NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
NGUYÊN LIỆU
Nguyên liệu nghiên cứu của đề tài là loài rong Sargassum polycystum và Sargassum oligocystum đƣợc thu hái ở biển Nha Trang.
HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ
Các loại hóa chất như cồn 96º, thuốc thử Folin-Ciocalteu, Na2CO3, CCl3COOH, FeCl3, K3[Fe(CN)6], nước cất 2 lần, H2SO4, sodium phosphate và ammonium molybdate đều là những hóa chất tinh khiết, đạt tiêu chuẩn phân tích, được sản xuất bởi Merck (Đức) hoặc các nhà sản xuất tại Trung Quốc.
Trong quá trình thí nghiệm, các thiết bị cần thiết bao gồm cân phân tích, máy so màu UV-VIS, ống nghiệm, cốc thủy tinh, bình tam giác, ống đong, phễu lọc, pipet, micro pipet, bể ổn nhiệt và quì tím Những dụng cụ này đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo độ chính xác và hiệu quả của các phép đo và phân tích hóa học.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1.1 Định lƣợng hàm lƣợng phlorotannin Định lượng phlorotannin tổng số theo phương pháp Folin-Ciocateu như mô tả bởi Singleton và cộng sự (1999) Lấy 100àl mẫu với 900àl nước cất cộng thờm 1ml Folin- Ciocalteus đã đƣợc pha loãng đến nồng dộ 10% vào ống nghiệm, giữ trong 5 phút
Tiếp theo, thêm vào 2ml Na 2 CO 3 10% trộn đều và giữ trong 90 phút trong bóng tối, sau đó đo độ hấp thụ ở bước sóng 750nm (Phụ lục 3)
3.3.1.2 Xác định hoạt tính chống oxy hóa tổng
Chống oxy hóa tổng được xác định theo phương pháp của Prieto (1999) Lấy 100àl mẫu bổ sung 900àl nước cất và thờm 3ml dung dịch A (H 2 SO 4 0,6M, sodium
31 phosphate 28mM và ammonium Molybdate 4mM) Hỗn hợp đƣợc giữ 90 phút ở 950C.Sau đó đo ở bước sóng 695nm với chất chuẩn là acid ascorbic
3.3.1.3 Xác định hoạt tính khử sắt
Hoạt tính khử sắt được xác định theo phương pháp của Zhu và cộng sự (2002) bằng cách lấy 500µl mẫu, bổ sung 0,5ml đệm phosphate (pH 7,2) và 0,2ml K3[Fe(CN)6] 1% Hỗn hợp này được giữ ở 50ºC trong 20 phút, sau đó thêm 500µl CCl3COOH 10%, 300µl nước cất và 80µl FeCl3 0,1% Cuối cùng, hoạt tính khử sắt được đo ở bước sóng 655nm với chất chuẩn là FeSO4.
3.3.2.1 Bố trí thí nghiệm tổng quát
Rong Nâu sau khi thu nhận sẽ được làm sạch bằng nước biển để loại bỏ tạp chất như đất và cát Sau đó, chúng sẽ được định danh bởi các chuyên gia phân loại học và tiến hành sấy hoặc phơi khô.
Mục đích của việc phơi rong khô là giảm hàm lượng ẩm, giúp ức chế sự phát triển của vi sinh vật và ngăn chặn quá trình tổng hợp, chuyển hóa trong rong Điều này không chỉ bảo quản rong tốt hơn mà còn đảm bảo nguồn nguyên liệu không bị gián đoạn Hơn nữa, khi hàm ẩm giảm, tốc độ trích ly tăng lên do nước không còn cản trở sự thẩm thấu của dung môi vào nguyên liệu, từ đó làm tăng hiệu quả khuếch tán.
Công đoạn chiết phlorotannin chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như thời gian, tỷ lệ dung môi/nguyên liệu, enzyme, pH và nhiệt độ Những yếu tố này tác động đến khả năng chiết rút phlorotannin, do đó, cần tiến hành các thí nghiệm để khảo sát ảnh hưởng của chúng Dung môi chiết tách được sử dụng là ethanol phân cực và nước cất.
