Xây dựng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ định lượng risperidon trong huyết tương người

TỔNG QUAN

Risperidon

1.1.1 Công thức cấu tạo và tính chất lý hóa

Hình 1.1 Công thức cấu tạo của RPD

3-[2-[4-(6-fluoro-1,2-benzisoxazol-3-yl)piperidin-1-yl]ethyl]-2-methyl-6,7,8,9- tetrahydro-4H-pyrido[1,2-a]pyrimidin-4-one

– Công thức phân tử: C 23 H 27 FN 4 O 2

– Khối lượng phân tử: 410,5 g/mol [1],[19]

– Bột kết tinh màu trắng hoặc gần trắng

– Nhiệt độ nóng chảy khoảng 170 o C

– Tan ít trong nước, rất tan trong methanol, acid hydrocloric 0,1M và methylen clorid

– Có tính base yếu: pKa = 8,76

– Hệ số phân bố octan/nước: log P = 3,47 [1],[28]

1.1.2 Tác dụng dược lý và cơ chế tác dụng

RPD là một loại thuốc chống loạn thần không điển hình thuộc thế hệ thứ hai, có khả năng đối kháng chọn lọc với thụ thể serotonin typ 2 (5-HT2) và dopamin.

RPD tương tác với thụ thể adrenergic alpha1 và có mức độ liên kết thấp hơn với thụ thể histamin H1 cùng thụ thể adrenergic alpha2, trong khi không có sự ái lực với thụ thể cholinergic.

Cơ chế tác dụng chống loạn thần của thuốc RPD vẫn chưa được hiểu rõ, nhưng được cho là phức tạp hơn so với nhiều thuốc chống loạn thần khác Một số tác dụng mạnh của RPD có thể bù đắp cho hoạt tính đối kháng D2, tạo ra tính chất "không điển hình" của thuốc Nghiên cứu cho thấy RPD hiệu quả hơn haloperidol trong việc ngăn chặn tái phát ở bệnh nhân ngoại trú sau ít nhất 1 năm điều trị Đặc biệt, RPD rất hữu ích cho những bệnh nhân đã sử dụng thuốc chống loạn thần điển hình và gặp phải phản ứng ngoại tháp, vì loại thuốc này ít gây ra phản ứng này hơn.

1.1.3 Chỉ định, chống chỉ định và thận trọng khi sử dụng

Điều trị tâm thần phân liệt dành cho người lớn và thanh thiếu niên từ 13 đến 17 tuổi Ngoài ra, điều trị ngắn hạn cho các cơn hưng cảm cấp tính hoặc hỗn hợp liên quan đến rối loạn lưỡng cực ở người lớn, trẻ em và thanh thiếu niên từ 10 đến 17 tuổi cũng rất quan trọng Bên cạnh đó, bệnh tự kỷ kèm theo rối loạn hành vi ở trẻ em từ 5 đến 11 tuổi cần được chú ý và điều trị kịp thời.

Người bệnh dùng quá liều barbiturat, chế phẩm có chất gây nghiện hoặc rượu và người có tiền sử mẫn cảm với các thành phần của thuốc [3]

Khi vận hành máy móc nguy hiểm, bao gồm cả xe gắn động cơ, RPD có thể gây rối loạn khả năng phán đoán, suy nghĩ và kỹ năng vận động Điều này làm tăng nguy cơ tai nạn và ảnh hưởng đến an toàn trong quá trình làm việc.

– Người đái tháo đường hoặc người có nhiều nguy cơ bị đái tháo đường

– Người bị hội chứng Parkinson, người có tiền sử co giật

– Người cao tuổi bị mất trí nhớ vì thuốc có thể tăng nguy cơ gây đột quỵ

– Khi sử dụng thuốc cho trẻ em, phải theo dõi cân nặng vì thuốc làm tăng tiết prolactin [3],[20]

1.1.4 Đặc tính dược động học của RPD

RPD có khả năng hấp thu tốt khi uống, với thức ăn không làm ảnh hưởng đến tốc độ và mức độ hấp thu của thuốc Nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt được sau 1 giờ uống RPD Sinh khả dụng đường uống của RPD khoảng 66 ± 28% ở người có chuyển hóa mạnh, và cao hơn ở những người có chuyển hóa yếu.

– Phân bố: Tỷ lệ gắn với protein huyết tương của thuốc khoảng 89% và thể tích phân bố là 1 – 2 lít/kg [3]

RPD được chuyển hóa chủ yếu thành 9-hydroxy-RPD tại gan nhờ enzym CYP2D6 và một phần nhờ CYP3A4, chất này có hoạt tính gắn với thụ thể tương tự như RPD Thời gian bán thải của RPD khoảng 3 giờ, trong khi 9-hydroxy-RPD có thời gian bán thải khoảng 20 giờ Thuốc được đào thải chủ yếu qua nước tiểu và một phần nhỏ qua phân.

– Kết quả xác định các thông số dược động học của RPD trong một số nghiên cứu trên thế giới được trình bày trong Bảng 1.1:

Bảng 1.1 Các thông số dược động học của RPD

STT Thiết kế nghiên cứu

(-): Không xác định; ( a ): Dữ liệu của thuốc đối chiếu; ( b ): Dữ liệu của thuốc thử

Dữ liệu báo cáo là giá trị trung bình và độ lệch chuẩn tương đối

Các thông số dược động học của RPD cho thấy sau khi uống viên nén RPD 2 mg, nồng độ tối đa (C max) trong huyết tương dao động từ 12 đến 17 ng/mL Do đó, phương pháp định lượng RPD trong mẫu huyết tương cần có giới hạn định lượng dưới 0,5 ng/mL (tương đương khoảng 1/30 – 1/20 Cmax) và giới hạn trên của đường chuẩn khoảng 50 ng/mL (khoảng 2 – 3 lần C max).

1.1.5 Một số phương pháp định lượng RPD

Phân tử RPD chứa vòng thơm benzen hấp thụ ánh sáng tử ngoại và nhóm amin bậc 3 có tính base yếu, cho phép định lượng bằng phương pháp quang phổ UV, chuẩn độ môi trường khan hoặc HPLC với đầu dò UV, ECD Các phương pháp này sử dụng thiết bị phổ biến, có độ lặp lại cao và thích hợp cho định lượng RPD trong các mẫu tương đối tinh khiết như nguyên liệu hoặc chế phẩm thuốc Tuy nhiên, để định lượng thuốc có nồng độ thấp trong mẫu huyết tương, kỹ thuật sắc ký lỏng ghép nối khối phổ tỏ ra vượt trội hơn Một số phương pháp định lượng RPD trong huyết tương đã được công bố trên thế giới như thể hiện trong Bảng 1.2.

