TRỊNH THỊ THÙY KHẢO sát một số TÍNH CHẤT của VI NANG ALGINAT – TINH bột cố ĐỊNH ENZYM NATTOKINASE KHÓA LUẬN tốt NGHIỆP dược sĩ

TỔNG QUAN

Nattokinase

Nattokinase là enzym làm tan huyết khối, được phát hiện trong Natto(đậu nành lên men – một trong những món ăn truyền thống của Nhật Bản) vào năm

Nattokinase là một serine protease thuộc họ enzym subtilisin, có cấu trúc polypeptide sợi đơn với 275 acid amin, trọng lượng phân tử 27,7 kDa và pI 8,6 Enzym này không chứa cystein, do đó không có liên kết disulfua nội phân tử Trình tự bảo tồn trong trung tâm hoạt động của nattokinase bao gồm các acid amin aspartate (D32), histidine (H64), serine (S221) và asparagine (N155).

Hình 1 1: Hình ảnh cấu trúc không gian 3 chiều của NK [43]

1.1.2 Nguồn thu nhận Enzym Nattokinase

Các chủng vi khuẩn Bacillus được phân lập từ thực phẩm lên men truyền thống đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất enzym tan huyết khối Ví dụ, B natto được chiết xuất từ thực phẩm Natto ở Nhật Bản và Bacillus amyloliquefaciens DC-4 từ Douchi tại Trung Quốc Những vi khuẩn này có tiềm năng ứng dụng cao trong ngành công nghiệp thực phẩm và y tế.

Chungkook-Jang và Bacillus sp DJ-4 từ Doe-Jang, Hàn Quốc [28]

Nattokinase, enzyme được chiết xuất từ dịch nuôi cấy B subtilis natto B-12, có độ tinh sạch cao gấp 51,6 lần và đạt hiệu suất thu hồi 43,2% so với hoạt tính ban đầu.

Trên thị trường hiện nay, có nhiều thực phẩm chức năng chứa nattokinase dưới dạng viên nang cứng nhập khẩu từ Nhật Bản và Hoa Kỳ, như Nattospes® (3000 FU/g), Japato (600 FU/g), Nattokinase plusTM (3000 FU/g) và Dosaka (300 FU/g) Mặc dù dạng thực phẩm truyền thống của Nhật Bản cũng được nhập khẩu, nhưng do có mùi nặng, nhớt và khó ăn, nên không được ưa chuộng tại Việt Nam, đồng thời hoạt tính nattokinase trong sản phẩm này cũng thấp.

1.1.3 Tác dụng và cơ chế tác dụng

Nattokinase được coi là một chất hoàn toàn tự nhiên, hiệu quả cao, chi phí thấp để điều trị các bệnh tim mạch

Cơ chế chống đông máu và tan cục máu đông của NK được tóm tắt trong hình 1.2 NK có khả năng làm tan cục máu đông thông qua việc trực tiếp phân cắt fibrin trong huyết khối, đồng thời kích thích sản xuất urokinase và plasmin một cách gián tiếp.

NK đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển đổi pro-urokinase nội sinh thành urokinase (uPA), đồng thời làm giảm chất ức chế t-PA (PAI-1) và tăng cường hoạt động của plasminogen mô (t-PA) Hơn nữa, NK cũng có khả năng chống hình thành cục máu đông bằng cách giảm nồng độ các yếu tố đông máu, đặc biệt là yếu tố VIII.

Hình 1 2: Sơ đồ mô tả cơ chế làm tan cục máu đông của NK [39]

NK có khả năng hạ huyết áp, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, giảm lipid máu, và hỗ trợ chống kết tập tiểu cầu cũng như chống đông máu Những tác dụng này đã được xác nhận qua nhiều nghiên cứu trên cả người và động vật.

Hình 1 3: Sơ đồ mô tả tác dụng dược lý của NK [12]

Gần đây, Nattokinase đã được nghiên cứu về khả năng làm tan huyết khối liên quan đến ung thư, giúp tăng cường khả năng tiếp cận khối u của các hạt nano và tế bào miễn dịch.

1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến độ ổn định

Enzym hoạt động hiệu quả nhất trong khoảng nhiệt độ từ 30 o C đến 40 o C, với nhiệt độ tối ưu là 40 o C Khi nhiệt độ tăng lên 50 o C, hoạt tính của enzym giảm nhanh chóng và hoàn toàn mất hoạt tính ở 60 o C sau 30 phút.

Enzym NK hoạt động hiệu quả trong khoảng pH 6,0-9,0, với pH tối ưu là 8,0 Trong môi trường acid, enzym NK giảm hoạt động nhanh hơn so với môi trường kiềm Cụ thể, enzym này mất hoàn toàn hoạt tính khi pH dưới 5,0 chỉ sau 1 giờ, trong khi ở pH 12, chỉ còn 20% enzym giữ được hoạt tính.

 Các ion kim loại và chất ức chế

Hoạt động của enzym được kích hoạt bởi Zn 2+ và bị ức chế bởi Fe 3+ và Al 3+

NK bị bất hoạt toàn bởi PMSF (phenylmethylsulfonyl florid) [24], [29].

