TỔNG QUAN
Tổng quan về cây cúc hoa vàng (Chrysanthemum indicum L.)
Cây cúc hoa vàng là cây thảo hàng năm, cao từ 20-50 cm, với thân thẳng, nhẵn và có khía dọc Lá cây mọc so le, hình bầu dục, chia nhiều thùy sâu, mép lá có răng cưa nhọn không đều, mặt trên màu lục đen sẫm và mặt dưới nhạt hơn, cuống lá ngắn với tai ở gốc Cụm hoa hình đầu xuất hiện trên cuống dài ở ngọn thân hoặc kẽ lá, có đường kính từ 1-1,5 cm, với tổng bao lá bắc và lá vảy thuôn dài, mép khô Hoa bên ngoài có hình lưỡi nhỏ màu vàng, trong khi hoa ở giữa có hình ống, không có mào lông, với tràng hoa hình ống ngắn hơn tràng hoa hình lưỡi, và đều có màu vàng.
Cúc hoa vàng, có nguồn gốc từ Đông Á, đặc biệt là Trung Quốc và Nhật Bản, được trồng rộng rãi không chỉ làm thuốc mà còn làm cảnh ở nhiều quốc gia như Triều Tiên, Nhật Bản, Việt Nam, Lào, Thái Lan và Ấn Độ Tại Việt Nam, cúc hoa vàng phân bố chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc như Hưng Yên, Hải Dương, Bắc Ninh và Hà Nội.
1.1.4 Công dụng và liều dùng
Cúc hoa vàng là thảo dược hiệu quả trong việc chữa trị các triệu chứng như cảm lạnh, hoa mắt, sốt, chóng mặt, nhức đầu, đau mắt đỏ, chảy nước mắt nhiều, mờ mắt, huyết áp cao, đinh độc và mụn nhọt sưng đau Sử dụng lâu dài loại hoa này giúp lợi khí huyết và có tác dụng tích cực đối với nội tiết, góp phần làm trẻ lâu.
Liều dùng hàng ngày của thuốc sắc là từ 8-16 g, có thể sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với các vị thuốc khác Ngoài ra, nó còn có thể được dùng để hãm trà hoặc ngâm rượu uống Đối với việc sử dụng ngoài, thuốc có thể được dùng để rửa hoặc đắp lên các vùng bị mụn nhọt.
1.1.5 Một số bài thuốc có cúc hoa vàng
Tang cúc ẩm là bài thuốc hiệu quả trong việc chữa ho và cảm mạo Công thức bao gồm tang diệp và cúc hoa mỗi vị 6g, cùng với liên kiều, bạc hà, cam thảo, và cát cánh mỗi vị 4g, kết hợp với 600ml nước Sau khi sắc, lượng nước còn lại là 200ml, chia đều để uống 3 lần trong ngày.
Chữa cảm sốt hiệu quả với bài thuốc gồm các thành phần: cúc hoa vàng 5g, địa liền 5g, cúc tần 20g, lá tre 20g, bạc hà 20g, kinh giới 20g, tía tô 20g và cát căn 20g Thuốc có thể được bào chế dưới dạng bột hoặc viên, liều dùng 2-3 lần mỗi ngày, mỗi lần từ 4-6g.
Chữa cảm phong hàn: cúc hoa vàng 5g, địa liền 5g, bạc hà 20g, kinh giới 20g, cát căn 20g, tía tô 20g Sắc uống [1].
Các nghiên cứu về cúc hoa vàng
1.2.1 Các nghiên cứu về thành phần hóa học của cúc hoa vàng
Nghiên cứu trong và ngoài nước đã chỉ ra rằng cúc hoa vàng chứa nhiều hợp chất hóa học quan trọng, bao gồm flavonoid, terpenoid, phenolic và một số nhóm hợp chất khác Bảng 1 trình bày cấu trúc hóa học của một số hợp chất chiết xuất từ cúc hoa vàng.