Bảng 1.2 Một số phương pháp định lượng RPD trong huyết tương

STT Phương pháp xử lý mẫu Điều kiện sắc ký LLOQ

– Kiềm hoá bằng natri borat 0,05 M, chiết bằng ethyl acetat, chiết lại bằng H 2 SO 4

0,05 M, kiềm hóa và chiết bằng heptan – isoamyl alcol (90:10)

- Pha động: Nước – MeCN – diethyl amin (65:35:0,02)

- Thời gian phân tích: 10 phút

MeCN, kiềm hóa bằng dung dịch

NaOH 1M, chiết bằng carbon tetraclorid

- Pha động: dung dịch KH 2 PO 4 0,1 M pH 3,3 – MeCN (75:25)

- Thời gian phân tích: 4 phút

– Chiết bằng methyl tert-butyl ether

- Pha động: MeCN – amoni acetat 5 mM (50:50)

- Pha động: acid formic 0,1% – MeCN (40:60)

- Thời gian phân tích: 3 phút

- Pha động: dung dịch amoni acetat 10 mM chứa 0,1% acid formic – MeCN (50:50)

- Thời gian phân tích: 3 phút

- Pha động: dung dịch amoni acetat 10 mM pH 4,6 – MeCN (40:60)

- Thời gian phân tích: 3 phút

- Pha động: dung dịch amoni acetat 5 mM – MeCN (20:80) chứa 0,1% acid formic

- Thời gian phân tích: 2 phút

Phương pháp 1 và 2 sử dụng detector DAD có độ nhạy thấp và LLOQ cao, dẫn đến quy trình xử lý mẫu phức tạp qua nhiều giai đoạn Thời gian phân tích kéo dài và việc sử dụng nhiều dung môi độc hại làm cho các phương pháp này không phù hợp cho việc phân tích liên tục nhiều mẫu thử trong đánh giá tương đương sinh học.

Phương pháp 3 áp dụng kỹ thuật chiết lỏng – lỏng với dung môi methyl tert-butyl ether, mang lại quy trình chiết dễ thực hiện và mẫu tinh khiết hơn Quá trình bốc hơi dung môi giúp làm giàu mẫu, từ đó tăng LLOQ của phương pháp Sử dụng đồng vị RPD làm chất chuẩn nội, phương pháp này có nhiều ưu điểm trong sắc ký lỏng khối phổ nhờ tính chất lý hóa tương đồng với chất phân tích, chỉ khác nhau về số khối, giúp giảm sai số và hiện tượng khử ion trong phân tích Tuy nhiên, chi phí cao của phương pháp này có thể làm tăng tổng chi phí nghiên cứu.

Các phương pháp 4, 5, 6 và 7 sử dụng kỹ thuật tủa protein trong xử lý mẫu huyết tương mang lại nhiều ưu điểm như tính đơn giản, dễ thực hiện, độ thu hồi và độ lặp lại cao, đồng thời chỉ cần sử dụng lượng huyết tương rất nhỏ Thời gian phân tích ngắn giúp phù hợp cho việc phân tích nhiều mẫu liên tục trong nghiên cứu sinh khả dụng (SKD) và đánh giá tác động sinh học (TĐSH) Tuy nhiên, việc pha loãng mẫu thử có thể làm giảm giới hạn phát hiện thấp nhất (LLOQ) của phương pháp Đáng lưu ý, tại Việt Nam, hiện chưa có nghiên cứu nào công bố về định lượng RPD trong huyết tương.

Phân tích thuốc trong dịch sinh học

Phân tích thuốc trong dịch sinh học là quá trình định tính và định lượng các chất quan trọng nhằm phục vụ cho nhiều mục đích khác nhau, bao gồm nghiên cứu và phát triển thuốc mới, nghiên cứu dược động học, đánh giá tương đương sinh học, theo dõi nồng độ thuốc trong điều trị và nghiên cứu về đa hình gen.

1.2.1 Thành phần và đặc điểm của huyết tương người

Trong cơ thể người, có nhiều loại dịch sinh học với thành phần khác nhau, chẳng hạn như huyết tương chứa nhiều protein, nước tiểu chiếm 98% là nước, và sữa mẹ giàu chất béo Việc xây dựng các phương pháp xử lý và bảo quản riêng cho từng loại mẫu thử là rất cần thiết Hiểu rõ thành phần và đặc điểm của từng mẫu sẽ hỗ trợ các nhà nghiên cứu trong việc phát triển các kỹ thuật xử lý và đo lường hiệu quả hơn.

Máu toàn phần của con người là một hỗn hợp không đồng nhất, bao gồm hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu và một số tế bào nhỏ khác, tất cả đều được hòa trộn trong huyết tương.

Tổng thể tích tế bào máu chiếm khoảng 45%, trong đó hồng cầu chiếm 44%, trong khi thể tích huyết tương khoảng 55% Độ pH của huyết tương duy trì ở mức khoảng 7,4, với phạm vi hẹp từ 7,35 đến 7,43 nhờ khả năng đệm tốt Nồng độ của các chất phân tích có thể thay đổi đáng kể giữa huyết tương, hồng cầu và máu đã ly giải từ cùng một mẫu máu.

Hình 1.2 Máu toàn phần sau khi ly tâm

Huyết tương chiếm khoảng 90% là nước, 2% là các ion vô cơ hoặc hữu cơ và 8% là protein, bao gồm 80% albumin, 16% globulin và 4% fibrinogen cùng một số enzym nhỏ Thường có màu vàng trong suốt, huyết tương có thể chuyển sang màu hồng hoặc đỏ nếu xảy ra quá trình tan huyết Để ổn định huyết tương, các chất chống đông máu như citrat, EDTA hoặc oxalat được sử dụng Huyết tương được thu thập từ máu toàn phần, ly tâm để lấy phần dịch trong và bảo quản ở nhiệt độ từ -20°C đến -80°C.

1.2.2 Kỹ thuật xử lý mẫu

Phân tích thuốc trong dịch sinh học gặp nhiều khó khăn do nồng độ các chất cần phân tích rất nhỏ và nền mẫu phức tạp Do đó, việc định lượng trực tiếp từ mẫu máu là không khả thi; cần phải thực hiện các bước chiết tách và xử lý để loại bỏ tạp chất và làm giàu mẫu Hiện nay, ba kỹ thuật chính được áp dụng để xử lý mẫu dịch sinh học là tủa protein, chiết lỏng-lỏng và chiết pha rắn.

Dịch sinh học được sử dụng phổ biến nhất để phân tích là huyết tương Huyết tương chứa khoảng 8% (w/w) protein, như đã thảo luận trong mục 1.2.1.2

Tiêm huyết tương trực tiếp vào thiết bị sắc ký hoặc các dụng cụ phân tích khác không được khuyến khích, vì các protein trong huyết tương có thể dễ dàng kết tủa khi tiếp xúc với dung môi hữu cơ hoặc muối đệm trong pha động Điều này có thể ảnh hưởng tiêu cực đến tuổi thọ của cột sắc ký và thiết bị phân tích.

Tác nhân gây tủa protein thường sử dụng bao gồm các loại acid như acid tricloroacetic và acid percloric, cùng với dung môi hữu cơ như acetonitril, aceton, ethanol và methanol, cũng như các muối vô cơ như (NH4)2SO4 và NaCl Hiệu suất kết tủa của một số chất khi thêm các thể tích khác nhau vào 1 mL huyết tương được trình bày chi tiết trong Bảng 1.3 [12],[24].

