TỔNG QUAN
Indazol và các dẫn chất mang khung indazol
Indazol là một hợp chất quan trọng trong nhóm dị vòng chứa nitơ, nổi bật với sự đa dạng trong cấu trúc của các dẫn xuất Chất này đã thu hút sự chú ý đáng kể trong cả quá khứ và hiện tại, nhờ vào nhiều ứng dụng sinh học và dược phẩm của nó.
Indazol là một hợp chất có cấu trúc vòng bicyclic, được hình thành từ sự kết hợp của vòng pyrazol và benzen Hợp chất này tồn tại dưới hai dạng đồng phân là 1H-indazol và 2H-indazol, trong đó 1H-indazol chiếm ưu thế nhờ vào tính ổn định nhiệt động học cao hơn.
Hình 1.1 Các đồng phân của indazol
Indazol là một hợp chất hiếm gặp trong tự nhiên, với chỉ một số ít alkaloid được chiết xuất có chứa vòng indazol, chẳng hạn như Nigellicin từ cây Nigella sativa và Nigeglanin từ Nigella routeulifera.
Hình 1.2 Các chất chứa vòng indazol trong tự nhiên
Các hợp chất chứa khung indazol đã được ứng dụng rộng rãi trong ngành dược phẩm nhờ vào các tác dụng dược lý đa dạng như kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư và kháng HIV Các dẫn xuất indazol đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc cơ bản của nhiều phân tử thuốc, chẳng hạn như granisetron, một chất đối kháng thụ thể 5-HT3 được sử dụng làm thuốc chống nôn trong điều trị hóa trị ung thư.
[14], Benzydamin là một chất chống viêm [14], [40], hay như asitinib, một chất được FDA phê duyệt năm 2012 để điều trị ung thư biểu mô tế bào thận (hình 1.3) [16]
Hình 1.3 Một số thuốc mang cấu trúc indazol
Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất indazol
1.2.1 Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất indazol trên các đích khác nhau
1.2.1.1 Các dẫn chất indazol ức chế tyrosin kinase
Tyrosin kinase là một nhóm enzym quan trọng, có vai trò trong việc vận chuyển gốc phosphat từ ATP đến tyrosin của protein, ảnh hưởng đến sự tăng sinh, biệt hóa và tồn tại của tế bào Tuy nhiên, khi hoạt động quá mức, tyrosin kinase có thể góp phần vào sự phát triển của tế bào ung thư Do đó, ức chế hoạt động của enzym này trở thành một chiến lược điều trị ung thư quan trọng Các thụ thể như yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FFR), yếu tố tăng trưởng biểu bì (EFR) và yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEFR) là những mục tiêu mà các dẫn chất indazol nhắm đến trong nghiên cứu và phát triển thuốc điều trị.
Năm 2017, Zhu W và cộng sự đã tổng hợp một loạt dẫn chất 1H-indazol nhằm ức chế nhiều tyrosin kinase Chất 1 (hình 1.4) cho thấy tác dụng ức chế mạnh đối với FFR-1,2,3 với IC50 lần lượt là 18,0 nM, 1,6 nM và 27,5 nM, đồng thời ức chế EFR và dạng đột biến T790M/L858R với IC50 là 4,7 nM và 6,0 nM Nhóm nghiên cứu cũng thử độc tính của chất 1 trên các dòng tế bào ung thư dạ dày, phổi, tủy xương, thận và bàng quang, cho thấy chất 1 ức chế sự tăng sinh của 12 dòng tế bào ung thư với IC50 từ 0,4 nM đến 447,6 nM.
Hình 1.4 Dẫn chất 1H-indazol ức chế tyrokin kinase đa mục tiêu
Năm 2018, Qi Wang và cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất của 1H-indazol nhằm ức chế nhiều tyrosin kinase Kết quả cho thấy chất 2 (hình 1.5) có khả năng ức chế enzym hiệu quả với giá trị IC50 tương ứng cho từng phân tử đích là 31,1 nM (FFR).
1) và 3,2 nM (DDR2) Tiếp sau đó, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thử độc tính của chất
Chất 2 đã được thử nghiệm trên năm dòng tế bào ung thư, bao gồm ung thư dạ dày, ung thư bạch cầu, ung thư biểu mô tuyến đại trực tràng, ung thư biểu mô phổi và ung thư biểu mô thận Kết quả cho thấy chất 2 ức chế sự tăng sinh của cả năm dòng tế bào này với giá trị IC50 dao động từ 31,8 đến 306,6 nM.
Hình 1.5 Cấu trúc dẫn chất mang khung indazol của Qi Wang và cộng sự
1.2.1.2 Các dẫn chất indazol ức chế indoleamin 2,3-dioxygenase 1
Indoleamin 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) là một enzym quan trọng trong quá trình chuyển hóa tryptophan qua con đường kynurenin, chiếm tới 95% tổng lượng tryptophan được chuyển hóa Quá trình này đóng vai trò then chốt trong việc ức chế miễn dịch liên quan đến ung thư Hoạt tính của enzym IDO1 ở các tế bào ung thư thường mạnh hơn so với tế bào bình thường, và sự hoạt động quá mức của nó đã được ghi nhận trong nhiều loại ung thư, bao gồm ung thư đại trực tràng, ung thư biểu mô vòm họng, ung thư tuyến tụy và ung thư phổi không phải tế bào nhỏ.
Nghiên cứu cho thấy IDO1 ức chế miễn dịch thông qua hai cơ chế chính: giảm nồng độ tryptophan và độc tính từ các chất chuyển hóa trong con đường kynurenin.
Hoạt động của IDO1 làm tăng chuyển hóa tryptophan, dẫn đến giảm nồng độ tryptophan, ngăn chặn chu trình tế bào và tăng tính nhạy cảm với sự chết tế bào theo chương trình của tế bào lympho T Hơn nữa, các chất chuyển hóa qua con đường kynurenin trực tiếp ức chế chu trình tế bào, kích hoạt sự chết tế bào theo chương trình hoặc gián tiếp ngăn chặn tế bào.
IDO1 đóng vai trò quan trọng trong việc giúp tế bào ung thư lẩn tránh hệ miễn dịch và kháng lại các liệu pháp điều trị thông qua việc biệt hóa tế bào T ức chế (Treg) Nghiên cứu lâm sàng cho thấy bệnh nhân có nồng độ IDO1 thấp thường đáp ứng tốt hơn với các phương pháp điều trị Vì vậy, IDO1 được xem là một mục tiêu tiềm năng cho các chiến lược điều trị ung thư, dẫn đến việc phát triển mạnh mẽ các chất ức chế IDO1.
Hình 1.6 Cơ chế lẩn tránh miễn dịch thông qua IDO
Năm 2017, Manna và cộng sự đã tổng hợp các dẫn chất 1H-indazol nhằm ức chế enzym IDO1 Kết quả cho thấy trong số các dẫn chất được tổng hợp, có một chất nổi bật.
3 và 4 (hình 1.7) cho hoạt tính ức chế enzym mạnh nhất với giá trị IC50 tương ứng là
Hình 1.7 Dẫn chất 1H-indazol ức chế IDO1
1.2.1.3 Các dẫn chất indazol ức chế serin/threonin kinase (STK)
Serin/threonine kinase là một nhóm enzym quan trọng trong hoạt động sinh lý của tế bào, nhưng sự biểu hiện quá mức của chúng có thể góp phần vào sự hình thành một số loại ung thư Do đó, một trong những chiến lược điều trị ung thư hiện nay là phát triển các chất ức chế cho một số serine/threonine kinase như CDK, PLK-4 và ERK1/2.
