Nghiên cứu khả năng chuyển gen của hệ vi bọt phối hợp siêu âm trên mô hình in vitro

TỔNG QUAN

Vi bọt

Các bọt có đường kính dưới 10 μm được gọi là vi bọt Trong lĩnh vực vật lý chất lỏng, vi bọt thường được định nghĩa là các bọt có đường kính vài trăm μm trở xuống Trong nghiên cứu về hoạt động sinh lý, các bọt có đường kính từ 10 μm trở xuống cũng được xem xét.

Vi bọt được định nghĩa là các bọt có đường kính khoảng 40 μm, tương đương với vài chục μm Chúng có nhiều đặc điểm khác biệt so với các bọt có kích thước mm, theo nghiên cứu của Li và cộng sự.

Vi bọt được định nghĩa bởi một số nhà nghiên cứu là những bong bóng nhỏ có đường kính nhỏ hơn vài trăm μm Tuy nhiên, cho đến nay, vẫn chưa có sự thống nhất giữa các nhà khoa học về định nghĩa chính xác của vi bọt.

1.1.2 Thành phần của vi bọt

Về cấu tạo, vi bọt có 3 thành phần chính [11] như biểu thị trong Hình 1.1

Hình 1.1 Các thành phần của vi bọt

Pha khí là một chất khí hoặc sự kết hợp của nhiều loại khí Việc kết hợp các loại khí thường nhằm tạo ra sự chênh lệch áp suất riêng phần và áp suất thẩm thấu, giúp ổn định vi bọt.

Các công thức cấu tạo vi bọt ban đầu sử dụng không khí (hỗn hợp oxy và nitơ), nhưng vi bọt này chỉ tồn tại trong tuần hoàn chưa đến 1 phút Sau đó, các loại khí không hòa tan như C3F8 (perfluorocarbons), C4F10 (perflubutane) và C5F12 được sử dụng để cải thiện độ bền của vi bọt.

Nghiên cứu về perflenapent và C6F14 (perflexane) cho thấy khả năng kéo dài thời gian tuần hoàn trong máu của vi bọt đã tăng từ giây lên phút Kết quả này đóng vai trò quan trọng trong việc ứng dụng vi bọt cho các nghiên cứu tiếp theo.

Pha khí được bảo vệ bởi lớp màng vi bọt, và sự khuếch tán khí cùng các tính chất cơ học của vi bọt phụ thuộc vào bản chất lớp màng này Khi độ đàn hồi của nguyên liệu cấu tạo màng tăng lên, năng lượng siêu âm mà nó có thể chịu đựng trước khi nở to hoặc vỡ cũng tăng theo, dẫn đến thời gian ổn định của vi bọt được cải thiện.

Màng vi bọt có thể có bản chất là là protein, lipid, polyme hay chất diện hoạt [12]

Vi bọt có màng albumin là một trong những dạng bào chế đầu tiên trong siêu âm cản quang, với Albunex (GE Healthcare) là sản phẩm đầu tiên được FDA phê duyệt Các phân tử albumin trong màng vi bọt được liên kết qua các liên kết disulfua giữa các gốc cystein, tạo nên độ cứng cho lớp màng albumin trong quá trình siêu âm Sau Albunex, công thức vi bọt albumin khác được phát triển với lõi khí perfluorocarbon, mang tên Optison ™ (GE Healthcare), với độ hòa tan thấp giúp vi bọt tồn tại lâu hơn trong cơ thể.

Một số protein lưỡng tính được sử dụng để tạo lớp màng bao bọc vi bọt, như lysozyme, giúp duy trì hoạt tính enzym trong vài tháng Nghiên cứu của Korpanty và cộng sự cho thấy việc kết hợp albumin và avidin trong cấu trúc vi bọt cho phép tích hợp kháng thể qua biotin, nhằm hướng đến tác dụng tại đích là các tế bào mạch máu nội mô.

Các vi bọt có màng lipid là một dạng bào chế quan trọng trong chẩn đoán và điều trị, với một số loại như Definity và Sonovue® đã được FDA phê duyệt Lớp vỏ lipid mang lại nhiều lợi ích, bao gồm khả năng tự lắp ráp của phospholipid, tạo thành một lớp có tính định hướng cao tại bề mặt tiếp xúc giữa nước và không khí Khi đó, các chuỗi acyl kỵ nước tiếp xúc với pha khí, trong khi các nhóm ưa nước tiếp xúc với pha nước, dẫn đến việc hình thành lớp lipid xung quanh bong bóng khí Sức căng bề mặt thấp của lớp màng lipid giúp tăng cường sự ổn định của vi bọt Thêm vào đó, tính liên kết cao từ các tương tác kỵ nước và Van Der Waals giữa các chuỗi acyl tạo ra độ rắn chắc cho lớp vỏ lipid Những cơ chế này làm cho vi bọt có màng lipid ổn định hơn so với vi bọt có màng protein, vì vậy lipid được ưa chuộng trong nghiên cứu cấu tạo vỏ vi bọt.

Các phân tử lipid trong lớp vỏ được liên kết bằng các tương tác vật lý yếu, cho phép lớp vỏ dễ dàng mở rộng và nén lại khi siêu âm Vi bọt màng lipid có khả năng được chức năng hóa để phân phối thuốc hiệu quả, thông qua việc gắn kết với các phối tử hoặc vận chuyển thuốc và vật liệu di truyền, nhằm nâng cao hiệu quả chẩn đoán và điều trị.

Thuật ngữ "microbubble polymer" chỉ loại vi bọt đặc biệt được ổn định bởi lớp vỏ dày từ các polyme liên kết Nhiều polyme tự nhiên có khả năng chống nén và giãn nở vượt trội hơn lipid và albumin.

