TỔNG QUAN
Tổng quan về Metformin hydroclorid
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của Metformin Hydroclorid
- Tên khoa học: 1,1-Dimethylbiguanid monohydroclorid
- Công thức phân tử: C 4 H 11 N 5 HCl
- Trọng lƣợng phân tử: 165,6 g/mol
Bột kết tinh màu trắng hoặc tinh thể màu trắng Tan tốt trong nước, tan vừa trong ethanol, thực tế không tan trong aceton và diclorometan
1.1.3 Cơ chế tác dụng và tác dụng dược lý [2], [8]
Metformin là một loại thuốc thuộc nhóm biguanid, được sử dụng để điều trị bệnh đái tháo đường Thuốc hoạt động bằng cách tăng cường khả năng sử dụng glucose của tế bào, cải thiện sự kết nối giữa insulin và thụ thể, đồng thời ức chế quá trình tổng hợp glucose tại gan và giảm hấp thu glucose ở ruột.
Metformin không chỉ có tác dụng trong việc chống đái tháo đường mà còn ảnh hưởng tích cực đến chuyển hóa lipoprotein, một vấn đề thường gặp ở những người mắc bệnh đái tháo đường không phụ thuộc insulin.
Metformin được hấp thu chậm và không hoàn toàn qua đường tiêu hóa, với nồng độ tối đa trong huyết tương (Cmax) đạt được sau khoảng 2,5 giờ kể từ khi uống Sự hiện diện của thức ăn có thể làm chậm quá trình hấp thu và giảm mức độ hấp thu của Metformin.
Metformin liên kết yếu với protein huyết tương, phân bố nhanh chóng vào các mô và dịch
Metformin không bị chuyển hóa ở gan, và không bài tiết qua mật
Metformin thải trừ chủ yếu qua thận ở dạng không bị biến đổi Sau khi dùng đường uống, thời gian bán thải khoảng 6,5 giờ
- Metformin là lựa chọn đầu tay để điều trị ĐTĐ typ II ở các bệnh nhân thừa cân, béo phì
- Ðiều trị bệnh ĐTĐ không phụ thuộc insulin (typ II): Ðơn trị liệu, khi không thể điều trị tăng glucose huyết bằng chế độ ăn đơn thuần
Metformin có thể được sử dụng kết hợp với sulfonylurea khi chế độ ăn uống và việc sử dụng riêng lẻ Metformin hoặc sulfonylurea không đủ hiệu quả trong việc kiểm soát mức glucose huyết.
1.1.6 Các phương pháp định lượng Metformin
Metformin, với tính base (pKa = 12,4), có thể được định lượng qua phương pháp chuẩn độ bằng acid trong môi trường khan, sử dụng chỉ thị đo điện thế theo DĐVN V và BP 2020 Ngoài ra, nó cũng có thể được xác định bằng phương pháp đo quang nhờ vào tính chất hấp thụ UV Tuy nhiên, phương pháp phổ biến nhất hiện nay để định lượng Metformin là sắc ký phân bố pha đảo Dưới đây là một số phương pháp nghiên cứu định lượng Metformin.
Bảng 1.1 Một số phương pháp định lượng Metformin
Tài liệu Chế phẩm Phương pháp Điều kiện phân tích Nồng độ phân
Chuẩn độ bằng acid trong môi trường khan
- Hòa tan 0,100 g chế phẩm trong 4 ml acid formic khan thêm 80 ml acetonitril Chuẩn độ ngay lập tức bằng dung dịch acid percloric 0,1 N
- Xác định điểm kết thúc bằng phương pháp chuẩn độ đo điện thế
- 1 ml dung dịch acid percloric 0,1 N tương đương với 16,56 mg
- Dung dịch chuẩn Metformin hydroclorid
- Dung môi pha mẫu: dung dịch acetonitril (ACN) 2,5% pha trong H 2 O
- Dung dịch đệm: 0,5g/l NaCl và 0,5 g/l Natri heptansulfonat, pH
= 3,85 (điều chỉnh bằng acid phosphoric)
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Dung môi pha mẫu: ACN -
- Dung dịch đệm: 0,5 g/l Natri heptansulfonat, pH = 3,85 (điều chỉnh bằng acid phosphoric) và 0,5g/l NaCl
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Dung dịch A: Natri hexansulfonat 0,05 M, pH = 2 (điều chỉnh bằng acid trifloroacetic)
- Dung môi pha mẫu: ACN - dung dịch A - H2O (7 : 30 : 63)
- Pha động: dung dịch A - dung dịch B - H2O (30 : 20 : 50)
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
Đối với việc định lượng Metformin trong chế phẩm 1 thành phần, phương pháp đơn giản như đo quang và chuẩn độ bằng acid trong môi trường khan thường được sử dụng Trong khi đó, đối với chế phẩm nhiều thành phần, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là lựa chọn phổ biến, với đệm từ các muối alkyl sulfonat như natri heptansulfonat hoặc natri hexansulfonat, hoặc sử dụng cột phenyl để định lượng Metformin, do tính chất phân cực mạnh của hợp chất này.
