Đại cương về probiotic
Định nghĩa về probiotic
Lịch sử sử dụng vi sinh vật có lợi trong sữa lên men đã bắt đầu từ hơn 2500 năm trước Công nguyên Tuy nhiên, thuật ngữ "probiotic" chỉ được Lilley và Stillwell sử dụng lần đầu tiên vào năm 1965 để mô tả các vi sinh vật này.
“chất do một vi sinh vật tiết ra để kích thích sự phát triển của VSV khác” [25]
Thuật ngữ “probiotic” có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp, mang nghĩa “dành cho sự sống” và đã trải qua nhiều ý nghĩa khác nhau theo thời gian Tác dụng của các vi sinh vật này được xác thực qua nghiên cứu khoa học của Elie Metchnikoff Ông đã đưa ra những phát hiện mới và nghiên cứu sâu về lợi ích sức khỏe của sữa lên men trong cuốn sách “Essais Optimistes” (1907).
Theo Lilley và Stillwell, nhiều nhà khoa học đã nỗ lực cải thiện định nghĩa về probiotic Parker (1974) đề xuất rằng “Probiotic là những vi sinh vật góp phần cân bằng hệ vi sinh đường ruột” Đến năm 1989, Fuller đã định nghĩa lại probiotics là những vi sinh vật sống mang lại lợi ích cho sức khỏe khi được tiêu thụ với một lượng phù hợp.
Chất cung cấp vi sinh vật sống có tác dụng tích cực đối với cơ thể vật chủ bằng cách cải thiện sự cân bằng vi sinh đường ruột.
Việc định nghĩa probiotic một cách chính xác là rất quan trọng, vì nhiều sản phẩm hiện nay chưa đáp ứng được các tiêu chí cần thiết Sự quan tâm từ các cơ quan quản lý về sức khỏe người tiêu dùng đối với sản phẩm men vi sinh ngày càng tăng Năm 2002, sau nhiều cuộc thảo luận giữa các chuyên gia, FAO và WHO đã đưa ra một định nghĩa thống nhất về probiotic: “Probiotic là những vi sinh vật sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức khỏe vật chủ.” Định nghĩa này đã trở nên phổ biến và được sử dụng rộng rãi trong các ấn phẩm khoa học trên toàn thế giới.
Các loài probiotic phổ biến
Không có một bộ tiêu chí thống nhất để lựa chọn và phân loại một chủng vi
Ba khuẩn sống được làm lợi khuẩn thường được phân lập và xác định dựa trên các tiêu chí như: (i) nguồn gốc từ người; (ii) khả năng ổn định chống lại acid mật, acid, enzym và oxy; (iii) khả năng bám dính vào niêm mạc ruột, với khả năng phát triển và sinh sản nhanh chóng trong ruột; (iv) khả năng sản xuất các chất kháng khuẩn; và (v) hiệu quả tích cực trong điều trị và an toàn khi sử dụng, thuộc nhóm GRAS.
Hiện nay, có nhiều chế phẩm probiotic được sử dụng nhằm cải thiện sức khỏe cho vật chủ, chủ yếu chứa các chủng vi khuẩn lactic như Lactobacillus và Bifidobacterium, cùng với nấm men Saccharomyces boulardii và các vi khuẩn khác như Bacillus, Lactococcus Trong số đó, Lactobacillus và Bifidobacteria là hai chi vi khuẩn được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong các chế phẩm sinh học hiện nay Các loài phổ biến nhất bao gồm Lactobacillus acidophilus, L casei, Bifidobacterium bifidum, B longum và nấm men Saccharomyces boulardii Đặc biệt, Saccharomyces boulardii là loại nấm men không gây bệnh được sử dụng như một chế phẩm sinh học hiệu quả.