Vào năm 2005, Cui đã phát triển vi bọt PLGA bằng phương pháp bay hơi dung môi, với kích thước đo được từ bộ đếm Coulter dao động từ 1–2 μm Kính hiển vi điện tử quét (SEM) cho thấy các hạt vi bọt có hình dạng cầu và bề mặt nhẵn, không có lỗ rỗng hay hốc rõ ràng PLGA bao quanh vi bọt chứa không khí hoặc perfluoropropane, có khả năng làm mờ tâm thất trái Những vi bọt này cho thấy khả năng quang hóa tâm thất trái ở thỏ trong khoảng thời gian 1–2 phút và 7–8 phút.

Các vi bọt được ổn định nhờ hỗn hợp chất hoạt động bề mặt SPAN40 và TWEEN40, theo nghiên cứu của Wheatley và cộng sự Dung dịch SPAN/TWEEN được siêu âm trong môi trường có không khí để tạo ra các vi bọt ổn định Sử dụng máng Langmuir giúp xác định tỷ lệ chính xác giữa SPAN và TWEEN (khoảng 1:1), từ đó tối ưu hóa độ ổn định của vi bọt.

1.1.2.3 Pha nước hoặc pha lỏng

Chất lỏng bao quanh màng vi bọt có thể tương tự như nguyên liệu của lớp vỏ vi bọt, hoặc có thể là chất hoạt động bề mặt hay chất tạo bọt, tùy thuộc vào từng quy trình cụ thể.

Hệ vận chuyển vi bọt kết hợp siêu âm

Tính chất của vi bọt kết hợp siêu âm chủ yếu bị ảnh hưởng bởi áp suất âm Khi áp suất âm ở mức rất thấp, dưới ngưỡng ổn định, vi bọt sẽ tạo ra dao động tuyến tính và tần số phản xạ tương đương với tần số truyền đi Sự gia tăng áp suất âm sẽ dẫn đến những thay đổi trong hành vi của vi bọt.

Áp lực quán tính đạt ngưỡng 7 gây ra sự giãn nở và nén không tuyến tính của các vi bọt, dẫn đến việc phát ra tín hiệu phi tuyến tính với tần số là bội của tần số truyền đi Khi áp suất âm cao hơn, vi bọt sẽ bị giãn nở và nén, dẫn đến hiện tượng phá vỡ (xẹp lại) của chúng Áp lực quán tính này còn tạo ra các sóng xung kích và sóng vi mô xung quanh vi bọt, với vận tốc cực đại có thể lên đến 700 m/s.

Phá hủy vi bọt kết hợp siêu âm (UTMD) là một phương pháp vận chuyển gen và thuốc không xâm lấn, nhằm đưa liệu pháp đến mô mục tiêu Quá trình này bao gồm việc gắn gen hoặc thuốc vào vi bọt, sau đó cho chúng lưu thông trong mạch máu và bị phá hủy bởi siêu âm tại vị trí điều trị UTMD tận dụng nồng độ cao của các chất điều trị tại chỗ và khả năng tăng tính thấm mao mạch tạm thời, cho phép điều trị hiệu quả các khối u.

Hình 1.2 Cơ chế vận chuyển ADN thông qua áp lực ổn định và áp lực quán tính của vi bọt

1.2.2 Khả năng điều trị tại đích

Các tương tác hóa lý có thể nâng cao độ đặc hiệu của nghiên cứu bào chế vi bọt tác dụng tại đích, như việc sử dụng điện tích bề mặt Lindner và cộng sự đã phát hiện rằng vi bọt điện tích dương tồn tại trong vi tuần hoàn của mô bị thiếu máu cục bộ và viêm nhờ vào sự tương tác với hệ thống miễn dịch bẩm sinh Tuy nhiên, các tương tác tĩnh điện không đủ đặc hiệu do tính phức tạp của môi trường sinh học Ngược lại, tương tác giữa phối tử và thụ thể cho thấy độ đặc hiệu cao hơn trong môi trường sinh học, khi bề mặt vi bọt được gắn với các phối tử liên kết đặc hiệu với thụ thể trên tế bào, giúp vi bọt tác dụng tại tế bào đích mong muốn Để phối tử liên kết với bề mặt vi bọt, thường cần một cầu nối, và các kiến trúc bề mặt được thiết kế để tối đa hóa sự tiếp xúc với mô đích Tuy nhiên, điều này có thể dẫn đến nguy cơ tăng cường trình bày hợp chất gây miễn dịch, gây ra thanh thải sớm hoặc phản ứng quá mẫn Một số nghiên cứu cho thấy lipopolymer liên hợp biotin trên bề mặt vi bọt có khả năng kích hoạt hệ thống bổ thể ở người và chuột.

Có hai phương pháp chính để gắn các phối tử vào bề mặt vi bọt: liên kết cộng hóa trị trực tiếp và liên kết biotin-avidin Kỹ thuật biotin-avidin đơn giản cho phép phối tử đánh dấu sinh học kết hợp với vi bọt qua cầu nối avidin Trong khi đó, liên kết cộng hóa trị được sử dụng phổ biến hơn và có thể thực hiện trước hoặc sau khi tạo vi bọt Phương pháp gắn kết phụ thuộc vào loại phối tử, kích thước và sinh khả dụng của chúng Các phân tử nhỏ, ưa nước như chất chuyển hóa và peptit có thể liên hợp trực tiếp với cầu nối polyme mà không làm ảnh hưởng đến động lực học của polyme Ngược lại, các phối tử lớn như kháng thể thường dễ bị biến tính do ứng suất cắt và dung môi hữu cơ, vì vậy chúng thường được liên hợp với bề mặt vi bọt thông qua liên kết biotin-avidin.

Hình 1.3 Hai phương pháp cơ bản gắn phối tử lên bề mặt vi bọt

1.2.3 Khả năng vận chuyển gen/thuốc

Hệ vận chuyển vi bọt kết hợp siêu âm không chỉ có khả năng tác dụng hướng đích mà còn mang lại hiệu quả trong việc vận chuyển các nguyên liệu điều trị Việc giải phóng đồng thời và tăng tính thấm thành mạch là những đặc tính nổi bật khi sử dụng công nghệ này Thành phần màng là yếu tố quyết định khả năng thiết kế vi bọt để vận chuyển các chất, với lõi khí cô lập các hợp chất hữu cơ và lớp vỏ lipid mỏng (∼3 nm) chứa các chất vận chuyển Để nâng cao hiệu quả vận chuyển, một phương pháp đơn giản là đưa các chất thân dầu vào vỏ lipid, giúp hòa tan các thuốc thân nước hoặc thân dầu.

