có nghiên cứu nào sử dụng CE - C4D để phân tích ba nucleoside: adenosine, cordycepin và inosine Do đó, một phương pháp điện di mao quản tự chế loại xách tay kết hợp với detector đo độ dẫn không tiếp xúc kiểu tụ điện (C4D) đã được phát triển nhằm khai thác tiềm năng cao trong phân tích các nucleoside này.
CE như một giải pháp thay thế đơn giản trong sàng lọc có khả năng triển khai tại các cơ sở.
Tổng quan về phương pháp điện di mao quản
1.4.1 Nguyên lý tách chất và cấu tạo cơ bản của thiết bị điện di mao quản Điện di mao quản là phương pháp tách chất dựa trên khả năng di chuyển khác nhau của các phần tử tích điện trong lòng một mao quản rất hẹp dưới tác dụng của điện trường nhờ dòng chuyển dời có hướng của các điện tích trong điện trường theo một chiều nhất định [48] Kết hợp giữa kỹ thuật tách chất bằng điện di mao quản với các detector khác nhau (theo nguyên tắc đo điện, đo quang hoặc khối phổ) sẽ là phương pháp phân tích công cụ hữu hiệu.
Hình 1.3 Sơ đồ cấu tạo của hệ thống điện di mao quản
Hệ thống điện di mao quản (CE) bao gồm các thành phần cơ bản như nguồn cấp điện áp cao và điện cực tạo điện trường để tách chất trong mao quản Nó còn có bộ bơm mẫu hoặc hệ thống dẫn lưu để đưa dung dịch và mẫu vào mao quản, cùng với các loại detector như detector quang, khối phổ hoặc điện hóa để xác định các chất sau quá trình điện di Ngoài ra, hệ thống còn bao gồm bộ ghi dữ liệu và các thiết bị phụ trợ khác.
Theo phương pháp CE, các ion trong mao quản di chuyển với tốc độ khác nhau theo công thức:
Tốc độ di chuyển của hạt mang điện tỷ lệ thuận với điện tích (q) và tỷ lệ nghịch với độ nhớt của dung dịch đệm điện di (Ƞ) cùng bán kính hydrat (r) Trong một điện trường E nhất định, các chất có điện tích lớn và kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn Đối với các chất mang điện có cùng điện tích, chất nào có kích thước nhỏ sẽ di chuyển nhanh hơn, và trong trường hợp các chất có cùng bán kính, chất nào có điện tích lớn sẽ có tốc độ di chuyển nhanh hơn.
Dòng điện di thẩm thấu (EOF)
Dòng điện di thẩm thấu (EOF) trong mao quản được hình thành từ lớp điện kép trên thành mao quản và chất điện li bên trong Khi mao quản silica tiếp xúc với dung dịch chất điện li, các nhóm silanol (Si-OH) trên bề mặt có thể deproton hóa thành SiO-, đặc biệt trong môi trường kiềm, tạo điều kiện cho lớp điện kép hình thành Lớp di động bên ngoài mang điện dương sẽ di chuyển về phía cực âm khi có điện thế áp vào hai đầu mao quản, tạo ra dòng EOF Độ lớn của dòng EOF tỉ lệ thuận với lực điện trường E và độ lớn thế ξ, hằng số điện môi, và tỉ lệ nghịch với độ nhớt của pha động điện di, được mô tả bằng công thức: ν EOF = μ EOF.
Trong đó: ε: hằng số điện môi của dung dịch đệm ξ: thế zeta của lớp điện tích kép
Dòng EOF di chuyển từ cực dương sang cực âm, dưới tác dụng của điện trường, cation di chuyển nhanh hơn cùng chiều với dòng EOF, trong khi anion di chuyển chậm hơn ngược chiều Các phần tử trung hòa không bị ảnh hưởng bởi điện trường nên di chuyển với tốc độ tương đương dòng EOF Để đạt hiệu quả tách cao, cần tối ưu hóa cường độ dòng EOF phù hợp với chất phân tích trong quá trình điện di.