Các xu hướng chế phẩm chứa probiotic
Việc cải tiến các dạng bào chế probiotic đang ngày càng được chú trọng nhằm nâng cao hiệu quả và tính an toàn trong quá trình sử dụng Trong số các sản phẩm probiotic hiện nay, sữa là một nhóm lớn có khả năng vận chuyển probiotic vào cơ thể người Một số dạng chế phẩm từ sữa phổ biến bao gồm sữa lên men dạng lỏng, sữa chua và phô mai.
Nước trái cây và rau quả lên men bổ sung probiotic ngày càng được ưa chuộng, đặc biệt với những người không dung nạp lactose trong sữa và có nhu cầu năng lượng thấp Sản phẩm này mang lại nhiều lợi ích vượt trội, phù hợp với xu hướng tiêu dùng hiện đại.
Để phát triển các chế phẩm probiotic, vi sinh vật (VSV) cần phải tồn tại trong điều kiện gia công công nghiệp và ổn định trong suốt quá trình bảo quản Các sản phẩm probiotic ban đầu thường là dạng lỏng như sữa chua và nước trái cây Tuy nhiên, VSV trong các chế phẩm này gặp khó khăn trong việc sống sót khi đi qua dạ dày.
Có bốn dạng bào chế di động trong đường tiêu hóa thấp, cho phép vi sinh vật (VSV) ổn định hơn trong quá trình sản xuất, bảo quản và sử dụng Hiện nay, trên thị trường Việt Nam có các dạng bào chế dạng rắn như sau:
Thế hệ 1 của VSV probiotic thường ở dạng bột hoặc cốm và là đơn loài Nhược điểm lớn nhất của các dạng chế phẩm này là VSV gần như không thể sống sót qua tác động của dạ dày và muối mật Để khắc phục nhược điểm này, nhiều nhà sản xuất đã sử dụng các chủng VSV ở dạng bào tử, điển hình là chi Bacillus.
Thế hệ 2 của vi sinh vật probiotic được sản xuất dưới dạng bào chế nang cứng, có thể là đơn hoặc đa loài Vi sinh vật này được đưa vào trong nang dưới dạng bột Trong hình thức bào chế này, vi sinh vật vẫn chịu tác động của các yếu tố môi trường bên ngoài, dẫn đến việc giảm số lượng vi sinh vật.
Thế hệ 3 của vi sinh vật probiotic được thiết kế để bao tan ở ruột, với các vi sinh vật được đóng gói trong nang có lớp bảo vệ, cho phép giải phóng probiotic chỉ tại ruột Hầu hết các probiotic trong thế hệ này đều được xử lý bằng polymer acrylic acid.
Thế hệ 4: Vi nang hóa, tan trong ruột, là phương pháp sử dụng các polymer có nguồn gốc tự nhiên để bao gói vi sinh vật (VSV) Phương pháp này giúp bảo vệ VSV khỏi những tác động của các yếu tố bên ngoài như pH thấp, muối mật và sốc nhiệt.
Thế hệ 5 sử dụng phương pháp bao kép để bảo vệ và giải phóng vi sinh vật (VSV) tại ruột, với hai lớp bao nhằm nâng cao hiệu quả trong sản xuất, bảo quản và sử dụng Lớp bao trong cùng là hệ thống peptide/protein, cho phép giải phóng VSV tùy thuộc vào độ pH của môi trường Lớp bao ngoài là hệ thống polysaccharid và hydrocolloid, giúp bảo vệ VSV khỏi các yếu tố như độ ẩm, nhiệt độ và áp suất.
Loài Saccharomyces boulardii
Đặc điểm hình thái và điều kiện nuôi cấy
Saccharomyces boulardii thuộc giới Fungi (nấm), ngành Ascomycota, phân ngành Saccharomycotina, lớp Saccharomycetes, bộ Saccharomycetales, họ Saccharomycetaceae, chi Saccharomyces [6]
Hình 1.1: Hình ảnh Saccharomyces boulardii quan sát dưới kính hiển vi thường và kính hiển vi điện tử [19]
Saccharomyces boulardii là một loại nấm men có hình cầu hoặc hình trứng, thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí không bắt buộc Trong điều kiện hiếu khí, nấm men này sử dụng đường làm nguồn năng lượng chính để tích lũy sinh khối Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của hầu hết các loài trong chi Saccharomyces dao động từ 22℃ đến 30℃.