Phương pháp vận chuyển dựa vào tương tác tĩnh điện, tương tự như quá trình vận chuyển ADN hoặc ARN, khai thác liên kết tĩnh điện giữa lớp vỏ lipid mang điện tích dương và ADN hoặc ARN mang điện tích âm Kỹ thuật này được áp dụng phổ biến trong các nghiên cứu về gen trị liệu.

Khả năng vận chuyển của vi bọt có thể được cải thiện thông qua liên kết phối tử-thụ thể Một nghiên cứu gần đây của Lum cho thấy các hạt nano rắn có thể liên kết với vỏ vi bọt thông qua liên kết biotin-avidin Bên cạnh đó, vi bọt cũng có khả năng vận chuyển các hạt nano mềm như liposome.

1.2.4 Cơ chế vận chuyển gen

Cơ chế tương tác giữa tế bào, vi bọt và siêu âm liên quan đến áp suất âm và các thông số siêu âm trong môi trường in vitro Ở áp suất âm thấp, vi bọt tạo ra dòng chảy và lực cắt, giúp làm vỡ màng tế bào mà không gây tổn thương, thúc đẩy hoạt động nội bào và chuyển gen Ngược lại, ở áp suất âm cao, vi tiêm xảy ra, tạo ra các lỗ tạm thời trên màng tế bào, cho phép ADN tiếp cận trực tiếp với tế bào chất Vi bọt hiệu quả trong việc mở tạm thời màng tế bào, tạo điều kiện cho việc vận chuyển thuốc và gen, nhưng có thể gây tổn thương cơ học cho tế bào hoặc làm mất ion canxi ngoại bào.

Vận chuyển gen bằng vectơ không phải virus phải vượt qua nhiều rào cản ngoại bào và nội bào, bao gồm sự bám dính trên bề mặt tế bào, xâm nhập vào tế bào, thoát khỏi nội bào và giải phóng axit nucleic tại vị trí tác dụng Sau khi hoàn tất quá trình phiên mã ADN thành ARN và dịch mã ARN thành protein, sự biểu hiện gen sẽ diễn ra để tổng hợp các sản phẩm của gen trong tế bào.

Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen của hệ vi bọt kết hợp siêu âm

1.3.1 Các yếu tố về vi bọt

Vi bọt đóng vai trò quan trọng trong quá trình hình thành các lỗ trên màng tế bào [42-

Các tính chất của vi bọt đóng vai trò quan trọng trong hiệu quả của hệ chuyển gen vi bọt kết hợp siêu âm.

Khả năng tạo lực quán tính của vi bọt phụ thuộc vào kích thước của chúng, với các đáp ứng động học mạnh hơn được kích hoạt xung quanh tần số cộng hưởng.

Một yếu tố khác cũng ảnh hưởng đến khả năng chuyển gen là lớp vỏ của vi bọt [48–

Nghiên cứu của Karshafian và cộng sự chỉ ra rằng vi bọt Definity® với lớp vỏ lipid có hiệu quả điều trị vượt trội so với vi bọt Optison có lớp vỏ protein Liu cũng nhận thấy vi bọt Definity® có khả năng chuyển gen cao hơn so với vi bọt Optison đối với 70-kDa FITC-dextrans Điều này có thể được giải thích bởi lớp vỏ lipid mỏng và linh hoạt hơn, trong khi lớp vỏ polyme hoặc protein thường dày và cứng Kết quả là, vi bọt có vỏ lipid có khả năng xâm nhập thấp hơn và phản ứng động học mạnh mẽ hơn Chúng cũng có xu hướng phân mảnh thành các vi bọt nhỏ hơn sau khi vỡ, giúp duy trì sự xâm nhập lâu hơn Để đánh giá ảnh hưởng của độ nhớt của vi bọt lên kết quả chuyển gen, Wang đã mô phỏng ứng suất cắt vi dòng và phát hiện rằng vi bọt có độ nhớt và độ đàn hồi thấp có khả năng chuyển gen tốt hơn.

Nghiên cứu cho thấy nồng độ vi bọt có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả chuyển gen, với nồng độ thích hợp giúp tối ưu hóa kết quả điều trị Nồng độ này thay đổi tùy thuộc vào điều kiện thí nghiệm, bao gồm thông số siêu âm và đặc điểm mô đích Nếu nồng độ vi bọt quá thấp, khoảng cách giữa chúng sẽ làm giảm hiệu quả chuyển gen, trong khi nồng độ quá cao có thể gây tác động tiêu cực, ngăn cản siêu âm đến các vi bọt ở xa Do đó, nồng độ vi bọt lý tưởng thường nằm trong khoảng 10^7 - 10^8 vi bọt/ml, đảm bảo khoảng cách giữa các vi bọt khoảng hàng chục micromet để đạt hiệu quả chuyển gen đồng đều và giảm thiểu tác động tiêu cực.

1.3.2 Các yếu tố về siêu âm

Khả năng chuyển gen của hệ vận chuyển phụ thuộc vào các thông số siêu âm như áp suất âm, chu kỳ nhiệm vụ, số chu kỳ siêu âm tập trung, tần số lặp lại xung và thời gian chiếu sóng Mặc dù giá trị thích hợp của các thông số này không nhất quán giữa các nghiên cứu, nhưng hiệu quả chuyển gen có thể được cải thiện đáng kể khi điều chỉnh các thông số siêu âm Do đó, việc tối ưu hóa và chuẩn hóa các thông số này là cần thiết Một số nghiên cứu đã sử dụng hệ thống siêu âm tùy chỉnh với phạm vi thông số rộng hơn để có cái nhìn hệ thống hơn Các thông số siêu âm được lựa chọn nhằm đạt hiệu quả chuyển gen tốt nhất và giảm thiểu tổn thương cho mô khỏe mạnh Áp suất âm được coi là yếu tố quyết định trong việc cải thiện tính thấm qua màng và hiệu quả chuyển gen, nhưng cũng có thể làm giảm khả năng sống của tế bào do tăng cường quá trình gây độc tế bào.