Nhóm nghiên cứu của Mallinger đã phát triển một loạt dẫn chất 1H-indazol nhằm ức chế CDK, trong đó dẫn chất 5 (hình 1.8) cho thấy khả năng ức chế chọn lọc mạnh mẽ CDK8 (IC50 = 2,3 ± 0,8 nM) và CDK9 (IC50 = 2,6 ± 0,4 nM) Ngoài ra, nghiên cứu còn cho thấy chất 5 có khả năng ức chế con đường truyền tín hiệu WNT trong tế bào ung thư biểu mô tuyến trực tràng.
Hình 1.8 Dẫn chất 1H-indazol ức chế CDK
Nhóm nghiên cứu của Cao đã tổng hợp các dẫn chất từ chất đường 6 và thử nghiệm khả năng ức chế hoạt động của enzym ERK1/2 Kết quả cho thấy ba chất 7, 8, 9 có tác dụng ức chế enzym rất hiệu quả với giá trị IC50 từ 9,3 đến 25,8 nM Khi thử độc tính của ba chất này trên dòng tế bào ung thư đại trực tràng, IC50 của chúng dao động từ 0,9 đến 6,1 µM, cho kết quả khả quan.
Hình 1.9 Dẫn chất 1H-indazol ức chế ERK1/2
1.2.2 Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol trên các đích khác nhau
1.2.2.1 Các dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế tyrosin kinase
Nhiều dẫn chất tại vị trí số 6 có hoạt tính chống ung thư mạnh mẽ, trong đó pazopanib nổi bật như một chất ức chế tyrosin kinase được FDA phê duyệt vào năm 2009 để điều trị ung thư biểu mô tế bào thận tiến triển Pazopanib ức chế chọn lọc và hiệu quả với VEFR - 1,2,3 Nghiên cứu cho thấy sự kết hợp giữa 3-methylindazol và chuỗi pyrimidin qua cầu nối nitơ tại vị trí số 6 có vai trò quan trọng trong việc tăng cường hoạt tính và sinh khả dụng đường uống Trong thử nghiệm lâm sàng pha III, pazopanib đã chứng minh hiệu quả vượt trội trong việc cải thiện tỷ lệ đáp ứng và kéo dài thời gian không tiến triển của bệnh ở cả bệnh nhân chưa điều trị và bệnh nhân đã điều trị bằng cytokin trước đó.
Hình 1.10 Cấu trúc của pazopanid
Năm 2018, Zang và các đồng nghiệp đã tổng hợp các dẫn chất dựa trên cấu trúc của pazopanid nhằm ức chế đồng thời cả VEFR và HDAC, trong đó có chất 10.
Chất 10 cho thấy tác dụng ức chế VEFR tương đương với pazopanib, với IC50 lần lượt là 0,037 μM và 0,034 μM Ngoài ra, chất này còn ức chế HDAC mạnh mẽ hơn so với SAHA, với IC50 là 0,0033 μM so với 0,13 μM của SAHA Kết quả thử độc tính tế bào cho thấy chất 10 ức chế tế bào ung thư đại trực tràng HT29 hiệu quả hơn SAHA, với IC50 lần lượt là 1,07 μM và 1,51 μM.
Hình 1.11 Dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế nhiều tyrosin kinase
Một số phản ứng liên quan đến tổng hợp dẫn chất indazol
1.3.1 Các phản ứng hóa học cơ bản
1.3.1.1 Phản ứng N-alkyl hóa theo Hoffman Đây là phản ứng thế ái nhân lưỡng phân tử (SN2) giữa tác nhân ái nhân là amoniac hoặc amin với các alkyl halogenid [1]
Các amin có tính ái nhân yếu cần sử dụng chất xúc tác là base để chuyển đổi từ dạng phân tử sang dạng anion, từ đó tăng cường tính ái nhân và làm cho phản ứng diễn ra dễ dàng hơn.
Tỷ lệ mol của các chất tham gia phản ứng quyết định mức độ alkyl hóa sản phẩm, ảnh hưởng đến tỷ lệ tạo thành các bậc amin Việc lựa chọn tỷ lệ mol phản ứng ban đầu là rất quan trọng Thông thường, các alkyl halogenid có mạch carbon ngắn như methyl halogenid và ethyl halogenid, thường ở dạng lỏng với nhiệt độ sôi thấp, được sử dụng trong quá trình này, chẳng hạn như CH3I với nhiệt độ sôi 42°C.
1.3.1.2 Phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm
Khử hóa là quá trình giảm độ oxy hóa của các chất, trong đó hợp chất hữu cơ tiếp nhận nguyên tử hydro, loại bỏ các dị tố như oxy, hoặc nhận thêm điện tử Quá trình này đặc biệt quan trọng trong ngành hóa dược, nhất là trong việc khử các nitro thơm thành amin.
Tác nhân khử hóa được phân loại thành ba nhóm chính: thứ nhất là tác nhân khử hóa hóa học, bao gồm kim loại trong môi trường acid và kiềm, hỗn hống kim loại, kim loại kết hợp với amin, và các hydride kim loại Thứ hai là tác nhân khử hóa là hydro phân tử kết hợp với xúc tác Cuối cùng là tác nhân khử hóa điện hóa.
Kim loại trong môi trường acid, như Fe/HCl hoặc Sn/HCl, thường được sử dụng để khử nhóm nitro thơm thành amin Phương pháp này có hiệu quả cao khi kết hợp với hydro phân tử và chất xúc tác.
• Sắt trong môi trường acid (phản ứng Bechamp)
Phản ứng khử hóa bằng tác nhân Fe trong môi trường acid HCl, được biết đến là phản ứng Bechamp, đóng vai trò quan trọng trong việc điều chế các amin thơm trong công nghiệp Phản ứng này diễn ra theo một phương trình hóa học cụ thể, mang lại ý nghĩa thực tiễn lớn.
Sơ đồ 1.1 Phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm bằng sắt trong môi trường acid
• Thiếc trong môi trường acid
Tác nhân khử thiếc có khả năng khử nhiều hợp chất, nhưng do giá thành cao nên việc ứng dụng trong công nghiệp còn hạn chế Trong khi đó, khử hóa bằng hydro phân tử chỉ diễn ra hiệu quả khi có mặt xúc tác, vì hydro ở điều kiện thường ít phản ứng Độ hoạt hóa của xúc tác được đo bằng lượng hydro hấp phụ trên một đơn vị khối lượng, và có thể sử dụng riêng hoặc kết hợp với chất mang để giảm chi phí, đặc biệt khi sử dụng các kim loại quý.
1.3.1.3 Phản ứng amin hóa khử
Khi các hợp chất carbonyl như aldehyd và ceton phản ứng với amoniac hoặc amin bậc 1, 2, kèm theo tác nhân khử, sẽ tạo ra amin bậc 1, 2, 3 tương ứng Phản ứng này diễn ra qua hai giai đoạn.
Trong giai đoạn 1, hợp chất chứa nhóm carbonyl phản ứng với amoniac hoặc amin để tạo thành imin, đồng thời thải ra một phân tử nước Đây là phản ứng cộng hợp ái nhân vào nhóm carbonyl, thường sử dụng acid để proton hóa nguyên tử oxy, giúp amin dễ dàng tấn công hơn.