1.4.2 Nguyên tắc nhận biết các chất và cấu tạo cơ bản của detector độ dẫn không tiếp xúc
Nghiên cứu này sử dụng detector độ dẫn không tiếp xúc để nhận diện các chất dưới dạng ion, dựa trên khả năng dẫn điện của chúng Các detector này, bao gồm cả loại tiếp xúc và không tiếp xúc, đo dòng điện giữa hai điện cực khi áp một điện thế nhất định Theo định luật Ôm, khi điện thế được áp vào hai điện cực, dung dịch điện ly sẽ tạo ra một trở kháng, cho thấy dung dịch có độ dẫn nhất định Độ dẫn của dung dịch (L) phụ thuộc vào diện tích bề mặt điện cực (A), khoảng cách giữa chúng (l), nồng độ (C) của chất dẫn điện, và độ linh động (λ) của chất dẫn điện trong trường điện từ.
Độ linh động của các ion phụ thuộc vào kích thước và điện tích của chúng, cụ thể là bán kính hydrat hóa Vì vậy, giá trị L sẽ thay đổi dựa trên bản chất của ion cần phân tích và nồng độ của chúng.
Detector độ dẫn không tiếp xúc (C 4 D) là thiết bị đo độ dẫn mà không cần tiếp xúc trực tiếp với dung dịch Thiết bị này bao gồm hai điện cực hình ống đặt xung quanh mao quản, tạo ra khoảng cách xác định để đo thể tích dung dịch Dung dịch giữa hai điện cực hoạt động như một điện trở, trong khi một dòng xoay chiều được áp vào một điện cực Dòng điện này đi qua mao quản và dung dịch điện ly, sau đó được thu nhận, khuyếch đại và xử lý để cho ra tín hiệu chất phân tích Mô hình đo độ dẫn không tiếp xúc và mạch điện tương đương sẽ được trình bày sau đây.
Hình 1.4 Mô hình của đo độ dẫn không tiếp xúc và mạch điện tương đương
A: Không có điện cực nối đất; B: Có điện cực nối đất ngăn cách giữa hai điện cực; a: sơ đồ khối; b: dạng mặt cắt; c: mạch điện tương đương
1.4.3 Các thông số đánh giá trong điện di mao quản
Diện tích pic và độ phân giải là hai yếu tố được xem xét để định lượng trongCE.
Diện tích pic tỷ lệ thuận với nồng độ chất phân tích đi qua detector Từ giá trị diện tích pic, chúng ta có thể xác định nồng độ của chất phân tích có trong mẫu theo công thức 4.
Trong đó: S là diện tích pic thu được; k là hệ số;
C là nồng độ của chất phân tích, trong khi độ phân giải phản ánh khả năng phân tách hai đỉnh gần nhau Độ phân giải được tính toán theo công thức (5) như sau [13]:
Trong nghiên cứu này, ti và tj đại diện cho thời gian lưu của hai chất i và j, với điều kiện ti lớn hơn tj Độ rộng đáy của hai pic chất i và j được ký hiệu là wi và wj Theo lý thuyết, hai pic sẽ được xem là hoàn toàn tách biệt nếu đạt được độ tin cậy nhất định.
Độ phân giải R ≥ 1,5 đạt được 95%, tuy nhiên, trong thực tế, các nhà phân tích thường chấp nhận độ phân giải R > 1,2 cho các phương pháp sắc ký và điện di mao quản.
1.4.4 Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chất
Dung dịch điện di nền
Dung dịch điện di nền (BGE) đóng vai trò quan trọng trong việc tách chất, ảnh hưởng đến tốc độ di chuyển của các ion Điều này được thể hiện qua độ nhớt của dung dịch và khả năng solvat hóa, cụ thể là bán kính hidrat r.
BGE thường được sử dụng làm dung dịch đệm trong môi trường nước, bao gồm một hợp phần acid và một hợp phần bazơ Khi lựa chọn dung dịch điện di nền, cần chú ý đến thành phần, nồng độ và pH của dung dịch Điện thế tách được tạo ra khi áp dụng một hiệu điện thế lớn, khoảng kV, giữa hai đầu mao quản, theo công thức E = V/L, điều này ảnh hưởng trực tiếp đến khả năng tách chất và tín hiệu thu được Hiệu điện thế nhỏ làm chân pic dãn và diện tích pic lớn hơn nhưng thời gian phân tích dài hơn, trong khi hiệu điện thế lớn rút ngắn thời gian phân tích nhưng làm hẹp diện tích pic và có thể gây ra hiệu ứng nhiệt Do đó, độ lớn của hiệu điện thế là yếu tố quan trọng cần xem xét.