Nghiên cứu của Qiu và cộng sự đã chỉ ra rằng khả năng tạo lỗ màng liên quan đến áp suất âm, với áp suất âm đỉnh từ 0 đến 3.0 MPa, dẫn đến sự mở rộng kích thước lỗ màng từ 150 nm đến 1 μm khi áp suất âm tăng Kết quả từ hình ảnh SEM cho thấy có mối tương quan tỉ lệ thuận giữa áp suất âm và kích thước lỗ màng Đồng thời, nghiên cứu cũng phát hiện mối tương quan tỉ lệ nghịch giữa khả năng sống của tế bào và kích thước lỗ màng Mặc dù hiệu quả chuyển gen tăng khi kích thước lỗ tăng ở giai đoạn đầu, nhưng sau đó có xu hướng bão hòa hoặc giảm do sự hình thành các lỗ màng lớn gây tổn thương không thể phục hồi cho tế bào.

Số chu kỳ siêu âm tập trung, PRF và chu kì nhiệm vụ

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng số chu kỳ siêu âm tập trung, tần số xung (PRF) và chu kỳ nhiệm vụ có ảnh hưởng đáng kể đến kích thước lỗ màng, khả năng chuyển gen và sự sống sót của tế bào.

Helfield và cộng sự đã chứng minh rằng sự xâm nhập của vi bọt xảy ra do sự hình thành các lỗ tạm thời trên màng tế bào Kích thước của các lỗ này có xu hướng tăng khi số chu kỳ siêu âm tập trung tăng, tức là khi độ dài xung trở nên ngắn hơn.

Số chu kỳ siêu âm tập trung có mối liên hệ tỉ lệ thuận với khả năng chuyển gen, trong khi đó lại tỉ lệ nghịch với khả năng sống sót của tế bào.

PRF, thường được đo bằng số lượng xung trong một giây, được biểu thị bằng Hertz (Hz) hoặc pps (xung trên giây) Nghiên cứu của Qiu cho thấy việc tăng PRF có thể mở rộng kích thước lỗ màng và cải thiện hiệu quả chuyển gen, mặc dù lại làm giảm khả năng sống của tế bào Karshafian et al cũng đã báo cáo kết quả tương tự về PRF, trong khi Han và cộng sự cho rằng sự khác biệt trong khả năng chuyển gen giữa các PRF khác nhau có thể không đáng kể khi chu kỳ nhiệm vụ được giữ cố định.

Nghiên cứu của Karshafian chỉ ra rằng siêu âm tần số 500 kHz có tác động mạnh mẽ hơn đến tính thấm và khả năng sống của tế bào so với tần số 5 MHz Mặc dù vậy, trong nhiều nghiên cứu về hệ vận chuyển vi bọt kết hợp siêu âm, tần số 1 MHz thường được chọn để tối ưu hóa hiệu quả kích thích dao động của vi bọt.

Chỉ số cơ học (Mechanical index – MI)

MI, hay chỉ số hình ảnh siêu âm, được định nghĩa là tỷ số giữa áp suất âm đỉnh (MPa) và căn bậc hai của tần số trung tâm (MHz) Chỉ số cơ học thường nằm trong khoảng từ 0,2 đến 1,9, và thường được áp dụng cho hệ vận chuyển vi bọt kết hợp siêu âm Cường độ siêu âm có mối tương quan với MI.

Chỉ số cơ học là một yếu tố quan trọng trong siêu âm, phụ thuộc vào áp suất âm và liên quan đến các hiệu ứng cơ học do sự tạo lỗ hổng tự phát gây ra Với chỉ số cơ học trên 0,7, khả năng xâm nhập sâu hơn vào mô tăng lên, đặc biệt khi biên độ áp suất được nâng cao hoặc tần số giảm Do đó, chỉ số cơ học thường được sử dụng như một thước đo an toàn trong hệ thống hình ảnh siêu âm lâm sàng để ngăn ngừa tổn thương mô, với giới hạn tối đa là 1,9 theo quy định của FDA Đối với các ứng dụng chuyển gen hoặc thuốc bằng vi bọt kết hợp siêu âm, chỉ số cơ học được duy trì dưới giới hạn của FDA nhưng vẫn đủ cao để kích hoạt quá trình tạo vi bọt.

Các thông số siêu âm đóng vai trò quan trọng trong hiệu quả chuyển gen của hệ vi bọt Việc lựa chọn giá trị thích hợp cho các thông số này là cần thiết để đảm bảo chuyển đủ lượng gen đến đích, từ đó đạt được đáp ứng điều trị mong muốn Đây là mục tiêu chính của nghiên cứu này.

Ứng dụng của hệ vận chuyển vi bọt kết hợp siêu âm trong điều trị…

1.4.1 Các ưu điểm giúp ứng dụng hệ vi bọt kết hợp siêu âm trong điều trị

Khi sử dụng vi bọt kết hợp với siêu âm tần số cao, pha khí trong vi bọt sẽ bốc hơi, tạo ra những bọt khí nhỏ hơn, nhanh chóng tăng kích thước và tạo lực đẩy mạnh, giúp giải phóng thuốc và làm xốp màng tế bào, tăng tính thấm thành mạch máu Phương pháp này cho phép hướng đích tế bào ung thư thông qua năng lượng siêu âm tập trung, chỉ tác động vào vị trí u mà không ảnh hưởng đến mô lành, đồng thời phá vỡ lớp vỏ bao quanh vi bọt tại mô ung thư Ngoài việc bắn gói thuốc chính xác, phương pháp còn giúp thuốc thấm sâu hơn vào mô nhờ siêu âm làm màng tế bào trở nên xốp hơn Nghiên cứu trước đây cũng cho thấy rằng tần số cộng hưởng siêu âm cao khi kết hợp với siêu âm tập trung có khả năng mở tạm thời hàng rào máu não trong một khoảng thời gian ngắn.