Saccharomyces boulardii phát triển tối ưu ở nhiệt độ cơ thể 37℃ và có khả năng ức chế một số mầm bệnh virus, mang lại lợi thế đặc biệt cho chủng nấm men này Nấm men này phát triển tốt nhất trong khoảng pH 4.5 – 6.5 Các nghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng Saccharomyces boulardii có sức đề kháng với dịch dạ dày mô phỏng cao hơn so với các chủng khác.
Saccharomyces cerevisiae W303 và Saccharomyces boulardii có khả năng phát triển mạnh mẽ và tích lũy sinh khối nhanh chóng trong môi trường giàu hydrocarbon, nitơ, phospho và các nguyên tố vi lượng cần thiết.
1.2.2 Vai trò của Saccharomyces boulardii trong đời sống
Nấm men Saccharomyces boulardii là một loại nấm men không gây bệnh, được sử dụng để phòng và điều trị các loại tiêu chảy, bao gồm tiêu chảy do sử dụng kháng sinh, tiêu chảy liên quan đến ống thông mũi - dạ dày, tiêu chảy do Clostridium difficile và tiêu chảy liên quan đến bệnh AIDS.
Saccharomyces boulardii không chỉ giúp cân bằng hệ vi sinh đường ruột mà còn nổi bật với khả năng đề kháng với kháng sinh và sulfamid, ngoại trừ kháng nấm.
Saccharomyces boulardii có tác dụng quan trọng trong việc điều trị bệnh tiêu chảy cấp, nhưng cần được đánh giá thêm do thời gian mắc bệnh thường ngắn và bệnh nhân có khả năng cao tự phục hồi.
Saccharomyces boulardii không chỉ có tác dụng tích cực trong việc điều trị bệnh viêm dạ dày cấp tính mà còn hỗ trợ hiệu quả trong việc loại bỏ vi khuẩn Helicobacter pylori gây nhiễm trùng.
Saccharomyces boulardii có ba cơ chế chính để chống lại các tác nhân gây bệnh: tác động luminal, tác động đến dinh dưỡng và tác động truyền tín hiệu chống viêm Trong ruột, Saccharomyces boulardii có khả năng tác động đến các tác nhân gây bệnh, bảo tồn tế bào, can thiệp vào sự gắn kết của các vi sinh vật gây bệnh vào niêm mạc, và tăng cường quần thể đường ruột của các vi khuẩn có lợi như Bifidobacterium và Lactobacilli.
Xét về mặt dược động học, nếu sử dụng chế phẩm uống chứa nấm men
Việc sử dụng Saccharomyces boulardii hàng ngày giúp đạt được nồng độ ổn định và duy trì mức độ cao trong ruột Tuy nhiên, nếu ngừng sử dụng, vi khuẩn này sẽ nhanh chóng bị loại bỏ khỏi cơ thể mà không trở thành một phần của hệ vi sinh vật đường ruột như các vi sinh vật khác.
1.2.3 Các dạng chế phẩm chứa Saccharomyces boulardii hiện nay
Trên thị trường hiện nay, các chế phẩm chứa Saccharomyces boulardii rất đa dạng, bao gồm từ nhóm sản phẩm thực phẩm như sữa chua uống đến thực phẩm bảo vệ sức khỏe và dược phẩm dạng bột hòa tan hoặc viên nang uống.