Cố định Enzym

Cố định enzym là kỹ thuật giữ enzym ở vị trí cố định trong không gian mà vẫn duy trì hoạt tính xúc tác của chúng Phương pháp này giúp tối ưu hóa hiệu suất và ứng dụng của enzym trong các quá trình sinh hóa.

Các ưu điểm của enzym cố định:

 Enzym cố định tách biệt dễ dàng khỏi sản phẩm, do đó giảm thiểu hoặc loại bỏ sự ô nhiễm protein của sản phẩm

 Enzym cố định không thể dễ dàng xâm nhập vào da và do đó, khả năng gây dị ứng thấp hoặc không có

 Việc cố định cũng tạo điều kiện thuận lợi cho việc tái sử dụng hiệu quả enzym

 Nâng cao độ ổn định, trong cả lưu trữ và điều kiện hoạt động, ví dụ: biến tính bằng nhiệt, dung môi hữu cơ hoặc bằng cách tự phân

 Cải thiện hiệu suất sử dụng và tái sử dụng enzym do đó hiệu suất xúc tác cao hơn (kg sản phẩm trên mỗi kg enzym)

1.2.2 Các phương pháp cố định Enzym

Về cơ bản, có thể chia các phương pháp cố định enzym thành ba loại: liên kết với chất mang, bẫy (vi nang hoá) và liên kết ngang [32]

Hình 1 4: Các phương pháp cố định enzym cơ bản [32]

 Liên kết với chất mang

Các liên kết giữa enzym và chất mang bao gồm lực van der Waals, liên kết hydro, liên kết ion và liên kết cộng hóa trị Trong đó, lực van der Waals và liên kết hydro quá yếu để giữ enzym cố định trong điều kiện thí nghiệm có nồng độ chất phản ứng, sản phẩm và ion cao Ngược lại, liên kết ion và liên kết cộng hóa trị thường mạnh hơn, giúp ngăn enzym rửa trôi khỏi bề mặt Tuy nhiên, liên kết cộng hóa trị có nhược điểm là nếu enzym bị vô hiệu hóa không thể đảo ngược, cả enzym và chất hỗ trợ sẽ không thể tái sử dụng, gây lãng phí.

Các chất mang phổ biến thường được sử dụng bao gồm nhựa tổng hợp, polysaccharid làm chất tạo màng sinh học, cùng với các chất rắn vô cơ như silicas (trung tính) và zeolit.

Phương pháp liên kết ngang tạo ra các liên kết giữa các enzym mà không cần chất mang, chỉ cần tác nhân để kết nối enzym thành đại phân tử không tan Glutaraldehyde là tác nhân phổ biến được sử dụng, với hai nhóm aldehyd có khả năng liên kết với amin của từng enzym.

Enzym được tạo thành một khối giúp giảm thiểu tình trạng bị rửa trôi, đồng thời tăng cường khả năng chống chịu của enzym trước các tác nhân gây biến tính như nhiệt độ, muối và pH.

Nhược điểm của phương pháp này bao gồm lượng enzym cố định thấp hơn so với các phương pháp khác, giảm hoạt tính của enzym tương tự như trong phương pháp tạo liên kết cộng hóa trị, và chi phí cao.

Bẫy enzym là quá trình giữ enzym trong một mạng lưới polyme, có thể là polyme hữu cơ hoặc vô cơ như polyacrylamid và silica sol-gel Các thiết bị màng như sợi rỗng hoặc vi nang cũng được sử dụng trong quá trình này.

Cấu trúc ba chiều của enzym ảnh hưởng lớn đến hoạt động xúc tác của nó, vì vậy việc cố định enzym cần cân nhắc kỹ lưỡng các phương pháp và hóa chất để bảo vệ cấu trúc bậc ba Phương pháp bẫy vật lý trong mạng tinh thể gel cho phép cố định enzym mà không làm thay đổi các gốc acid amin, giúp duy trì điều kiện phản ứng nhẹ nhàng và hạn chế thay đổi đáng kể trong cấu trúc enzym Phương pháp này có khả năng ứng dụng rộng rãi cho hầu hết các loại enzym, bao gồm cả dịch chiết tinh khiết và dịch chiết thô, cũng như các tế bào vi sinh vật.

Phương pháp bẫy Enzym chia thành 2 loại:

Bẫy kiểu mạng lưới là một phương pháp hiệu quả để bẫy enzym trong các không gian xem kẽ của polyme không tan trong nước đã được liên kết chéo Các polyme như Canci-alginat, agar, κ-carrageenin, polyacrylamid và collagen thường được sử dụng trong quy trình này Enzym được trộn lẫn với dung dịch polyme trước khi gel hóa, sau đó hỗn hợp này được ép đùn hoặc định hình bằng khuôn để tạo ra các hạt.

 Bẫy dạng màng là việc giữ các enzym trong màng polyme bán thấm

Màng nylon, cellulose, polysulfone và polyacrylat thường được sử dụng

Các phân tử lớn như enzym không thể khuếch tán qua màng tổng hợp, trong khi các phân tử nhỏ như cơ chất và sản phẩm lại có khả năng đi qua dễ dàng.