Lượng mẫu đi vào mao quản
Lượng mẫu đi vào mao quản có ảnh hưởng lớn đến diện tích và khả năng phân tách các pic trong phân tích Khi lượng mẫu ít, diện tích pic giảm, dẫn đến khả năng phát hiện chất cũng giảm theo Ngược lại, khi lượng mẫu lớn, diện tích pic tăng nhưng độ phân giải lại bị giảm Trong hệ điện di mao quản đơn giản, vận hành bằng tay và sử dụng phương pháp bơm mẫu xi phông, lượng mẫu phụ thuộc chủ yếu vào thời gian bơm mẫu, tuy nhiên, trong phân tích đơn đối tượng, thời gian bơm mẫu thường được giữ cố định.
Cơ sở thiết kế thí nghiệm xác định các hợp chất adenosine,
cordycepin và inosine bằng phương pháp CE-C 4 D
Nguyên tắc đầu tiên trong phân tích bằng CE-C 4 D là chọn lựa BGE phù hợp để chuyển đổi các chất phân tích thành ion mang điện, từ đó thực hiện quá trình điện di và phát hiện Việc lựa chọn BGE, đặc biệt là pH, phụ thuộc vào tính axit-bazo của chất phân tích Adenosine và cordycepin có cấu trúc phân tử tương tự, với pKa lần lượt là 3,6 và 12,4, cho thấy tính chất axit-bazo gần giống nhau Giá trị pKa = 3,6 liên quan đến sự phân li H+ của dạng axit liên hợp do nguyên tử N(1) bị proton hóa, trong khi pKa = 12,4 liên quan đến sự phân li của nhóm -OH ở C(2’) trong gốc đường ribose Các trung tâm axit-bazo khác có pKa < 0 hoặc pKa > 14 không có ý nghĩa trong phân tích CE và không được xem xét.
(1) (C(2')) + H + pKa2 = 12,4 với X là đại diện cho phân tử adenosine và cordycepin.
Inosine có các giá trị pKa là 1,2; 8,9 và 12,5, tương ứng với sự phân li của ion NH+, nhóm -OH do enol hóa ở vị trí C(6) trong vòng hypoxanthine, và nhóm -OH ở vị trí C(2’) trong gốc đường ribose.
Như vậy, các dạng tồn tại chính của các chất phân tích phụ thuộc vào pH của môi trường, cụ thể như sau:
Khoảng pH Dạng tồn tại
3,6 – 8,9 Trung tính Trung tính Trung tính
8,9 – 12,4 Trung tính Trung tính Anion
Để phân tích đồng thời adenosine, cordycepin và inosine trên cùng một kênh, cần chọn BGE có pH < 1,2 hoặc pH > 12,4, nhưng điều này gặp khó khăn do tính khắc nghiệt trong CE và độ dẫn nền lớn khi pH quá thấp hoặc quá cao Do đó, trong nghiên cứu này, adenosine và cordycepin sẽ được phân tích trên cùng một kênh điện di dưới dạng cation với BGE có pH < 3,6, trong khi inosine sẽ được phân tích trên một kênh điện di khác dưới dạng anion với BGE có pH ~ 8,9 Các quy trình thực nghiệm và kết quả khảo sát phân tích đồng thời ba hoạt chất này sẽ được trình bày trong chương 2 và chương 3.
THỰC NGHIỆM
Mục tiêu và nội dung nghiên cứu
Nghiên cứu này tập trung vào việc xây dựng quy trình phân tích đồng thời adenosine, cordycepin và inosine trong thực phẩm chức năng bằng hệ thiết bị điện di mao quản hai kênh xách tay kết hợp với detector đo độ dẫn không tiếp xúc Quy trình này đã được áp dụng để phân tích hàm lượng ba nucleoside trên trong một số mẫu thực phẩm chức năng chứa đông trùng hạ thảo thu thập từ thị trường.