Bảng 1.3 Hiệu suất của một số chất gây tủa protein

% Protein bị kết tủa Thể tích 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,5 2,0 3,0 4,0

Acetonitril 13,4 14,8 45,8 88,1 97,2 99,4 99,7 99,8 99,8 Aceton 1,5 7,4 33,6 71,0 96,2 99,1 99,4 99,2 99,1 Ethanol 10,0 11,2 41,7 74,8 91,4 96,3 98,3 99,1 99,3 Methanol 17,6 17,4 32,2 49,3 73,4 97,9 98,7 98,9 99,2 Acid tricloroacetic

Kỹ thuật tủa protein mang lại nhiều ưu điểm như tính đơn giản, tiết kiệm dung môi và chi phí Phương pháp này có độ lặp lại và thu hồi cao, thời gian xử lý mẫu ngắn, và dễ dàng áp dụng cho nhiều mẫu trong nghiên cứu SKD và TĐSH Trong thực tế, để xử lý mẫu huyết tương cho LC-MS/MS, kỹ thuật tủa protein bằng dung môi hữu cơ thường được sử dụng Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp này là mẫu thử có thể bị pha loãng và chưa đạt độ tinh khiết, vẫn còn chứa nhiều tạp chất.

1.2.2.2 Kỹ thuật chiết lỏng – lỏng

Chiết lỏng là phương pháp phổ biến trong phân tích thuốc trong dịch sinh học, giúp chuyển các chất phân tích sang dung môi hữu cơ phù hợp, trong khi giữ lại hầu hết các thành phần nền trong pha nước Kỹ thuật này mang lại mẫu thử có độ tinh khiết cao, đặc biệt hiệu quả cho các chất phân tích có độ phân cực thấp, ít tan trong nước và dễ tan trong dung môi hữu cơ.

Khi chọn dung môi chiết cho một chất phân tích, cấu trúc phân tử của chất là yếu tố chính, nhưng còn nhiều yếu tố khác cần xem xét Đầu tiên, dung môi cần không hòa trộn với nước, với chỉ số phân cực từ 4 – 5 trở xuống Thứ hai, dung môi phải dễ bay hơi, đặc biệt khi cần bốc hơi và hòa tan lại trong dung môi khác Thứ ba, dung môi nên nhẹ hơn nước để tạo thành lớp trên sau khi tách pha, thuận tiện cho việc thu thập mẫu Cuối cùng, dung môi phải an toàn cho con người và môi trường; ví dụ, cần hạn chế diethyl ether do nguy cơ tạo peroxit dễ cháy nổ, tránh 1-octanol vì khó bay hơi, không sử dụng benzen vì nguy cơ ung thư, và tránh cloroform do độc tính.

Thay vì sử dụng một dung môi tinh khiết, việc áp dụng hỗn hợp hai hoặc nhiều dung môi có thể mang lại lợi ích Bằng cách kết hợp các dung môi khác nhau, độ phân cực có thể được điều chỉnh linh hoạt, từ đó nâng cao hiệu suất chiết xuất.

pH của mẫu thử có ảnh hưởng lớn đến khả năng thu hồi các chất phân tích acid hoặc base Để đạt hiệu quả tối ưu, pH nên thấp hơn ít nhất hai đơn vị so với pKa của chất phân tích acid và cao hơn ít nhất hai đơn vị đối với chất phân tích base Tuy nhiên, nếu pH quá acid hoặc kiềm, có thể dẫn đến sự phân hủy của chất phân tích và kết tủa các thành phần nền, gây thất bại trong quá trình chiết xuất.

1.2.2.3 Kỹ thuật chiết pha rắn

Kỹ thuật chiết pha rắn, phát triển từ các nguyên tắc tách sắc ký, bao gồm bốn giai đoạn chính: hoạt hóa cột, nạp mẫu, rửa tạp và rửa giải Hiệu suất chiết phụ thuộc vào sự tương tác giữa chất phân tích, pha tĩnh và pha động, với cơ chế lưu giữ chính dựa vào lực Van der Waals, lực liên kết hydro, tương tác phân cực và tương tác điện tích Mỗi chất hấp phụ có các thuộc tính riêng, phù hợp với từng loại chất phân tích Kỹ thuật này mang lại nhiều ưu điểm như mẫu sạch, giảm thiểu ảnh hưởng từ nền mẫu và tỷ lệ thu hồi cao Mặc dù kỹ thuật chiết pha rắn đang được áp dụng rộng rãi và tự động hóa ở nhiều nơi trên thế giới, nhưng tại Việt Nam, việc ứng dụng vẫn còn hạn chế do chi phí cao.

1.2.3 Phân tích thuốc trong dịch sinh học bằng thiết bị sắc ký lỏng khối phổ

Kể từ khi ra mắt vào những năm 1980, sắc ký lỏng khối phổ (LC-MS) và sắc ký lỏng khối phổ hai lần (LC-MS/MS) đã trở thành thiết bị phân tích thiết yếu trong các phòng thí nghiệm Kỹ thuật này kết hợp khả năng phân tách của hệ thống sắc ký lỏng với khả năng phân tích khối của detector khối phổ Bộ phận sắc ký tách biệt hoạt chất cần phân tích khỏi các tạp chất trong mẫu, giảm thiểu sự đồng rửa giải và tăng cường độ nhạy của phương pháp phân tích.

ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu, trang thiết bị nghiên cứu

– Chất chuẩn: Thông tin các chất chuẩn sử dụng trong quá trình nghiên cứu được thể hiện ở Bảng 2.1

Bảng 2.1 Các chất chuẩn được sử dụng

Tên chuẩn Mục đích sử dụng

Nơi sản xuất Số kiểm soát Hàm lượng

Risperidon Chuẩn Sigma LRAC2895 99,8% (nt) -

Olanzapin Khảo sát EP 2,0 99,8% (nt) -

Quetiapin fumarat Khảo sát EP 2,0 100,0% (nt) -

Carbamazepin Khảo sát VKNTTW WS.0115218.01 100,0% (nt) -

Bảng 2.2 Các dung môi, hóa chất được sử dụng

Tên thuốc thử Độ tinh khiết Nơi sản xuất

Amoni bicarbonat LCMS Fluka, Đức

Nước loại ion 18,2 MΩ.cm; TOC < 5ppb VKNTTW

– Mẫu huyết tương trắng: Các mẫu huyết tương trắng được cung cấp bởi Bệnh viện Trung ương quân đội 108 và được bảo quản ở nhiệt độ –35 o C, có số lô là: 19.01357; T01197; T16806; T18122; T15445; 04835; 01370

Bảng 2.3 Danh mục thiết bị đã sử dụng

Tên thiết bị Nhà sản xuất

Hệ thống sắc ký lỏng khối phổ Sciex Qtrap 6500 +, Mỹ

Cân phân tích Mettler Toledo, Thụy Sĩ

Máy lắc xoáy Benchmark, USA

Máy ly tâm lạnh Sigma 4-16KS Sigma, Đức

Tủ lạnh sâu MDF U5412-02 Panasonic, Nhật Bản

Tủ lạnh bảo quản chuẩn Haier, Trung Quốc

Micropipette: 0,5-10 àL; 10-100 àL; 100-1000 àL Eppendorf, Đức Ống falcon 15 mL Isolab, Đức

Cột sắc ký: Acquity BEH C18; 50*2,1 mm; 1,7 àm Waters, Mỹ

Bình định mức Isolab, Đức

Pipet class A EM Hirschmann, Đức

Đối tượng nghiên cứu

– Mẫu huyết tương tự tạo: Là mẫu huyết tương trắng được thêm chuẩn RPD ở các nồng độ thích hợp;

– Mẫu huyết tương của người tham gia nghiên cứu TĐSH chế phẩm viên nén risperidon

2 mg do công ty cổ phần Dược phẩm Cửu Long sản xuất.