Mặc dù phương pháp bẫy enzym có nhiều ưu điểm, nhưng vẫn tồn tại một số nhược điểm như rò rỉ enzym vào dung dịch, hạn chế trong quá trình khuếch tán và giảm hoạt tính enzym Để khắc phục tình trạng rò rỉ enzym, có thể giảm trọng lượng phân tử của màng hoặc kích thước lỗ xốp của mạng lưới rắn.

Hạn chế khuếch tán có thể được khắc phục bằng cách giảm kích thước hạt Tuy nhiên, việc giảm hoạt tính và độ ổn định của enzym thường gặp phải do điều kiện môi trường không thuận lợi, gây khó khăn trong việc kiểm soát Để giải quyết vấn đề này, việc sử dụng các thành phần công nghệ tiên tiến là cần thiết.

9 thức khác nhau, bằng cách thay đổi điều kiện môi trường và giảm kích thước hạt có thể cải thiện vấn đề này [23], [21].

Chất mang Natri Alginat

Alginat có khá nhiều trong tự nhiên và có thể xuất phát từ 2 nguồn gốc khác nhau:

- Là thành phần cấu trúc của tảo nâu biển (Phaeophyceae), chiếm đến 40% khối lượng chất khô

- Là polysaccharid màng bao trong các loại vi khuẩn đất

Tuy nhiên tất cả các alginat thương mại hiện nay đều có nguồn gốc từ tảo

Natri alginat, với công thức hóa học NaC6H7O6, là muối natri của acid alginic có trọng lượng phân tử từ 32.000 đến 200.000 Đây là một copolyme không phân nhánh, được cấu tạo từ các monome D-Mannuroic acid (M) và L-Guluronic acid (G) liên kết với nhau qua liên kết 1,4-glucosid.

Các monome này phân bố trong mạch alginat theo các khối:

- Khối M: gồm các gốc mannuronic acid nối tiếp nhau

- Khối G: gồm các gốc guluronic acid nối tiếp nhau

- Khối MG: gồm các gốc mannuronic acid và guluronic acid luân phiên nối với nhau [28], [31], [36]

Alginat là một chất không độc hại, có khả năng phân hủy sinh học, và có giá thành thấp Nó được xem như một chất kết dính niêm mạc, tương hợp sinh học và không gây phản ứng miễn dịch.

Hình 1 5: Đặc điểm cấu trúc của alginat: (a) monome alginat, (b) cấu trúc chuỗi, (c) phân bố khối [3], [28]

Quá trình gel hoá alginat diễn ra nhờ vào việc hình thành các liên kết chéo giữa các chuỗi polyme Đặc tính lý hoá của gel alginat chịu ảnh hưởng bởi loại liên kết chéo, mật độ liên kết, trọng lượng phân tử và thành phần của alginat.

Phương pháp chuyển hóa gel alginat phổ biến nhất là sử dụng liên kết chéo ion với các cation đa hóa trị Phương pháp này có thể thực hiện trong điều kiện nhẹ nhàng, giúp bảo vệ các vật liệu nhạy cảm một cách hiệu quả.

Hình 1 6: Quá trình hình thành gel Alginat [28]

Calci alginat được tạo ra từ phản ứng trao đổi ion giữa natri alginat và ion Ca 2+, dẫn đến hình thành một biocomposit không tan trong nước Chất này có khả năng dễ dàng tạo thành hạt hoặc màng, mở ra nhiều ứng dụng trong lĩnh vực y tế và công nghệ thực phẩm.

2 Na(alginat) + Ca 2+  Ca(Alginat)2 + 2 Na + [2]

Ngoài ion Ca2+, các ion Ba2+ và Sr2+ cũng có khả năng tạo thành biocomposit tương tự như calci alginat khi phản ứng với sodium alginat Mặc dù Mg2+ có thể phản ứng với natri alginat, nhưng sản phẩm Mg(Alginat)2 lại tan trong nước Calci alginat tạo thành một mạng lưới cấu trúc, đóng vai trò quan trọng trong việc bẫy các hợp chất sinh học và tế bào.

Có 3 phương pháp thường sử dụng để gel hoá alginat

Phương pháp gel hoá từ bên ngoài là cách tạo gel phổ biến nhất sử dụng alginat Ưu điểm của phương pháp này là khả năng tạo gel nhanh chóng và thao tác thực hiện rất đơn giản.

Khi dung dịch alginat tiếp xúc với cation tạo gel, đặc biệt là Ca2+, bề mặt ngoài của hạt alginat sẽ nhanh chóng gel hóa Các cation này sau đó khuếch tán vào bên trong hạt, khiến các phân tử alginat bên trong cũng bị gel hóa Quá trình này bắt đầu từ bề mặt và dần phát triển vào bên trong, tạo ra gel nhanh chóng, nhưng chất lượng đồng thể của hạt gel không cao.