Tổng quan về Vildagliptin
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của Vildagliptin
- Tên khoa học: (2S)-1-[2-[(3-hydroxy-1-adamantyl) amino] acetyl] pyrrolidin-2-carbonitril
- Trọng lƣợng phân tử: 303,4 g /mol
Bột kết tinh màu trắng Độ tan: 1,75 mg trong 1 ml H2O
1.2.3 Cơ chế tác dụng và tính chất vật lý [12], [ 14]
Vildagliptin là một chất ức chế có chọn lọc DPP-4, giúp tăng nồng độ hai hormon GLP-1 và GIP Sự gia tăng này cải thiện khả năng đáp ứng của tế bào α và β trong đảo tụy đối với glucose, từ đó kiểm soát hiệu quả đường huyết cả sau ăn lẫn lúc đói Cơ chế hoạt động của Vildagliptin bao gồm kích thích bài tiết insulin, giảm tiết glucagon, cải thiện độ nhạy insulin, và tối ưu hóa chuyển hóa lipid cũng như lipoprotein Kết quả là giảm glucose và HbA1c trong cả hai trạng thái ăn và nhịn ăn.
Vildagliptin được hấp thu nhanh chóng qua đường tiêu hóa, với nồng độ tối đa trong huyết tương đạt được sau khoảng 1,7 giờ Mặc dù thức ăn có thể làm giảm tốc độ hấp thu của thuốc, nhưng không ảnh hưởng đến AUC (diện tích dưới đường cong) Sinh khả dụng của Vildagliptin khoảng 85%.
Vildagliptin liên kết với protein huyết tương thấp (9,3%)
Khoảng 69% liều dùng đƣợc chuyển hóa, chủ yếu bằng cách thủy phân ở thận Chất chuyển hóa chính là LAY 151, Vildagliptin không bị chuyển hóa bởi các enzym CYP 450
Khoảng 85% liều dùng Vildagliptin được bài tiết qua nước tiểu, trong đó 23% vẫn giữ hoạt tính, và 15% được thải qua phân Thời gian bán thải của Vildagliptin là khoảng 2 giờ sau khi tiêm tĩnh mạch và khoảng 3 giờ sau khi uống.
Vildagliptin được chỉ định trong điều trị đái tháo đường typ II ở người lớn Liều tối đa một ngày không đƣợc quá 100 mg
1.2.6 Các phương pháp định lượng Vildagliptin
Vildagliptin là một loại thuốc mới được Cơ quan Dược phẩm Châu Âu (EMA) chấp nhận vào năm 2007 Tuy nhiên, thuốc này vẫn chưa được Cục Quản lý Thực phẩm và Dược phẩm Hoa Kỳ (FDA) cấp phép lưu hành Do đó, các nghiên cứu về định hướng sử dụng và hiệu quả của Vildagliptin vẫn đang tiếp tục được thực hiện.
Lượng Vildagliptin hiện vẫn còn hạn chế, và chưa có các chuyên luận định lượng trong các dược điển như DĐVN, USP, EP, JP Dưới đây là một số phương pháp định lượng Vildagliptin mà chúng tôi đã tham khảo từ các nghiên cứu.
Bảng 1.2 Một số phương pháp định lượng Vildagliptin
Phương pháp phân tích Điều kiện phân tích
- Dung dịch đệm: Kali hydrogen phthalat, Tetra butyl ammonium hydroxyd, acid phosphoric điều chỉnh về pH 8,2
- Pha động: đệm - ACN - MeOH
- Dung môi pha mẫu: pha động
- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút
- Dung dịch A: 0,025% NH4OH, điều chỉnh về pH 9,5 bằng dung dịch H3PO4
- Dung môi pha mẫu: pha động
- Cột Xterra ® Waters C18 (150 x 4,6mm, 5 àm)
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Dung môi pha mẫu: pha động
- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
Vì công thức của Vildagliptin không chứa nối đôi liên hợp hay nhóm chức hấp thụ UV hiệu quả, việc định lượng bằng phương pháp đo quang cần sử dụng bước sóng ngắn Tuy nhiên, phương pháp này không phải là tối ưu cho việc định lượng Vildagliptin Thực tế, các nghiên cứu chủ yếu áp dụng phương pháp sắc ký phân bố pha đảo với cột C18 để xác định hoạt chất này.
Sự kết hợp giữa Metformin và Vildagliptin
1.3.1 Ý nghĩa về mặt cơ chế và tác dụng dược lý
Việc kết hợp Vildagliptin, một chất ức chế DPP-4, với Metformin hydroclorid, thuộc nhóm biguanid, đã chứng minh hiệu quả trong việc cải thiện kiểm soát đường huyết cho bệnh nhân ĐTĐ typ 2 Nghiên cứu lâm sàng cho thấy sự kết hợp này mang lại lợi ích cho những bệnh nhân không kiểm soát tốt chỉ bằng Metformin đơn trị liệu Hơn nữa, sự phối hợp này không gây tăng cân hay tăng nguy cơ hạ đường huyết, đồng thời giảm tác dụng không mong muốn trên đường tiêu hóa của Metformin, từ đó nâng cao tuân thủ điều trị khi sử dụng trong cùng một chế phẩm.
Metformin kết hợp với Vildagliptin đƣợc chỉ định trong điều trị bệnh đái tháo đường typ 2:
Chỉ định điều trị cho bệnh nhân người lớn không đạt được kiểm soát đường huyết đầy đủ ở liều tối đa của Metformin khi dùng đơn độc, hoặc những bệnh nhân đang sử dụng riêng rẽ viên Vildagliptin và viên Metformin.
Chỉ định kết hợp sulphonylurea như một liệu pháp phối hợp ba thuốc là cần thiết cho bệnh nhân người lớn không đạt được kiểm soát đường huyết chỉ bằng metformin và sulphonylurea, nhằm hỗ trợ hiệu quả cho chế độ ăn kiêng và tập thể dục.
