TỔNG QUAN
Tổng quan về cây Cỏ nhọ nồi (Eclipta prostrata L.)
Cây Cỏ nhọ nồi hay còn gọi là Cỏ mực, hạn liên thảo có tên khoa học là Eclipta prostrata L thuộc họ Cúc (Asteraceae)
Theo hệ thống phân loại của Takhtajan năm 2009 [53], vị trí phân loại của cây Cỏ nhọ nồi được tóm tắt như sau:
Giới: Thực vật (Plantae) Lớp: Ngọc Lan (Magnolipsida) Phân lớp: Cúc (Asteridae) Bộ: Cúc (Asterales) Họ: Cúc (Asteraceae) Chi: Eclipta
Cây thảo mọc đứng hoặc bò, cao từ 30 – 40 cm, có thân tròn, lông cứng màu lục hoặc đỏ tía Mủ cây trong suốt, chuyển sang màu đen khi tiếp xúc với không khí Lá mọc đối, hình mác, dài 2 – 8 cm, rộng 0,5 – 1,5 cm, với gốc thuôn và đầu nhọn, mép lá có răng nhỏ, cả hai mặt đều có lông nháp Cây rất đa dạng, với thân có thể thắt lại ở mấu và phình ra ở dóng, lá có thể to bản, hình bầu dục hoặc hình trứng Thời gian ra hoa từ tháng 2 đến tháng 5, với cụm hoa mọc ở ngọn thân hoặc kẽ lá, cuống dài 1 – 4 cm, có lông thô Đầu hoa có đường kính 0,8 – 1,2 cm, lá bắc thuôn nhọn và có lông, hoa màu trắng, với hoa cái ở ngoài hình lưỡi, xếp thành hàng, trong khi hoa lưỡng tính hình ống có mào lông giảm thành vảy nhỏ và ngắn, tràng hoa cái có lưỡi nguyên hoặc xẻ.
2 răng, tràng hoa lưỡng tính có 4 thùy hình trái xoan nhị 4
Quả bế, dài 3 mm, rộng 1,5 mm, có 3 cạnh, hơi dẹt, đầu bẹt, có 2 sừng nhỏ [1],
Chi Eclipta L ở Việt Nam chỉ có một loài là Eclipta prostrata L (Syn Eclipta alba (L.) Hassk.)
Cỏ nhọ nồi (E prostrata L.) là loại cây rất phổ biến tại Việt Nam, phân bố rộng rãi ở các tỉnh đồng bằng, trung du và miền núi, có thể mọc ở độ cao lên đến 1500 m, đặc biệt là ở các tỉnh phía Nam như Yên Bái, Hà Giang (Vị Xuyên), Tuyên Quang, Lạng Sơn (Chi Lăng) và Bắc Giang (Hiệp Hòa).
Cây mọc chủ yếu ở các tỉnh như Hà Nội, Kon Tum, Đắk Lắk, Bà Rịa-Vũng Tàu và đồng bằng sông Cửu Long, ưa ẩm và ánh sáng nhưng cũng có thể chịu bóng nhẹ Chúng thường xuất hiện cùng với các loại cỏ thấp trên bãi sông, ruộng hoa màu, ven đường và bãi hoang xung quanh làng Cây ra hoa và quả nhiều hàng năm, chủ yếu tái sinh tự nhiên bằng hạt Với khả năng mọc chồi gốc và phân cành phong phú, cây dễ dàng phát triển và tạo thành các đám bò lan trên mặt đất.
Ngoài ra, Cỏ nhọ nồi còn được tìm thấy ở Ấn Độ, Mianma, Trung Quốc, Lào, Campuchia, Thái Lan, Malaysia, Indonesia [2]
1.1.4 Thành phần hóa học Đã có rất nhiều nghiên cứu về các thành phần hóa học của Cỏ nhọ nồi, các nhóm chất được tìm thấy trong cây bao gồm: alcaloid, coumarin, saponin, tanin, chất đắng, tinh dầu, acid hữu cơ, thiophen, flavonoid, acid phenolic, triterpenoid, các sterol [15],
Cỏ nhọ nồi chứa các coumarin chủ yếu là dẫn chất của coumestan, với những thành phần quan trọng như wedelolacton, demethylwedelolacton và demethylwedelolacton-7-glucoside Các hợp chất này được nghiên cứu và quan tâm nhiều trong cây cỏ nhọ nồi.
Gần đây, đã xác định thêm được 2 coumarin có trong cây thuộc nhóm furanocoumarin: psoralen, isopsoralen [28]
Tinh dầu trong Cỏ nhọ nồi có thể thu được từ lá và thân cây, các phân tích GC-
MS cho thấy các chất có trong tinh dầu chủ yếu thuộc nhóm sesquiterpen, trong đó thành phần chính được tìm ra là α-humulen; 6,9-heptadecadien; (E)-β-farnesen; và α- phellandren [14], [40]
Nghiên cứu về các alcaloid có trong cây Cỏ nhọ nồi, đã xác định được hai chất đó là nicotin (0,078 %) và ecliptin [1]
Năm 1998, từ dịch chiết methaol, MS Abdel-Kader và cộng sự đã phân lập được
8 alcaloid có khung steroid, lần lượt là: (20S)(25S)-22,26-imino-cholesta-5,22(N)- dien-3β-ol (verazin) (4); (20R)-verazin (5); 20-epi-3-dehydroxy-3-oxo-5,6-dihydro-
4,5-dehydroverazin (6); ecliptalbin [(20R)-20-pyridyl-cholesta-5-ene-3β,23-diol] (7),
(20R)-4β-hydroxyverazin (8); 4β-hydroxyverazin (9); (20R)-25β-hydroxyverazin (10) và 25β-hydroxyverazin (11) [10].