Hình 1 7: Cơ chế tạo gel từ bên ngoài của alginat [9]

Để tạo gel từ dung dịch alginat, cho các muối chứa cation tạo gel như CaCO3, CaSO4, EDTA-Ca, hoặc calci citrat vào dung dịch Tiếp theo, điều chỉnh pH của dung dịch về mức acid bằng các tác nhân acid hóa như D-glucono-δ-lacton (GDL) Sự giảm pH sẽ làm giảm độ hòa tan của các muối này, giải phóng ion Ca2+ và kích thích quá trình tạo gel với alginat Phương pháp này mang lại hạt gel đồng nhất hơn so với phương pháp khuếch tán, nhờ vào sự phân bố đồng đều của ion Ca2+ Hơn nữa, nó cho phép tạo gel với nhiều hình dạng khác nhau bằng cách đổ dung dịch alginat vào khuôn phù hợp trước khi quá trình tạo gel diễn ra, trong khi phương pháp tạo gel từ bên ngoài chỉ tạo ra hạt hình cầu.

Hình 1 8: Cơ chế tạo gel từ bên trong của alginat [9]

Dung dịch alginat với muối calci ở nhiệt độ cao (90 o C), sau đó được làm lạnh, Phương pháp này không phù hợp với các vật liệu nhạy cảm nhiệt [28]

Việc sử dụng alginat để tạo vi nang giúp bảo vệ enzym NK khỏi tác động của dịch tiêu hóa Tuy nhiên, viên nang thu được sau khi đông khô thường bị méo mó và không tròn đều.

Tình hình nghiên cứu trong và nước ngoài về enzym Nattokinase

Do đặc điểm bị mất hoạt tính khi đi qua môi trường acid dạ dày, nhiều biện pháp đã được áp dụng để bảo vệ NK Nghiên cứu của H Sumi năm

Năm 1990, nghiên cứu cho thấy việc cố định NK trong hạt polyhydroxybutyrat (PHB) có thể tăng cường khả năng kháng acid trong các thử nghiệm in vitro Ngoài ra, NK được chứa trong tế bào hồng cầu đã được phát triển thành công cho ứng dụng tiêm tĩnh mạch, với các tế bào này được cấy vào polypropylen siêu kỵ nước, tạo ra vật liệu chống huyết khối PP.

Eng-Seng Chan và cộng sự (2011) đã nghiên cứu vai trò của tinh bột trong việc cải thiện các tính chất vật lý của hạt calci-alginat đông khô, cho thấy tinh bột không chỉ nâng cao độ hình cầu, độ chảy và độ bền cơ học của hạt mà còn ảnh hưởng tích cực đến khả năng tồn tại của tế bào trong quá trình đông khô và bảo quản Bên cạnh đó, Toshiba Haider và cộng sự (2008) đã cố định d-galactosidase trong chất mang alginat – tinh bột và phát hiện rằng enzym này không bị ảnh hưởng nhiều bởi amylase khi có mặt của tinh bột, chứng tỏ tính ổn định của hạt trong hệ tiêu hóa.

1.4.2 Nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam, các nghiên cứu về cố định enzym protease (đặc biệt là Nattokinase) còn khá ít hoặc chưa có công bố nhiều

Nhóm tác giả Trương Thị Mộng Thu đã thực hiện nghiên cứu về tính chất của protease cố định, sử dụng các phức hợp polyme khác nhau để khảo sát nồng độ alginat Kết quả cho thấy sự tương tác giữa protease và các polyme này có ảnh hưởng đáng kể đến hiệu suất hoạt động của enzym.

Nghiên cứu cho thấy rằng nồng độ tối ưu của chitosan là 0,4% và alginat 2%, giúp tạo ra vi nang có hoạt tính enzym ổn định trong thời gian bảo quản dài Việc ngâm trong nước cho thấy sự thất thoát hoạt tính enzym thấp, đồng thời duy trì hiệu suất cố định enzym cao, phù hợp cho các ứng dụng trong quy trình sản xuất.

Hồ Chí Minh đã thực hiện cố định protease bằng chitosan qua hai phương pháp: liên kết cộng hóa trị và phương pháp bẫy Nghiên cứu cho thấy rằng việc cố định protease theo phương pháp này giúp cải thiện khả năng ổn định nhiệt của enzyme.

14 pháp cộng hóa trị tốt hơn so với phương pháp bẫy (hoạt tính enzym vẫn duy trì 67,24% trong điều kiện 60 o C trong 100 phút) [7]

Trong nghiên cứu về quá trình cố định enzym Nattokinase trong chất mang alginat, dược sĩ Nguyễn Thu Trang đã khảo sát các đặc điểm vi nang ở nhiều nồng độ tinh bột khác nhau Kết quả cho thấy nồng độ tinh bột 4% là lựa chọn tối ưu nhất, giúp bảo vệ Nattokinase hiệu quả trong môi trường dịch vị dạ dày (SGF).