Chỉ định thêm insulin như một liệu pháp hỗ trợ chế độ ăn uống và luyện tập nhằm cải thiện kiểm soát đường huyết cho bệnh nhân đã sử dụng liều ổn định của insulin và Metformin đơn độc nhưng vẫn không đạt được mức kiểm soát đường huyết mong muốn.
1.3.3 Các phương pháp định lượng đồng thời Metformin và Vildagliptin
Hiện nay, các phương pháp định lượng Vildagliptin, đặc biệt là định lượng đồng thời Metformin và Vildagliptin, vẫn chưa được đề cập nhiều trong các chuyên luận dược điển, và số lượng bài báo, công bố khoa học về vấn đề này còn hạn chế Mặc dù có một số phương pháp như đo quang và sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao, nhưng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) vẫn được nghiên cứu nhiều hơn nhờ vào độ chính xác cao và khả năng ứng dụng thực tiễn của nó.
Bảng 1.3 Một số phương pháp định lượng đồng thời Metformin và Vildagliptin trong viên nén
Phương pháp phân tích Điều kiện phân tích Khoảng tuyến tính
- Pha động: MeOH - ACN - đệm phosphat pH 3,5 (5 : 30 : 65)
- Dung môi pha mẫu: pha động
- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
- Pha động: đệm 0,05 M phosphat pH 6,0
- Dung môi pha mẫu: pha động
- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Pha động: 0,05 M KH2PO4 pH 3,5 - ACN (70 : 30)
- Dung môi pha mẫu: pha động
- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
Tham khảo từ các nghiên cứu trong Việt Nam và trên thế giới, tôi lựa chọn cố định các điều kiện sắc ký sau:
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
Chúng tôi đã thực hiện khảo sát một số pha động dựa trên các tài liệu tham khảo, tập trung vào việc lựa chọn những phương pháp phù hợp với điều kiện phân tích của phòng.
12 thí nghiệm và yêu cầu thực tế (ứng dụng để định lƣợng viên nén có hàm lƣợng Metformin 850 mg và Vildagliptin 50 mg)
Vài nét về phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.4.1 Nguyên tắc và các kiểu sắc ký lỏng hiệu năng cao
HPLC (High-Performance Liquid Chromatography) là một kỹ thuật tách biệt các chất phân tích thông qua cột chứa hạt pha tĩnh, với tốc độ di chuyển khác nhau phụ thuộc vào hệ số phân bố giữa hai pha Sự ái lực của chất phân tích với pha tĩnh và pha động quyết định thứ tự rửa giải của chúng ra khỏi cột Để đạt được hiệu quả tách biệt tối ưu, thành phần pha động cần được điều chỉnh hợp lý, nhằm rửa giải các chất phân tích trong thời gian thích hợp.
Các kiểu sắc ký lỏng hiệu năng cao [1]:
Là kỹ thuật đƣợc sử dụng phổ biến nhất hiện nay, có thể phân thành 2 loại tùy thuộc vào pha tĩnh
+ Sắc ký lỏng - lỏng: pha tĩnh là lớp chất lỏng bao quanh hạt chất mang rắn
Sắc ký pha liên kết là phương pháp sắc ký sử dụng pha tĩnh có liên kết hóa học với bề mặt chất mang rắn như silica hoặc alumina Pha tĩnh trong sắc ký pha thuận thường là chất lỏng phân cực, trong khi ở sắc ký pha đảo, pha tĩnh lại là chất không phân cực.
Sắc ký phân bố được phân loại thành hai loại chính dựa trên độ phân cực tương đối của pha động và pha tĩnh, bao gồm sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo.
Bảng 1.4 Đặc điểm sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo
Sắc ký pha thuận Sắc ký pha đảo
Pha tĩnh Phân cực: cột cyano, cột amino, cột diol, …
Không phân cực: cột C18, C8 hoặc cột phenyl
Pha động Không phân cực: hexan, iso propyl ether,…
Thứ tự rửa giải của chất phân tích
Chất ít phân cực nhất đƣợc rửa giải đầu tiên
Chất phân cực rửa giải trước
Pha tĩnh là chất rắn phân cực, lưu giữ chất phân tích nhờ lực hấp phụ
(3) Sắc ký trao đổi ion:
Pha tĩnh là chất trao đổi ion, bao gồm các polymer không tan trong nước với các nhóm trao đổi ion, chia thành hai loại chính là chất trao đổi anion và chất trao đổi cation.
Pha tĩnh là vật liệu lỗ có kích thước được kiểm soát chính xác Các chất được phân tách dựa vào kích thước phân tử
Lưu giữ chất phân tích trong cơ thể sống là kết quả của các tương tác thuận nghịch và chọn lọc giữa các cặp như kháng nguyên-kháng thể, enzyme-cơ chất, và hormone-receptor Những tương tác này đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì các chức năng sinh lý và điều hòa các quá trình sinh hóa trong cơ thể.
(6) Sắc ký đồng phân quang học:
Pha tĩnh là các chất có tính liên kết chọn lọc với các đồng phân Phổ biến nhất là pha tĩnh silica có gắn hợp chất cyclodextrin
1.4.2 Sắc ký phân bố cặp ion
Trong sắc ký phân bố pha đảo, khi chất phân tích có độ phân cực quá mạnh, nó sẽ thoát ra khỏi pha tĩnh kỵ nước của cột nhồi RPC mà không xảy ra tương tác Để khắc phục tình trạng này, cần trung hòa điện tích và giảm độ phân cực của chất phân tích, từ đó tăng lực giữ và kéo dài thời gian lưu.