Việc sử dụng quá nhiều acid sẽ giảm tính ái nhân của amin, dẫn đến hiệu suất phản ứng kém Do đó, phản ứng nên được thực hiện trong môi trường acid yếu để tối ưu hóa kết quả.
Sơ đồ 1.2 Giai đoạn tạo hợp chất trung gian imin
Giai đoạn 2 là quá trình hình thành các imin mạch hở, tuy nhiên chúng thường không bền và dễ bị khử hóa thành amin Quá trình này có thể xảy ra dưới tác động của nhiều tác nhân, trong đó có hydro phân tử kết hợp với xúc tác kim loại nặng như bạch kim (Pt).
NaBH3CN là một trong những dẫn chất boron quan trọng, được sử dụng rộng rãi như chất xúc tác trong các phản ứng amin hóa khử Chất này nổi bật nhờ khả năng khử chọn lọc liên kết C=N của nhóm imin trong môi trường acid yếu, giúp hạn chế sự hình thành sản phẩm phụ là các alcol.
Sơ đồ 1.3 Giai đoạn khử hóa tạo sản phẩm amin
1.3.2 Một số phương pháp tổng hợp dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol
Năm 1996, nhóm nghiên cứu của Morel đã khử nhóm nitro thơm của 1-methyl-6-nitro-1H-indazol bằng SnCl2 trong môi trường acid, ở nhiệt độ 100-110°C trong 2 giờ Sau phản ứng, hỗn hợp được kiềm hóa bằng KOH và chiết với diethyl ether Dung môi hữu cơ được làm khan bằng Na2SO4 và cất quay chân không để loại bỏ dung môi Sản phẩm cuối được kết tinh lại bằng hệ dung môi EtOH:H2O với tỷ lệ 90:10, đạt hiệu suất phản ứng 86%.
Sơ đồ 1.4 Tổng hợp 1-methyl-1H-indazol-6-amin bằng tác nhân khử hóa hóa học
Vào năm 2019, nhóm nghiên cứu của Terentjeva S và cộng sự cũng đã tiến hành phản ứng khử nhóm nitro thơm của 6-nitro-1,3-dimethyl-1H-indazol với tác nhân khử
Hóa hydro phân tử với xúc tác Pd/C trong dung môi MeOH được thực hiện ở nhiệt độ phòng, sau đó lọc bỏ xúc tác để thu được muối với HCl Sản phẩm thu được là chất rắn màu trắng với hiệu suất đạt 81%.
Sơ đồ 1.5 Tổng hợp 1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin bằng khí H 2 với xúc tác Pd/C
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu, thiết bị sử dụng
Các dung môi và hóa chất sử dụng trong tổng hợp hóa học chủ yếu được cung cấp bởi các hãng Merck (Đức), AKSci (Mỹ) và Trung Quốc Những hóa chất này được sử dụng trực tiếp mà không qua quá trình tinh chế, và được liệt kê trong bảng 2.1 dưới đây.
Bảng 2.1 Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu
STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc, xuất xứ
1 3-methyl-6-nitro-1H-indazol Trung Quốc
10 Ethyl acetat (EtOAc) Trung Quốc
13 Acid acetic (AcOH) Trung Quốc
22 Bản mỏng silicagel 60 F254 Merck - Đức
Dụng cụ thủy tinh trong phòng thí nghiệm bao gồm nhiều loại thiết bị quan trọng như bình cầu đáy tròn, đũa thủy tinh, bình chịu áp Sigma-Aldrich, sinh hàn, pipet chia vạch, cốc thủy tinh, phễu lọc, phễu Buchner, bình nón, bình chiết và ống đong Những dụng cụ này hỗ trợ hiệu quả trong các thí nghiệm và quy trình nghiên cứu khoa học.
- Cân kĩ thuật điện tử Shimadzu (Nhật Bản)
- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC (Đức)
- Bơm hút chân không DIVAC.1.21 (Mỹ)
- Máy cất quay Buchi R-210 (Thụy Sĩ)
- Máy sinh khí Hydro PH200 (Mỹ) tại Bộ môn Hóa Dược – Trường Đại học Dược
- Thiết bị Hydrogen hóa 3911-PAR (Mỹ) tại bộ môn Hóa Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội
Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 MHz sử dụng chất chuẩn nội Tetramethylsilan (TMS) của Bruker BioSpin (Thụy Sĩ) đang được áp dụng tại khoa hóa, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân JEOL JNM-LA 300 MHz và máy đo phổ Bruker Avance 500 MHz cùng 125 MHz, sử dụng TMS làm chất chuẩn nội tại, đang được sử dụng tại Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc.
- Sắc kí lớp mỏng (TLC): được tiến hành trên bản mỏng Silicagel kieselgel 60
- Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện MPA 120 (Mỹ) tại bộ môn Hóa Hữu Cơ – Trường Đại học Dược Hà Nội
Máy đo phổ khối lượng LTQ-Orbitrap của hãng Thermo-Scientific (Mỹ) hiện đang được sử dụng tại Khoa Hóa Học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Đồng thời, máy đo phổ khối LC-MSD-Trap-SL của hãng Agilent (Mỹ) cũng được trang bị tại Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc.
- Máy đo phổ hồng ngoại FTIR Affinity-IS-Shimadzu (Nhật Bản) tại Khoa Hóa Học – Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội
Nội dung nghiên cứu
- Tổng hợp 7 dẫn chất của 1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin, bao gồm:
+ 1,3-dimethyl-N-(pyridin-3-ylmethyl)-1H-indazol-6-amin
- Kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được
- Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được
2.2.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư
Sau khi tổng hợp và tinh chế các dẫn chất 1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin, cấu trúc của chúng được xác định và tiến hành thử nghiệm độc tính trên một số loại tế bào ung thư, bao gồm A549 (tế bào ung thư phổi), SK-HEP-1 (tế bào ung thư biểu mô tế bào gan), SNU-638 (tế bào ung thư dạ dày), MDA-MB-231 (tế bào ung thư vú) và HCT116 (tế bào ung thư đại trực tràng).
Phương pháp nghiên cứu
Dựa trên nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ, chúng tôi thực hiện tổng hợp các dẫn chất theo thiết kế Các phản ứng hóa học được áp dụng trong quá trình này bao gồm nhiều kỹ thuật khác nhau nhằm đạt được sản phẩm mong muốn.
+ Phản ứng N-methyl hóa với tác nhân CH3I trong dung môi DMF, dùng K2CO3 làm tác nhân hoạt hóa, tiến hành ở 60 o C
+ Phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm dùng tác nhân khử là H2 phân tử với xúc tác 10% Pd/C ở nhiệt độ phòng
+ Phản ứng amin hóa khử với các aldehyd hoặc ceton, sử dụng tác nhân khử hóa hóa học NaBH3CN, tiến hành ở 40 o C
+ Một số phản ứng cơ bản khác
- Theo dõi tiến trình phản ứng bằng TLC
- Tinh chế các chất tổng hợp được bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng hoặc sắc kí cột hở
2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết
Kiếm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và đo nhiệt độ nóng chảy
2.3.1.3 Khẳng định cấu trúc của chất tổng hợp được
Sau khi tổng hợp và tinh chế, các chất được đánh giá độ tinh khiết và xác định cấu trúc thông qua các phương pháp phổ, bao gồm phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), và phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) cũng như carbon (13C-NMR).