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu và thiết bị

Dạng bào chế: Dạng bột, màu trắng đục

Nguồn gốc: Bộ môn Công nghiệp Dược

2.1.2 Nguyên liệu, hoá chất và thuốc thử

Các hóa chất trong đề tài đều đạt tiêu chuẩn phân tích, được mô tả trong bảng dưới đây:

Bảng 2 1: Nguyên liệu và hóa chất sử dụng

Hóa chất Nguồn gốc Hóa chất Nguồn gốc

Natri alginat Trung Quốc NaOH Trung Quốc

Tinh bột Việt Nam Na2HPO4 Trung Quốc

CaCl2 Trung Quốc KH2PO4 Trung Quốc

NaCl Việt Nam Casein Trung Quốc

HCl Trung Quốc Thạch bột Việt Nam

Các dung dịch sử dụng trong đề tài

Dung dịch Natri alginat 3% được chuẩn bị bằng cách cân 3,00g Natri alginat và phân tán trong 100ml nước cất Sau đó, dung dịch này được hấp tiệt trùng ở nhiệt độ 115 o C trong 20 phút để đảm bảo alginat đồng nhất, và để nguội trước khi tiến hành thí nghiệm.

Dung dịch Calci clorid (CaCl2) 2% (kl/tt): Cân 2,00g CaCl2, hòa tan hoàn toàn trong nước cất vừa đủ 100ml

Dung dịch MT mô phỏng dịch dạ dày pH 1,2 (SGF) (Theo DĐVN V, PL11.4): Pha dung dịch NaCl 0.9%, sau đó dùng HCl 1M hoặc NaOH 1M điều chỉnh về pH 1,2 [1]

Dung dịch MT mô phỏng dịch ruột pH 6,8 (SIF) (Theo DĐVN V, PL11.4): Hòa tan 28,80g Dinatri hydrophosphat và 11,45g Kali dihydrophosphat trong nước cất vừa đủ 1000ml [1]

Bảng 2 2: Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu Tên thiết bị Nguồn gốc Tên thiết bị Nguồn gốc

Cân kỹ thuật Đức (Satorious) Máy lắc ổn nhiệt Trung Quốc

(KWF) Kích lúp soi nổi Đức (Leica EZ4) Nồi hấp tiệt trùng Nhật (ALP) Máy đo đường kính vòng vô khuẩn

Tủ ấm CO2 Nhật (Sanyo)

Máy khuấy từ Hàn Quốc (Wisd) và máy ly tâm Đức (Satorious) là những thiết bị quan trọng trong phòng thí nghiệm Tủ lạnh Thái Lan (Sharp) cùng với tủ lạnh sâu -70 o Hàn Quốc (LG) đảm bảo bảo quản mẫu vật hiệu quả Ngoài ra, máy lắc Trung Quốc (IKA) và thiết bị đông khô Đức (Christ) cũng đóng vai trò thiết yếu trong quy trình nghiên cứu và phát triển.

Nội dung nghiên cứu

1 Khảo sát ảnh hưởng của tinh bột đến quá trình cố định enzym nattokinase trong chất mang alginat

2 Sơ bộ đánh giá ảnh hưởng của tinh bột đến khả năng bảo vệ và giải phóng enzym từ vi nang

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp cố định enzym Nattokinase trong chất mang Alginat và Alginat – Tinh bột

Trong nghiên cứu này, Enzym Nattokinase được cố định vào chất mang alginat và alginat tinh bột thông qua phương pháp gel hóa từ bên ngoài, sử dụng kỹ thuật bẫy tế bào để đảm bảo tính ổn định và hiệu quả của enzym.

Hỗn dịch EZ – Alg 3% được tạo ra từ dung dịch natri alginat 3% đã được làm nguội Sau đó, Enzym Nattokinase được phân tán vào dung dịch alginat, lắc đều và khuấy với tốc độ 500 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 20 phút để đạt được hỗn dịch đồng nhất Cuối cùng, để yên 5 phút nhằm loại bỏ bọt khí.

 Hỗn dịch EZ – Alg 3% – TB (ở các nồng độ tinh bột 2%, 4%, 6%, 8%, 10%): tiến hành tương tự như trên, lúc phân tán cho thêm lượng tinh bột tương ứng

Sử dụng pipet Pasteur nhỏ để nhỏ hỗn dịch polymer EZ – Alg 3% – TB từ độ cao khoảng 15 – 20 cm xuống cốc chứa dung dịch CaCl2 2% sẽ tạo ra hạt cố định Enzym (vi nang) Trong quá trình tạo hạt, cần khuấy đều hỗn dịch Alginat – NK – TB một cách từ từ và liên tục để tránh tinh bột lắng và hình thành bọt khí.

Ngâm hạt trong dung dịch CaCl2 2% trong 30 phút giúp vi nang gel hóa hoàn toàn Sau đó, vớt hạt ra và rửa bằng nước cất để loại bỏ lượng Ca2+ dư thừa.