Bảng 1: Một số hợp chất từ cúc hoa vàng
TT Tên hợp chất Công thức hóa học TLTK
Một số hợp chất khác
1.2.2 Các nghiên cứu về tác dụng sinh học của cúc hoa vàng a Tác dụng chống oxy hóa
Dịch chiết methanol từ cúc hoa vàng cho thấy khả năng loại bỏ các gốc DPPH với giá trị IC50 là 87,64 μg/mL Đặc biệt, Quercetin được phân lập từ cúc hoa vàng có khả năng thu dọn gốc DPPH mạnh mẽ với giá trị IC50 chỉ 3,1 μg/mL Hơn nữa, dịch chiết carbon dioxide lỏng siêu tới hạn từ cúc hoa vàng còn có khả năng tăng cường hoạt động của các enzym chống oxy hóa như Superoxide dismutase (SOD) và Glutathione peroxidase (GPX).
Dịch chiết từ cúc hoa vàng, đặc biệt là dịch chiết EtOH 70%, cho thấy hiệu quả rõ rệt trong việc ức chế các triệu chứng viêm Nghiên cứu đã chứng minh rằng nó có khả năng ức chế hoạt động của các cytokine như IL-1 và TNF-α, đồng thời làm giảm sự tích tụ của bạch cầu, từ đó hỗ trợ trong việc điều trị các tình trạng viêm.
200 mg/kg [6] c Tác dụng điều hòa miễn dịch
Phân đoạn chiết butanol từ cúc hoa vàng có khả năng tăng cường phản ứng quá mẫn tuyp 3, đồng thời nâng cao việc sản xuất kháng thể từ tế bào lách, làm tăng nồng độ IgG và IgM trong huyết thanh Đặc biệt, tác dụng này được ghi nhận rõ rệt ở liều 300 mg/kg, đồng thời cải thiện chức năng của hệ thống thực bào đơn nhân ở chuột.
Nghiên cứu gần đây cho thấy thuốc tiêm cúc hoa vàng với liều lượng 32 μL/mL có khả năng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư tuyến tiền liệt (PC3) và tế bào ung thư máu (HL60) Phần dịch chiết lỏng-lỏng CH2Cl2 từ dịch chiết EtOH 80% cũng ức chế con đường tín hiệu nội bào, làm giảm các tín hiệu tiền viêm (JAK1/2 và STAT3), từ đó thúc đẩy quá trình chết theo chu trình của tế bào và có tác dụng chống ung thư tuyến tiền liệt Ngoài ra, dịch chiết metanol cho thấy tác dụng ức chế 27% trên tế bào ung thư phổi A549 ở liều 100 μg/mL.
Dịch chiết nước từ cúc hoa vàng có khả năng ức chế nhiều loại vi khuẩn, bao gồm S aureus, E coli, S pneumoniae, P aeruginosa và S flexneri, với nồng độ ức chế tối thiểu lần lượt là 0,025%, 0,1%, 0,1%, 0,05% và 0,025% khi mật độ vi khuẩn đạt 10 tế bào/mL.
Dịch chiết nước của cúc hoa vàng có khả năng ức chế sự xâm nhập của virus hô hấp với giá trị EC50 là 60,9 ± 2,41 μg/mL Ngoài ra, các hợp chất từ dịch chiết EtOH của hoa này cũng có tác dụng ức chế bài tiết kháng nguyên HBsAg và HBeAg của virus viêm gan B, cho thấy tiềm năng bảo vệ gan.
Dịch chiết nước từ cúc hoa vàng đã được xác nhận có khả năng ức chế hoạt tính gây độc cho gan do Carbon tetrachloride, cả trong điều kiện in vitro và in vivo, với liều lượng 50 mg/kg.
[26] g Tác dụng bảo vệ thần kinh
Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng dịch chiết từ hoa cúc vàng có khả năng bảo vệ hệ thần kinh và hỗ trợ điều trị các bệnh như Alzheimer và Parkinson Các tác dụng dược lý khác của loại hoa này cũng đang được khám phá.
Cúc hoa vàng không chỉ có nhiều công dụng trong các hoạt động khác mà còn mang lại lợi ích cho hệ tim mạch Dịch chiết từ cúc hoa vàng đã được chứng minh có khả năng điều trị bệnh gút Ngoài ra, dịch chiết n-Butanol từ cúc hoa vàng cũng có tác dụng làm giảm tổn thương oxy hóa thận ở chuột Đặc biệt, phần EtOAc của dịch chiết etanol từ cúc hoa vàng có thể giúp ngăn chặn tình trạng béo phì.