Nội dung và phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Xây dựng phương pháp định lượng RPD bằng kỹ thuật LC-MS/MS

2.3.1.1 Xây dựng điều kiện khối phổ

Hệ thống LC-MS/MS sử dụng nguồn ion hóa kiểu ESI được áp dụng để tiến hành thí nghiệm Trong quá trình này, dung dịch chuẩn RPD được tiêm trực tiếp trong methanol với nồng độ xác định.

1 àg/mL với tốc độ 5 àL/phỳt vào trong hệ thống khối phổ thụng qua nguồn ion húa để xác định các thông số sau:

Các điều kiện tối ưu cho nguồn ion hóa bao gồm điện thế ion hóa, nhiệt độ đầu phun, và áp suất dòng khí nitơ cung cấp cho nguồn ion để bay hơi dung môi Đặc biệt, điện thế của bộ phận hội tụ dòng ion cần được điều chỉnh để đảm bảo lượng ion mẹ vào bộ phận phân tích khối đạt được mức cao và ổn định nhất.

+ Mảnh ion con của RPD có cường độ tín hiệu cao và ổn định nhất;

+ Năng lượng tối ưu để phân mảnh ion mẹ thành ion con đã xác định ở trên

2.3.1.2 Khảo sát lựa chọn chuẩn nội

Dựa vào tính chất hóa lý của chất phân tích và các tài liệu đã công bố, nghiên cứu lựa chọn các chất chuẩn nội ổn định để tham gia vào quá trình chiết tách và phân tích sắc ký cùng với RPD Các chất chuẩn nội được khảo sát bao gồm haloperidol, carbamazepin, olanzapin và quetiapin Điều kiện khối phổ của các chất chuẩn nội sẽ được xác định tương tự như với chất chuẩn RPD nhằm đạt được cường độ tín hiệu cao và ổn định Cuối cùng, các điều kiện sắc ký và quy trình xử lý mẫu sẽ được thực hiện cùng với RPD.

2.3.1.3 Khảo sát điều kiện sắc ký

Chuẩn bị dung dịch chuẩn RPD bao gồm dung dịch hỗn hợp chứa chất phân tích và chuẩn nội trong pha động Tiến hành khảo sát điều kiện sắc ký trên các cột C18, C8 với kích thước và hãng sản xuất khác nhau Sử dụng các hệ pha động kết hợp dung môi hữu cơ như MeCN hoặc MeOH với dung dịch đệm amoni acetat 2 mM, 10 mM hoặc amoni bicarbonat 2 mM, 5 mM theo các tỷ lệ khác nhau.

2.3.1.4 Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương

Dựa trên tính chất hoá lý của RPD và đặc điểm của nền mẫu huyết tương, nghiên cứu này khảo sát quy trình xử lý các mẫu huyết tương trắng và mẫu huyết tương tự tạo chứa chuẩn RPD với nồng độ 0,6 ng/mL và 40 ng/mL Đồng thời, dung dịch chuẩn nội được pha trộn trong hỗn hợp MeOH – nước với tỷ lệ 50:50 để đạt được nồng độ cần thiết.

500 ng/mL Một số kỹ thuật xử lý mẫu dự kiến khảo sát như sau:

+ Phương pháp tủa protein với tác nhân gây tủa là các dung môi hữu cơ gồm methanol và acetonitril

Phương pháp chiết lỏng – lỏng sử dụng các dung môi như methyl tert-butyl ether, diethyl ether, ethyl acetat, cloroform và các hỗn hợp dung môi như methyl tert-butyl ether với cloroform hoặc diethyl ether, được phối hợp theo nhiều tỷ lệ khác nhau Trước khi thêm dung môi chiết, mẫu huyết tương có thể được kiềm hóa hoặc không, tùy thuộc vào từng hệ dung môi sử dụng.

Chuẩn bị các mẫu với nồng độ tương ứng trong nền mẫu cho phương pháp tủa protein và trong pha động cho phương pháp chiết lỏng – lỏng nhằm so sánh đáp ứng pic giữa các mẫu đã qua chiết tách và chưa chiết tách Dựa trên kết quả khảo sát, lựa chọn phương pháp xử lý mẫu có tỷ lệ thu hồi cao, độ lặp lại tốt, quy trình đơn giản, tiết kiệm dung môi và hóa chất, đồng thời giảm thiểu ảnh hưởng của nền mẫu đến tín hiệu phân tích, kéo dài tuổi thọ của cột và hệ thống sắc ký khối phổ.

2.3.2 Thẩm định phương pháp phân tích

Bài viết tiến hành thẩm định phương pháp định lượng RPD trong huyết tương người bằng kỹ thuật LC-MS/MS, tuân thủ quy định của US-FDA và EMA về thẩm định phương pháp phân tích trong dịch sinh học Các chỉ tiêu thẩm định bao gồm độ thích hợp hệ thống, độ đặc hiệu, giới hạn định lượng dưới, đường chuẩn, ảnh hưởng của nền mẫu, độ nhiễm chéo, độ đúng, độ chính xác, tỉ lệ thu hồi và độ ổn định của hoạt chất trong quá trình xử lý, phân tích và bảo quản mẫu.

* Cách chuẩn bị các mẫu thẩm định

– Chuẩn bị các dung dịch chuẩn trong dung môi

Dung dịch chuẩn gốc để pha đường chuẩn (CCA) được tạo ra bằng cách cân chính xác lượng chất chuẩn RPD và hòa tan trong methanol, nhằm thu được dung dịch chuẩn gốc với nồng độ RPD khoảng 200 àg/mL.

Để chuẩn bị dung dịch chuẩn gốc cho mẫu kiểm tra (QCA), cần cân chính xác lượng chất chuẩn RPD và hòa tan trong methanol, nhằm tạo ra dung dịch có nồng độ RPD khoảng 200 µg/mL.

Dung dịch chuẩn gốc làm việc CCB và QCB được pha loãng từ dung dịch chuẩn gốc CCA và QCA trong hỗn hợp methanol và nước theo tỷ lệ 1:1 Kết quả thu được là dung dịch chuẩn làm việc CCB, QCB có nồng độ RPD khoảng 2 µg/mL.

+ Dung dịch chuẩn nội gốc: cân chính xác lượng chất chuẩn haloperidol, hòa tan trong methanol thu được dung dịch chuẩn nội gốc có nồng độ haloperidol khoảng

Dung dịch chuẩn nội làm việc được tạo ra bằng cách pha loãng dung dịch chuẩn nội gốc trong hỗn hợp methanol và nước theo tỷ lệ 1:1, nhằm thu được dung dịch có nồng độ haloperidol khoảng 500 ng/mL.