Vi nang sau khi tạo thành được chứa trong các đĩa petri nhựa đường kính 9cm Quá trình đông khô được tiến hành qua 2 giai đoạn:

Tiến hành đông lạnh trong tủ lạnh sâu ở nhiệt độ -70 o C trong 12 giờ

Tiến hành đông khô ở nhiệt độ -50 o C, áp suất 0.1mbar trong 24 giờ bằng thiết bị đông khô

Trong quá trình đông khô mở nắp các đĩa petri Khi áp suất giảm các phân tử nước sẽ bay hơi chuyển từ thể rắn sang thể hơi

Kết thúc quá trình đông khô, các đĩa petri chứa vi nang được bảo quản trong tủ lạnh (nhiệt độ 2-8 o C) giúp hạn chế sự hút ẩm của vi nang

2.3.3 Phương pháp xác định đường kính vi nang

Thiết bị sử dụng: Máy đo đường kính vòng vô khuẩn Caliper (Tây Ban Nha)

Để xác định đường kính của vi nang, hãy đặt vi nang lên phiến kính, đưa một mép hạt đến vạch giới hạn và ấn set-up Tiếp theo, di chuyển vạch đến mép còn lại của vi nang và ghi lại kết quả đường kính Lặp lại quy trình này để xác định đường kính của n vi nang.

2.3.4 Phương pháp đánh giá hoạt tính protease được cố định trong các mẫu vi nang

Dùng “casein” làm cơ chất, xác định khả năng phân giải protein của protease trên cơ sở đo vòng phân giải casein trên đĩa thạch

Pha 100ml dung dịch với 1% casein và 2% thạch bằng cách phân tán 1g casein và 2g thạch trong cốc có mỏ 200ml, thêm 10 giọt xanh methylen, khuấy đều và đun cho đồng nhất Sau đó, đổ 16ml dung dịch vào các đĩa petri đường kính 9cm Khi thạch đông, tiến hành đục các giếng thạch có đường kính 0,6cm.

Nhỏ 50µl dịch thử vào giếng thạch và ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ Enzym khuyếch tán sẽ làm tan casein, tạo ra các vòng trong suốt Sau đó, tiến hành đo đường kính các vòng này.

Nguyên tắc đánh giá: Hoạt tính enzym còn lại càng nhiều thì vòng phân giải casein trong thử nghiệm đánh giá hoạt tính protease càng lớn

2.3.5 Phương pháp xác định mức độ hút nước của vi nang trong môi trường mô phỏng dịch dạ dày (SGF)

Xác định khối lượng vi nang sau khi đông khô (Wo) và tiến hành ủ trong môi trường mô phỏng dịch dạ dày pH 1,2 trong 30 phút bằng máy lắc điều nhiệt với tốc độ 75 vòng/phút ở 37 oC Sau khi lắc, hạt được vớt bằng lưới và xác định khối lượng ngay lập tức bằng cân phân tích, sau khi đã hấp thu lượng nước thừa bề mặt bằng giấy lọc (WT).

Mức độ hút nước (% Sw) được sử dụng để mô tả khả năng hấp thụ nước để trương nở của viên nang trong điều kiện dạ dày mô phỏng

Mức độ hút nước (% Sw) được tính theo công thức: [17]

WT: khối lượng vi nang sau khi ủ ở thời điểm t

W0: khối lượng ban đầu của vi nang khô tương ứng

2.3.6 Phương pháp quan sát vi nang bằng kính lúp soi nổi Leica EZ4 Đặt thiết bị lên bàn hoặc một bề mặt phẳng và ổn định một khoảng không gian đủ rộng để thao tác Bật nguồn sáng, đặt mẫu ngay chính giữa bàn mang mẫu Điều chỉnh độ phóng đại Điều chỉnh thị kính để lấy được vi trường và quan sát thông qua kính lúp soi nổi mà không gây mỏi mắt Hình ảnh quan sát được chụp lại

2.3.7 Phương pháp đánh giá khả năng bảo vệ enzym của vi nang trong môi trường mô phỏng dịch dạ dày (SGF)

Chuẩn bị môi trường dịch dạ dày mô phỏng (SGF) pH 1,2 và môi trường dịch ruột mô phỏng pH 6,8 (SIF) theo mục 2.1.2

Lấy lượng hạt đông khô phù hợp cho vào bình nón chứa 100ml dung dịch

MT SGF và ủ vi nang trên máy lắc ở 37 o C, tốc độ 75 vòng/phút trong thời gian

30 phút Theo dõi trạng thái vi nang sau đó tách riêng vi nang ra khỏi dịch acid

Vi nang được chuyển vào bình nón chứa 100,0 ml dịch ruột mô phỏng (SIF) và ủ trên máy lắc ở nhiệt độ 37 oC với tốc độ 75 vòng/phút trong 2 giờ Trong suốt quá trình lắc, trạng thái của vi nang được theo dõi liên tục Cuối cùng, tiến hành ly tâm để loại bỏ cặn dưới đáy bình (tinh bột).

Dung dịch SIF sau thí nghiệm được sử dụng để đánh giá hoạt tính protease theo phương pháp ở mục 2.3.4

2.3.8 Phương pháp đánh giá khả năng giải phóng enzym của vi nang trong môi trường mô phỏng dịch ruột (SIF)

Chuẩn bị môi trường dịch ruột mô phỏng pH 6,8 (SIF)

Lấy lượng hạt đông khô phù hợp cho vào bình nón chứa 100ml dung dịch

MT SIF được ủ vi nang trên máy lắc ở 37 oC với tốc độ 75 vòng/phút trong 2 giờ Trong quá trình lắc, theo dõi trạng thái vi nang và tiến hành hút 50 ml dung dịch SIF bằng pipet tại các thời điểm xác định để đánh giá hoạt tính protease theo phương pháp đã nêu ở mục 2.3.4.