Gần đây đã xác định được thêm công thức của bốn alcaloid mới thuộc nhóm guanidin được đặt tên là eclitamin A, B, C, D (12 - 15) [52]
Các flavonoid được tìm thấy có trong cây chủ yếu thuộc 3 nhóm: flavon, isoflavon, flavonol
+ Nhóm flavon: luteolin (16) [22], [25], [28], [29], [34], [76], luteolin-7-O-glucoside
(17) [22], [29], apigenin (18) [22], [34], [76] , acacetin (19) [28], acacetin-7-O- rutinoside (20) [28], [76], diosmetin (21) [27]
+ Nhóm isoflavon: pratensein (22) [19], [22], pratensein-7-O-β-D-glucopyranosid
+ Nhóm flavonol: quercetin (28) [22], [28], [77], kaemferol (29) [28], kaemferid (30)
Các saponin được tìm thấy trong cây thuộc nhóm saponin triterpenoid, phần lớn thuộc nhóm oleanan:
Năm 1994, Yahara và cộng sự đã xác định cấu trúc của 6 saponin, được gọi là eclalbasaponin I đến VI Đến năm 2013, Han đã phân lập echinocystic acid-28-O-β-D-glucopyranosid Tiếp theo, vào năm 2014, Feng-Min Xi đã phân lập và xác định cấu trúc của 8 hợp chất, bao gồm các este của oleanolic acid với các nhóm glucopyranosyl khác nhau.
3β,16β,29-trihydroxy oleanan-12-en-3-O-β-D-glucopyranosid, 3,28-di-O-β-D- glucopyranosyl-3β,16β-dihydroxy oleanan-12-en-28-oleanlic acid; Silphiosid B;
Silphiosid E; 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranosyl oleanlic-18-en acid-28-O-β-D-glucopyranosid [58]
Năm 1997, Yahara tiếp tục phân lập được các saponin thuộc phân nhóm taraxasteran, đặt tên là eclalbasaponin từ VII đến X (46-49) [60]
Phân nhóm lupan mới xác định được 1 chất là 28-O-β-D-glucopyranosyl betulinic acid 3β-O-β-D-glucopyranosid (50) [58]
Công thức các chất được phân lập từ Cỏ nhọ nồi được trình bày trong Phụ lục 2
1.1.5 Công dụng và tác dụng dược lý 1.1.5.1 Công dụng
Dựa theo kinh nghiệm dân gian, Cỏ nhọ nồi được sử dụng để chữa nhiều bệnh
Nghiên cứu về việc sử dụng cây cỏ làm thuốc tại quần đảo Hải Nam, Trung Quốc cho thấy nước sắc Cỏ nhọ nồi có giá trị cao trong điều trị các bệnh về gan, chống viêm, cầm máu và chữa rắn cắn Tại Ấn Độ, Cỏ nhọ nồi được sử dụng như một loại thuốc bổ, hỗ trợ điều trị các vấn đề về phì đại gan và lách, cũng như chữa xổ mũi ở trẻ nhỏ Trong y học cổ truyền Trung Quốc, Cỏ nhọ nồi cũng được biết đến với nhiều công dụng quý giá.
Cỏ nhọ nồi là thành phần quan trọng trong thuốc mỡ điều trị một số bệnh ngoài da Nước sắc từ cỏ nhọ nồi chứa các hợp chất có khả năng thúc đẩy quá trình melanogenesis và bảo vệ da khỏi tác động của ánh sáng.
Cỏ nhọ nồi, phổ biến tại Việt Nam và Trung Quốc, được sử dụng làm thuốc bổ máu và có tác dụng cầm máu cho nhiều tình trạng như ho ra máu, lỵ ra máu, rong kinh, băng huyết, chảy máu cam, trĩ ra máu, nôn ra máu, đái ra máu và các vết thương chảy máu Ngoài ra, cỏ nhọ nồi còn hỗ trợ điều trị bệnh ban sởi, ho hen, viêm họng, bỏng, lao phổi, di tinh, mộng tinh, và bệnh nấm da Nó cũng được sử dụng trong các bài thuốc trị viêm gan virus, sốt xuất huyết và sỏi tiết niệu.
Tác dụng bảo vệ gan:
Nghiên cứu trên mô hình gây độc gan cấp ở chuột bằng các tác nhân như CCl4 và paracetamol cho thấy, nhóm chuột được sử dụng Cỏ nhọ nồi trước khi gây độc gan có tỷ lệ tử vong giảm đáng kể, cùng với nồng độ các enzym aminotransferase (ASAT, ALAT) và phosphatase kiềm cũng giảm, cải thiện hình ảnh mô bệnh.
Nghiên cứu cho thấy Cỏ nhọ nồi có tác dụng bảo vệ gan rõ rệt so với nhóm chuột không sử dụng thuốc, với việc giảm tổn thương hoại tử tế bào gan và lắng đọng mỡ Mô hình chuột được gây tăng lipid máu bằng chế độ ăn giàu chất béo cho thấy sự cải thiện đáng kể khi so với nhóm chứng, bao gồm giảm sự giãn mạch máu trong gan và kích thích tái tạo tế bào gan Mặc dù cơ chế bảo vệ gan của Cỏ nhọ nồi chưa được làm rõ, nhưng nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các coumestan như wedelolacton và demethylwedelolacton có thể đóng vai trò quan trọng trong tác dụng này.