– Chuẩn bị đường chuẩn và mẫu LLOQ trong huyết tương

+ Từ dung dịch CCB, pha dung dịch chuẩn làm việc trong huyết tương có nồng độ RPD tương ứng khoảng 50 ng/mL (WSS-CC1) và 2 ng/mL (WSS-CC2)

+ Mỗi đường chuẩn bao gồm: 01 mẫu huyết tương trắng (blank), 01 mẫu huyết tương trắng có pha IS (zero) và 08 mẫu huyết tương có pha chuẩn RPD và IS

+ Tóm tắt nồng độ và cách chuẩn bị các mẫu của đường chuẩn và mẫu giới hạn định lượng dưới (LLOQ) trong huyết tương được trình bày ở Bảng 2.4 và 2.5

Bảng 2.4 Cách chuẩn bị đường chuẩn trong huyết tương

Bảng 2.5 Cách chuẩn bị mẫu LLOQ trong huyết tương

Mẫu Nồng độ (ng/mL) V huyết tương trắng (àL) V WSS-CC2 (àL)

– Chuẩn bị các mẫu kiểm tra trong huyết tương

Từ dung dịch QCB, chúng ta pha chế dung dịch chuẩn làm việc trong huyết tương (WSS-QC1 và WSS-QC2) với nồng độ RPD tương ứng khoảng 50 ng/mL và 2 ng/mL.

+ Tóm tắt nồng độ và cách chuẩn bị các mẫu kiểm tra (QC) trong huyết tương được trình bày ở Bảng 2.6

Bảng 2.6 Cách chuẩn bị mẫu kiểm tra trong huyết tương

Mẫu Nồng độ (ng/mL) V WSS-QC1 (àL) V WSS-QC2 (àL) V HT trắng (L)

– Cách chuẩn bị mẫu pha loãng: từ dung dịch QCB, chuẩn bị mẫu pha loãng trong huyết tương có nồng độ 80 ng/mL (gấp 2 lần nồng độ mẫu HQC)

– Chuẩn bị mẫu độ thích hợp hệ thống: từ dung dịch QCB, chuẩn bị mẫu trong huyết tương có nồng độ 15 ng/mL

* Phương pháp tính kết quả

Để xác định nồng độ RPD trong các mẫu thử không rõ nồng độ, cần dựa vào tỷ lệ diện tích pic RPD/IS từ sắc ký đồ của mẫu thử và đường chuẩn tương ứng được phân tích trong cùng điều kiện.

+ Xây dựng đường chuẩn Y = aX + b bằng phương pháp bình phương tối thiểu

Trong đó: + Y: tỷ lệ diện tích pic RPD/IS

+ a: hệ số góc (slope) + b: hệ số chắn (intercept) + Nồng độ định lượng được : X = (Y – b)/a

Độ đúng là chỉ số thể hiện mức độ gần gũi giữa nồng độ định lượng được và nồng độ pha thực tế của mẫu Để tính toán độ đúng, ta sử dụng công thức: Độ đúng (%) = (Nồng độ định lượng được / Nồng độ pha thực tế) x 100.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Xây dựng phương pháp phân tích

3.1.1 Lựa chọn điều kiện khối phổ

* Ion hóa RPD và phổ khối MS

Phân tích phổ khối trên thiết bị LC-MS/MS sử dụng kỹ thuật ghi toàn phổ tại tứ cực Q1 và khảo sát nguồn ion hóa ESI ở chế độ điện tích dương cho thấy, trong dung dịch chuẩn RPD với nồng độ 1 àg/mL, xuất hiện vạch phổ có cường độ lớn và ổn định tại tỷ số m/z = 411 Vạch phổ này tương ứng với cấu trúc phân tử RPD (CTPT: C23H27FN4O2, KLPT: 410,5 g/mol) khi nhận một proton và mang điện tích +1 ([RPD+H]+) Phổ khối của RPD ở chế độ ESI (+) được thể hiện rõ trong Hình 3.1.

Hình 3.1 Phổ khối MS dung dịch chuẩn RPD với chế độ ESI (+)

Sau khi xác định mảnh ion mẹ của RPD, việc tối ưu hóa điện thế của bộ phận tập trung ion là cần thiết để tăng cường sự hình thành của các ion [RPD+H]+ tại nguồn ESI Điều này giúp tập trung các ion này và đưa chúng vào bộ phận phân tích khối với số lượng tối đa trong thời gian ngắn nhất Sử dụng phần mềm thiết bị giúp xác định điện thế tập trung ion tối ưu nhất.

+Q1: 5 MCA scans from Sample 1 (TuneSampleName) of Risperidone_FinalQ1_Pos.wiff (Turbo Spray Max 1.4e8 cps

*Phân mảnh ion ban đầu và phổ khối MS/MS của RPD

Trong quá trình phân mảnh ion RPD mẹ (m/z = 411), ion con có m/z = 191 được xác định là bền vững và mang lại đáp ứng cao nhất Sự hình thành ion m/z = 191 phụ thuộc vào mức năng lượng cung cấp, với năng lượng tối ưu để phân mảnh ion [RPD+H]+ thành ion con có số khối 191 là 37 V, như được thể hiện trong giản đồ mối quan hệ giữa số lượng ion m/z = 191 và mức năng lượng phân mảnh.

Hình 3.2 Phổ khối MS/MS phân mảnh ion [RPD + H] +

Hình 3.3 Giản đồ năng lượng phân mảnh ion [RPD+H] +

* Lựa chọn các điều kiện khác của nguồn ion hóa

Kết quả thu được từ việc thực hiện tự động bằng phần mềm cho thấy điện thế đầu phun đạt 4500 V, nhiệt độ mao quản là 450 °C, và áp suất dòng khí hóa hơi dung môi cùng khí bổ trợ là 65 psi.

3.1.2 Khảo sát lựa chọn chuẩn nội

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn một số thuốc điều trị rối loạn tâm thần có tính chất lý hóa tương tự với RPD, bao gồm haloperidol, olanzapin, carbamazepin và quetiapin Các chất này được pha riêng biệt trong methanol để tạo ra dung dịch chuẩn với nồng độ khoảng 1 µg/mL Sau đó, chúng tôi tiến hành xác định điều kiện khối phổ cho từng chất bằng cách tiêm trực tiếp vào nguồn ion hóa Kết quả cho thấy, trong chế độ ion dương, các chất này tạo ra các mảnh ion con bền vững và ổn định khi sử dụng các thế phân mảnh khác nhau Cặp ion mẹ và ion con của từng chất được xác định như sau: haloperidol (376 → 165), olanzapin (313 → 256), và carbamazepin (237).

 194) và quetiapin (384  253) Với cùng một nồng độ thì cường độ tín hiệu của haloperidol là ổn định và cao nhất

Tiếp tục tiêm dung dịch chuẩn hỗn hợp RPD và bốn chất với nồng độ khoảng 2 ng/mL cho mỗi chất vào hệ thống sắc ký, đảm bảo điều kiện tối ưu cho quá trình phân tích.

XIC of +MRM (4 pairs): 410.991/191.018 Da from Sample 1 (TuneSampleName) of Risperidone_CE_Po Max 1.1e7 cps

Trong mục 3.1.4, các pic đều có thời gian lưu gần tương đương với pic RPD, dao động từ 0,5 đến 2 phút Tuy nhiên, pic haloperidol cho thấy đáp ứng cao nhất và hình dáng cân đối nhất.