Saccharomyces boulardii có đầy đủ đặc tính sinh học để chống lại các tác nhân gây bệnh trong đường tiêu hóa, nhưng không phát triển trong ruột và bị thải trừ nhanh chóng khi ngừng sử dụng Do đó, trên thị trường hiện nay, ngoài các chế phẩm probiotic chứa Saccharomyces boulardii đơn lẻ, phần lớn là dạng phối hợp để mang lại nhiều tác dụng có lợi cho vật chủ Một số dạng chế phẩm hiện có thể kể đến như:
Bột cốm pha hỗn dịch Sachaces của công ty Mediphar USA, Pháp với 10 tỷ Saccharomyces boulardii trong 1 g kết hợp với Kẽm Gluconate
Men vi sinh Normagut được sản xuất bởi công ty Ardeypharm GmbH
Thành phần có chứa ít nhất 2.5x10 9 Saccharomyces boulardii trong 1 viên nang uống.
Các dạng chế phẩm chứa Saccharomyces boulardii hiện nay
Trên thị trường hiện nay, các chế phẩm chứa Saccharomyces boulardii rất đa dạng, bao gồm từ các sản phẩm thực phẩm như sữa chua uống đến thực phẩm bảo vệ sức khỏe và dược phẩm dưới dạng bột hòa tan hoặc viên nang uống.
Saccharomyces boulardii có đầy đủ đặc tính sinh học để chống lại các tác nhân gây bệnh trong đường tiêu hóa, nhưng không phát triển trong đường ruột và nhanh chóng bị thải trừ khi ngừng sử dụng Do đó, trên thị trường hiện nay, ngoài các chế phẩm probiotic chứa Saccharomyces boulardii đơn lẻ, phần lớn là dạng phối hợp để mang lại nhiều tác dụng có lợi cho vật chủ Một số chế phẩm tiêu biểu trên thị trường hiện nay bao gồm:
Bột cốm pha hỗn dịch Sachaces của công ty Mediphar USA, Pháp với 10 tỷ Saccharomyces boulardii trong 1 g kết hợp với Kẽm Gluconate
Men vi sinh Normagut được sản xuất bởi công ty Ardeypharm GmbH
Thành phần có chứa ít nhất 2.5x10 9 Saccharomyces boulardii trong 1 viên nang uống
Men vi sinh Bioacimin Gold của công ty cổ phần Dược phẩm Việt Đức
Sản phẩm chứa hỗn hợp vi sinh vật giúp phòng ngừa và hỗ trợ điều trị rối loạn tiêu hóa, với mỗi gói 4g cung cấp Lactobacillus (≥ 10^8 CFU).
Bacillus subtilis (≥ 10 8 CFU), Bacillus clausii (≥ 10 8 CFU), Saccharomyces boulardii (≥ 10 8 CFU), các thành phần vitamin và khoáng chất khác
Các chế phẩm men vi sinh thế hệ đầu có nhược điểm là dễ bị tác động bởi môi trường bên ngoài, dẫn đến số lượng vi sinh vật sống (VSV) đến đích tác dụng không cao Do đó, nghiên cứu về các công nghệ bao kép và bao đa lớp đang được tiến hành sâu rộng nhằm nâng cao hiệu quả sử dụng của các chế phẩm probiotic.
Đại cương về vi nang hóa
Các phương pháp tạo vi nang
Hiện nay, có nhiều kỹ thuật bao bì khác nhau để đóng gói các vi sinh vật probiotic Việc lựa chọn phương pháp bao gói phù hợp phụ thuộc vào kích thước vi hạt, các đặc tính vật lý và hóa học của chất mang, ứng dụng của vật liệu bao gói, cơ chế giải phóng và chi phí quy trình Đặc biệt, các kỹ thuật này cần đảm bảo không gây ra tác động bất lợi cho vi sinh vật probiotic Một số kỹ thuật phổ biến để bao gói các vi sinh vật bao gồm: (i) Phương pháp phun sấy; (ii) Phương pháp tách pha đông tụ; (iii) Phương pháp nhũ tương hóa.