Để tách các cation trong quá trình phân tích, người ta thường thêm các đối ion vào pha động, thường là anion từ các muối alkyl sulfonat hoặc alkylsulfat, chẳng hạn như Natri 1-pentan sulfonat hoặc Natri octan.
14 sulfonat,… Ngược lại, để tách các anion, thường dùng muối amoni bậc 4
R4N + X - Khi đó, thời gian lưu có thể tăng từ 10 – 20 lần [20]
Cơ chế tạo cặp của các IPA (tác nhân tạo cặp ion) với các chất phân tích là cation, anion nhƣ sau:
IPA cần tạo liên kết không chỉ với chất phân tích mà còn với pha tĩnh kỵ nước, đòi hỏi IPA phải có gốc kỵ nước, thường là các chuỗi phân tử với độ dài các nhóm thế khác nhau.
IPA có khả năng tăng cường lưu giữ các chất phân tích có điện tích trái dấu, trong khi giảm khả năng lưu giữ các chất có cùng điện tích và ảnh hưởng không đáng kể đến các chất không tích điện Tương tác giữa IPA và chất phân tích phụ thuộc vào trạng thái ion hóa của cả hai, mà trạng thái này lại phụ thuộc vào pH Do đó, pH của pha động trong sắc ký phân bố tạo cặp ion rất quan trọng Trong nghiên cứu này, MET có tính base và phân cực mạnh, tạo cation, nên nếu chỉ phân tích bằng sắc ký phân bố pha đảo mà không tạo cặp ion, thời gian lưu của MET sẽ ngắn Vì vậy, chúng tôi đã khảo sát các pha động phổ biến và pha động có chất tạo cặp ion để tối ưu hóa quá trình phân tích.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu, thiết bị và đối tƣợng nghiên cứu
Hoạt chất Metformin hydroclorid và Vildagliptin
2.1.2 Nguyên vật liệu, dung môi, hóa chất
- Chuẩn Metformin.HCl: số lô: 20180808A, hàm lƣợng 99,7%, nhà sản xuất Fengcheng group Co.,Ltd
- Chuẩn nguyên liệu Vildagliptin số lô: 20181101Q, hàm lƣợng: 99,6%, nhà sản xuất: Jiangxi Synergy Pharmaceutical Co.,Ltd
- Natri heptansulfonat: hãng sản xuất: Merk KGaA, Đức; dùng cho HPLC
- NaCl: hãng sản xuất: Merk KGaA, Đức; dùng cho HPLC
+ Acetonitril (dùng cho HPLC), hãng sản xuất: Merk KGaA, Đức
+ Methanol (dùng cho HPLC), hãng sản xuất: Merk KGaA, Đức
+ Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao: Hãng Shimadzu, model:
L20155518195, cột Shim-pack GIST C18 (250 x 4,6mm; 5àm)
+ Bộ lọc dung mụi (màng lọc 0,45 àm)
+ Máy lọc hút chân không Gast Manufacturing, INC, Mỹ
+ Cân phân tích Mettler Toledo 21 XPE 105, Mỹ
+ Máy đo pH Eutech, Singapore
+ Tủ lạnh Sanyon MDF U333, Nhật Bản
+ Tủ sấy Memmert ULM 500, Đức
+ Máy siêu âm Sonirex Bandelin, Đức
+ Máy cất nước hai lần Hamilton, Anh
- Dụng cụ: Bình định mức chính xác, pipet chính xác, quả bóp cao su và các dụng cụ thủy tinh khác.
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Xây dựng phương pháp phân tích
Khảo sát và xây dựng phương pháp định lượng đồng thời Metformin và Vildagliptin trong viên nén hỗn hợp 2 thành phần bằng kỹ thuật HPLC Nghiên cứu tập trung vào việc xác định các điều kiện sắc ký tối ưu, bao gồm cột sắc ký, bước sóng phát hiện, pha động, tỉ lệ pha động, tốc độ dòng và thể tích tiêm để đạt được kết quả chính xác và đáng tin cậy.
2.2.2 Thẩm định phương pháp phân tích
Thẩm định phương pháp phân tích được thực hiện theo "Hướng dẫn của ASEAN về thẩm định quy trình phân tích" và tiêu chuẩn của AOAC, với các tiêu chí cụ thể nhằm đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả phân tích.
- Độ phù hợp hệ thống
- Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
- Độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian)
2.2.3 Ứng dụng Ứng dụng phương pháp đã thẩm định để xác định hàm lượng của Metformin và Vildagliptin trong viên nén bao phim Galvus Met trên thị trường
Phương pháp nghiên cứu
Dung dịch chuẩn gốc MET khoảng 8500 àg/ml: Cõn chớnh xỏc khoảng
0,8500g chuẩn Metformin hydrochorid vào bình định mức 100,0 ml, thêm khoảng 70 ml nước cất 2 lần, siêu âm 3 phút, định mức tới vạch bằng H2O
Dung dịch chuẩn gốc VIL khoảng 500 àg/ml: Cõn chớnh xỏc khoảng
0,0500 g chuẩn Vildagliptin vào bình định mức 100,0 ml, thêm khoảng 70 ml nước cất 2 lần, siêu âm 3 phút, định mức tới vạch bằng H 2 O
Dung môi pha mẫu: ACN – H 2 O (1 : 40)
Từ dung dịch chuẩn gốc MET, VIL, pha loãng 10 lần bằng dung môi pha mẫu để được dung dịch chuẩn làm việc MET, VIL tương ứng
Dung dịch chuẩn làm việc MET và VIL được pha loãng bằng dung môi pha mẫu để tạo thành dung dịch chuẩn phân tích Hỗn hợp MET và VIL cần có nồng độ phù hợp và phải được lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi tiến hành tiêm sắc ký.