Tổng quan tài liệu về các phương pháp xác định các hoạt chất adenosine, cordycepin và inosine.
Nghiên cứu, khảo sát và tối ưu các điều kiện phân tích adenosine, cordycepin và inosine trên hệ thiết bị CE-C 4 D, bao gồm:
Kênh 1: Phân tích adenosine và cordycepin
- Khảo sát dung dịch điện ly nền.
- Khảo sát điện thế tách.
- Khảo sát dung dịch điện ly nền: loại đệm, pH và nồng độ đệm.
Thẩm định và đánh giá quy trình phân tích adenosine, cordycepin và inosine trên thiết bị CE-C 4 D được thực hiện thông qua các thông số như giới hạn phát hiện (LOD), giới hạn định lượng (LOQ), khoảng tuyến tính, đường chuẩn và độ chính xác (bao gồm độ chụm và độ đúng) Quy trình đã được áp dụng thực tế để phân tích hàm lượng adenosine, cordycepin và inosine trong 8 mẫu sản phẩm đông trùng hạ thảo đang có mặt trên thị trường.
• 3 mẫu khô (M1-M3, xuất xứ Việt Nam),
• 3 viên nang (M4-M6, xuất xứ Việt Nam),
• 2 mẫu lỏng (M7-M8, xuất xứ Hàn Quốc).
Thực hiện phân tích đối chứng bằng phương pháp HPLC-DAD.
Hóa chất và thiết bị
Các hóa chất được sử dụng trong nghiên cứu đều có độ tinh khiết phân tích (
> 99%), được đặt mua từ Sigma-Aldrich (Darmstadt, Đức), ngoại trừ acid lactic từ Xilong Chemical (Guangdong, Trung Quốc) và methanol từ Merk (USA).
Dung dịch chuẩn gốc của adenosine, cordycepin và inosine được pha chế trong dung môi methanol với nồng độ 1000 µg/ml Để tạo ra các dung dịch chuẩn làm việc có nồng độ thấp hơn, cần cân chính xác 50,0 mg từng chất chuẩn vào ba bình định mức 50,0 ml, sau đó thêm khoảng 30 ml MeOH và siêu âm trong 5 phút Tiếp theo, thêm MeOH đủ để đạt vạch định mức, lắc kỹ và bảo quản ở nhiệt độ 2 – 8 °C, sử dụng trong vòng 1 tháng.
Các dung dịch điện ly nền (BGE) được nghiên cứu để phân tích adenosine và cordycepin có tính chất acid, được chuẩn bị từ dung dịch nước của các acid hữu cơ như acid acetic (Ace), acid formic (For), acid lactic (Lac), acid citric (Cit) và acid succinic (Suc).
The study investigates various chemicals used to prepare background electrolyte solutions (BGE) for the analysis of inosine, including Ace, Lac, For, Tris (hydroxymethyl aminomethane), 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MES), 2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid (MOPS), and N-Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid (CHES).
Nước deion được dùng để pha các dung dịch chuẩn và xử lý mẫu, lấy từ máy lọc nước Simplicity UV, Millipore (USA).
2.2.2 Hệ thiết bị điện di mao quản
Hệ thiết bị điện di mao quản hai kênh xách tay, kết hợp với detector đo độ dẫn không tiếp xúc tự chế tạo của Trung tâm Nghiên cứu Công nghệ Môi trường và Phát triển Bền vững (CETASD), thuộc trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, là một thiết bị nhỏ gọn, chỉ nặng khoảng 10 kg Thiết bị này sử dụng nguồn điện một chiều 12V, cho phép người dùng dễ dàng sử dụng cả trong phòng thí nghiệm và ngoài hiện trường.
Hình 2.1 Hệ thiết bị điện di mao quản hai kênh loại xách tay
Hệ dẫn lưu lỏng 2 kênh bao gồm các thành phần chính như bơm màng, van chặn, van chia dòng, vòng mẫu, đường ống dẫn lỏng, khớp nối, vòng đệm cho đường ống, mao quản fused-silica, bình chứa dung dịch bằng nhôm, bình khí nén tạo áp suất và các giao diện dòng chảy kết nối với phần cao thế Sơ đồ cấu tạo và kết nối giữa các thành phần này được thể hiện rõ trong hình 2.2.