Việc phá vỡ hàng rào máu-não trong 15 giờ giúp giải phóng thuốc, tăng khả năng thấm và lưu giữ tại mô u não Điều này mở ra bước đột phá mới trong điều trị u não, đồng thời tạo điều kiện cho việc sử dụng siêu âm tập trung trong việc truyền hóa trị liệu không xâm lấn cho bệnh u não và một số rối loạn não khác.

Sử dụng hệ vi bọt kết hợp siêu âm để chuyển gen mang lại nhiều lợi ích nổi bật Đầu tiên, siêu âm tần số MHz đã được chứng minh an toàn trong chẩn đoán y học và được FDA phê duyệt cho mục đích lâm sàng Thứ hai, kỹ thuật này cho phép chuyển gen một cách không xâm lấn vào các cơ quan, đặc biệt là não, nơi mà các phương pháp khác không thể thực hiện Thứ ba, vùng chuyển gen có thể được điều khiển chính xác bằng cách chiếu siêu âm vào khu vực cần điều trị Cuối cùng, phương pháp này cho phép kết hợp điều trị và theo dõi kết quả qua hình ảnh thời gian thực bằng các thiết bị đơn giản.

1.4.2 Các nghiên cứu đã được tiến hành trong và ngoài nước sử dụng vi bọt kết hợp sóng siêu âm

Nhiều nghiên cứu trên thế giới đã sử dụng vi bọt kết hợp với siêu âm tập trung để mở hàng rào máu não tại các mao mạch Kết quả cho thấy một số phân tử chỉ thị, như Xanh Trypan (872 Da) và Xanh Evans (960 Da), có thể đánh giá khả năng thâm nhập hàng rào máu não trong các nghiên cứu tiền lâm sàng Ngoài ra, các yếu tố tương phản như Gd-DTPA cũng được sử dụng trong hình ảnh cộng hưởng từ (MRI) để theo dõi vị trí và hiệu quả của quá trình mở hàng rào máu não.

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc sử dụng hệ vi bọt kết hợp siêu âm có thể hiệu quả trong việc vận chuyển các dược chất điều trị ung thư não Các loại dược phẩm như Herceptin (150 kDa), kháng thể thụ thể D4 (150 kDa), doxorubicin (DOX; 543 Da) và methotrexate (545 Da) đã được chuyển giao thành công thông qua phương pháp này.

Hệ vi bọt-siêu âm đã cho thấy tiềm năng trong việc điều trị các bệnh về não, như loại bỏ các mảng bám amyloid-β trong bệnh Alzheimer và điều chỉnh biểu hiện của protein huntingtin đột biến thông qua việc xâm nhập siARN vào tế bào não mà không gây tổn thương Gần đây, việc sử dụng tế bào gốc được đưa vào mô não cũng đã thành công nhờ công nghệ này, chứng tỏ khả năng ứng dụng rộng rãi của hệ vi bọt kết hợp siêu âm trong lĩnh vực y tế.

Nghiên cứu về chuyển gen HSV-TK qua hệ vi bọt đã đạt được nhiều kết quả đáng chú ý Nhóm nghiên cứu của Andrew R Carson đã chứng minh rằng hệ vi bọt mang gen HSV-TK có khả năng chuyển gen cao trong mô hình ung thư phổi loại biểu mô tế bào vảy, cho phép Ganciclovir chuyển hóa thành hợp chất ức chế khối u hiệu quả Ngoài ra, hệ chuyển gen HSV-TK/vi bọt cũng cho thấy hiệu quả cao trong việc điều trị ung thư buồng trứng.

Nhóm nghiên cứu của giáo sư Chih-Kuang Yeh đã thành công trong việc sử dụng hệ vi bọt kết hợp siêu âm hội tụ để mở hàng rào máu não mà không gây tổn hại cho tế bào và mô não, đồng thời giải phóng thuốc 1,3-bis(2-chloroethyl)-1-nitrosourea (BCNU) nhằm ức chế hệ mạch máu xung quanh mô u não, áp dụng hiệu quả trên mô hình não chuột và giảm liều điều trị Năm 2013, nhóm cũng công bố kết quả dẫn chuyển doxorubicin điều trị ung thư bằng hệ vi bọt đa chức năng cải tiến, trong đó hệ vận chuyển được liên hợp với oxyt sắt từ (SPIO) để tăng cường khả năng tác dụng hướng đích tại mô ung thư não.

Nghiên cứu gần đây cho thấy hệ vi bọt đa năng có khả năng tăng cường hiệu quả chuyển gene GDNF và biểu hiện protein GDNF, mang lại tiềm năng điều trị bệnh Parkinson Đặc biệt, hệ vi bọt kết hợp siêu âm tập trung đã thành công trong việc chuyển gen mã hóa luciferase gắn acid folic, cho thấy khả năng chuyển và biểu hiện gen cao, đồng thời hướng đích hiệu quả vào u não.

Tại Việt Nam, nghiên cứu ứng dụng công nghệ micro và nano trong lĩnh vực Y-Dược học để dẫn chuyển thuốc đến đích vẫn còn mới mẻ và chưa được chú trọng Hiện tại, chỉ có một số ít công trình nghiên cứu công bố về bào chế thuốc liposom điều trị ung thư tại đích, cùng với một số nghiên cứu trong nước về hệ vi bọt nhằm tăng độ tương phản trong chẩn đoán siêu âm và hình ảnh cộng hưởng từ của TS Nguyễn Phúc Nghĩa.