2.3.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư invitro
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư người in vitro được thực hiện tại Khoa Dược, Trường Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc, sử dụng phương pháp Sulforhodamin B (SRB) Giá trị IC50 được tính toán thông qua phần mềm Probits.
Hàm lượng protein tổng số trong tế bào có mối liên hệ tỷ lệ thuận với mật độ quang (Optical Density - OD) được đo sau khi nhuộm bằng Sulforhodamin B, cho phép xác định số lượng tế bào sống sót dựa trên khả năng gắn kết của các acid amin trong protein với thuốc nhuộm.
2.3.2.2 Các dòng tế bào thử nghiệm
Các dòng tế bào thử nghiệm bao gồm:
- A549 (tế bào ung thư phổi)
- SK-HEP-1 (tế bào ung thư biểu mô tế bào gan)
- SNU-638 (tế bào ung thư dạ dày)
- MDA-MB-231 (tế bào ung thư vú)
- HCT116 (tế bào ung thư đại trực tràng)
Các dòng tế bào được mua từ Viện bảo tàng giống chuẩn Hoa Kỳ (ATCC, Manassas, VA, USA) và được nuôi cấy trong môi trường DMEM hoặc RPMI 1640 Môi trường nuôi cấy này được bổ sung với penicillin, streptomycin, amphotericin B, heparin, chất kích thích tăng trưởng tế bào và huyết thanh bò chửa (FBS) để đảm bảo sự phát triển và sinh trưởng tối ưu của tế bào.
2.3.2.3 Chất chuẩn đối chiếu dương tính
Etoposide pha trong DMSO được sử dụng làm chất đối chiếu dương tính
Các tế bào ở pha logarit được trypsin hóa và phân tán thành hỗn dịch đơn tế bào trong môi trường DMEM hoặc RPMI có bổ sung 10% FBS, điều chỉnh đến nồng độ 2 x 10^4 tế bào Sau đó, hỗn dịch này được chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng chứa 180 μL Các đĩa được ủ ở 37 độ C trong môi trường có 5% CO2.
Sau 24 giờ ủ, các mẫu thử được chuẩn bị trong 20 μL môi trường DMEM/RPMI bổ sung 10% FBS từ dung dịch gốc trong dimethylsulfoxid (DMSO) rồi được thêm vào các đĩa ở nhiều nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó được ủ thêm 48 giờ Tất cả các mẫu được chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO là nhỏ hơn 0,1%
Các tế bào được cố định bằng 50 μL dung dịch tricloroacetic 50% lạnh, sau đó ủ ở 4°C trong 1 giờ Sau khi cố định, tế bào được rửa sạch 5 lần bằng nước máy.
Các đĩa được để khô trong không khí, sau đó được nhuộm với sulforhodamin B 0,4% trong dung dịch acid acetic 1% trong 30 phút Sau khi nhuộm, các đĩa được rửa bằng acid acetic 1% để loại bỏ thuốc nhuộm không kết dính.
Các đĩa được để khô ở nhiệt độ phòng, sau đó phần thuốc nhuộm còn lại sẽ được hòa tan trong 200 μL dung dịch 10 mM Tris-base không đệm (pH 10,0) Độ hấp thụ được đo bằng thiết bị ELISA tại bước sóng 515 nm.
Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà độ hấp thụ giảm 50% so với nhóm chứng, với nhóm trắng âm tính chỉ chứa dung môi Kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của bốn lần đo độc lập, trong đó độ hấp thụ không chênh lệch quá 5% Giá trị IC50 được tính toán bằng phần mềm Probits.
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ
Hóa học
Quá trình tổng hợp 7 chất Va-g trong khóa luận được thực hiện theo sơ đồ quy trình chung như sau:
Sơ đồ 3.1 Sơ đồ tổng hợp chung
Trong đó, các nguyên liệu IVa-g được trình bày trong bảng 3.1
Bảng 3.1 Các nguyên liệu IVa-g
3.1.1.1 Tổng hợp dẫn chất trung gian 1,3-dimethyl-6-nitro-1H-indazol (II)
Hợp chất 1,3-dimethyl-6-nitro-1H-indazol (II) được tổng hợp từ 3-methyl-6-nitro-1H-indazol (I) thông qua phản ứng N-methyl hóa với tác nhân CH3I, có sự hiện diện của xúc tác K2CO3, theo sơ đồ 3.2.
Sơ đồ 3.2 Sơ đồ tổng hợp chất II
- Hòa tan 0,708 g (4 mmol) chất I vào 20,00 mL DMF khan trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 mL, sau đó thêm 1,106 g (8,0 mmol) K2CO3
- Khuấy hỗn hợp trong bình ở 60 o C trong khoảng 1 giờ
- Thêm 0,5 mL (8 mmol) CH3I vào bình phản ứng Tiếp tục khuấy hỗn hợp ở 60 o C trong 3 giờ
- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là EtOAc:n-hexan = 1:1
- Làm lạnh bình phản ứng đến nhiệt độ phòng
- Phân tán khối phản ứng vào 25 mL nước cất
- Chiết thu sản phẩm bằng dung môi EtOAc (3 lần, mỗi lần 40 mL), gộp dịch chiết chung của cả 3 lần chiết
- Lắc dịch chiết với NaCl bão hòa, sau đó làm khan bằng Na2SO4
- Tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột hở với hệ dung môi EtOAc:n-hexan, chất II thu được ở hệ EtOAc:n-hexan = 15:85
- Cất quay chân không ở 70 o C loại dung môi
- Sấy khô trong tủ sấy chân không thu được 0,399 g sản phẩm II
- Cảm quan: Chất rắn màu vàng
- Rf = 0,56 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)
3.1.1.2 Tổng hợp dẫn chất trung gian 1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (III)
Hợp chất 1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (III) được tổng hợp từ chất II thông qua phản ứng hydrogen hóa, sử dụng khí H2 được hấp phụ trên Pd/C, theo sơ đồ 3.3.
Sơ đồ 3.3 Sơ đồ tổng hợp chất III
- Hòa tan 0,382 g (2 mmol) chất II vào 10,00 mL MeOH trong bình phản ứng
Thêm từ từ 50 mg 10% Pd/C Lắp bình phản ứng vào thiết bị Hydrogen hóa,
- Khí H2 được tạo thành trong máy sinh khí hydro và chuyển vào thiết bị Hydrogen hóa
- Đuổi không khí khỏi bình phản ứng bằng cách sục khí H2 từ thiết bị Hydrogen hóa vào bình phản ứng nhiều lần
- Thêm khí H2 vào bình phản ứng đến áp suất 3,5 bar Hỗn hợp được hydro hóa ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ
- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động EtOAc:n-hexan = 1:1
- Khối phản ứng được lọc qua Celite, rửa bằng MeOH
- Dịch lọc được cất quay chân không ở 50 o C để loại dung môi
- Tinh chế sản phẩm bằng sắc ký cột silicagel với pha động EtOAc:n-hexan, chất
III thu được ở hệ EtOAc:n-hexan = 50:50
- Cất quay chân không ở 50 o C loại dung môi
- Sấy khô trong tủ hút chân không thu được 0,290 g sản phẩm III
- Cảm quan: Chất rắn màu nâu đỏ
- Rf = 0,36 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)
3.1.1.3 Tổng hợp các dẫn chất 1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin
Các dẫn chất Va-g được tạo ra thông qua phản ứng amin hóa khử giữa chất III và các aldehyd hoặc ceton (IVa-g), với tác nhân khử NaBH3CN Trong đó, quá trình tổng hợp chất Va diễn ra hiệu quả nhờ vào phương pháp này.