Vì vậy, haloperidol được lựa chọn làm chuẩn nội để khảo sát các điều kiện khác

3.1.3 Khảo sát điều kiện sắc ký

Khảo sát các hệ pha động với dung môi hữu cơ MeCN, MeOH và dung dịch amoni acetat 2 mM, 10 mM, cùng với dung dịch amoni bicarbonat 2 mM, 5 mM cho thấy hệ pha động gồm MeCN và dung dịch amoni bicarbonat 5 mM (tỷ lệ 80:20) mang lại các pic RPD và IS có hình dáng cân đối và cường độ tín hiệu cao hơn so với các hệ pha động khác.

Khi cố định tốc độ dòng, việc thay đổi tỷ lệ thành phần pha động sẽ ảnh hưởng đến thời gian lưu, hình dạng pic và đáp ứng pic của RPD và IS Sử dụng pha động với MeCN và dung dịch amoni bicarbonat theo tỷ lệ 50:50 (v/v) dẫn đến đáp ứng pic của các chất thấp, trong khi tỷ lệ 90:10 (v/v) khiến pic của RPD và chuẩn nội bị doãng và kéo đuôi Tại tỷ lệ MeCN: amoni bicarbonat 5 mM (80:20, v/v), các pic RPD và IS có hình dạng cân đối nhất.

Khi cố định thành phần, tỷ lệ pha động và nhiệt độ cột, nghiên cứu đã tiến hành khảo sát trên các cột C18 và C8 của các hãng Thermo, Water và Phenomenex Kết quả cho thấy, các pic RPD và IS xuất hiện với thời gian lưu từ 0,5 đến 2 phút Đặc biệt, cột Water Acquity BEH C18 cho kết quả cao hơn với hình dạng pic cân đối hơn so với các cột khác Do đó, cột Acquity BEH C18 được chọn để tiếp tục nghiên cứu.

Hình 3.4 SKĐ mẫu chuẩn chứa RPD và IS với cột Phenomenex C18 (50 x 2,1mm;

1,7àm) Chú thích hình (từ trên xuống): sắc ký đồ tổng ion, sắc ký đồ chọn lọc ion chuẩn nội có m/z = 376  165, sắc ký đồ chọn lọc ion risperidon có m/z = 411  191

Hình 3.5 SKĐ mẫu chuẩn chứa RPD và IS với cột Acquity BEH C18 (50 x 2,1 mm;

XIC of +MRM (2 pairs): 411.000/191.000 Da ID: Risperidone from Sample 7 (HQC 3) of 04032021.wiff (T Max 4.1e6 cps

XIC of +MRM (2 pairs): 376.000/165.000 Da ID: Haloperidol from Sample 7 (HQC 3) of 04032021.wiff (T Max 3.4e6 cps

XIC of +MRM (2 pairs): 411.000/191.000 Da ID: Risperidone from Sample 7 (HQC 3) of 04032021.wiff (T Max 4.1e6 cps

XIC of +MRM (2 pairs): 411.000/191.000 Da ID: Risperidone from Sample 59 (MQC3 Max 3.1e6 cps

XIC of +MRM (2 pairs): 376.000/165.000 Da ID: Haloperidol from Sample 59 (MQC3) Max 3.1e6 cps

XIC of +MRM (2 pairs): 411.000/191.000 Da ID: Risperidone from Sample 59 (MQC3 Max 3.1e6 cps

Khảo sát tốc độ dòng pha động từ 0,2 đến 0,4 mL/phút trên cột Acquity BEH C18 (50 x 2,1 mm; 1,7 µm) cho thấy, ở tốc độ 0,4 mL/phút, áp suất hệ thống cao và các pic xuất hiện sớm (trước 0,5 phút) Khi giảm tốc độ dòng xuống 0,2 mL/phút, các pic RPD và IS có hình dạng cân đối với thời gian lưu khoảng 0,8 phút và 1,0 phút Thời gian phân tích cho một mẫu khoảng 2 phút, rất phù hợp cho việc phân tích số lượng mẫu lớn trong nghiên cứu SKD và đánh giá TĐSH của thuốc.

Khảo sát các thể tích tiêm mẫu từ 1 đến 10 µL cho thấy, với thể tích tiêm mẫu 2 µL, cường độ tín hiệu ổn định và hình dáng pic cân đối Khi giảm thể tích tiêm mẫu xuống 1 µL, pic đáp ứng thấp và hệ số nhiễu so với đường nền của pic RPD chỉ khoảng 20 trên mẫu nồng độ thấp (0,2 ng/mL) Đối với thể tích tiêm mẫu 5 hoặc 10 µL, các mẫu chuẩn có nồng độ cao (40 ng/mL) cho pic bị giãn và kéo đuôi Do đó, thể tích tiêm mẫu 2 µL được lựa chọn để tiếp tục khảo sát.

Hỡnh 3.6 SKĐ mẫu chuẩn chứa RPD và IS với thể tớch tiờm 10 àL

3.1.4 Nghiên cứu qui trình xử lý mẫu RPD trong huyết tương

Khảo sát quy trình xử lý mẫu huyết tương trắng và huyết tương tự tạo chứa RPD ở nồng độ 0,6 ng/mL và 40 ng/mL Đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu và độ thu hồi hoạt chất trong từng quy trình xử lý mẫu.

XIC of +MRM (2 pairs): 411.000/191.000 Da ID: Risperidone from Sample 65 (10 uL) of 04032021.wiff (T Max 6.3e6 cps

XIC of +MRM (2 pairs): 376.000/165.000 Da ID: Haloperidol from Sample 65 (10 uL) of 04032021.wiff (T Max 5.2e6 cps

XIC of +MRM (2 pairs): 411.000/191.000 Da ID: Risperidone from Sample 65 (10 uL) of 04032021.wiff (T Max 6.3e6 cps

0.77 so sánh kết quả sắc ký với các mẫu chuẩn pha trong nền mẫu hoặc pha động (không qua chiết tách) được phân tích đồng thời

* Đối với phương pháp tủa protein: sử dụng MeCN hoặc MeOH làm tác nhân gây tủa, mẫu huyết tương được xử lý theo sơ đồ sau:

Hình 3.7 Quy trình xử lý mẫu bằng phương pháp tủa protein

Kết quả thực nghiệm cho thấy:

Quy trình xử lý protein bằng phương pháp tủa là một phương pháp đơn giản và nhanh chóng, giúp tiết kiệm huyết tương Phương pháp này cho phép thu được cường độ tín hiệu ổn định, đồng thời ảnh hưởng của nền mẫu đối với các tác nhân tủa như MeCN và MeOH là không đáng kể.

Tỷ lệ thu hồi của chất phân tích và chuẩn nội đạt cao và ổn định, với giá trị lần lượt là 95% và 102% cho tác nhân tủa MeCN, trong khi đó tỷ lệ thu hồi đối với MeOH là 82% và 81%.

Thẩm định phương pháp phân tích

3.2.1 Sự phù hợp của hệ thống LC-MS/MS

Chuẩn bị mẫu chuẩn có nồng độ RPD khoảng 15 ng/mL trong huyết tương

Mẫu được xử lý theo quy trình phân tích đã thiết lập, với việc tiêm lặp lại 6 lần mẫu thu được Các thông số đặc trưng của mỗi pic và tỷ lệ diện tích giữa pic RPD so với pic IS được ghi lại Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng dưới đây.