1.5 Cơ sở thiết kế hệ vi bọt kết hợp siêu âm trong điều trị hướng đích u não

Gần đây, điều trị gen đã mở ra nhiều hy vọng cho các phương pháp điều trị bệnh hiểm nghèo Mặc dù công nghệ gen đã phát triển nhanh chóng, tốc độ áp dụng điều trị gen vẫn còn chậm do việc sử dụng virus để vận chuyển gen chống ung thư đến tế bào mục tiêu Phương pháp này tiềm ẩn nhiều rủi ro như độc tính, khả năng kích hoạt hệ miễn dịch của bệnh nhân chống lại virus, và nguy cơ virus kích thích sự phát triển của khối u Do đó, việc phát triển hệ thống vận chuyển gen không phải virus là rất cần thiết để nâng cao hiệu quả và giảm thiểu độc tính Trong điều trị ung thư, việc sử dụng gen tự sát (suicide gene) được coi là một trong những công cụ hấp dẫn nhất.

Gen thymidine kinase (HSV-TK) của virus herpes simplex là một gen tự sát phổ biến trong điều trị ung thư, đã được áp dụng trong nhiều thử nghiệm lâm sàng Enzyme HSV-TK xúc tác phản ứng chuyển đổi các chất tương tự nucleosid, như Ganciclovir (GCV), thành các phân tử monophosphorylat Những phân tử này sau đó được chuyển đổi thành các dẫn xuất triphosphorylat bởi enzyme kinase của tế bào và được tích hợp vào ADN của bệnh nhân, dẫn đến việc chấm dứt quá trình sao chép ADN và tiêu diệt tế bào ung thư.

Hiện nay có rất ít phương pháp chuyển gen được áp dụng nhằm phá vỡ hàng rào máu

Phương pháp tiêm trực tiếp phức hợp gen tự sát vào các khối u não là một kỹ thuật chuyển gen phổ biến, nhưng thường yêu cầu phẫu thuật mở hộp sọ, dẫn đến nguy cơ tổn thương thần kinh, chảy máu và nhiễm trùng Mặc dù chất mannitol đã được sử dụng để phá hàng rào khi tiêm vào mạch máu, phương pháp này không kiểm soát và có thể gây ảnh hưởng đến huyết áp cũng như cân bằng chất lỏng trong cơ thể Do đó, phương pháp chuyển gen nhờ vi bọt kết hợp siêu âm tập trung xuất hiện như một giải pháp hứa hẹn, không gây tổn hại Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng hệ vi bọt kết hợp siêu âm tập trung có thể hiệu quả trong việc vận chuyển gen tiêu diệt ung thư.

Trong quá trình phát triển khối u, yếu tố tăng trưởng tế bào biểu mô mạch (VEGF) đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành hệ mạch máu xung quanh khối u não bằng cách gắn với thụ thể VEGFR2 trên bề mặt tế bào ung thư Thụ thể VEGFR2 kích thích quá trình tăng sinh tế bào và hình thành mạch máu, tạo điều kiện cho khối u phát triển Để nâng cao hiệu quả điều trị, một giải pháp tiềm năng là thiết kế hệ vi bọt chuyển gen kết hợp với kháng thể kháng VEGFR2 và siêu âm tập trung, nhằm mục tiêu giải phóng thuốc tại chỗ khối u mà không ảnh hưởng đến các tế bào và mô lành Tuy nhiên, hiện tại vẫn còn rất ít nghiên cứu áp dụng liệu pháp gen với hệ pHSV-TK/GCV kết hợp siêu âm trong điều trị ung thư, và chưa có nghiên cứu nào sử dụng hệ vi bọt đa chức năng cho điều trị u não.

Nghiên cứu thiết kế và chế tạo hệ vi bọt đa chức năng VCMBs mang gen HSV-TK và gắn với kháng thể kháng VEGFR2 cho phép nhận diện và kết hợp đặc hiệu với tế bào đích Điều này giúp tập trung các hạt vi bọt vào các tế bào mục tiêu mà không ảnh hưởng đến tế bào lành, nâng cao hiệu quả trong điều trị.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

The firefly luciferase gene expression vector (pLUC), regulated by the cytomegalovirus promoter (CMV), is illustrated in Figure 2.2 The pLUC vector, measuring 6.6 kb, was obtained from Origene Technologies, USA All plasmid DNA was purified from Escherichia coli DH5a cultures using the Plasmid Maxi Kit from Macherey-Nagel, following standard protocols.

22 trình do nhà sản xuất cung cấp Độ tinh khiết của pADN được xác định bằng phương pháp đo độ hấp thụ ở bước sóng 260 nm (A260)

Hình 2.2 Cấu trúc của pLUC trong Escherichia coli

Tỷ lệ A260:A280 của ADN plasmid nằm trong khoảng 1,8 đến 1,9, cho thấy ADN tinh khiết, không chứa protein và ARN Để đánh giá chất lượng plasmid tinh khiết, phương pháp enzym giới hạn được áp dụng, sau đó tiến hành điện di trên gel agarose 0,8% Kết quả cho thấy chiều dài các đoạn ADN thu được hoàn toàn phù hợp với bản đồ DNA đã cung cấp.

Nguyên liệu nghiên cứu

Tế bào u thần kinh đệm U87 (U87 Glioma cell)

Tế bào u thần kinh đệm U87 được mua từ American Type Culture Collection (Hoa Kỳ) và được nuôi cấy trong môi trường Dulbecco's Modified Eagle's/Ham's Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12), với 10% huyết thanh bào thai bò và penicillin/streptomycin ở nhiệt độ 37°C Trước khi tiến hành nghiên cứu, các tế bào được cấy với nồng độ 1 × 10^5/ml vào đĩa 24 giếng.