Dịch chiết nước Cỏ nhọ nồi đã được chứng minh có tác dụng ức chế virus viêm gan C Phân tích hóa học cho thấy ba hợp chất quan trọng, bao gồm wedelolacton, luteolin và apigenin, có khả năng ức chế sao chép virus Trên mô hình in-vitro, các hợp chất này hoạt động bằng cách ức chế enzym liên quan đến quá trình sao chép của virus.
NS5B và tác dụng này là phụ thuộc liều [16][41]
Tác dụng trên hệ thần kinh
Dịch chiết cồn nước từ cây Cỏ nhọ nồi với liều 300 mg/kg có tác dụng an thần, giãn cơ, giảm lo âu, hỗ trợ chức năng thần kinh và chống trầm cảm Ngoài ra, dịch chiết này còn cho thấy hiệu quả trong việc bảo vệ tế bào thần kinh khỏi tổn thương do thiếu máu cục bộ, nhờ vào khả năng chống oxi hóa mạnh mẽ của cây.
Cao chiết methanol từ lá cây Cỏ nhọ nồi đã được chứng minh có khả năng chống động kinh trên mô hình chuột gây động kinh bằng pentylenetetrazol và picrotoxin với liều từ 10-200 mg/kg Các thành phần chính như wedelolacton và luteolin được xác định có tác dụng tích cực, nhờ vào khả năng điều biến thụ thể GABA A, vốn là yếu tố góp phần vào bệnh động kinh Cả hai hợp chất này đều có ái lực chọn lọc với vị trí gắn kết benzodiazepin trên thụ thể GABA A, từ đó kích hoạt thụ thể và ngăn chặn các cơn động kinh.
Tác dụng giảm đau và chống viêm
Dịch chiết ethanol Cỏ nhọ nồi có tác dụng giảm đau ở mức liều 200 mg/kg trên các mô hình kẹp đuôi, mâm nóng và gây đau quặn ở chuột [26], [42]
Cỏ nhọ nồi có tác dụng chống viêm rõ rệt, hiệu quả trên mô hình viêm cấp do carrageenan và các chất trung gian hóa học như histamin, serotonin, cũng như trong mô hình viêm mạn.
Tác dụng chống ung thư:
Quá trình cầm máu và tác dụng cầm máu của Cỏ nhọ nồi
1.2.1 Các giai đoạn của quá trình cầm máu
Cầm máu là quá trình quan trọng nhằm ngăn chặn máu chảy ra khỏi mạch khi có tổn thương Quá trình này diễn ra qua các giai đoạn chính, giúp bảo vệ cơ thể khỏi mất máu nghiêm trọng.
- Co cục máu đông và tan cục máu đông
Co mạch xảy ra ngay khi có tổn thương nhằm hạn chế lượng máu thoát ra và tạo điều kiện cho việc hình thành nút tiểu cầu, với sự tham gia của các yếu tố như thần kinh giao cảm, serotonin và thromboxan A2 từ tiểu cầu Thời gian co mạch thường kéo dài từ vài phút đến vài giờ, và mức độ co mạch càng mạnh khi tổn thương lớn Thành mạch bị tổn thương sẽ bộc lộ collagen, tạo điều kiện cho tiểu cầu kết tập Tại đây, tiểu cầu giải phóng nhiều chất trung gian hóa học như ADP và thromboxan A2, thu hút các tiểu cầu khác đến kết tụ, hình thành nút tiểu cầu để bịt kín tổn thương Đông máu xảy ra sau phản xạ co mạch và hình thành nút tiểu cầu, là quá trình chuyển đổi máu từ thể lỏng sang thể đặc thông qua chuỗi phản ứng hóa học của các yếu tố đông máu trong huyết tương, mô tổn thương và tiểu cầu, bao gồm ba giai đoạn: tạo phức hợp prothrombinase, hình thành thrombin và chuyển fibrinogen thành các sợi fibrin, từ đó hình thành cục máu đông bịt kín chỗ tổn thương.
Dưới tác dụng của tiểu cầu cục máu đông sau khi hình thành sẽ được co lại sau
20 phút đến 1 giờ Sau đó 1-2 tuần, các chất ở bên trong cục máu đông sẽ được hoạt hóa và hoạt động như 1 enzim làm tan cục máu đông [4], [5]
1.2.2 Vài nét về quá trình đông máu
Khi thành mạch bị tổn thương, quá trình đông máu được khởi động qua hai con đường: đông máu nội sinh và ngoại sinh Đông máu ngoại sinh bắt đầu bằng việc giải phóng thromboplastin từ mô bị tổn thương, kích hoạt yếu tố VII và tạo phức hợp III-VII, dẫn đến việc kích hoạt yếu tố X Yếu tố X kết hợp với phospholipid tiểu cầu, ion Ca++ và yếu tố V để hình thành phức hợp prothrombinase Ngược lại, đông máu nội sinh khởi đầu khi yếu tố XII được kích hoạt, tiếp theo là sự kích hoạt dây chuyền của các yếu tố đông máu khác Quá trình kích hoạt yếu tố X trong đông máu nội sinh cũng cần có phospholipid tiểu cầu, ion Ca++ và yếu tố VIII Khi phức hợp prothrombinase được hình thành, nó sẽ xúc tác chuyển prothrombin thành thrombin, giúp chuyển fibrinogen thành fibrin đơn phân, từ đó tạo điều kiện cho sự hình thành mạng lưới fibrin bịt kín chỗ tổn thương.