Tổng hợp N-isopropyl-1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (Va) từ nguyên liệu 1,3- dimethyl-1H-indazol-6-amin (III) và aceton (IVa) theo sơ đồ 3.4 như sau:
Sơ đồ 3.4 Sơ đồ tổng hợp chất Va
- Hòa tan 0,161 g (1 mmol) chất III và 0,058 g (1 mmol) chất IVa vào hỗn hợp dung môi gồm 0,28 mL (5 mmol) AcOH và 10,0 mL MeOH trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 mL
- Khuấy hỗn hợp trong bình ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó thêm 0,314 g (5,0 mmol) NaBH3CN
- Khuấy hỗn hợp ở 40 o C trong 4 giờ Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là EtOAc:n-hexan = 1:1
- Pha loãng khối phản ứng với 25 mL DCM
- Chiết với dung dịch NaHCO3 bão hòa (3 lần, mỗi lần 30 mL), gộp pha dung môi hữu cơ của cả 3 lần chiết
- Lắc với NaCl bão hòa, sau đó làm khan bằng Na2SO4
- Tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột hở với hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 6:4
- Cất quay chân không ở 50 o C loại dung môi
- Sấy khô trong tủ sấy chân không thu được 0,182 g sản phẩm Va
- Cảm quan: Chất rắn màu hồng
- Rf = 0,49 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)
Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể ở mục 3.1.3 b) Tổng hợp chất Vb
Tổng hợp N-cyclopentyl-1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (Vb) từ nguyên liệu
1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (III) và cyclopentanon (IVb) theo sơ đồ 3.5 như sau:
Sơ đồ 3.5 Sơ đồ tổng hợp chất Vb
➢ Các bước tiến hành và xử lý phản ứng tương tự như chất Va, thay 0,058 g chất IVa bằng 0,084 g (1 mmol) chất IVb Thu được 0,216 g sản phẩm Vb
- Cảm quan: Chất rắn màu trắng
- Rf = 0,51 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)
Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể ở mục 3.1.3 c) Tổng hợp chất Vc
Tổng hợp N-cyclohexyl-1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (Vc) từ nguyên liệu 1,3- dimethyl-1H-indazol-6-amin (III) và cyclohexanon (IVc) theo sơ đồ 3.6 như sau:
Sơ đồ 3.6 Sơ đồ tổng hợp chất Vc
➢ Các bước tiến hành và xử lý phản ứng tương tự như chất Va, thay 0,058 g chất IVa bằng 0,098 g (1 mmol) chất IVc Thu được 0,212 g sản phẩm Vc
- Cảm quan: Chất rắn màu trắng
- Rf = 0,53 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)
Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể ở mục 3.1.3
Tổng hợp N-benzyl-1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (Vd) từ nguyên liệu 1,3- dimethyl-1H-indazol-6-amin (III) và benzaldehyd (IVd) theo sơ đồ 3.7 như sau:
Sơ đồ 3.7 Sơ đồ tổng hợp chất Vd
➢ Các bước tiến hành và xử lý phản ứng tương tự như chất Va, thay 0,058 g chất IVa bằng 0,106 g (1 mmol) chất IVd Thu được 0,231 g sản phẩm Vd
- Cảm quan: Chất rắn màu hồng
- Rf = 0,42 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)
Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể ở mục 3.1.3 e) Tổng hợp chất Ve
Tổng hợp 1,3-dimethyl-N-(pyridin-3-ylmethyl)-1H-indazol-6-amin (Ve) từ nguyên liệu 1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (III) và 3-pyridincarboxaldehyd (IVe) theo sơ đồ 3.8 như sau:
Sơ đồ 3.8 Sơ đồ tổng hợp chất Ve
➢ Các bước tiến hành và xử lý phản ứng tương tự như chất Va, thay 0,058 g chất IVa bằng 0,107 g (1 mmol) chất IVe Thu được 0,207 g sản phẩm Ve
- Cảm quan: Chất rắn màu hồng
- Rf = 0,58 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)
Khẳng định cấu trúc bằng phổ MS, 1 H-NMR Kết quả được trình bày cụ thể ở mục 1.1.3 f) Tổng hợp chất Vf
Tổng hợp N-(4-florobenzyl)-1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (Vf) từ nguyên liệu 1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (III) và 4-florobenzaldehyd (IVf) theo sơ đồ 3.9 như sau:
Sơ đồ 3.9 Sơ đồ tổng hợp chất Vf
➢ Các bước tiến hành và xử lý phản ứng tương tự như chất Va, thay 0,058 g chất IVa bằng 0,124 g (1 mmol) chất IVf Thu được 0,245 g sản phẩm Vf
- Cảm quan: Chất rắn màu trắng
- Rf = 0,47 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)
Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể ở mục 1.1.3 g) Tổng hợp chất Vg
Tổng hợp N-(3-florobenzyl)-1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (Vg) từ nguyên liệu 1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (III) và 3-florobenzaldehyd (IVg) theo sơ đồ 3.10 như sau:
Sơ đồ 3.10 Sơ đồ tổng hợp chất Vg
➢ Các bước tiến hành và xử lý phản ứng tương tự như chất Va, thay 0,058 g chất IVa bằng 0,124 g (1 mmol) chất IVg Thu được 0,234 g sản phẩm Vg
- Cảm quan: Chất rắn màu trắng
- Rf = 0,46 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)
Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể ở mục 1.1.3
Kết quả tổng hợp được các dẫn chất như sau (Bảng 3.2):
Bảng 3.2 Thông số cảm quan và hiệu suất tổng hợp các dẫn chất Va-g
TT Kí hiệu R Cảm quan Hiệu suất (%)
1 Va Chất rắn màu hồng 89,5
2 Vb Chất rắn màu trắng 94,2
3 Vc Chất rắn màu trắng 87,1
4 Vd Chất rắn màu hồng 91,9
5 Ve Chất rắn màu hồng 82,0
6 Vf Chất rắn màu trắng 91,0
7 Vg Chất rắn màu trắng 86,9
3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết
Các chất Va-g sau khi được tổng hợp và tinh chế sẽ được kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng với bản mỏng Silica gel 60 F254 Chúng được hòa tan trong dung môi EtOAc và chấm lên bản mỏng, sử dụng hệ dung môi pha động EtOAc:n-hexan với tỷ lệ 1:1 Sau khi chạy sắc kí, bản mỏng được sấy khô và quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm, cho thấy một vết tròn rõ ràng Giá trị Rf được xác định và tổng hợp trong Bảng 3.3.
3.1.2.2 Đo nhiệt độ nóng chảy Đo nhiệt độ nóng chảy của các chất Va-g bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện MPA 12 Kết quả cụ thể được trình bày ở Bảng 3.3 Kết quả nhiệt độ nóng chảy cho thấy: các chất Va-g có điểm chảy rõ ràng, khoảng chênh lệch từ điểm bắt đầu nóng chảy đến nóng chảy hoàn toàn hẹp
Bảng 3.3 Thông số nhiệt độ nóng chảy và giá trị R f của các dẫn chất Va-g
TT Kí hiệu R Nhiệt độ nóng chảy ( o C)
R f (hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)
Kết quả từ sắc kí lớp mỏng và nhiệt độ nóng chảy chỉ ra rằng tất cả các chất tổng hợp được Va-g đều đạt tiêu chuẩn tinh khiết và sẵn sàng cho việc đo phổ.