Hóa chất và dụng cụ, thiết bị

Các hóa chất và nguồn gốc các hóa chất sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Hóa chất nghiên cứu

STT Tên hóa chất Nguồn gốc

2 1,2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N- [carboxy

3 1 , 2-distearoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine-N- [biotinyl

5 Đệm glycerol-PBS ThermoFisher - Mỹ

8 Kháng thể kháng VEGFR2 Miltenyi Biotec (Đức)

Các dụng cụ, thiết bị và nguồn gốc các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong nghiên cứu này được liệt kê trong Bảng 2.2

Bảng 2.2 Dụng cụ, thiết bị

STT Tên dụng cụ, thiết bị Nguồn gốc

1 Phiến nhựa 12 giếng Trung Quốc

2 Đầu côn có lọc 1ml, 0,2 ml, 0,01ml, 0,03ml Trung Quốc

3 Pipet pasteur nhựa tiệt trùng Trung Quốc

4 Ống eppendorf 1.5 ml, 2.0 ml Trung Quốc

5 Ống Falcon 15ml Trung Quốc

6 Găng tay không bột cỡ S và M Trung Quốc

7 Máy điện di Hoa Kì

8 Máy đo quang UV-VIS Hoa Kì

9 Plasmid xtra maxi kit Hoa Kì

11 Máy ly tâm siêu nhỏ Đài Loan

12 Đầu dò FUS đường kính 6 mm Hoa Kì

13 Bộ khuếch đại công suất RF Hoa Kì

14 Máy ảnh thiết bị tích điện IVIS Hoa Kì

Phương pháp nghiên cứu

2.4.1 Phương pháp nhân dòng, tách chiết tinh chế và biểu hiện gen chỉ thị

(luciferase gen) tích hợp trong plasmid pFLUC

Nghiên cứu này sử dụng plasmid pFLUC, chứa gen chỉ thị mã hóa luciferase, để theo dõi và đánh giá hiệu quả chuyển gen trong mô hình in vitro thông qua hình ảnh phát quang sinh học Số lượng plasmid sử dụng là 10μg.

25 plasmid được đưa vào và nhân bản nhờ E.coli trong môi trường nuôi cấy LB, sử dụng

Bộ kit tách chiết plasmid (Plasmid xtra maxi kit) được sử dụng để tách chiết plasmid theo quy trình được mô tả trong Hình 2.3 Sau khi tách chiết, plasmid được tinh sạch và định lượng nồng độ bằng phương pháp quang phổ UV-VIS tại bước sóng 260nm, chuẩn bị cho các thí nghiệm tiếp theo Plasmid được bảo quản trong đệm pha với 400ml nước không có nuclease, chia thành các tuýp 10ml và bảo quản lạnh Thí nghiệm được lặp lại 5 lần, và sản phẩm thu được sẽ được sử dụng để theo dõi đánh giá hiệu quả chuyển gen qua hệ vi bọt kết hợp siêu âm trong các mục sau.

Hình 2.3 Sơ đồ nhân dòng, tách chiết và tinh chế gen chỉ thị pLUC [126]

2.4.2 Phương pháp thiết kế, bào chế hệ vi bọt chuyển gen chỉ thị

VCMBs được chế tạo bằng phương pháp hydrat hóa màng mỏng 1, 2 – dipalmitoyl – sn - glycerol - 3 - phosphocholine (DPPC), 1, 2 – distearoyl – sn – glycero - 3 - phosphoethanolamine-N- [carboxy (polyethylene glycol) -2000] (DSPE-PEG 2000),

1, 2 – distearoyl – sn – glycerol – 3 – phosphoethanolamine – N - [biotinyl (polyethylene glycol)-2000] (DSPE–PEG2000–Biotin) và 1,2-dipalmitoyl-3- trimethylammonium-propane (DPTAP) được hòa tan trong cloroform với tỷ lệ 9 : 1

Màng cứng được tạo ra bằng cách chảy qua thiết bị cô quay với tỷ lệ 1:1 theo khối lượng Sau đó, màng này được hydrat hóa bằng dung dịch đệm glycerol - PBS với nồng độ 5 μl/ml.

Sục khí C3F8 và lắc cơ học bằng máy khuấy trong 45 giây tạo ra các vi bọt với lõi khí C3F8 kỵ nước và vỏ lipid Sau đó, vi bọt được ly tâm trong 2 phút ở tốc độ 6000 vòng/phút bằng máy ly tâm siêu nhỏ (Bertec Enterprise Co., Ltd., Đài Loan) để loại bỏ lipid tự do chưa liên kết, trước khi được trộn lại với đệm glycerol-PBS.

Sau khi thêm 1mg avidin (10mg/ml) vào vi bọt và ủ trong 10 phút ở nhiệt độ phòng, vi bọt được ly tâm để loại bỏ avidin dư thừa và trộn với đệm glycerol-PBS Tiếp theo, 75 μg kháng thể đơn dòng liên hợp biotin (VEGFR2) được thêm vào vi bọt và ủ trong 10 phút Sau đó, các VCMBs được ly tâm lần nữa để loại bỏ kháng thể đánh dấu biotin dư thừa Cuối cùng, ADN trong nước khử ion được kết hợp với quá trình ủ, và VCMBs được đảo nhẹ nhàng trong 30 phút để tăng tốc quá trình hấp thụ DNA vào VCMBs thông qua cầu nối biotin-avidin.

Các vi bọt đối chứng (MBs) gồm DPPC, DSPE-PEG 2K và DSPE-PEG2000-Biotin, không chứa VEGFR2, trong khi đó vi bọt mang điện tích dương (CMBs) bao gồm DPPC, DSPE-PEG 2K, DSPE-PEG2000-Biotin và DPTAP, cũng không có VEGFR2.

Bảng 2.3 Tỷ lệ theo khối lượng của các thành phần các loại vi bọt

DPTAP Kháng thể kháng VEGFR2

2.4.3 Phương pháp đánh giá khả năng chuyển gen pLUC và khả năng sống của tế bào

Một ngày trước khi tiến hành nghiên cứu, các tế bào U87 (1x10^5) được cấy vào 24 giếng Các vi bọt (VCMBs) được ủ với 2μg pLUC trong 4ml DMEM trong 30 phút để gắn kết ADN Sau khi loại bỏ môi trường trong đĩa, các VCMBs đã gắn ADN được thêm vào mỗi giếng và được đậy bằng màng PCR không có không khí bên trong Thiết kế đảo ngược được áp dụng để tăng cường hiệu quả tại đích tế bào U87, bằng cách nâng cao tiếp xúc giữa MBs nổi và các tế bào trong 10 phút, sau đó tiến hành quay thẳng đứng để chiếu siêu âm tập trung.