Trong thực nghiệm, huyết tương có thể được đông lại trong khoảng 10 – 14 giây khi thêm thromboplastin mô và ion calci, điều này là cơ sở cho xét nghiệm thời gian PT để đánh giá quá trình đông máu ngoại sinh Để đánh giá thời gian đông máu ngoại sinh, người ta sử dụng thời gian Cephalin - Kaolin (APTT), trong đó Cephalin là chất tương tự phospholipid của tiểu cầu và Kaolin là chất kích hoạt yếu tố tiếp xúc.
1.2.3 Một số nghiên cứu về tác dụng đông máu in-vitro của dược liệu
Năm 2012, Hataichanok Pandith đã khảo sát tác dụng cầm máu in-vitro của cây
Chromolaena odorata sẽ được chế biến thành dịch chiết nước đông khô và cao đặc bằng cách chiết với ethanol 50, 70, và 95% Sau đó, dịch chiết này sẽ được ủ với huyết tương theo tỷ lệ 1:1 Tác dụng cầm máu của sản phẩm sẽ được so sánh với mẫu chứng NaCl 0,9% cho dịch chiết đông khô và Tween 80 1% cho cao đặc Các thông số quan sát sẽ được ghi nhận để đánh giá hiệu quả.
11 là thời gian PT (thời gian đông máu ngoại sinh) và thời gian đông APTT (thời gian đông máu nội sinh) [43]
Năm 2014, Naoki Ohkura đã thực hiện một nghiên cứu sàng lọc tác dụng cầm máu in-vitro của 114 loại dược liệu Trung Quốc Các dược liệu được đun trong nước trong 30 phút, sau đó dịch chiết được pha loãng tới nồng độ 10 mg/ml để khảo sát Các thông số quan sát bao gồm thời gian PT (con đường ngoại sinh) và sự hoạt hóa yếu tố XII (con đường nội sinh) Mẫu huyết tương được ủ với dịch thử để đánh giá hiệu quả.
Thời gian để tiến hành phân tích PT là 5 phút, bắt đầu từ khi thêm thuốc thử Yếu tố XII hoạt hóa sẽ được phát hiện và định lượng thông qua phương pháp điện di không liên tục SDS-PAGE.
Năm 2018, Hoàng Thị Phương Liên và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tác dụng cầm máu in-vitro của cao chiết nước từ lá cây Lấu đỏ (Psychotria rubra) với ba nồng độ 0,5; 1,0; và 2,0 mg/ml trên mẫu huyết tương chuột Tác dụng cầm máu được so sánh với nhóm chứng là DMSO, và mẫu huyết tương được ủ với các mẫu khảo sát trong 3 phút Thời gian PT được tính từ khi thêm thuốc thử PT, trong khi thời gian APTT được tính từ khi thêm CaCl2.
1.2.4 Tác dụng cầm máu của cây Cỏ nhọ nồi
Trong quyển “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam” của Đỗ Tất Lợi, Cỏ nhọ nồi được phân loại là thuốc cầm máu, có tác dụng chữa các bệnh chảy máu cả trong lẫn ngoài và sốt xuất huyết Nước sắc từ Cỏ nhọ nồi khô, với liều 3 g/kg thể trọng, có khả năng giảm thời gian Quick và làm tăng tổng lượng prothrombin (yếu tố II) Ngoài ra, Cỏ nhọ nồi cũng tương tự như vitamin K trong việc chống lại tác dụng của dicoumarin Hoạt tính cầm máu của 1 g Cỏ nhọ nồi tương đương với 1,33 g vitamin K.
Mahar đã nghiên cứu tác dụng cầm máu của dịch chiết ethanol từ cây Cỏ nhọ nồi (EEEA) trên ba nhóm thỏ: nhóm bình thường, nhóm bị rối loạn chức năng tiểu cầu do aspirin và nhóm bị rối loạn các yếu tố đông máu do heparin Quá trình cầm máu được đánh giá thông qua thời gian chảy máu, thời gian máu đông, các thông số đông máu như thời gian đông máu ngoại sinh (PT), thời gian đông máu nội sinh (APTT) và số lượng tiểu cầu Nghiên cứu sử dụng các liều lượng 200, 400, 600 và 800 mg/kg qua đường uống Mặc dù không có ảnh hưởng đáng kể đến quá trình đông máu và số lượng tiểu cầu ở các liều thấp, nhưng liều cao 600 mg/kg và 800 mg/kg đã cho thấy sự giảm đáng kể.
12 kể thời gian cầm máu ở cả 3 nhóm thông qua các thông số thời gian chảy máu và thời gian máu đông [35]
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng cho cao khô Cỏ nhọ nồi
- Thu mẫu dược liệu và kiểm nghiệm theo các chỉ tiêu định tính (bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng) theo tiêu chuẩn DĐVN V
- Điều chế cao khô từ các mẫu dược liệu thu được
Nghiên cứu này tập trung vào việc xây dựng các chỉ tiêu chất lượng cho cao khô Cỏ nhọ nồi, bao gồm các yếu tố cảm quan, mất khối lượng do quá trình làm khô, độ pH, cùng với việc xác định định tính và định lượng wedelolacton thông qua phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng.