3.1.3 Khẳng định cấu trúc Để xác định cấu trúc các chất đã tổng hợp được, chúng tôi tiến hành phân tích phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR), và phổ cổng hưởng từ hạt nhân 13 C ( 13 C-NMR) Kết quả được trình bày dưới đây:
Phổ hồng ngoại đã được ghi lại bằng máy FTIR Affinity-IS của Shimadzu (Nhật Bản) tại Khoa Hóa học, Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN Các phổ đồ chi tiết có thể được tham khảo trong các Phụ lục 1-6, trong khi kết quả phân tích dữ liệu phổ hồng ngoại được trình bày trong Bảng 3.4.
Bảng 3.4 Số liệu phổ hồng ngoại của các dẫn chất Va-g
Các dẫn chất tổng hợp đã được phân tích bằng phương pháp phun mù điện tử (ESI-MS) trên máy phổ khối lượng LTQ - Orbitrap của Thermo - Scientific tại Khoa Hóa học, Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN và máy LC-MSD-Trap-SL của Agilent tại Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc Kết quả phân tích này được trình bày chi tiết trong Bảng 3.5 và các phổ đồ có thể tham khảo trong các Phụ lục 7-13.
Bảng 3.5 Số liệu phổ khối lượng của các dẫn chất Va-g
TT Kí hiệu R CTPT KLPT m/z (ESI-MS)
3.1.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR)
Bảng 3.6 Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1 H-NMR của các dẫn chất
TT Kí hiệu Công thức cấu tạo Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1 H-NMR
7,33 (d, J = 8,61 Hz, 1H, H4); 6,39 (dd, J = 8,58; 1,83 Hz, 1H, H5); 6,23 (d, J = 1,83 Hz, 1H, H7); 3,85 (s, 3H, H8); 3,69 (hep, J = 6,21 Hz, 1H,H14); 2,44 (s, 3H, H9); 1,24 (d,
3.1.3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C ( 13 C-NMR)
Bảng 3.7 Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C-NMR của các dẫn chất Va-g
TT Kí hiệu R Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton
163,7–161,8 (d, 1 J C-F = 241,8 Hz); 148,2; 143,8- 143,8 (d, 3 J C-F = 6.8 Hz); 143,0; 140,1; 130,7- 130,6 (d, 3 J C-F = 8,3 Hz); 123,8-123,8 (d, 4 J C-F 2,7 Hz); 120,8; 115,7; 114,4-114,3 (d, 2 J C-F 21,3 Hz); 113,9-113,8 (d, 2 J C-F = 20.9 Hz);
Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro
Các dẫn chất Va-g đã được đánh giá về hoạt tính kháng tế bào ung thư trên năm dòng tế bào ung thư người, bao gồm A549 (ung thư phổi), SK-HEP-1 (ung thư biểu mô gan), SNU-638 (ung thư dạ dày), MDA-MB-231 (ung thư vú) và HCT116 (ung thư đại trực tràng) Kết quả cụ thể về giá trị IC50 của các dẫn chất này được trình bày trong Bảng 3.8.
Bảng 3.8 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất Va-g
TT Kí hiệu R Độc tính tế bào (IC 50 ) (μM)
BÀN LUẬN
Về tổng hợp hóa học
4.1.1 Phản ứng tổng hợp chất II
Phản ứng tổng hợp chất II diễn ra qua cơ chế thế ái nhân lưỡng phân tử (SN2), trong đó amin thơm bậc 2 (I) tác động với alkyl halogenid CH3I K2CO3 được sử dụng làm xúc tác trong dung môi DMF và phản ứng được thực hiện ở nhiệt độ 60°C.
Chất I là một amin thơm bậc 2 có tính ái nhân yếu, do đó việc sử dụng K2CO3 tạo môi trường base nhận proton để chuyển chất I từ dạng phân tử sang dạng anion, từ đó làm tăng tính ái nhân của chất I giúp phản ứng xảy ra dễ dàng hơn Ngoài ra, khi vắng mặt môi trường base, sản phẩm alkyl hóa ở vị trí N2 chiếm ưu thế hơn [20] do đó base góp phần định hướng sản phẩm có nhóm CH3 gắn vào N1
CH3I, một alkyl halogenid với cấu trúc ít cản trở không gian, có khả năng alkyl hóa mạnh mẽ và nhanh chóng hơn so với các tác nhân methyl hóa khác Nguyên tử iod với bán kính lớn làm cho liên kết C-I kém bền, giúp iod dễ dàng tách ra khỏi phân tử, từ đó thúc đẩy quá trình alkyl hóa diễn ra thuận lợi hơn.
Dung môi DMF được lựa chọn cho phản ứng dựa trên nghiên cứu của Hunt và cộng sự, cho thấy DMF mang lại hiệu suất phản ứng cao hơn so với các dung môi khác Hơn nữa, tỷ lệ sản phẩm thế ở vị trí N1 cũng cao hơn khi sử dụng dung môi này.
Tỷ lệ mol của các chất tham gia phản ứng có ảnh hưởng lớn đến mức độ alkyl hóa và tỷ lệ hình thành các bậc amin trong sản phẩm Việc sử dụng không đủ CH3I sẽ dẫn đến giảm tốc độ và hiệu suất của phản ứng, trong khi việc sử dụng thừa CH3I có thể làm tăng tốc độ phản ứng.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã chọn tỷ lệ mol phản ứng là 1 mol I tương ứng với 2 mol CH3I, mặc dù CH3I có giá thành cao và có thể gây lãng phí nguyên liệu Hơn nữa, trong quá trình phản ứng, một phần CH3I sẽ bay hơi, và việc tăng thêm lượng CH3I không làm tăng hiệu suất phản ứng.
Sản phẩm từ phản ứng N-alkyl hóa là hỗn hợp hai đồng phân 1,3-dimethyl-6-nitro-1H-indazol (N1-chất II) và 2,3-dimethyl-6-nitro-2H-indazol (N2) Thời gian tối ưu cho phản ứng được xác định là 4 giờ Qua quá trình tinh chế bằng sắc ký cột silicagel với pha động EtOAc:n-hexan, chúng tôi thu được chất II với hiệu suất 52% ở tỉ lệ EtOAc:n-hexan là 15:85 Đồng phân N2 được sử dụng để tổng hợp dẫn chất trong một nghiên cứu khác.
4.1.2 Phản ứng tổng hợp chất III
Phương pháp của Morel, mặc dù mang lại hiệu suất cao hơn, nhưng yêu cầu kiểm soát nhiệt độ và quy trình xử lý phức tạp hơn Hơn nữa, các nghiên cứu trước đây đều áp dụng tác nhân hydro phân tử kết hợp với xúc tác.
Để tiết kiệm chi phí và thuận tiện cho việc tiến hành phản ứng, chúng tôi đã chọn phương pháp của Terentjeva S [33] với tác nhân khử hóa.
H2, xúc tác Pd/C được sử dụng với dung môi MeOH và thực hiện ở điều kiện thường Sau phản ứng, hỗn hợp được lọc qua Celite để loại bỏ xúc tác và dung môi được cất dưới áp suất giảm, thu được chất III với hiệu suất cao lên đến 90%.