Bảng 1.1: Ưu nhược điểm của các phương pháp tạo vi nang phổ biến Đặc điểm
Phương pháp Đặc điểm phương pháp Ưu điểm Nhược điểm
Phương pháp nhũ tương hóa
Pha không liên tục là hệ phân tán sinh khối tế bào probiotic, pha liên tục là dầu thực vật
Dễ nâng cấp quy mô Kích thước vi nang tạo thành nhỏ hơn phương pháp tách pha đông tụ
Kích thước và hình dạng vi nang tạo thành không đồng đều
Hỗn dịch chứa vi sinh vật được phun tán thành dạng tia vào luồng khí áp suất cao, sau đó đi qua buồng sấy để bốc hơi dung môi và tạo ra vi nang.
Quy trình khép kín dễ nâng cấp quy mô
Vi nang tạo thành có kích thước rất nhỏ (5-600àm)
Tác động của nhiệt độ và sự mất nước nhanh chóng có thể làm giảm khả năng sống sót của VSV
Phương pháp tách pha đông tụ
Các pha được tách nhờ sự thay đổi nhiệt độ, sự hóa muối hoặc khi thêm dung môi thứ hai vào hệ vi nang
Dụng cụ, thiết bị đơn giản, rẻ tiền
Ít gây tổn thương tế bào
Sự hình thành hạt chậm, khó nâng cấp quy mô
Phương pháp tách pha đông tụ
Tách pha động tụ là quy trình sử dụng kỹ thuật cố định gel để bao bọc tế bào probiotic bằng hydrocolloid Trong kỹ thuật này, hydrocolloid được trộn với sinh khối vi sinh vật, sau đó hỗn hợp thu được sẽ được đùn qua vòi phun (máy đùn hoặc kim tiêm) và rơi tự do vào dung dịch hóa rắn Phương pháp này dựa trên việc bảo vệ và duy trì hoạt tính của probiotic trong môi trường khắc nghiệt.
Sự kết dính của polysaccharid anion với ion đa hóa trị giúp ổn định vi sinh vật (VSV), tạo ra gel ổn định trong môi trường acid nhưng phân hủy trong môi trường base Nhiều loại polymer khác nhau được sử dụng để tạo vi nang, trong đó alginate, k-carrageenan và whey protein là những chất phổ biến nhất.
Hình 1.3: Phương pháp tách pha đông tụ tạo vi nang [11]
Kích thước hạt phụ thuộc vào khoảng cách giữa kim và dung dịch tạo gel, bản chất polymer, độ nhớt của dung dịch bao gói, và chủ yếu dựa vào đường kính lỗ đùn.
Phương pháp tách pha đông tụ được coi là đơn giản và dễ thực hiện, với chi phí thấp và không yêu cầu nhiệt độ cao, giúp bảo tồn khả năng sống của các tế bào probiotic.
Nguyên liệu tạo vi nang đa nhân
Alginat là muối của acid alginic, một polysaccharide anion không phân nhánh có nguồn gốc từ tảo nâu Nó được cấu tạo từ hai gốc acid uronic là β-D-mannuronate (M) và β-L-guluronate (G), liên kết với nhau bằng liên kết 1,4-glycosid, tạo thành các cấu trúc homopolyme (khối GGG và khối MMM) hoặc khối dị trùng hợp (khối MGM) Tỷ lệ hai gốc khác nhau trong alginat phụ thuộc vào quá trình thu hoạch và chiết xuất, ảnh hưởng đến các đặc tính của nó.
Có 12 loại alginat khác nhau, và để hòa tan alginat trong nước, nhiệt độ cần thiết nằm trong khoảng 60℃ – 80℃ Đặc biệt, gel alginat không tan trong môi trường acid.
Hình 1.4: Cấu trúc của Alginat [30]
Sự gel hóa các hạt alginate xảy ra nhờ liên kết chéo với các ion kim loại hóa trị II như Ca²⁺ và Ba²⁺ Dung dịch alginat có cấu trúc gồm các khối M với dạng dải hẹp và khối G là các dải gấp khúc Các khối G này tạo liên kết chọn lọc với cation hóa trị II, hình thành các liên kết chuỗi và tạo ra các vùng tiếp giáp được gọi là “mô hình hộp trứng” Alginate có nhiều ưu điểm như không độc hại, tương thích sinh học cao, giá thành rẻ và dễ dàng hình thành ma trận gel bao bọc xung quanh tế bào vi khuẩn.