2.2.2 Đánh giá tác dụng của cao khô Cỏ nhọ nồi trên quá trình đông máu in-vitro
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Xây dựng một số chỉ tiêu chất lượng cho cao khô Cỏ nhọ nồi 2.3.1.1 Chuẩn bị nguyên liệu và đánh giá sơ bộ Để cho ra một chế phẩm cao khô có thể sử dụng trực tiếp hoặc làm nguyên liệu để sản xuất thì việc kiểm soát nguyên liệu đầu vào là rất quan trọng Sáu mẫu dược liệu tươi sau khi thu hái, xử lý sơ bộ sẽ được đem đi giám định tên khoa học và kiểm nghiệm các chỉ tiêu định tính bằng phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng theo tiêu chuẩn DĐVN V:
Phương pháp A (dùng để định tính khung steroid): Lấy 1 g bột dược liệu, thêm
Để tiến hành thí nghiệm, ngâm 5 ml ether ethylic trong 10 phút, thỉnh thoảng lắc và sau đó lọc Lấy 1 ml dịch lọc cho vào ống nghiệm, thêm 10 giọt anhydrid acetic, sau đó từ từ thêm 15 giọt acid sulfuric theo thành ống nghiệm Phản ứng dương tính sẽ xuất hiện khi nơi tiếp giáp giữa hai lớp chất lỏng có màu nâu đỏ, đồng thời lớp ether chuyển sang màu xanh da trời.
Phương pháp B (bằng sắc ký lớp mỏng):
Các điều kiện sắc ký:
Dung dịch thử : Lấy 1,0 g bột dược liệu, thêm 10 ml MeOH, siêu âm trong 30 phút, lọc, dùng dịch lọc làm dung dịch thừ
Dung dịch đối chiếu : Dung dịch wedelolacton trong MeOH nồng độ 0,1 mg/ml
Pha tĩnh : Bản mỏng tráng sẵn silicagel GF 254 hoạt hóa ở 105 °C trong 1 h
Pha động : n-hexan - ethyl acetat - acid formic (10 : 7 : 1 )
Tiờm mẫu : Chấm riờng biệt lờn bản mỏng 3 àl dung dịch thừ, 1,5 àl dung dịch chuẩn
Phát hiện vết : Quan sát dưới bước sóng UV 366 nm
Trên sắc ký đồ của dung dịch thử, cần phải xuất hiện vết có màu sắc và giá trị Rf tương đồng với các vết của dung dịch chuẩn.
2.3.1.2 Điều chế cao khô Cỏ nhọ nồi
Sau khi sấy khô đạt độ ẩm quy định, dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp sắc với nước Để điều chế cao khô Cỏ nhọ nồi, cần cân khoảng 50 g dược liệu đã được chia nhỏ, sau đó thêm nước vừa ngập và đun trong 1 giờ Tiếp theo, lọc dịch chiết và lặp lại quá trình trên thêm 2 lần, mỗi lần kéo dài 30 phút Cuối cùng, gộp tất cả dịch chiết thu được.
Để thu được cao đặc, cần lắng 16 lít dịch trong 12 giờ và gạn vào dụng cụ có đáy rộng Sau đó, đun trên bếp cho đến khi đạt được cao đặc, tiếp tục sấy ở nhiệt độ không quá 70°C với thông khí trong 24 giờ Cao thu được cần được nghiền và trộn đều thành bột, sau đó bảo quản trong túi PE có mép kín Hàm lượng cao thu được được tính theo công thức.
Trong đó: H (%): hàm lượng cao thu được m c : khối lượng cao thu được (g) m dl : khối lượng dược liệu (g)
RH dl : độ ẩm dược liệu (%)
2.3.1.3 Xây dựng tiêu chuẩn cao khô Cỏ nhọ nồi
Quan sát và mô tả các mẫu cao về thể chất, màu sắc, mùi, vị
Mất khối lƣợng do làm khô
Tiến hành như phụ lục 9.6 (DĐVN V) [72]: Cân chính xác khoảng 1 g cao sấy ở 105°C đến khối lượng không đổi Mỗi mẫu cao làm 3 lần, lấy giá trị trung bình
Dược điển Việt Nam V quy định lượng nước trong cao khô không quá 5 %
Theo phụ lục 6.2 DĐVN V, cân chính xác khoảng 1 g cao khô Cỏ nhọ nồi và pha loãng với nước để tạo dung dịch thử 1% Sau khi hiệu chỉnh máy đo pH ở hai giá trị pH 4 và 7, tiến hành đo các mẫu thử trong cùng điều kiện Mỗi mẫu được đo ba lần để lấy kết quả trung bình.
Cỏ nhọ nồi đã được nghiên cứu rộng rãi về tác dụng chữa bệnh, nhờ vào bốn nhóm chất chính trong cây, bao gồm: coumarin, flavonoid, saponin và tanin Những hợp chất này đóng vai trò quan trọng trong việc mang lại lợi ích sức khỏe cho con người.
[57] [73] [47] Kết quả định tính sơ bộ trong dược liệu cho thấy cỏ nhọ nồi có chứa cả
Nhóm nghiên cứu đã đề xuất việc kiểm soát bốn nhóm chất chính trong các mẫu cao, bao gồm coumarin, flavonoid, saponin và tanin Việc này được thực hiện thông qua các phản ứng hóa học, nhằm đảm bảo chất lượng và hiệu quả của sản phẩm.