Bảng 3.3 Kết quả đánh giá sự phù hợp của hệ thống

RPD/IS Diện tích pic t R Diện tích pic t R

Nhận xét: Trên sắc ký đồ của mẫu huyết tương có pha thêm IS và chuẩn

Hệ thống LC-MS/MS cho phép định lượng RPD trong huyết tương với độ ổn định cao Thời gian lưu của các pic RPD và IS có độ biến thiên (CV) dưới 1,0%, trong khi tỷ lệ diện tích giữa các pic RPD và IS đạt độ lặp lại tốt với CV dưới 5,0%.

3.2.2 Độ đặc hiệu – chọn lọc của phương pháp

– Tiến hành chuẩn bị các mẫu sau:

+ 6 mẫu huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau

+ 6 mẫu chuẩn có chứa IS và chuẩn RPD ở nồng độ LLOQ (0,2 ng/mL) trong từng nguồn mẫu huyết tương trắng trên

+ 01 đường chuẩn và các mẫu QC (LQC, SQC, MQC, HQC)

– Phân tích các mẫu trên theo quy trình đã xây dựng Ghi lại sắc ký đồ, thông số pic và đáp ứng pic

Kết quả được trình bày ở Hình 3.13, Hình 3.14 và Bảng 3.4

Hình 3.13 SKĐ mẫu huyết tương trắng

Hình 3.14 SKĐ mẫu huyết tương trắng có pha IS và chuẩn RPD ở nồng độ LLOQ

XIC of +MRM (2 pairs): 411.000/191.000 Da ID: Risperidone from Sample 52 (BL) of Max 3.4e4 cps

XIC of +MRM (2 pairs): 376.000/165.000 Da ID: Haloperidol from Sample 52 (BL) of Max 2.1e4 cps

XIC of +MRM (2 pairs): 411.000/191.000 Da ID: Risperidone from Sample 52 (BL) of Max 3.4e4 cps

XIC of +MRM (2 pairs): 411.000/191.000 Da ID: Risperidone from Sample 49 (LLOQ1) of VAL1703 Max 3.3e4 cps

XIC of +MRM (2 pairs): 376.000/165.000 Da ID: Haloperidol from Sample 49 (LLOQ1) of VAL1703 Max 3.6e6 cps

XIC of +MRM (2 pairs): 411.000/191.000 Da ID: Risperidone from Sample 49 (LLOQ1) of VAL1703 Max 3.3e4 cps

Bảng 3.4 Ảnh hưởng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với t R của RPD và IS

CC-QC*: Đáp ứng IS trung bình của các mẫu CC, QC và LLOQ

Trong mẫu huyết tương trắng trên SKĐ (Hình 3.13), tại thời điểm trùng với thời gian lưu của RPD và IS trong mẫu chuẩn (Hình 3.14), không có sự xuất hiện của các pic với mảnh phổ khối m/z = 411 → 191, đặc trưng cho RPD, cũng như mảnh phổ khối m/z = 376.

165 (đặc trưng cho IS) Trên SKĐ mẫu chuẩn, các pic RPD và IS đều có hình dạng cân đối, tách hoàn toàn khỏi các pic tạp có trong mẫu

Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của RPD, mức đáp ứng pic của từng mẫu trắng không vượt quá 20% so với mẫu LLOQ tương ứng, với giá trị cao nhất ghi nhận là 18,5%.

Tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS, tỷ lệ đáp ứng pic của từng mẫu trắng không vượt quá 5% so với đáp ứng trung bình pic IS của các mẫu CC, QC và LLOQ, với mức cao nhất đạt 0,9%.

Như vậy, phương pháp phân tích đã xây dựng đáp ứng được yêu cầu về độ đặc hiệu – chọn lọc đối với RPD và chuẩn nội

3.2.3 Ảnh hưởng của nền mẫu

– Chuẩn bị các mẫu sau:

+ 6 mẫu huyết tương trắng có nguồn gốc khác nhau, tiến hành chiết tách theo quy trình phân tích để thu được các dung dịch nền mẫu tương ứng

+ Mẫu chuẩn có chứa RPD, IS ở hai nồng độ LQC, HQC trong từng dung dịch nền mẫu trên

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 6 mẫu chuẩn trong dung môi chứa RPD và IS với hai nồng độ LQC và HQC Các mẫu này được phân tích bằng phương pháp sắc ký, trong đó ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng pic để xác định tỷ lệ giữa các thành phần.

Kết quả được trình bày trong Bảng 3.5:

Bảng 3.5 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của nền mẫu

STT Dung môi Nền mẫu

MF RPD MF IS MF RPD

STT Dung môi Nền mẫu

Kết quả thực nghiệm cho thấy tỷ số MFRPD/MFIS ở hai nồng độ LQC và HQC có giá trị CV lần lượt là 9,8% và 3,3%, đều dưới 15% Điều này cho thấy nền mẫu sau xử lý đáp ứng yêu cầu của phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học.

– Chuẩn bị các mẫu sau:

+ 6 mẫu huyết tương trắng (blank);

Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng 6 mẫu huyết tương chuẩn có chứa RPD với nồng độ ULOQ là 50 ng/mL và 6 mẫu với nồng độ LLOQ là 0,2 ng/mL Các mẫu này được xử lý theo quy trình phân tích đã định Đầu tiên, chúng tôi tiêm sắc ký 6 mẫu LLOQ, sau đó xen kẽ tiêm từng mẫu blank sau mẫu ULOQ Kết quả được ghi lại thông qua sắc ký đồ và đáp ứng pic.

Kết quả được trình bày ở Bảng 3.6

Bảng 3.6 Kết quả đánh giá độ nhiễm chéo

STT Mẫu Blank Mẫu LLOQ Tỷ lệ đáp ứng pic

RPD IS RPD IS RPD IS

Kết quả thực nghiệm từ Bảng 3.6 chỉ ra rằng mẫu trắng không có sự xuất hiện của pic RPD, trong khi đó, đáp ứng của mẫu LLOQ tại thời điểm trùng với thời gian lưu của pic IS đạt gấp 148,4 – 173,7 lần so với mẫu trắng, vượt ngưỡng 20 lần Điều này chứng tỏ phương pháp xây dựng đã đạt tiêu chuẩn về độ nhiễm chéo.

3.2.5 Xác định đường chuẩn và khoảng tuyến tính

– Tiến hành khảo sát trên 8 mẫu chuẩn trong huyết tương có nồng độ RPD từ 0,2 ng/mL đến 50 ng/mL

Chuẩn bị năm đường chuẩn riêng biệt với RPD ở nồng độ đã chỉ định Tiến hành xử lý theo quy trình phân tích, thực hiện tiêm sắc ký và ghi lại sắc ký đồ cùng với đáp ứng pic.

Khảo sát các hệ số trọng số như 1, 1/x, 1/x² và 1/√x là cần thiết khi xây dựng đường chuẩn Mục tiêu là lựa chọn hệ số trọng số sao cho tổng bình phương sai số của các điểm chuẩn đạt giá trị nhỏ nhất.