Chitosan là một polyaminosaccharide được hình thành thông qua quá trình deacetyl hóa chitin với mức độ từ 66% đến 95% Mặc dù chitosan có thể được tìm thấy trong tự nhiên ở một số loài nấm, nhưng nó vẫn ít phổ biến hơn nhiều so với chitin.
Hình 1.5: Cấu trúc hóa học của Chitin [40]
Hình 1.6: Cấu trúc hóa học của Chitosan [40]
Chitosan là một polysaccharide tích điện dương, có tính base yếu và dễ tan trong các dung dịch acid hữu cơ có pH dưới 6.0, như acid acetic, acid lactic và acid formic Dung dịch chitosan có khả năng tạo phức hợp đa ion với hydrocolloid anion và hình thành màng gel Độ nhớt của dung dịch chitosan tăng khi nồng độ chitosan tăng, giảm nhiệt độ và phụ thuộc vào mức độ deacetyl hóa chitin Chitosan nổi bật với khả năng phân hủy sinh học, thân thiện với môi trường, tương thích sinh học tốt, không độc hại và giá thành rẻ Tính kết dính sinh học của chitosan ở pH sinh lý giúp tăng khả năng lưu giữ tại vị trí tác dụng Trong các chế phẩm probiotic, chitosan có khả năng tạo lớp màng sinh học, giúp các tế bào vi khuẩn sống sót đến đại tràng dưới điều kiện khắc nghiệt của đường tiêu hóa.
Tinh bột là polysaccharid được cấu tạo từ amylose và amylopectin, đều được cấu tạo từ D – glucose Tỷ lệ amylose và amylopectin trong tinh bột thường là 1/4 [35],[14]
Khi tạo vi nang calci alginat, việc phối hợp tinh bột như tá dược độn rắn không chỉ cải thiện thể chất vi nang sau đông khô mà còn giúp tế bào ổn định hơn và nâng cao khả năng sống sót trong quá trình đông khô và bảo quản Sử dụng riêng tinh bột hoặc kết hợp với chitosan đã cho thấy khả năng bao bọc vi sinh vật sống tốt hơn so với việc không sử dụng tinh bột.
1.5 Một số nghiên cứu vi nang hóa Saccharomyces boulardii
Nhu cầu sử dụng men vi sinh ngày càng gia tăng, dẫn đến việc nghiên cứu và khai thác thương mại nhiều chủng probiotic Tuy nhiên, việc duy trì khả năng sống sót và hoạt động của probiotic vẫn là một thách thức lớn cho các nhà nghiên cứu Công nghệ vi nang hóa là một trong những phương pháp hiện đại có tác dụng đáng kể trong việc nâng cao khả năng sống sót của vi sinh vật Do đó, nhiều nghiên cứu đã được tiến hành cả trong nước và trên thế giới.
Nghiên cứu của Hassan Ghorbani-Choboghl và cộng sự (2019) đã điều tra ảnh hưởng của vi nang đến khả năng sống sót của Saccharomyces boulardii trong dịch dạ dày mô phỏng và dung dịch muối mật Thí nghiệm được thực hiện trên 30 chuột Wistar chia thành ba nhóm: nhóm chứng, nhóm sử dụng Saccharomyces boulardii dạng tự do, và nhóm sử dụng Saccharomyces boulardii được bao gói trong vi nang Vi nang được tạo ra bằng phương pháp đùn Natri alginat 2% vào dung dịch Canxi clorid 0.1M Kết quả cho thấy sau 2 giờ trong dịch dạ dày (pH = 2) và dịch tiêu hóa mô phỏng (pH = 8), số lượng vi sinh vật ở dạng tự do giảm đáng kể so với nhóm sử dụng vi nang chứa vi sinh vật (p < 0.05).