Bóc vỏ 20 viên thuốc và cân để tính khối lượng trung bình của mỗi viên Nghiền thành bột mịn và cân lượng bột chính xác tương đương với khối lượng của 1 viên, sau đó cho vào bình định mức 100,0 ml Thêm khoảng 70 ml nước cất hai lần, siêu âm trong 15 phút và định mức đến vạch bằng H2O Lọc qua giấy lọc và bỏ 20 ml dịch lọc đầu Pha loãng dịch lọc gốc 100 lần bằng dung môi pha mẫu, sau đó lọc qua màng lọc kích thước 0,45 µm để tiến hành tiêm sắc ký.
2.3.2 Xác định điều kiện sắc ký
Nhƣ đã trình bày ở mục 1.3.3, chúng tôi tiến hành cố định các điều kiện sắc ký sau:
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
Các điều kiện sắc ký sau sẽ đƣợc khảo sát:
- Bước sóng phát hiện: lấy phổ tử ngoại ở pic chính trên sắc ký đồ dung dịch chuẩn, lựa chọn bước sóng thích hợp
Lựa chọn pha động phù hợp là rất quan trọng để đảm bảo thời gian lưu vừa phải, đồng thời tạo ra hình ảnh sắc nét và cân đối cho chất phân tích Cần tiến hành khảo sát các pha động khác nhau để tìm ra phương án tối ưu nhất.
+ Đệm Natri 1-heptansulfonat pH 3,85 – ACN (90:10)
+ Đệm Natri 1-heptansulfonat pH 3,85 – ACN tỷ lệ các thành phần theo chương trình gradient
2.3.3 Thẩm định quy trình phân tích
Tiến hành thẩm định phương pháp định lượng theo ―Hướng dẫn của ASEAN về thẩm định quy trình phân tích‖ [4] và AOAC [6]
2.3.3.1 Độ phù hợp hệ thống: Độ phù hợp hệ thống là phép thử để đánh giá độ ổn định của toàn hệ thống phân tích nhƣ máy móc, thiết bị
Phân tích sắc ký lặp lại 6 lần mẫu chuẩn hỗn hợp MET và VIL trong khoảng nồng độ tuyến tính, ghi lại sắc ký đồ để đánh giá tính thích hợp của hệ thống dựa trên thời gian lưu và diện tích pic của MET và VIL.
Yêu cầu: RSD của thời gian lưu, diện tích pic phải ≤ 2,0% nếu không có quy định khác
Là khả năng đánh giá rõ ràng chất cần phân tích khi có mặt các chất khác nhƣ tạp chất, chất phân hủy, chất nền,…
So sánh đáp ứng của các mẫu:
- Mẫu placebo thêm chuẩn MET
- Mẫu placebo thêm chuẩn VIL
- Mẫu phacebo thêm chuẩn hỗn hợp MET và VIL
Phân tích trong cùng điều kiện
Mẫu placebo không được phép hiển thị pic của chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng với mẫu chuẩn Cả mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu placebo đều phải có thời gian lưu giống nhau cho chất phân tích Độ phân giải giữa các pic chính cần đảm bảo không nhỏ hơn 1,5.
2.3.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ, ở đó có sự phụ thuộc tuyến tính giữa đại lƣợng đo đƣợc và nồng độ chất phân tích
19 Đường chuẩn là đường thẳng biểu diễn mối quan hệ giữa đại lượng đo đƣợc và nồng độ chất phân tích
Từ 2 dung dịch chuẩn làm việc nồng độ chớnh xỏc khoảng 850 àg/ml MET và 50 àg/ml VIL, pha loóng với dung mụi pha mẫu để đƣợc dóy dung dịch cú nồng độ 50% - 70% - 90% - 100% - 110% - 120% so với nồng độ dung dịch thử dự kiến (tương ứng khoảng 85 g/ml MET, 5 g/ml VIL) Tiến hành sắc ký trong cùng điều kiện, xây dựng phương trình hồi quy tuyến tính và tính bình phương hệ số tương quan R 2
Yêu cầu: Đường hồi quy có dạng đường thẳng và bình phương hệ số tương quan 0,99 ≤ R 2 ≤ 1
Bảng 2.1 Nồng độ các điểm chuẩn Điểm 1 2 3 4 5 6
2.3.3.4 Độ đúng Độ đúng chỉ mức độ gần nhau giữa giá trị trung bình của các kết quả thử nghiệm và giá trị thực hoặc giá trị đƣợc chấp nhận là đúng Độ thu hồi: đánh giá độ đúng, là tỷ lệ phần trăm thu lại đƣợc so với giá trị lý thuyết
Thêm chính xác khoảng lƣợng chuẩn MET, VIL vào bột placebo để đƣợc 3 nồng độ nhƣ sau:
Bảng 2.2 Nồng độ các điểm thực hiện độ đúng Điểm 1
Nồng độ VIL (àg/ml)
Tại mỗi nồng độ, thực hiện 6 mẫu độc lập tương tự như mẫu thử, tiến hành phân tích mẫu, ghi lại sắc ký đồ và tính toán độ thu hồi của MET và VIL.