So với tác nhân khử hóa hóa học (SnCl2/HCl), việc sử dụng tác nhân hydro phân tử với xúc tác có một số ưu điểm sau:
- Phản ứng diễn ra ở điều kiện nhẹ nhàng hơn
- Quá trình tinh chế đơn giản hơn do sản phẩm ở dạng base
- Hiệu suất tổng hợp cao
- Sản phẩm khử hóa tương đối sạch nên thuận lợi để tiến hành các phản ứng sau đó
Khi thực hiện phản ứng với khí H2, cần lưu ý rằng đây là một chất khí nhẹ, dễ rò rỉ, vì vậy cần kiểm tra kỹ lưỡng các chỗ nối, hệ thống ống dẫn và van H2 cũng dễ gây cháy nổ khi có oxy, do đó cần loại bỏ không khí trong thiết bị trước khi bắt đầu phản ứng Sản phẩm thu được là amin thơm, rất nhạy cảm với oxy, nên trong quá trình cất chân không, cần kiểm soát nhiệt độ không quá cao và bảo quản lạnh, tránh ánh sáng để đảm bảo chất lượng.
4.1.3 Phản ứng tổng hợp các dẫn chất Va-g
Các dẫn chất Va-g được tạo ra thông qua phản ứng amin hóa khử giữa aldehyd hoặc ceton (IVa-g) và amin thơm bậc 1 (III), với NaBH3CN được sử dụng làm tác nhân khử.
Sơ đồ 4.2 Cơ chế phản ứng tổng hợp chất Va-g
Acid acetic được sử dụng để tạo ra môi trường acid yếu, proton hóa nguyên tử oxy của nhóm carbonyl Điều này làm tăng tính ái điện tử của nhóm carbonyl, giúp amin dễ dàng tấn công hơn.
Việc chọn NaBH3CN làm tác nhân khử có nhiều lý do thuyết phục NaBH3CN là một tác nhân khử yếu, giúp định hướng khử nhóm C=N của imin trong môi trường pH acid yếu (5-7), từ đó hạn chế sự hình thành sản phẩm phụ như alcol do quá trình khử aldehyd hoặc ceton khi sử dụng tác nhân khử mạnh Hơn nữa, NaBH3CN có độ bền cao trong môi trường acid của phản ứng và giá thành cũng thấp hơn so với nhiều tác nhân khử khác.
Về khẳng định cấu trúc
Chúng tôi đã thực hiện đo phổ hồng ngoại của các dẫn chất tổng hợp và nhận diện các dải hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức và liên kết thông qua nghiên cứu phổ đồ (Phụ lục 1-6) Kết quả phân tích phổ được trình bày chi tiết trong Bảng 3.4.
Phổ hồng ngoại của các dẫn chất đều xuất hiện dải hấp thụ nằm trong vùng 3435-
3254 cm -1 phù hợp với dao động hóa trị của nhóm N-H amin Dải hấp thụ của nhóm C=N trong 1638-1624 khoảng cm -1
Trên phổ đồ của các dẫn chất tổng hợp, xuất hiện dải phổ đặc trưng của nhóm C-H trong vòng thơm, nằm trong khoảng 3071-3032 cm-1, cho thấy sự hấp thụ đặc trưng.
39 đặc trưng của các nhóm C=C thuộc vòng thơm xuất hiện mũi đôi các dải hấp thụ trong vùng 1585-1450 cm -1
Phổ đồ của hai chất Vf và Vg xuất hiện dải hấp thụ mạnh lần lượt ở 1225 cm -1 và
1250 cm -1 phù hợp với dao động hóa trị của nhóm C-F thơm
Dưới đây là hình ảnh minh họa phổ đồ hồng ngoại của hợp chất Vf (Hình 4.1)
Hình 4.1 Phổ hồng ngoại của hợp chất Vf
Trên phổ đồ hồng ngoại của Vf thấy xuất hiện các pic của NH-amin hấp thụ tại
3253,91 cm -1 ; pic của C-H vòng thơm tại 3070,68 cm -1 ; pic của C=N tại 1637,56 cm -1 , pic của C=C tại 1562,34 cm -1 và 1452,40 cm -1 , pic của C-F thơm tại 1224,80 cm -1
4.2.2 Phổ khối lượng (MS) Để khẳng định thêm về cấu trúc của 7 dẫn chất tổng hợp được, chúng tôi đã tiến hành ghi phổ ESI-MS (Bảng 3.5) Trên phổ đồ của 7 chất Va-g (Phụ lục 7-13) đều xuất hiện pic ion có giá trị bằng [M+H] + với cường độ mạnh Do đó, có thể sơ bộ khẳng định các chất Va-g đã tổng hợp có đúng số khối như dự kiến
Phân tích phổ khối lượng của chất Vf cho phép xác định sự phù hợp giữa công thức phân tử dự kiến và công thức phân tử thực tế của chất Vf đã tổng hợp.
Chất Vf có công thức phân tử C16H16FN3 và khối lượng phân tử dự kiến là 269,32 Trên phổ đồ, pic [M+H]+ với cường độ mạnh nhất xuất hiện ở số khối 270,20, cho thấy khối lượng phân tử của chất Vf đúng như dự kiến.
Hình 4.2 Phổ khối lượng của hợp chất Vf
4.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR)
Phổ 1 H-NMR cho thấy các tín hiệu đặc trưng của các proton của 7 dẫn chất tổng hợp được qua số liệu về độ dịch chuyển hóa học, độ bội, hằng số tương tác spin-spin J, và cường độ của các pic được trình bày ở Bảng 3.6 và Phụ lục 14-20
Trên phổ đồ của các chất, ta nhân thấy:
- Ba proton của vòng 1H-indazol nằm trong vùng dịch chuyển từ 7,40-6,20 ppm
- Ba proton của nhóm N 1 -CH3 nằm trong vùng dịch chuyển từ 3,85-3,77 ppm
- Ba proton của nhóm C 3 -CH3 nằm trong vùng dịch chuyển từ 2,46-2,40 ppm
- Ngoài ra còn có các tín hiệu proton của các nhóm thế khác nhau của nhóm amin thơm bậc hai:
Các proton thuộc nhóm -CH3 của isopropyl (chất Va) có độ dịch chuyển hóa học là 1,24 ppm, trong khi proton của nhóm -CH có độ dịch chuyển là 3,69 ppm.
+ Các proton của nhóm -CH2 (của nhóm cyclopentyl, chất Vb) có độ dịch chuyển là 2,06-1,48 ppm
Proton của nhóm -CH2 trong cyclohexyl (chất Vc) có độ dịch chuyển từ 2,15-1,24 ppm, trong khi proton của nhóm -CH trong cùng nhóm cyclohexyl có độ dịch chuyển là 3,35-3,25 ppm.
+ Các proton của vòng benzen và pyridin (chất Vd-g) nằm trong vùng dịch chuyển từ 7,40-6,96 ppm
Trên phổ 1 H-NMR của các dẫn chất Va-g, tín hiệu proton của nhóm N-H không xuất hiện do H của nhóm này linh động và thường trao đổi với dung môi Trong khi đó, phổ hồng ngoại IR cho thấy dải hấp thụ tương ứng với dao động hóa trị của nhóm N-H amin Ngoài ra, phổ khối lượng MS xác nhận rằng các chất đều có số khối phù hợp với dự kiến Do đó, có thể kết luận rằng các dẫn chất Va-g có số H tương ứng với công thức dự kiến.
Sau đây là phổ đồ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR) minh họa của hợp chất Va (Hình 4.3)
Hình 4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR) của hợp chất Va
4.2.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C ( 13 C-NMR)
Các dẫn chất Va-g được phân tích bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon-13 (13 C-NMR) Kết quả đo phổ 13 C-NMR của các hợp chất Va-g được trình bày chi tiết trong Bảng 3.7 và Phụ lục 21.