Bảng 2.2: Phản ứng định tính các nhóm chất trong cao khô Cỏ nhọ nồi
Nhóm chất Tên phản ứng Tiến hành
Coumarin Mở đóng vòng lacton
Cân 1g cao khô Cỏ nhọ nồi vào cốc có mỏ, thêm 20 ml ethanol 90˚, sau đó đun cách thủy trong 2-3 phút cho đến khi sôi Lọc nóng dịch chiết vào 2 ống nghiệm và cô cách thủy cho đến khi mỗi ống còn lại 1 ml dịch chiết để tiến hành phản ứng.
Trong thí nghiệm, ống 1 được thêm 0,5 ml dung dịch NaOH 10%, trong khi ống 2 giữ nguyên Sau khi đun sôi cả hai ống và để nguội, ống 1 sẽ xuất hiện màu vàng hoặc tủa đục màu vàng, trong khi ống 2 vẫn trong suốt.
Thêm vào cả 2 ống nghiệm mỗi ống khoảng 2 ml nước, đun sôi, để nguội rồi quan sát Ống 1 trong trở lại, ống 2 có tủa đục
Acid hóa ống 1 bằng vài giọt acid clohydric đặc, quan sát
=> Phản ứng dương tính khi ống 1 có tủa đục như ống 2
Saponin Hiện tượng tạo bọt
Cho 0,5 g cao khô Cỏ nhọ nồi vào cốc có mỏ, thêm 5 ml nước và đun sôi Sau khi nguội, lọc dịch chiết vào ống nghiệm lớn, thêm 5 ml nước và lắc mạnh trong 5 phút Cuối cùng, để yên và quan sát hiện tượng tạo bọt.
=> Dương tính nếu bọt còn bền vững sau 15 phút
Để chiết xuất flavonoid, cho khoảng 0,5 g cao khô Cỏ nhọ nồi vào cốc có mỏ, thêm 10 ml ethanol 90˚ và đun cách thủy đến khi sôi trong 2 – 3 phút Sau đó, lọc nóng và để nguội dịch lọc để tiến hành các phản ứng hóa học.
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết Thêm một ít bội magnesi kim loại (khoảng 10 mg) Nhỏ từng giọt HCl đậm đặc
=> Phản ứng dương tính khi dung dịch chuyển từ màu
Để thực hiện thí nghiệm, cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết và thêm vài giọt NaOH 10% Quan sát hiện tượng tủa vàng xuất hiện Tiếp theo, thêm 1 ml nước cất vào ống nghiệm; nếu tủa tan và màu vàng của dung dịch tăng thêm, kết quả sẽ dương tính.
Nhỏ một giọt dịch chiết lên giấy lọc Hơ khô rồi để lên miệng lọ amoniac đã mở nút, sẽ thấy màu vàng của dịch chiết tăng lên
Cho vào ống nghiệm nhỏ 1 ml dịch chiết Thêm vài giọt dung dịch FeCl 3 5 % Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa xanh đen
Cho 1 ml dịch chiết vào ống nghiệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (dung dịch NaOH 10 %) thêm vài giọt thuốc thử diazo mới pha, lắc đều Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu đỏ
Tanin Cân khoảng 0, 5 g cao khô Cỏ nhọ nồi thêm 10 ml nước cất, đun sôi trong 2 phút Để nguội rồi lọc, dịch lọc dùng để làm các phản ứng
Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 5 giọt gelatin 1 % Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông trắng
Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 2 giọt dung dịch FeCl 3 5 % Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu hoặc tủa màu xanh đen hoặc xanh nâu nhạt
Phản ứng với chì acetat 10 %
Lấy 2 ml dịch lọc, thêm 2 giọt chì acetat 10 % Phản ứng dương tính nếu xuất hiện tủa bông
Định tính bằng sắc ký lớp mỏng
Cỏ nhọ nồi, theo Dược điển Việt Nam V, được nghiên cứu sử dụng wedelolacton làm chất đối chiếu cho chỉ tiêu định tính cao khô của cây này bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.
Các điều kiện sắc ký:
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Đánh giá tác dụng của cao khô Cỏ nhọ nồi trên quá trình đông máu in-vitro
Mẫu cao khô từ Thái Nguyên được chọn cho thí nghiệm đánh giá tác dụng nhờ đạt tiêu chuẩn chất lượng về cảm quan, hàm ẩm, pH và định tính, đồng thời có hàm lượng wedelolacton cao nhất.
Thử nghiệm đánh giá tác dụng của cao khô Thái Nguyên đối với thời gian đông máu in-vitro đã được thực hiện ở nhiều nồng độ khác nhau Kết quả của nghiên cứu này được trình bày chi tiết trong bảng 3.10.