Phần trăm tìm lại của MET và VIL ở mỗi nồng độ phải trong khoảng 98 – 102%
RSD của phần trăm tìm lại ở mỗi nồng độ ≤ 2%
2.3.3.5 Độ chính xác (độ lặp lại, độ chụm trung gian): Độ chính xác chỉ mức độ mức độ dao động của các kết quả thử nghiệm độc lập quanh trị giá trung bình
Để xác định độ lặp lại, cần tiến hành phân tích độc lập 6 thử nghiệm trong cùng điều kiện và tính kết quả dựa vào điểm chuẩn Độ lặp lại được xác định thông qua việc tính toán RSD (Relative Standard Deviation) của các giá trị thu được từ các lần định lượng.
Độ chính xác trung gian là chỉ số thể hiện mức độ dao động của kết quả thí nghiệm trong cùng một phòng thí nghiệm, được thực hiện vào những ngày khác nhau hoặc bởi những người phân tích khác nhau.
Tiến hành kiểm tra độ lặp lại bằng cách thực hiện các phép đo trong 3 ngày khác nhau với 2 người khác nhau Dựa trên điểm chuẩn, xác định nồng độ hoạt chất trong các mẫu thử Để đánh giá độ lặp lại trong cùng ngày, khác ngày và khác người, tính toán độ lệch RSD % giữa các giá trị định lượng thu được.
Yêu cầu: RSD của MET ≤ 1,3%, RSD của VIL ≤ 1,9%
2.3.4 Ứng dụng thực tế: Ứng dụng phương pháp đã thẩm định để định lượng viên nén bao phim Galvus Met chứa 50 mg VIL và 850 mg MET của công ty Novartis Pharma Services AG.
Phương pháp xử lý số liệu
Kết quả thực nghiệm đƣợc xử lí bằng thống kê trên phần mềm Microsoft Office Excel 2013
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Khảo sát bước sóng phát hiện
Quét phổ hấp phụ tử ngoại của MET và VIL thu đƣợc kết quả nhƣ hình 3.1 và hình 3.2:
Hình 3.1 Phổ hấp thụ tử ngoại của MET
Hình 3.2 Phổ hấp thụ tử ngoại của VIL
Hình 3.1 chỉ ra rằng MET có cực đại hấp thụ tại 239 nm và cực tiểu tại 217 nm, cho thấy hiệu suất hấp thụ tốt nhất ở hai bước sóng này Ngược lại, Hình 3.2 cho thấy VIL có khả năng hấp thụ tử ngoại kém, với độ hấp thụ giảm dần từ 200 đến 240 nm Đặc biệt, nồng độ phân tích của VIL trong nghiên cứu này thấp hơn nhiều so với MET, với 5 µg/ml cho VIL và 85 µg/ml cho MET, do đó, MET được ưu tiên lựa chọn.
22 bước sóng 218 nm (cực tiểu hấp thụ của MET ± 1 nm) tiến hành phân tích để phù hợp hơn với VIL.
Khảo sát pha động
Các điều kiện sắc ký đã xác định:
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
Dựa vào các tài liệu tham khảo nhƣ đã trình bày ở mục 1.1.6, 1.2.6 và 1.3.3, chúng tôi tiến hành khảo sát các pha động sau:
Bảng 3.1 Các pha động kháo sát
Pha động Thành phần, tỷ lệ
Pha động 1 Đệm phosphat KH2PO4 0,01M pH 3,5 – MeOH (85:15)
Pha động 2 Đệm phosphat KH 2 PO4 0,05M pH 6,0 – ACN – H2O (65 :
Pha động 3 Đệm pH 3,85 (Natri 1-heptansulfonat 0,2 g/l và 0,5 g/l
Pha động 4 Đệm pH 3,85 (Natri 1-heptansulfonat 0,2 g/l và 0,5 g/l
NaCl) – ACN, chạy chương trình gradient
Sau đây là kết quả khảo sát pha động:
Pha động 1: Đệm phosphat KH2PO4 0,01M pH 3,5 – MeOH (85:15)
Data 1: Sắc ký đồ của chuẩn hỗn hợp MET và VIL Data 2: Sắc ký đồ của mẫu pha động
Hình 3.3.Sắc ký đồ của chuẩn hỗn hợp MET và VIL (pha động 1) và sắc ký đồ của pha động
Sắc ký đồ cho thấy tại thời gian lưu của MET xuất hiện pic sắc ký của pha động, điều này đã làm thay đổi cấu trúc sắc ký đồ của MET Do đó, pha động đệm phosphat pH 3,5 – MeOH (85:15) không phù hợp cho nghiên cứu này.
Pha động 2: Đệm phosphat KH 2 PO4 0,05M pH 6,0 – ACN – H2O (65 : 20 :
Hình 3.4 Sắc ký đồ của MET (pha động 2)
Hình 3.5 Sắc ký đồ của VIL (pha động 2)
Hình ảnh sắc ký đồ chỉ ra rằng, trong điều kiện pha động với đệm phosphat pH 6,0, thời gian lưu của MET và VIL quá ngắn (1,6 phút cho MET và 1,8 phút cho VIL) và gần như trùng nhau, do đó pha động này không phù hợp cho nghiên cứu của chúng tôi.
Pha động 3: Đệm pH 3,85 (Natri 1-heptansulfonat 0,2 g/l và 0,5 g/l NaCl)
Hình 3.6 Sắc ký đồ của chuẩn hỗn hợp MET và VIL (pha động 3)
Sử dụng pha động có đệm Natri 1-heptansulfonat pH 3,85 giúp kéo dài thời gian lưu của MET, tuy nhiên thời gian lưu của VIL lại quá dài, lên đến khoảng 38 phút Do đó, cần điều chỉnh tỷ lệ pha động để giảm thời gian lưu của VIL Chúng tôi đã thực hiện chương trình gradient để tối ưu hóa quá trình này.