Công thức tính phần trăm NK giải phóng

𝐷 𝑐 Trong đó: Dt là đường kính vòng phân giải casein vi nang tại các thời điển t

Dc là đường kính vòng phân giải casein của NK tự do tương ứng

THỰC NGHIỆM – KẾT QUẢ – BÀN LUẬN

Đánh giá ảnh hưởng tinh bột đến khả năng bảo vệ và giải phóng NK từ vi nang

3.2.1 Đánh giá khả năng hút nước của vi nang sau khi qua MT dịch dạ dày mô phỏng SGF

Cấu trúc vi nang vẫn được bảo toàn sau khi tiếp xúc với môi trường acid Tuy nhiên, khi vi nang hấp thụ nước và trương nở, một lượng H+ từ dạ dày có thể thấm vào trong hạt, ảnh hưởng đến hoạt tính của enzym Do đó, cần đánh giá khả năng này một cách cẩn thận.

Năng hấp thụ nước của vi nang sau khi trải qua môi trường dịch dạ dày mô phỏng (SGF) là yếu tố quan trọng trong việc đánh giá khả năng bảo vệ của nó.

Thí nghiệm này được thiết kế để đánh giá khả năng hút nước của vi nang sau khi qua môi trường SGF a) Tiến hành

Việc tạo vi nang calci alginat chứa enzym Nattokinase được thực hiện bằng phương pháp bẫy với chất mang alginat, sử dụng các nồng độ tinh bột từ 0% đến 10% Sau khi cố định enzym Nattokinase, các mẫu hạt sẽ được đông khô theo phương pháp đã nêu Để đánh giá khả năng hút nước của vi nang, tiến hành thí nghiệm với 20 vi nang mỗi loại trong 10ml môi trường SGF, và khối lượng hạt trước và sau khi ủ sẽ được xác định bằng cân phân tích Kết quả thu được sẽ được trình bày chi tiết trong phần tiếp theo.

Sau khi vi nang được ủ trong điều kiện dịch dạ dày mô phỏng, mức độ hút nước (% Sw) của vi nang cụ thể như sau:

Bảng 3 1: Mức độ hút nước (%) của các hạt cố định enzym Nattokinase sau khi ủ trong MT SGF 30 phút

Khối lượng 20 hạt vi nang khô

Khối lượng 20 hạt vi nang sau khi ủ

Mức độ hút nước (% Sw)

Vi nang NK – Alg – TB 10%

Hình 3 4: Hình ảnh vi nang đông khô ban đầu (bên trái) và vi nang trương nở sau khi sau khi qua MT SGF 30 phút (bên phải) c) Nhận xét

Khả năng thấm hút dịch SGF của vi nang giảm dần khi nồng độ tinh bột tăng, với mẫu vi nang NK – Alg đạt phần trăm hút nước cao nhất là 60,25%, trong khi mẫu NK – Alg – TB 10% có phần trăm hút nước thấp nhất là 55,48%.

 Phần trăm hút nước (% Sw)

Sau 30 phút ủ trong môi trường mô phỏng dịch dạ dày (SGF), các hạt chứa enzym Nattokinase đã hấp thụ nước và trương nở, làm tăng kích thước Vi nang có hình dạng thuôn dài hoặc gần giống cầu, với bề mặt nhẵn bóng hơn so với trước khi ủ Điều này có thể được giải thích bởi sự phân tán của tế bào (TB) trong cấu trúc hệ gel alginat, chiếm khoảng không gian xen kẽ giữa các thành phần trong hệ gel.

Cấu trúc bên trong của hạt với 29 lớp đồng tâm ít xốp hơn, dẫn đến lượng tinh bột lớn hơn và giảm thiểu sự hấp thu acid qua các lỗ xốp Do đó, phần trăm hút nước giảm dần theo nồng độ tinh bột Thí nghiệm tiếp theo sẽ đánh giá ảnh hưởng của quá trình hút nước đến hoạt tính enzym của vi nang.

 Khả năng phục hồi cấu trúc

Các hạt vi nang trương nở khi lắc trong môi trường dịch dạ dày mô phỏng (SGF), nhưng không trở lại hình dạng cầu như trước khi đông khô Sự khác biệt này có thể được quan sát qua hình dạng và thể chất của vi nang ngay sau khi tạo hạt và sau khi tiếp xúc với môi trường dịch acid mô phỏng, như được mô tả trong hình 3.4.

Nồng độ tinh bột cao giúp cải thiện khả năng hồi phục hình dạng ban đầu của sản phẩm Sự hiện diện của tinh bột trong cấu trúc vi nang hỗ trợ mạng gel, giảm thiểu sự phá vỡ cấu trúc trong quá trình đông khô và góp phần vào việc phục hồi cấu trúc hiệu quả hơn.