(đo thời gian APTT) và bảng 3.11 (đo thời gian PT)
Bảng 3.10: Khảo sát tác dụng của cao khô Cỏ nhọ nồi trên thời gian APTT
Mẫu thử Thời gian APTT (giây)
Mẫu thử nồng độ 0,5 mg/ml 29,5 ± 0,15 0,946
Mẫu thử nồng độ 1 mg/ml 29,3 ± 0,07 0,821
Mẫu thử nồng độ 2 mg/ml 27,3 ± 0,19 0,117
Mẫu thử nồng độ 5 mg/ml 31,2 ± 0,22 0,046
Mẫu thử nồng độ 10 mg/ml 40,1 ± 0,27 0,006
Nhận xét: kết quả bảng 3.10 cho thấy thời gian APTT của mẫu thử ở các nồng độ
Nghiên cứu cho thấy nồng độ 0,5; 1; 2 mg/ml không tạo ra sự khác biệt so với mẫu trắng (nước cất) với p > 0,05 Trong khi đó, các mẫu thử với nồng độ 5; 10 mg/ml mặc dù có sự khác biệt đáng kể (p < 0,05), nhưng thời gian APTT vẫn không ngắn hơn so với mẫu trắng.
Bảng 3.11: Khảo sát tác dụng của cao khô Cỏ nhọ nồi trên thời gian đông máu PT
Mẫu thử Thời gian PT (giây)
Mẫu thử nồng độ 0,5 mg/ml 10,9 ± 0,08 0,580
Mẫu thử nồng độ 1 mg/ml 11,2 ± 0,21 0,529
Mẫu thử nồng độ 2 mg/ml 10,7 ± 0,12 0,109
Mẫu thử nồng độ 5 mg/ml 11,6 ± 0,08 0,238
Mẫu thử nồng độ 10 mg/ml 13,0 ± 0,02 0,014
Nhận xét: kết quả bảng 3.11 cho thấy thời gian PT của mẫu thử ở các nồng độ 0,5;
1; 2; 5 mg/ml không có sự khác biệt so với mẫu trắng (p > 0,05) Mẫu thử ở nồng độ
10 mg/ml có sự khác biệt (p < 0,05) tuy nhiên thời gian PT không ngắn hơn so với mẫu trắng
Bàn luận
3.3.1 Về xây dựng chỉ tiêu chất lượng cao khô Cỏ nhọ nồi Đảm bảo chất lượng luôn là một vấn đề cần quan tâm để các chế phẩm có nguồn gốc dược liệu đảm bảo tính hiệu quả và an toàn Hơn nữa, kết quả đánh giá tác dụng dược lý các dạng cao đã có các chỉ tiêu về chất lượng đảm bảo được tính ổn định và chính xác Đảm bảo chất lượng là một quá trình xuyên suốt, từ đảm bảo chất lượng nguyên liệu đầu vào, chất lượng các sản phẩm trung gian, chế phẩm cuối cùng cũng như toàn bộ quá trình sản xuất, bảo quản, lưu thông, phân phối cho đến tay người sử dụng Trong đó xây dựng các chỉ tiêu để đánh giá chất lượng là một trong những khâu của quá trình này
Cỏ nhọ nồi là một loại cây thuốc nam truyền thống, được sử dụng từ lâu trong dân gian để hạ sốt và cầm máu Ngoài những công dụng này, cỏ nhọ nồi còn có tác dụng bảo vệ gan, mang lại nhiều lợi ích cho sức khỏe.
Cỏ nhọ nồi là một loại dược liệu dễ trồng và phát triển, được biết đến với các đặc tính chống viêm và chống oxy hóa Sản phẩm cao khô từ Cỏ nhọ nồi có tiềm năng lớn trong việc phát triển các dạng bào chế hiện đại Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã xây dựng một số chỉ tiêu để đánh giá chất lượng cao khô Cỏ nhọ nồi và tiến hành đánh giá sơ bộ tác dụng của sản phẩm này đối với quá trình đông máu in-vitro.
Nghiên cứu này thu thập các mẫu dược liệu từ 6 vùng khác nhau, được xác định tên khoa học và đáp ứng tiêu chuẩn dược điển Việt Nam V Qua đó, 6 mẫu cao khô Cỏ nhọ nồi được điều chế từ dịch chiết nước tương ứng Các chỉ tiêu chất lượng của các mẫu cao khô bao gồm cảm quan, mất khối lượng do làm khô, pH, định tính qua phản ứng hóa học và sắc ký lớp mỏng, cùng với việc định lượng wedelolacton có trong các mẫu.
Chỉ tiêu cảm quan được thu được sau khi quan sát, đánh giá các mẫu cao khô thu được về thể chất, màu sắc, mùi vị
Chỉ tiêu mất khối lượng do làm khô được sử dụng để xác định hàm lượng nước và các chất dễ bay hơi trong mẫu cao Cỏ nhọ nồi chứa tinh dầu với hàm lượng thấp (0,24 %), và quá trình điều chế cao chịu ảnh hưởng của nhiệt và lực cơ học, khiến tinh dầu dễ bay hơi Do đó, chỉ tiêu này chủ yếu dùng để xác định hàm lượng nước trong các mẫu cao khô, với lượng nước cần được kiểm soát trong giới hạn nhất định để ngăn chặn sự phát triển của vi khuẩn.
Kết quả khảo sát từ 33 sinh vật cho thấy các mẫu cao khô đều có giá trị mất khối lượng khi làm khô dưới 5%, đáp ứng tiêu chuẩn của Dược điển Việt Nam V.
Chỉ tiêu pH được sử dụng để xác định hoạt độ của các ion H+ trong dung dịch nước, với giá trị pH của các mẫu cao ở nồng độ 1% dao động từ 5,39 đến 6,44 Sự khác biệt về giá trị pH giữa các mẫu có thể được giải thích bởi hàm lượng acid hữu cơ, vô cơ và flavonoid khác nhau trong từng mẫu dược liệu, tuy nhiên, sự khác biệt này không đáng kể Do đó, nhóm nghiên cứu đề xuất phạm vi pH cho chỉ tiêu pH là từ 5,0 đến 6,5.