Trên phổ đồ 13 C-NMR của các chất Ve, số lượng carbon trong phân tử được thể hiện rõ ràng với cường độ mạnh và sắc nét Ngược lại, một số tín hiệu carbon trên phổ đồ của các chất Va, b, c, d, f không xuất hiện, có thể do lượng mẫu không đủ lớn và thời gian đo không đủ dài Tuy nhiên, phổ đồ của cả 7 dẫn chất Va-g đều cho thấy độ dịch chuyển hóa học đặc trưng của các carbon nhân thơm, phù hợp với cấu trúc dự kiến Kết quả phân tích phổ 1 H-NMR cũng xác nhận các tín hiệu proton đặc trưng của 7 dẫn chất tổng hợp tương ứng với công thức dự kiến Do đó, có thể kết luận rằng các dẫn chất Va-g có cấu trúc phù hợp với dự kiến.
Phổ đồ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C-NMR của hợp chất Ve (Hình 4.4) cho thấy 15 pic rõ ràng, tương ứng với 15 nguyên tử carbon trong công thức C15H16N4, với cường độ mạnh và sắc nét.
Hình 4.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C ( 13 C-NMR) của hợp chất Ve
Về thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro
Các dẫn chất Va-g đã được kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư người bằng phương pháp SRB, bao gồm A549 (ung thư phổi), SK-HEP-1 (ung thư biểu mô tế bào gan), SNU-638 (ung thư dạ dày), MDA-MB-231 (ung thư vú), và HCT116 (ung thư đại trực tràng) Kết quả cho thấy dẫn chất Va có giá trị IC50 > 100 μM trên cả năm dòng tế bào, trong khi các dẫn chất Vb-g thể hiện tác dụng tốt trên ít nhất hai dòng tế bào ung thư Đặc biệt, dẫn chất Vf có hoạt tính tốt nhất với giá trị IC50 dưới 60 μM trên tất cả các dòng tế bào thử nghiệm.
Các dẫn chất indazol có nhóm thế cồng kềnh hơn hoặc có cấu trúc vòng cho thấy khả năng kháng tế bào ung thư tốt hơn Điều này có thể được giải thích bởi sự tương tác hiệu quả giữa các nhóm thế ở vị trí số 6 và enzym đích, giúp ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.
So sánh độc tính của 2 dẫn chất Vc và Vd trên 4 dòng tế bào A549, SK-HEP-1,
SNU-638 và HCT116 là những dẫn chất cho thấy hoạt tính kháng ung thư mạnh mẽ hơn Điều này chỉ ra rằng các dẫn chất có cấu trúc vòng thơm mang lại hiệu quả tốt hơn so với những dẫn chất chứa vòng no.
Trên dòng tế bào MDA-MB-231, chỉ có hai dẫn chất Vf và Vg mang nhóm thế floro trên vòng thơm cho thấy độc tính ở ngưỡng dưới 100 μM Nguyên nhân có thể là do nhóm thế ở vị trí số 6 của hai dẫn chất này có kích thước đủ lớn để tương tác hiệu quả với enzym đích.
So sánh ba dẫn chất Vd, Vf và Vg trên dòng tế bào HCT116 cho thấy hoạt tính của Vf và Vg đều vượt trội hơn so với Vd Cụ thể, Vf gây độc tế bào HCT116 với giá trị IC50 là 0,4 μM, trong khi giá trị IC50 của Vg là 2,2 μM Điều này cho thấy nhóm thế floro trên vòng thơm có thể làm tăng hoạt tính của các dẫn chất này trên dòng tế bào HCT116, nhờ khả năng tạo liên kết hydro với đích tác dụng, phù hợp với nghiên cứu của Qian và cộng sự.
[31] về vai trò của nhóm halogen ở vị trí số 6 đối với tác dụng kháng ung thư
Nghiên cứu trên bốn dòng tế bào A549, SNU-638, MDA-MB-231 và HCT116 cho thấy dẫn chất Vf có hoạt tính ức chế mạnh hơn so với Vg Kết quả này củng cố nghiên cứu của Dược sỹ Phùng Huy Hiệu, chỉ ra rằng vị trí nhóm floro trên vòng thơm ảnh hưởng đến khả năng kháng ung thư của các dẫn chất 6-benzylamino của indazol, với nhóm floro ở vị trí para cho hiệu quả ức chế tốt hơn so với vị trí meta Kết hợp với các nghiên cứu của Qian và cộng sự, cũng như của Dược sỹ Nguyễn Minh Hường, nhóm nghiên cứu của chúng tôi nhận thấy rằng các dẫn chất indazol có nhóm thế ở vị trí số 6, đặc biệt là nhóm halogen, đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính chống ung thư.
Dẫn chất Vf là hợp chất duy nhất trong các dẫn chất tổng hợp có khả năng ức chế cả 5 dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 dưới 100 nM Nó thể hiện tác dụng vượt trội trên dòng tế bào ung thư trực tràng HCT116 với giá trị IC50 là 0,4 μM, mạnh hơn 3,2 lần so với chất chứng dương etoposide (IC50 = 1,27 μM) Điều này cho thấy Vf có tiềm năng trở thành chất dẫn đường trong việc tìm kiếm các hoạt chất mới hiệu quả cho điều trị ung thư trực tràng và các loại ung thư khác.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Từ các kết quả nghiên cứu đã trình bày có thể rút ra một số kết luận sau:
1.1 Về tổng hợp hóa học Đã tổng hợp được 7 dẫn chất như dự kiến và tất cả các dẫn chất đều chưa từng được công bố trong bất kỳ tài liệu nào trước đây:
+ 1,3-dimethyl-N-(pyridin-3-ylmethyl)-1H-indazol-6-amin
Cấu trúc của dẫn chất N-(3-fluorobenzyl)-1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin đã được khẳng định thông qua phân tích dữ liệu phổ IR, MS, 1H-NMR và 13C-NMR.
1.2 Về thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro Đã thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được, kết quả như sau: Dẫn chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt nhất là Vf với khả năng ức chế cả năm dòng tế bào ung thư A549, SK-HEP-1, SNU-638, MDA-MB-231 và HCT116 với giỏ trị IC50 tương ứng là 6,8 àM; 50,1 àM; 1,8 àM; 47,5 àM; 0,4 àM Dẫn chất Vd thể hiện hoạt tính mạnh trên ba dòng tế bào ung thư A549, SNU-638 và HCT116 với giá trị
Các dẫn chất Ve và Vg cho thấy hoạt tính chống ung thư mạnh mẽ trên các dòng tế bào HCT116 và SNU-638, với giá trị IC50 lần lượt là 2,7 àM và 2,5 àM; 2,2 àM Trong khi đó, các dẫn chất Va, Vb và Vc có hoạt tính yếu hơn so với các dẫn chất trên.
Va không thể hiện độc tính trên cả 5 dòng tế bào
Từ các kết quả trên, chúng tôi xin có một số đề xuất như sau:
- Tiếp tục tổng hợp các dẫn chất 1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin, đặc biệt là các dẫn chất có nhóm thế ở vị trí số 6 mang nhóm thế là halogen
- Tiếp tục thử độc tính tế bào của các dẫn chất tổng hợp được trên một số dòng tế bào ung thư khác.