Siêu âm được thực hiện với tần số trung tâm 1 MHz, độ dài xung 10 ms, tỉ lệ bùng nổ 5 Hz, chu kỳ nhiệm vụ 5%, áp suất âm 700 kPa và thời gian tiếp xúc 60 giây, sử dụng đầu dò FUS đường kính 6 mm (kiểu máy V302, Olympus NDT Inc., MA, Hoa Kỳ) Bộ khuếch đại công suất RF (150A100B, AR, PA, Hoa Kỳ) được sử dụng để tạo siêu âm tập trung, chiếu vào các tế bào trong khu vực tiêu điểm của đầu dò và bốn vị trí siêu âm trong 24 giếng Sau khi chiếu xong, các tế bào được rửa sạch bằng PBS và tiếp tục được nuôi cấy trong môi trường DMEM/F12.

Hình 2.4 Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng chuyển gen pLUC

Đánh giá phát quang sinh học được thực hiện 48 giờ sau khi các tế bào chuyển gen pLUC tiếp xúc với siêu âm Để tạo hình ảnh, D-luciferin (10 μl 1,5mg/ml trong PBS) được thêm vào mỗi giếng, và dòng chảy photon được đo trong 1,5 phút bằng máy ảnh IVIS Các khung hình ảnh dài 1 phút được thu thập cho đến khi đạt đỉnh tín hiệu phát quang sinh học Cuối cùng, tiến hành phân tích hình ảnh để thu được giá trị mức độ phát quang sinh học trung bình (average radiance) tính bằng photon/giây/cm²/steradian.

Khả năng sống của tế bào được xác định thông qua tỷ lệ phần trăm formazan tạo ra trong đánh giá chất chỉ thị màu xanh Chất chỉ thị màu xanh (5mg/mL trong môi trường không có huyết thanh) được thêm vào mỗi giếng và ủ ở 37°C trong 2 giờ Độ hấp thụ của mỗi đĩa được đo bằng hệ thống đọc tấm huỳnh quang tại bước sóng 570nm, với bước sóng tham chiếu là 600nm.

2.4.4 Phương pháp xử lý số liệu

2.4.4.1 Phương pháp biểu diễn số liệu dưới dạng biểu đồ

Sử dụng phần mềm Excel 2019 biểu diễn khả năng chuyển gen và khả năng sống của tế bào dưới dạng biểu đồ đường

2.4.4.2 Phương pháp phân tích thống kê

Dữ liệu được thu thập và phân tích bằng phương pháp phân tích phương sai một yếu tố (oneway ANOVA) và kiểm định t-test Kết quả được trình bày dưới dạng: X ± SD.

Sự khác biệt có ý nghĩa khi p < 0,05

2.4.4.3 Phương pháp xử lý số liệu bằng nghiên cứu học máy (machine learning)

Nghiên cứu học máy sẽ phát triển mô hình hồi quy phi tuyến từ 200 điểm dữ liệu thu thập được Các biến dự đoán bao gồm áp suất âm, chu kỳ nhiệm vụ, PRF và số chu kỳ siêu âm tập trung, trong khi biến phụ thuộc là khả năng sống sót của tế bào và khả năng chuyển gen luciferase Mục tiêu là đảm bảo tính tổng quát của mô hình.

29 tập dữ liệu trên sẽ được chia một cách ngẫu nhiên thành hai tập huấn luyện và tập thử nghiệm theo tỉ lệ 50%:50%

Thuật toán được sử dụng để thực hiện nghiên cứu học máy là thuật toán XGBoost

Thuật toán [124] sử dụng cây quyết định và kỹ thuật gradient boosting, được tối ưu hóa cho dữ liệu bảng và phi tuyến tính Để đảm bảo tính chính xác, mô hình máy học sẽ trải qua quá trình thẩm định chéo 10-tập và được thực hiện lại 5 lần nhằm tính toán độ chính xác trung bình của mô hình cuối cùng.

Thẩm định chéo 10-tập là phương pháp chia tập huấn luyện thành 10 tập con ngẫu nhiên nhằm đánh giá hiệu quả của mô hình học máy Trong quy trình này, chín tập con sẽ được sử dụng để xây dựng mô hình, trong khi tập con còn lại được dùng để đánh giá Quy trình này được thực hiện lặp lại 10 lần, từ đó cung cấp kết quả trung bình cho mô hình cuối cùng.

Sau đó quá trình trên sẽ được thực hiện lại 5 lần, như vậy nghiên cứu sẽ có tổng cộng

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thực hiện 50 lần huấn luyện thuật toán, trong đó các siêu tham số của mô hình học máy được tối ưu hóa bằng phương pháp tìm kiếm lưới từ thư viện Scikit-learn Sau khi hoàn thành các lần huấn luyện, các mô hình sẽ được áp dụng để dự đoán trên tập thử nghiệm Để đánh giá độ chính xác của mô hình, chúng tôi sử dụng hai chỉ số quan trọng là R²-score và sai số toàn phương trung bình (Mean Square Error - MSE) R²-score được tính toán dựa trên các giá trị dự đoán và giá trị thực tế.

MSE được tính như sau:

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Kết quả đánh giá khả năng chuyển gen của hệ vi bọt mang gen mã hóa

3.1.1 Kết quả đánh giá ảnh hưởng của các loại vi bọt khác nhau đến khả năng chuyển gen Đầu tiên, nghiên cứu đánh giá khả năng chuyển gen và khả năng sống của tế bào của các loại vi bọt khác nhau (VCMBs, CMBs và MBs) Kết quả được thể hiện trong Hình 3.13 và Hình 3.14

Hình 3.1 Biểu đồ ảnh hưởng của các loại vi bọt khác nhau để khả năng chuyển gen

Hình 3.2 Biểu đồ ảnh hưởng của các loại vi bọt khác nhau để khả năng sống của tế bào

Khả năng chuyển gen của VCMBs (18.24±1.23x10³ p/s/cm²/sr) cao hơn đáng kể so với MBs (5.43±0.10x10³ p/s/cm²/sr) và CMBs (10.55±1.28x10³ p/s/cm²/sr), với p