Hình 2.2 Sơ đồ cấu tạo của bộ phận dẫn lưu lỏng 2 kênh
Hệ thiết bị này hoạt động bằng cách bơm hút mẫu vào vòng mẫu, sau đó áp lực khí nén đẩy dung dịch đệm qua vòng mẫu, giúp mẫu di chuyển tới đầu vào của giao diện nối đất Giao diện này có một đầu vào cho dòng mẫu lỏng và hai đầu ra: một cho dòng lỏng vào mao quản và một cho dòng lỏng tiếp xúc với đầu điện cực nối đất, qua van kim chia dòng trước khi thải ra ngoài Trong giai đoạn bơm mẫu, một phần mẫu sẽ đi vào mao quản nhờ áp lực khí nén, trong khi phần còn lại sẽ được thải ra qua van chia dòng.
Cả hai mô-đun CE và C4D đều hoạt động với nguồn 12 V, sử dụng pin hoặc bộ chuyển đổi 220 VAC thành 12 VDC Mao quản sử dụng là loại fused-silica có đường kính trong 50 µm và lớp phủ polyamide bên ngoài có đường kính 365 µm (Polymicro, Phoenix, AZ, Hoa Kỳ) Mao quản được kích hoạt lại vào đầu mỗi ngày làm việc hoặc sau mỗi lần thay đổi BGE bằng cách đẩy dung dịch NaOH 1 M qua trong 10 phút, tiếp theo là nước deion trong 10 phút Trước mỗi lần phân tích, mao quản được rửa bằng BGE trong 5 phút.
2.2.3 Thiết bị và dụng cụ phụ trợ
Thiết bị sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối detector mảng diod (HPLC- DAD) của hãng Shimadzu. Điện cực đo pH và độ dẫn hiện trường, Hach.
Cân phân tích 4 số, Shimadzu, Nhật bản.
Máy siêu âm Elma D-78224 Singen/HTW, Đức.
Micropipet và đầu tip với cỏc cỡ khỏc nhau: 10, 100, 200, 1000 và 5000 àL, Ependoff.
Các bình định mức thủy tinh (Đức) 10, 25, 50 và 100 mL được sử dụng để pha các dung dịch gốc, các dung dịch đệm.
Các lọ thủy tinh 20 mL đựng các dung dịch chuẩn.
Thìa cân và thuyền cân phục vụ cân mẫu.
Máy lắc Vortex Mixer KMC 1300 V, 3000 vòng/phút, Hàn Quốc.
8 sản phẩm đông trùng hạ thảo, gồm 3 mẫu khô (S1-S3, xuất xứ Việt Nam),
Ba viên nang (S4-S6, xuất xứ Việt Nam) và hai mẫu lỏng (S7-S8, xuất xứ Hàn Quốc) được thu thập từ các cửa hàng khác nhau tại Việt Nam Các mẫu khô được nghiền mịn trước khi cân để tạo thành hỗn hợp đồng nhất Đối với viên nang, bột bên trong được thu thập và trộn đều, sau đó cân khoảng 0,5 gram và hòa tan trong 20 mL methanol Các dung dịch này được siêu âm trong 15 phút, ly tâm ở tốc độ 1500 vòng/phút trong 15 phút, và lọc qua màng PTFE 0,2 µm trước khi phân tích bằng thiết bị CE hoặc HPLC Đối với các mẫu lỏng, chúng được lọc qua màng 0,2 µm và pha loãng bằng nước methanol nếu cần, trước khi tiến hành phân tích bằng CE-C 4 D.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Khảo sát điều kiện phân tích adenosine và cordycepin trên kênh 1
2.3.1.1 Khảo sát lựa chọn BGE
Nghiên cứu đã khảo sát khả năng phân tách adenosine và cordycepin bằng cách sử dụng các BGE với nồng độ 0,5 M của năm acid Ace, For, Lac, Cit và Suc Tiếp theo, các thành phần acid trong BGE đã được kiểm tra để xác định tín hiệu pic và độ phân giải tốt nhất ở các nồng độ khác nhau trong khoảng 0,05 – 2,0 M nhằm tìm ra nồng độ tối ưu Các điều kiện điện di được duy trì ổn định với thời gian bơm mẫu 30 giây, mao quản fused-silica có đường kính 50 µm, chiều dài tổng cộng 60 cm và chiều dài hiệu dụng 49 cm, cùng với điện thế tách -17 kV.