Kết quả định tính sơ bộ cho thấy dược liệu Cỏ nhọ nồi chứa các nhóm chất như coumarin, flavonoid, tanin, steroid và saponin Trong số đó, coumarin, flavonoid, saponin và tanin không chỉ cho kết quả dương tính rõ ràng mà còn có nhiều bằng chứng hỗ trợ về tác dụng dược lý của cây Cỏ nhọ nồi Những phát hiện này là cơ sở quan trọng để xây dựng chỉ tiêu định tính bằng phản ứng hóa học cho cao khô Cỏ nhọ nồi.
Trong xây dựng tiêu chuẩn cho dược liệu và chế phẩm từ dược liệu, việc lựa chọn chất đánh dấu (marker) phù hợp là rất quan trọng Hiện tại, chưa có báo cáo về chất có hoạt tính liên quan đến tác dụng cầm máu của Cỏ nhọ nồi Dược điển Việt Nam V và Dược điển Châu Âu 8.0 đã chọn wedelolacton làm marker cho các chỉ tiêu định tính và định lượng, trong khi Dược điển Trung Quốc sử dụng ecliptasaponin A cho chỉ tiêu định tính và wedelolacton cho định lượng Wedelolacton, một coumarin chính trong cây, được nghiên cứu nhiều với các tác dụng như chống viêm, chống oxi hóa, và bảo vệ gan Ngược lại, ecliptasaponin A, thuộc nhóm saponin, có ít nghiên cứu hơn, mặc dù một số cho thấy nó có thể giảm thiểu tình trạng xơ hóa phổi và viêm xương khớp Tuy nhiên, chưa có phương pháp phân tích chuẩn để định lượng ecliptasaponin A trong Cỏ nhọ nồi, trong khi wedelolacton đã có phương pháp định lượng rõ ràng trong các dược điển Do đó, nhóm nghiên cứu đã quyết định chọn wedelolacton làm marker chính để đánh giá chất lượng dược liệu.
34 maker phân tích cho các chỉ tiêu định tính bằng sắc ký lớp mỏng và định lượng cho cao khô Cỏ nhọ nồi
Chỉ tiêu định tính bằng sắc ký lớp mỏng là phương pháp quan trọng để xác thực các mẫu cao khô Cỏ nhọ nồi, giúp phân biệt với các loại cao khác nhằm tránh nhầm lẫn và giả mạo Tuy nhiên, việc kiểm tra chỉ với chất chuẩn wedelolacton là không đủ, vì chất này cũng có mặt trong một số loài dược liệu khác như Sài đất Do đó, ngoài việc xác định vết chuẩn, các đặc điểm chung từ sắc ký đồ cũng cần được xem xét để xây dựng chỉ tiêu định tính Các mẫu cao khô Cỏ nhọ nồi, thu hái từ nhiều vùng khác nhau, cho thấy sự tương đồng rõ rệt khi quan sát sắc ký đồ ở 2 bước sóng UV 254 nm và UV 366 nm, với các vết chủ yếu tập trung trong khoảng Rf từ 0,5 – 0,8.
R f = 0,57 trùng với vị trí vết của mẫu wedelolacton chuẩn, khi quan sát ở UV 366 nm xuất hiện thêm 2 vết huỳnh quang xanh lần lượt ở vị trí R f bằng 0,55 và 0,75
Phương pháp định lượng wedelolacton bằng HPLC trong cao khô Cỏ nhọ nồi đã được xây dựng và thẩm định dựa trên chuyên luận dược liệu trong Dược điển châu Âu (EP 8.0) Kết quả nghiên cứu cho thấy phương pháp phân tích này đạt độ tin cậy cao, đủ khả năng định lượng wedelolacton có trong cao khô Cỏ nhọ nồi.
Kết quả phân tích định lượng wedelolacton trong các mẫu cao khô Cỏ nhọ nồi cho thấy hàm lượng chất này dao động từ 0,01% đến 0,15% Sự biến đổi này tương quan với kết quả quan sát trên sắc ký đồ và chỉ tiêu sắc ký lớp mỏng, cũng như kết quả sắc ký đồ khi định tính các mẫu dược liệu ban đầu.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã phát triển phương pháp định lượng wedelolacton trong cao khô Cỏ nhọ nồi, tuy nhiên, chưa xác định được giới hạn hàm lượng cho chỉ tiêu này.
3.3.2 Về tác dụng đông máu in-vitro của cao khô Cỏ nhọ nồi
Thử nghiệm đông máu in-vitro được thực hiện trên mẫu huyết tương của người tình nguyện khỏe mạnh, nhằm đánh giá tác động của cao khô Cỏ nhọ nồi đối với quá trình đông máu Nghiên cứu tập trung vào các yếu tố đông máu có trong huyết tương, được đo qua thời gian PT và APTT Kết quả thu được cho thấy mẫu thử ở các mức nồng độ khác nhau đều có ảnh hưởng đến giai đoạn đông máu.
Cao khô Cỏ nhọ nồi không làm rút ngắn thời gian đông máu, cho thấy rằng nó không tác động lên các yếu tố đông máu có sẵn trong huyết tương Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Mahar và cộng sự.