Pha động 4: Đệm pH 3,85 (Natri 1-heptansulfonat 0,2 g/l và 0,5 g/l NaCl)
– ACN, chạy chương trình gradient
Bảng 3.2 Chương trình chạy gradient của pha động 4 Thời gian Tỷ lệ đệm (%) Tỷ lệ ACN (%)
Hình 3.7 Sắc ký đồ của MET (pha động 4)
Hình 3.8 Sắc ký đồ của VIL (pha động 4)
Hình ảnh sắc ký đồ của MET và VIL cho thấy thời gian lưu của chúng hợp lý, với các pic cân đối và không bị ảnh hưởng bởi pic nhiễu trên nền Do đó, pha động 4 và chương trình gradient được đánh giá là phù hợp cho việc phân tích.
Từ các khảo sát ở trên, điều kiện sắc ký lựa chọn là:
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Nhiệt độ cột: nhiệt độ phòng
- Bước sóng phát hiện: 218 nm
- Pha động: đệm pH 3,85 (Natri 1-heptansulfonat 0,2 g/l và 0,5 g/l NaCl) – ACN, chạy chương trình gradient như bảng 3.2
Thẩm định phương pháp định lượng đồng thời MET và VIL bằng HPLC
3.3.1 Độ phù hợp hệ thống
Kết quả độ phù hợp hệ thống khi tiêm lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn hỗn hợp MET và VIL với nồng độ khoảng 85 àg/ml MET và 5 àg/ml VIL được trình bày trong Bảng 3.3.
Bảng 3.3 Độ phù hợp hệ thống
Nhận xét cho thấy rằng thời gian lưu và diện tích pic của MET và VIL thấp hơn 2% Kết luận cho thấy phương pháp xây dựng đáp ứng yêu cầu về độ phù hợp của hệ thống.
Chuẩn bị các mẫu placebo, mẫu chuẩn và mẫu trắng theo hướng dẫn trong mục 2.3.3.2 Tiến hành sắc ký dưới các điều kiện đã được chọn Kết quả được thể hiện trong Hình 3.9.
- Data 1: Sắc ký đồ mẫu placebo
- Data 2 Sắc ký đồ mẫu phacebo thêm chuẩn MET và VIL
- Data 3: Sắc ký đồ mẫu placebo thêm chuẩn VIL
- Data 4: Sắc ký đồ mẫu placebo thêm chuẩn MET
- Data 5: Sắc ký đồ mẫu thử
Hình 3.9 Kết quả độ chọn lọc
Mẫu placebo không hiển thị tín hiệu của chất phân tích tại thời gian lưu tương ứng với MET và VIL trong mẫu chuẩn Cả mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu placebo thêm chuẩn đều có thời gian lưu và phổ tử ngoại tương đồng tại đỉnh của chất phân tích Độ phân giải giữa các đỉnh chính của mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu placebo thêm chuẩn đạt khoảng 24,5.
Kết luận: Phương pháp đã xây dựng có tính đặc hiệu cao theo yêu cầu của AOAC
3.3.3 Khoảng tuyến tính và đường chuẩn
Tiến hành sắc ký dãy dung dịch chuẩn (chuẩn bị nhƣ đã trình bày ở mục
2.3.3.2) theo điều kiện sắc ký đã chọn Kết quả đƣợc thể hiện trong bảng 3.4, hình 3.10, hình 3.11
Bảng 3.4 Kết quả khảo sát độ tuyến tính Đường chuẩn
Nồng độ (àg/ml) S (mAu.s) Nồng độ (àg/ml) S (mAu.s)
Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của MET y = 64481x - 333451 R² = 0.9942
Hình 3.11 Đồ thị biểu diễn mối tương quan tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ của VIL
Trong nghiên cứu, đã xác định được mối tương quan tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic của MET và VIL trong khoảng nồng độ khảo sát Đường chuẩn của MET và VIL cho thấy hệ số tương quan bình phương đạt từ 0,99 đến 1, cho thấy sự liên kết chặt chẽ giữa các biến.