2.3.1.2 Khảo sát điện thế tách
Sau khi xác định được BGE phù hợp cho việc phân tách đồng thời adenosine và cordycepin, nghiên cứu tiếp theo tập trung vào điện thế tách, với khoảng biến đổi từ -14 kV đến -19 kV và bước nhảy -1 kV Các điều kiện điện di được giữ cố định bao gồm thời gian bơm mẫu là 30 giây, sử dụng mao quản fused-silica có đường kính 50 µm và chiều dài tổng cộng 60 cm.
2.3.2 Khảo sát điều kiện phân tích inosine trên kênh 2
Nghiên cứu quy trình phân tách Inosine đã lựa chọn một số loại BGE, bao gồm dung dịch Tris 50 mM với pH 9,0 kết hợp với các chất như MES, MOPS, CHES, acid acetic, acid formic và acid lactic Sau khi xác định được thành phần BGE phù hợp, nghiên cứu tiếp tục với sự thay đổi nồng độ và pH trong khoảng 20 – 175 mM và 8,5 – 9,5 Đồng thời, ảnh hưởng của các pic chất lạ trên mẫu thực cũng được khảo sát với sự thay đổi nồng độ Tris Các điều kiện điện di được giữ cố định với thời gian bơm mẫu 30 giây, mao quản fused-silica có đường kính 50 µm, chiều dài tổng 80 cm, chiều dài hiệu dụng 69 cm, và điện thế tách là -17 kV.
Xác định các thông số đánh giá phương pháp phân tích
2.4.1 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)
IDL được xác định bằng cách phân tích nồng độ chất chuẩn tại tín hiệu nhỏ nhất có thể thu được, với nồng độ C1 và chiều cao pic tín hiệu H1 Nhiễu nền có chiều cao Hnền, và IDL được tính theo công thức: IDL = (3Hnền x C1) / H1 IQL được xác định theo tỉ số IQL/IDL là 10/3 MDL được tính toán dựa trên IDL và hệ số chuyển đổi trong quá trình xử lý mẫu.
2.4.2 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng tuyến tính được xác định bằng cách đo mẫu chuẩn với nồng độ tăng dần cho đến khi giá trị nồng độ cao nhất không còn thể hiện mối quan hệ tuyến tính tốt với các điểm nồng độ thấp hơn, thể hiện qua chỉ số R² nhỏ hơn 0,995.
Dựa vào khoảng tuyến tính và nhu cầu thực tế trong phân tích mẫu môi trường, đường chuẩn được xây dựng với khoảng đường chuẩn thích hợp Phương trình của đường chuẩn có dạng y = ax + b, trong đó y là diện tích pic và x là nồng độ Các thông số đánh giá cho đường chuẩn thường được sử dụng để đảm bảo độ chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích.
- Đánh giá độ tuyến tính của đường chuẩn quan hệ số tương quan tuyến tính
- Đánh giá độ đúng đường chuẩn qua hiệu suất thu hồi.
2.4.3 Độ chính xác của phương pháp Độ chính xác thể hiện mức độ phân tán kết quả giữa một loạt phép đo từ nhiều lần tiến hành phân tích trên cùng một mẫu thử đồng nhất dưới những điều kiện xác định Độ chính xác bao gồm độ chụm và độ đúng.