Sultan Arslan và cộng sự (2015) đã thực hiện thí nghiệm đánh giá khả năng sống sót của Saccharomyces boulardii được bao bọc trong vi nang bằng phương pháp phun sấy với các vật liệu bao khác nhau như maltodextrin, gôm Arabic, tinh bột biến tính, đạm whey, gelatin và protein chiết xuất từ đậu Nhiệt độ khảo sát là 80℃ và 125℃ Kết quả cho thấy vật liệu bao gelatin có hiệu quả bảo vệ vi sinh vật trong quá trình phun sấy cũng như trong điều kiện thử nghiệm qua dịch dạ dày mô phỏng ở pH 1, 1.5 và 2 Hơn nữa, nhiệt độ 125℃ làm giảm khả năng sống sót của vi sinh vật trong quá trình phun sấy nhưng lại tăng cường khả năng bảo vệ vi sinh vật trong dịch tiêu hóa mô phỏng.
Tác giả Lê Thị Hoàng Anh và Ngô Nguyễn Quỳnh Anh (2020) đã thực hiện khảo sát công thức tạo vi nang đa lớp chứa Lactobacillus acidophilus và Saccharomyces boulardii Kết quả nghiên cứu cho thấy công thức bao gói vi sinh vật tối ưu là vi nang.
Viên nang đa lớp chứa Lactobacillus acidophilus, alginat 3%, tinh bột 10% và dung dịch gel hóa CaCl2 2%/Chitosan 3%; lớp vỏ màng bao chứa Saccharomyces boulardii, alginat 0.5%, tinh bột 10% và dung dịch gel hóa CaCl2 2%/Chitosan 3% Viên nang này đạt yêu cầu về hàm ẩm (dưới 5%) và số lượng vi sinh vật (trên 10^9 CFU/g) trong suốt 90 ngày bảo quản.
PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Nguyên vật liệu và thiết bị
Saccharomyces boulardii bộ môn Công Nghiệp Dược cung cấp
Bảng 2.1: Các nguyên liệu và hóa chất sử dụng
Tên hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn
Cao nấm men Merck – Đức TCNSX
Na2HPO4 Trung Quốc TKHH
Natri clorid Trung Quốc TKHH
KH2PO4 Trung Quốc TKHH
Natri citrat Trung Quốc TKHH
Calci clorid Trung Quốc TKHH
Bột thạch (Agar) Việt Nam TCCS
Tinh bột Việt Nam TCCS
Bảng 2.2: Các thiết bị sử dụng
Tên thiết bị Nguồn gốc Tên thiết bị Nguồn gốc Cân kỹ thuật Đức (Satorious) Máy ly tâm Đức (Satorious)
Máy khuấy từ Hàn Quốc (Wisd) Máy đông khô Đức (Christ
Alpha) Tủ ấm CO2 Nhật (Sanyo) Tủ lạnh sâu Hàn Quốc (LG)
Tủ cấy vô trùng Nhật (Sanyo) Máy lắc ổn nhiệt Trung Quốc
Tủ lạnh Thái Lan (Sharp) Nồi hấp tiệt khuẩn Nhật (ALP)
(Daihan) Kính lúp soi nổi Đức (Leica) Kính hiển vi Nhật (Nikon)
Bơm kim tiêm Vinahankook 10 ml
Pipet Eppendort Ống ly tâm Ống nghiệm có nắp Ống đong Đĩa petri đường kính 9 cm
2.1.5 Môi trường sử dụng trong nghiên cứu a Môi trường nhân giống nấm men (MT1)
Triamoni sulfat 3 g Nước máy vừa đủ 1000 ml b Môi trường nhân giống nấm men thạch (MT2)
MT2 = MT1 + thạch 2% (20 g thạch trong 1000 ml môi trường)
2.1.6 Dung dịch sử dụng trong nghiên cứu