Kết luận: độ tuyến tính của MET, VIL phù hợp với yêu cầu của AOAC trong khoảng nồng độ khảo sát
Chuẩn bị các mẫu placebo thêm chuẩn ở nồng độ nhƣ trình bày ở mục
2.3.3.4 Mỗi nồng độ làm 6 mẫu độc lập, tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn Kết quả độ thu hồi của MET và VIL đƣợc trình bày ở Bảng 3.5 và Bảng 3.6
Bảng 3.5 Độ thu hồi của MET
Bảng 3.6 Độ thu hồi của VIL
Nhận xét: Thỏa mãn yêu cầu phần trăm tìm lại của MET và VIL từ 98 – 102%, RSD ≤ 2%
Kết luận: Phương pháp đã xây dựng đạt yêu cầu về độ đúng của AOAC
3.3.5 Độ chính xác (độ lặp lại và độ chính xác trung gian)
Chuẩn bị các mẫu thử nhƣ đã trình bày ở mục 2.3.3.5 Tiến hành sắc ký, kết quả đƣợc thể hiện ở Bảng 3.7 và Bảng 3.8
Bảng 3.7 Kết quả độ lặp lại, độ chính xác trung gian khác ngày
Hàm lƣợng % so với nhãn của
Hàm lƣợng % so với nhãn của
Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3
Hàm lƣợng % so với nhãn của
Hàm lƣợng % so với nhãn của
Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3
Bảng 3.8 Kết quả độ chính xác trung gian khác người phân tích
Hàm lƣợng % so với nhãn của MET
Hàm lƣợng % so với nhãn của VIL
Nhận xét: RSD của MET và VIL trong cùng ngày, khác ngày cùng người phân tích, khác người phân tích đều thỏa mãn yêu cầu:
RSD của MET ≤ 1,3%, RSD của VIL ≤ 1,9%
Kết luận: Phương pháp đạt yêu cầu về độ chính xác theo yêu cầu của AOAC
Ứng dụng thực tế
Ứng dụng phương pháp đã thẩm định để định lượng viên nén bao phim Galvus Met chứa 50 mg VIL và 850 mg MET của công ty Novartis Pharma Services AG
Khối lƣợng trung bình viên: 0,9679 g
Tiến hành xử lý mẫu chuẩn và mẫu thử nhƣ đã trình bày ở mục 2.3.1
Kết quả định lƣợng đƣợc thể hiện trong Bảng 3.9
Bảng 3.9 Kết quả định lượng viên nén bao phim Galvus Met 50mg/850 mg
% hàm lƣợng so với nhãn
% hàm lƣợng so với nhãn Chuẩn
TB của % hàm lƣợng so với nhãn
Nhận xét: Hàm lƣợng dƣợc chất trong viên trong viên: MET từ 98,4% – 98,9 %, VIL từ 99,4% – 101,7%
Theo chuyên luận viên nén Metformin trong DĐVN V, yêu cầu hàm lƣợng MET từ 95,0% -105,0%
Do Vildagliptin chƣa có trong chuyên luận dƣợc điển nào nên lựa chọn đánh giá theo tiêu chuẩn cơ sở, yêu cầu hàm lƣợng từ 95,0% – 105,0%
Kết luận: viên nén bao phim Galvus Met của công ty Novartis Pharma Services AG đạt yêu cầu về chỉ tiêu định lƣợng.
Bàn luận
3.5.1 Khảo sát bước sóng phát hiện
MET có khả năng hấp thụ tia UV nhờ vào các liên hợp điện tử p – π từ nitơ và liên kết đôi của nhóm CO Trong khi đó, Vildagliptin chỉ có liên kết bội của nhóm CO và CN, dẫn đến khả năng hấp thụ kém và chỉ có thể hấp thụ bước sóng với năng lượng cao Do đó, để định lượng Vildagliptin, cần ưu tiên lựa chọn bước sóng ngắn.
Trong tài liệu tham khảo [22], bước sóng 239 nm được sử dụng để định lượng đồng thời Metformin, nhưng không phù hợp để hấp thụ Vildagliptin, dẫn đến đáp ứng kém Ngược lại, khảo sát ở bước sóng ngắn hơn 210 nm mặc dù cho đáp ứng tốt với Vildagliptin nhưng lại gặp phải nhiễu nền lớn, gây ra sai số đáng kể.
Kết quả khảo sát cho thấy Metformin có cực tiểu hấp thụ tại 217 nm, đây là bước sóng lý tưởng để định lượng Vildagliptin Do đó, chúng tôi đã chọn bước sóng 218 nm (cực tiểu hấp thụ của Metformin ± 1nm) để thực hiện định lượng đồng thời Metformin và Vildagliptin.
3.5.2 Khảo sát pha động và tỉ lệ pha động:
Khi sử dụng đệm phosphat làm pha động, một vấn đề thường gặp là pic của MET xuất hiện quá sớm do sắc ký pha đảo và tính phân cực mạnh của MET ở dạng muối Để khắc phục tình trạng này, có thể áp dụng phương pháp tạo cặp ion nhằm giảm bớt tính phân cực của MET, giúp cải thiện hiệu quả phân tách trên cột.
Chúng tôi sử dụng chất tạo cặp ion với MET là Natri 1-heptansulfonat để tăng thời gian lưu của MET Tuy nhiên, khi sử dụng Natri 1 - heptansulfonat :
ACN (90:10) được sử dụng làm pha động, mặc dù thời gian lưu của MET hợp lý, nhưng thời gian lưu của VIL lại quá dài do tính phân cực kém hơn Để giảm thời gian lưu của VIL, chúng tôi đã chọn chương trình gradient với phần trăm đệm giảm dần, nhằm tránh việc định lượng bằng hai phương pháp khác nhau và giảm thời gian phân tích Phương pháp này được so sánh với tiêu chuẩn cơ sở trong quá trình phân tích.
- Bước sóng phát hiện: 218 nm và 210 nm
- Tốc độ dòng: 1,0 ml/phút
- Đệm phosphate KH 2 PO 4 pH 3, thêm 8 g/l ammonium hexaflorophosphat
- Dung môi pha mẫu: đệm phosphate – H2O – ACN (400 : 600 : 25)
Thời gian Tỷ lệ kênh A (%) Tỷ lệ kênh B (%)
- Kết quả: thời gian lưu của MET khoảng 5 phút, thời gian lưu của VIL khoảng 11,5 phút
Tiêu chuẩn cơ sở định lượng đồng thời MET và VIL ở hai bước sóng khác nhau: MET tại 218 nm và VIL tại 210 nm Phương pháp sử dụng sắc ký đảo và tạo cặp ion với ammonium hexaflorophosphat, tương tự như Natri - 1-heptan sulfonat, giúp định lượng MET hiệu quả Nhờ đó, phương pháp này tiết kiệm thời gian và đơn giản hóa quy trình chuẩn bị pha động.