3.2.2 Đánh giá khả năng bảo vệ NK khi ủ ở MT dịch dạ dày mô phỏng

Tiến hành thí nghiệm theo các điều kiện sau:

- Khảo sát các vi nang đông khô có nồng độ tinh bột: 0%, 2%, 4%, 6%,

+ Tốc độ khuấy 75 vòng/phút

Mẫu thử: Cân lượng vi nang (tương đương 0,083g NK) mỗi loại NK – Alg

Đánh giá khả năng bảo vệ vi nang TB (0%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%) sau khi đi qua môi trường SGF được thực hiện bằng cách đo đường kính vòng phân giải casein của dịch phá hạt, như đã trình bày ở mục 2.3.6 và 2.3.8.

Mẫu chứng: Cân lượng vi nang (tương đương 0,083g NK) mỗi loại NK –

Alg – TB (0%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%) sau đông khô vào 100ml MT SIF Khuấy

Máy lắc điều nhiệt được thiết lập ở 37ºC với tốc độ khuấy 75 vòng/phút để khuấy đều các mẫu cho đến khi tan hoàn toàn Sau đó, ly tâm để thu lấy dịch trong và tiến hành đánh giá hoạt tính protease của các dịch này sau khi ủ trong môi trường SIF theo phương pháp đã nêu Kết quả cho thấy đường kính vòng phân giải casein ở các mẫu NK – Alg – TB với các nồng độ tinh bột khác nhau sau khi xử lý trong môi trường SGF được trình bày trong hình dưới đây.

Hình 3 4: Vòng phân giải casein của NK được cố định trong vi nang

NK – Alg – TB sau thời gian ngâm trong dịch SGF và SIF

A: Thử nghiệm ở MT SGF 30 phút sau đó chuyển sang MT SIF 2 giờ B: Thử nghiệm ở MT SIF

Trong đó 0, 2 ,4 ,6 ,8 ,10: là nồng độ tinh bột trong thành phần vi nang

Bảng 3 2: Đường kính vòng phân giải casein khi thử nghiệm khả năng bảo vệ vi nang

D vòng phân giải casein sau khi qua MT SGF 30 phút sau đó chuyển sang MT SIF 2 giờ

D vòng phân giải vi nang sau khi qua

Đường kính vòng phân giải casein trong thí nghiệm ủ ở môi trường SIF trong 2 giờ thường lớn hơn so với đường kính vòng phân giải casein của vi nang khi ủ ở môi trường SGF trong 30 phút, sau đó chuyển sang môi trường SIF trong 2 giờ Điều này cho thấy sự khác biệt rõ rệt trong khả năng bảo vệ của casein đối với vi nang tùy thuộc vào điều kiện ủ.

Qua MT SGF 30 phút sau đó chuyển sang MT SIF 2 giờ Qua MT SIF

Dù vi nang không bị rã và vẫn giữ được cấu trúc alginat bao gói enzym bên trong, nhưng vẫn có một lượng acid thấm vào, gây trương nở hạt và phá hủy enzym, dẫn đến giảm hoạt tính enzym.

Khi nồng độ tinh bột tăng từ 2% đến 10%, đường kính vòng phân giải casein tăng từ 18.79mm lên 21.56mm, đạt cao nhất tại nồng độ 6% và sau đó giảm xuống 15.37mm Sự hiện diện của tinh bột làm giảm độ xốp của vi nang và thay đổi kích thước lỗ xốp, ảnh hưởng đến khả năng bảo vệ hoạt tính enzym và khả năng rã vi nang trong dịch tiêu hóa mô phỏng Khi nồng độ tinh bột tăng, lượng acid xâm nhập vào vi nang qua môi trường SGF giảm nhẹ, dẫn đến khả năng bảo vệ vi nang tốt hơn Kết quả này phù hợp với thí nghiệm đánh giá khả năng hút nước của vi nang trong môi trường SGF.

Khi nồng độ tinh bột trong vi nang vượt quá 8-10%, hoạt tính enzym giảm, thể hiện qua việc đường kính vòng phân giải casein giảm đáng kể Nồng độ tinh bột cao làm giảm độ xốp của vi nang, ảnh hưởng đến quá trình giải phóng enzym Các thí nghiệm tiếp theo sẽ đánh giá khả năng giải phóng enzym NK của các mẫu vi nang có nồng độ tinh bột cao này.

3.2.3 Đánh giá khả năng giải phóng NK khi ủ vi nang ở MT dịch ruột mô phỏng SIF a) Tiến hành

Sử dụng vi nang đông khô đã tạo, tiến hành đánh giá khả năng giải phóng enzym NK trong môi trường SIF Cân mỗi loại vi nang NK – Alg – TB (0%, 2%, 4%, 6%, 8%, 10%) tương đương 0,042g NK sau khi đông khô Lấy mẫu dung dịch SIF tại các thời điểm 15 phút, 1 giờ và 2 giờ để đánh giá hoạt tính protease và tính phần trăm NK giải phóng theo phương pháp đã mô tả.