- Dung dịch alginat a% (kl/tt): Cân a g Natri alginat, phân tán đều trong 100 ml nước cất Đem hấp tiệt trùng ở 121℃ trong 15 phút cho alginat đồng nhất
- Dung dịch Calci clorid 2% (kl/tt): Cân 2,00 g CaCl2, hòa tan hoàn toàn trong nước cất vừa đủ 100 ml
- Dung dịch Calci clorid 2%/chitosan 3% (kl/tt): Cân 3,00 g chitosan và 2,00
18 g CaCl2 hòa tan hoàn toàn trong 100 ml nước cất
- Dung dịch Natri citrat 2% (kl/tt): Cân 2,00 g Natri citrat, hòa tan hoàn toàn trong nước cất vừa đủ 100 ml
- Dung dịch NaCl 0.9% (kl/tt): Cân 0,90 g NaCl, hòa tan hoàn toàn trong nước cất vừa đủ 100 ml
Dung dịch Lugol được tạo ra bằng cách hòa tan hoàn toàn 10,00 g KI trong 20 – 30 ml nước cất, sau đó thêm 5,00 g I2 Tiến hành khuấy và đun nóng nhẹ cho đến khi I2 tan hoàn toàn, sau đó bổ sung nước cho đủ 100 ml.
- Dung dịch pH 1,2: Pha dung dịch NaCl 0,9% dùng dung dịch HCl 1M hoặc NaOH 1M điều chỉnh về pH 1,2
- Dung dịch đệm phosphat hỗn hợp pH 6,8: Hòa tan 28,80 g Natri hydrophosphat và 11,45 g Kali dihydrophosphat trong nước cất vừa đủ
1000 ml, dùng dung dịch HCl 1M hoặc NaOH 1M để điều chỉnh về pH 6,8
2.2.1 Tạo vi nang đa nhân chứa Saccharomyces boulardii theo phương pháp tách pha đông tụ
- Khảo sát nồng độ alginat của thành phần dịch bao ngoài ảnh hưởng đến quá trình tạo vi nang đa nhân
- Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giữa vi nang nhân và hỗn dịch bao gói tới quá trình tạo vi nang đa nhân
- Tạo vi nang đa nhân chứa Saccharomyces boulardii
2.2.2 Đánh giá khả năng bảo vệ và giải phóng VSV của vi nang đa nhân
- Đánh giá khả năng bảo vệ VSV và giữ cấu trúc vi nang trong dung dịch pH 1.2
- Đánh giá khả năng giải phóng VSV của vi nang đa nhân
Phương pháp tiệt khuẩn bằng nhiệt ẩm
Áp dụng để tiệt khuẩn dung dịch nước, pipet tips và dụng cụ thủy tinh Nguyên liệu và dụng cụ tiệt khuẩn được gói bằng giấy bạc, giấy báo hoặc đựng trong bình nón đậy bút bông.
Tiến hành tiệt khuẩn trong nồi hấp ở điều kiện 115℃ trong 20 phút hoặc 121℃ trong 15 phút
Để thực hiện quy trình, trước tiên, bạn cần cân một lượng tinh bột nhất định và cho vào bình nón, sau đó đậy kín bằng nút bông Tiếp theo, đun cách thủy ở nhiệt độ 70℃–80℃ trong 1 giờ, rồi ủ bình trong tủ ấm ở 37℃ trong 24 giờ Lặp lại thao tác này trong 3 ngày liên tiếp để đạt được kết quả mong muốn.
2.3.2 Phương pháp nuôi cấy thu hỗn dịch tế bào
Để hoạt hóa vi sinh vật từ ống giống bảo quản trong thạch nghiêng, pha 100 ml môi trường MT1 và chia đều vào 10 ống nghiệm (10 ml mỗi ống) Nút kín các ống và hấp tiệt trùng bằng phương pháp nhiệt ẩm ở 115℃ trong 20 phút, sau đó để nguội Tiến hành cấy giống vào các ống nghiệm này và ủ trong 24 giờ ở nhiệt độ 30℃.