– Xác định độ đúng của từng mẫu chuẩn dựa vào đường chuẩn đã xây dựng

– Từ dữ liệu thực nghiệm, xác định được hệ số weighting là 1/x 2

– Kết quả xây dựng đường chuẩn được trình bày trong Bảng 3.7

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát đường chuẩn

CC1 CC2 CC3 CC4 CC5

Phương trình hồi quy (Y = aX +b) 1 a 0,0423 0,0404 0,0409 0,0416 0,0420 b 0,00070 0,00117 0,00095 0,00108 0,00116 r 0,9994 0,9992 0,9987 0,9977 0,9994

( 1 ) y: tỷ lệ đáp ứng pic RPD/IS; X: nồng độ RPD trong mẫu huyết tương

Kết quả thực nghiệm cho thấy có sự tương quan tuyến tính giữa nồng độ RPD và tỷ lệ diện tích pic RPD/IS trong khoảng nồng độ từ 0,2 đến 50 ng/mL, với hệ số tương quan đạt ≥ 0,9977 Độ chính xác tại 8 mức nồng độ đều nằm trong giới hạn 85% – 115%, xác nhận khoảng tuyến tính của phương pháp từ 0,2 ng/mL đến 50 ng/mL.

3.2.6 Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)

– Chuẩn bị các mẫu sau:

+ 6 mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn RPD ở nồng độ 0,2 ng/mL và IS

+ 01 đường chuẩn với mẫu huyết tương trắng, mẫu zero và các mẫu QC

Xử lý và phân tích các mẫu theo quy trình phân tích là rất quan trọng Cần ghi lại sắc ký đồ và đáp ứng pic để đảm bảo tính chính xác Việc xác định nồng độ, độ đúng và độ chính xác của các mẫu LLOQ cũng đóng vai trò then chốt trong quá trình này.

– Tiến hành lặp lại trên 3 ngày

Kết quả được trình bày ở Bảng 3.8 và Bảng 3.9

Bảng 3.8 Đáp ứng pic của mẫu LLOQ và mẫu Zero tại t R của RPD

Zero LLOQ Zero LLOQ Zero LLOQ

Bảng 3.9 Kết quả thẩm định độ đúng – độ chính xác của mẫu LLOQ

Nồng độ thực mẫu LLOQ: 0,206 ng/mL

Nồng độ (ng/mL) Độ đúng (%)

Nồng độ (ng/mL) Độ đúng (%)

Nồng độ (ng/mL) Độ đúng (%)

Kết quả trong Bảng 3.8 chỉ ra rằng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của RPD, tỷ lệ diện tích pic trung bình của mẫu LLOQ/zero thấp nhất là 11,5, vượt quá 5 lần Độ chính xác hàng ngày và trong 3 ngày cao nhất đạt 12,3%, thấp hơn 20%, trong khi độ đúng trung bình hàng ngày và trong 3 ngày nằm trong khoảng 80% đến 120% Do đó, phương pháp phân tích RPD trong huyết tương người đã xác định giá trị LLOQ là 0,2 ng/mL.

3.2.7 Độ đúng – độ chính xác

3.2.7.1 Độ đúng – độ chính xác trong ngày, khác ngày

Đánh giá độ đúng và độ chính xác trong ngày được thực hiện ở 5 mức nồng độ khác nhau: LLOQ (0,2 ng/mL), LQC (0,6 ng/mL), SQC (4 ng/mL), MQC (20 ng/mL) và HQC (40 ng/mL) Để thực hiện, cần chuẩn bị đường chuẩn, các mẫu QC và LLOQ trong huyết tương, với mỗi nồng độ chuẩn bị 6 mẫu Tất cả các mẫu sẽ được xử lý và phân tích sắc ký trong cùng một ngày.

Ứng dụng phương pháp đã xây dựng để định lượng RPD trong huyết tương người

Để đánh giá khả năng ứng dụng của phương pháp phân tích cho các nghiên cứu SKD và TĐSH các chế phẩm thuốc chứa RPD, chúng tôi đã thực hiện định lượng nồng độ RPD trong huyết tương của người tình nguyện sau khi uống 1 viên risperidon 2 mg Kết quả nồng độ RPD trong mẫu huyết tương của 03 người tình nguyện được trình bày chi tiết trong Bảng 3.16 và Hình 3.15 đến 3.17.

Bảng 3.16 Kết quả nồng độ RPD trong huyết tương 03 người tình nguyện

Hình 3.15 SKĐ mẫu huyết tương NTN trước khi uống thuốc có thêm chuẩn nội

Hình 3.16 SKĐ mẫu huyết tương NTN ở thời điểm 2 giờ sau khi uống thuốc

XIC of +MRM (2 pairs): 411.000/191.000 Da ID: Risperidone from Sample 1 (R06-1-0) of R06.wiff (Turb Max 9342.0 cps

XIC of +MRM (2 pairs): 376.000/165.000 Da ID: Haloperidol from Sample 1 (R06-1-0) of R06.wiff (Turbo Max 2.9e6 cps

XIC of +MRM (2 pairs): 411.000/191.000 Da ID: Risperidone from Sample 1 (R06-1-0) of R06.wiff (Turb Max 9342.0 cps

XIC of +MRM (2 pairs): 411.000/191.000 Da ID: Risperidone from Sample 11 (R06-1-2) of R06.wiff (Turb Max 1.6e6 cps

XIC of +MRM (2 pairs): 376.000/165.000 Da ID: Haloperidol from Sample 11 (R06-1-2) of R06.wiff (Turb Max 3.0e6 cps

XIC of +MRM (2 pairs): 411.000/191.000 Da ID: Risperidone from Sample 11 (R06-1-2) of R06.wiff (Turb Max 1.6e6 cps

Hình 3.17 Đường cong nồng độ RPD – thời gian của người tình nguyện Kết quả nghiên cứu tiến hành trên 03 người tình nguyện cho thấy:

Trên sắc ký đồ mẫu huyết tương của người tình nguyện trước khi uống thuốc, không có đáp ứng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của RPD, cho thấy nền mẫu huyết tương không ảnh hưởng đến độ chọn lọc của phương pháp Hình dạng pic RPD và IS trong các mẫu huyết tương người sau khi dùng thuốc là cân đối, tách biệt hoàn toàn khỏi các pic tạp.

Các mẫu đều có nồng độ RPD lớn hơn giới hạn định lượng dưới, với nồng độ đỉnh C max (18,441 – 24,123 ng/mL) tương đương khoảng 2/5 nồng độ cao nhất của đường chuẩn (50 ng/mL), do đó không cần pha loãng mẫu trong quá trình định lượng Giá trị LLOQ (0,2 ng/mL) là khoảng 1/100 lần giá trị C max với liều 2 mg, cho thấy khoảng tuyến tính được xây dựng phù hợp để định lượng RPD trong huyết tương người.

+ Các thông số dược động học như C max ; T max của người tình nguyện là phù hợp với các tài liệu đã công bố [4],[6],[7],[17]

Như vậy, phương pháp định lượng RPD đã xây dựng và thẩm định có thể áp dụng để nghiên cứu DĐH, SKD và TĐSH các chế phẩm chứa RPD

BÀN LUẬN