2.4.3.1 Độ chụm Độ chụm là mức độ gần nhau giữa các kết quả thử nghiệm độc lập nhận được trong điều kiện quy định Thước đo độ chụm thường được thể hiện bằng độ phân tán và được tính toán như là độ lệch chuẩn (RSD) của các kết quả thử nghiệm Độ
Độ chụm của phương pháp phân tích được đánh giá qua độ lặp lại và độ tái lặp lại, với độ lặp lại phản ánh độ chính xác trong cùng điều kiện thí nghiệm trong thời gian ngắn Độ lặp lại thường được xác định bằng độ lệch chuẩn tương đối (RSD); RSD càng lớn, sai khác giữa các kết quả phân tích càng cao, dẫn đến sai số lớn trong phép phân tích Để xác định độ lặp lại, RSD (%) được tính khi phân tích lặp 11 lần mẫu chuẩn có nồng độ 20 mg/L Ngược lại, độ tái lặp lại đo lường độ sai lệch giữa các giá trị riêng lẻ và giá trị trung bình trong các điều kiện thí nghiệm giống nhau qua nhiều ngày Độ tái lặp lại cũng được xác định thông qua RSD; RSD lớn cho thấy sự sai khác cao giữa các kết quả phân tích trong các ngày liên tiếp, làm tăng sai số trong phép phân tích Độ tái lặp lại được tính bằng RSD (%) khi phân tích tái lặp 7 ngày mẫu chuẩn có nồng độ 20 mg/L.
Trong đó: RSD: độ lệch chuẩn tương đối
SD: độ lệch chuẩn x : giá trị trung bình xi: giá trị đo được n: số thí nghiệm được thực hiện hoặc số ngày thực hiện
2.4.3.2 Độ đúng của phương pháp Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của dãy lớn các kết quả thí nghiệm và các giá trị quy chiếu được chấp nhận Do đó, độ đúng thường đánh giá qua sai số tương đối hay bằng cách xác định hiệu suất thu hồi Hiệu suất thu hồi được tính theo công thức (7) khi phân tích mẫu thêm chuẩn (là mẫu thực được thêm chuẩn nồng độ xác định).
C c ⋅100% (7) Trong đó: Cm+c: Nồng độ trong mẫu thêm chuẩn
Cm: Nồng độ trong mẫu
Cc: Nồng độ chuẩn thêm
Để tiến hành phân tích mẫu, cần cân chính xác lượng mẫu thử vào ống ly tâm cho mẫu rắn và bình định mức cho mẫu lỏng, sau đó thêm lượng chuẩn hỗn hợp phù hợp để đảm bảo tổng hàm lượng mỗi chất nằm trong khoảng tuyến tính Tiếp theo, thêm dung môi và thực hiện chiết mẫu theo quy trình đã thiết lập Nên tiến hành ở 3 mức nồng độ khác nhau, mỗi mức thực hiện 3 lần Độ chính xác được xác định dựa trên hiệu suất thu hồi lượng chuẩn so với lượng chuẩn đã thêm vào.
Áp dụng phân tích mẫu thực
Mẫu thực được thu thập từ thị trường và chuẩn bị trong phòng thí nghiệm, sau đó dịch chiết được phân tích trên hệ CE-C 4 D với các điều kiện tối ưu Bên cạnh đó, một phần mẫu cũng được phân tích đối chứng bằng phương pháp HPLC-DAD Các điều kiện phân tích trên thiết bị HPLC-DAD sử dụng cột C18 Shim-pack VP-ODS với kích thước 4,6 mm i.d x 150 mm và kích thước hạt 4,6 µm, nhiệt độ lũ cột được duy trì ở 38 °C, với pha động là dung dịch amoni acetat 2.
M trong nước) và pha B (methanol 100%), tốc độ dòng 1 ml/phút; detector dãy diot quang với bước súng lựa chọn là 254 nm; thể tớch bơm mẫu 10 àL [24].
Xử lý số liệu
Dữ liệu thu thập từ detector được ghi nhận và các thông số như diện tích pic và thời gian di chuyển được phân tích bằng phần mềm Chart v5 của eDAQ Để minh họa các điện di đồ, phần mềm Igor Pro v8 được sử dụng, trong khi Microsoft Excel hỗ trợ việc tạo biểu đồ và thực hiện các tính toán khác.
Sau khi xác định nồng độ các chất cần phân tích trong dịch chiết bơm vào thiết bị điện di, hàm lượng các chất trong mẫu khô và viên nang sẽ được tính toán dựa trên nồng độ đã đo và lượng mẫu sử dụng trong quá trình xử lý.