Lọc:thu nhận dịch chiết có chứa hợp chất cần thiết, tách phần bã rong ra khỏi dịch ngâm chiết
Sau khi tiến hành lọc, dịch chiết sẽ được phân tích để xác định hàm lượng phlorotannin, khả năng chống oxy hóa tổng thể và tính khử sắt, nhằm tìm ra các thông số tối ưu cho quá trình chiết xuất Đồng thời, phần bã sẽ được khảo sát tế bào lá và thân để đánh giá sự thay đổi về hình thái tế bào.
* Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát nhằm khảo sát tác động của các điều kiện lý hóa sinh đến hình thái tế bào, hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa Nghiên cứu này sẽ giúp hiểu rõ hơn về mối liên hệ giữa các yếu tố môi trường và sự phát triển của tế bào cũng như khả năng chống oxy hóa của chúng.
Quan sát tế bào lá và thân Đánh giá
Hàm lượng phlorotannin có vai trò quan trọng trong hoạt tính chống oxy hóa và khả năng khử sắt Nghiên cứu này đánh giá tác động của các điều kiện lý hóa sinh đến hình thái tế bào, từ đó xác định mối liên hệ giữa hàm lượng phlorotannin và các hoạt tính sinh học này.
3.3.2.2 Khảo sát tác động của yếu tố vật lý (thời gian) lên hình thái tế bào, hàm lƣợng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa
* Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 3.2: Khảo sát hình thái tế bào, hàm lƣợng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa dưới tác động của yếu tố vật lý (thời gian)
Hai loại rong nâu Sagarrsum oligocystum và Sagarrsum polycystum đƣợc chiết trong nước ở nhiệt độ phòng theo tỉ lệ dung môi và nguyên liệu là 40/1 (v/w) trong thời
1 giờ 2 giờ 3 giờ 5 giờ 8 giờ 12 giờ 24 giờ
Quan sát tế bào lá và thân Đánh giá
Hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa được đánh giá dưới tác động của các yếu tố vật lý, đặc biệt là thời gian Hoạt tính khử sắt cũng được xem xét trong nghiên cứu này, nhằm hiểu rõ hơn về mối liên hệ giữa các yếu tố này và hình thái tế bào.
Trong nghiên cứu, 34 gian đã được lựa chọn để thực hiện thí nghiệm Sau đó, quá trình lọc và dịch chiết được tiến hành nhằm đánh giá hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa Đồng thời, rong được cắt lát để đánh giá hình thái tế bào.
3.3.2.3 Khảo sát tác động của yếu tố vật lý (nhiệt độ) và yếu tố sinh học (enzyme) lên hình thái tế bào, hàm lƣợng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa
*Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Hình 3.3.Khảo sát sự tác động của yếu tố nhiệt độ và enzyme lên hình thái tế bào, hàm lƣợng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa
Quan sát tế bào lá và thân Đánh giá
Nghiên cứu này đánh giá ảnh hưởng của nhiệt độ và enzyme đối với hình thái tế bào, hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa tổng Kết quả cho thấy hoạt tính khử sắt cũng như hàm lượng phlorotannin có sự thay đổi đáng kể dưới tác động của các yếu tố này.
Rong sau chiết Dịch chiết
Mục đích: Đánh giá đƣợc sự tác động của điều kiện vật lý (nhiệt độ) và yếu tố sinh học
(enzyme) lên hình thái tế bào, hàm lƣợng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa
Hai loại rong nâu Sagarrsum oligocystum và Sagarrsum polycystum được chiết xuất trong đệm phosphate (pH 7,2) với các enzyme và nhiệt độ khác nhau theo tỷ lệ dung môi và nguyên liệu là 40/1 (v/w) trong thời gian 4 giờ Sau quá trình chiết, dịch chiết được lọc và đánh giá hàm lượng phlorotannin cùng hoạt tính chống oxy hóa, trong khi rong được cắt lát để phân tích hình thái tế bào Mỗi enzyme được thử nghiệm ở 4 nhiệt độ khác nhau.
3.3.2.4 Khảo sát tác động của yếu tố vật lý (tỷ lệ dung môi nguyên liệu) và yếu tố hóa học (ethanol) lên hình thái tế bào, hàm lƣợng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa
Mục đích của nghiên cứu này là đánh giá tác động của các yếu tố vật lý, bao gồm tỷ lệ dung môi nguyên liệu khác nhau, cùng với yếu tố hóa học như ethanol, lên hình thái tế bào, hàm lượng phlorotannin và hoạt tính chống oxy hóa.