Tổng quan về enzym soluble epoxide hydrolase (sEH)
Epoxide hydrolase là enzym chịu trách nhiệm thủy phân epoxide và arene oxide thành diol tương ứng bằng cách thêm nước, bao gồm năm loại chính: soluble epoxide hydrolase (sEH), microsomal epoxide hydrolase (mEH), leukotriene A4 hydrolase, hepoxilin A3 hydrolase, và cholesterol 5,6-oxide hydrolase Trong đó, sEH đóng vai trò quan trọng trong chuyển hóa axit epoxyeicosatrienoic (EETs) và leukotoxin (LTX) thành axit dihydroxyeicosatrienoic (DHET) và leukotoxin diol, giúp giảm tác dụng dược lý của các hoạt chất này EETs có nhiều tác dụng chống viêm và tim mạch, và tại mạc treo ruột và tĩnh mạch thận, chúng tạo ra tác dụng giãn mạch Cả sEH và EETs đều điều chỉnh kênh kali, có tác dụng chống apxe ở tế bào nội mô, và ức chế con đường tín hiệu của NF-κB Hơn nữa, sEHI giảm nồng độ cytokine tiền viêm và chất chuyển hóa NO trong huyết tương, đồng thời thúc đẩy sự hình thành lipoxit, cho thấy tiềm năng của sEHI trong điều trị các bệnh viêm cấp tính Do đó, sEHI được xem là phương pháp điều trị tiềm năng cho nhiều bệnh lý.
1.3.2 Một số hợp chất và vai trò của quá trình ức chế enzyme sEH Đến thời điểm hiện tại, các dẫn xuất urê là chất sEHI cho hiệu quả cao nhất vì chúng có khả năng liên kết mạnh mẽ với trung tâm hoạt động của enzym sEH Hợp
Chất N, N′-dicyclohexyl-urea (DCU) đã được chứng minh có khả năng ức chế enzyme sEH, giảm chuyển hóa 14,15-EET thành 14,15-DHET trong mô hình chuột tăng huyết áp Hợp chất AUDA, được cải tiến từ DCU, có độ tan và độ bền nhiệt tốt hơn, giúp duy trì tác dụng ức chế enzyme sEH Tuy nhiên, AUDA dễ bị oxy hóa và có tỷ lệ chuyển hóa ban đầu cao, nên không phù hợp cho điều trị Tiền chất AUDA n-butyl ester (AUDA-BE) có dược động học ổn định đã được nghiên cứu in vivo trên mô hình chuột hạ huyết áp do lipopolisaccharid (LPS) gây ra Tiêm AUDA-BE trước khi tiêm LPS cho thấy tác dụng ngăn ngừa tử vong và khôi phục 79 ± 7% huyết áp tâm thu trong vòng 24 giờ.
SEHI có khả năng hạ huyết áp và bảo vệ thận khỏi tổn thương do tăng huyết áp Nghiên cứu trên chuột cho thấy, sau khi được điều trị bằng AUDA, huyết áp của nhóm chuột được gây tăng huyết áp bằng angiotensin giảm từ 161 ± 4 mmHg xuống còn 140 ± 5 mmHg Điều này cũng đi kèm với việc giảm số lượng đại thực bào gây tổn thương thận và giảm microalbumin niệu.
Nghiên cứu được thực hiện trên ba nhóm chuột: nhóm chứng, nhóm chuột ăn chế độ giàu chất béo (HFD) và nhóm chuột HFD kết hợp với t-AUCB Sau 16 tuần, nồng độ triglycerid trong gan của nhóm chứng, nhóm 1 và nhóm 2 lần lượt là 7,7; 11; 9 mg/g gan, trong khi nồng độ cholesterol gan lần lượt là 1,85; 2,3; 2,0 mg/g gan Kết quả cho thấy sEHI có tác dụng giảm nồng độ triglycerid và cholesterol, từ đó hỗ trợ ngăn ngừa và điều trị các bệnh lý tim mạch và viêm gan.
SEHI đã được chứng minh có khả năng bảo vệ hệ thần kinh và hỗ trợ điều trị các bệnh lý thần kinh trung ương, đặc biệt là bệnh Parkinson Nghiên cứu trên chuột sử dụng AUDA trước khi tiêm 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydro pyridine (MPTP) cho thấy sự giảm 11% tế bào thần kinh dopamine.
Tỷ lệ tế bào mất đi ở nhóm không sử dụng AUDA cao hơn nhiều, lên đến 40%, so với nhóm sử dụng AUDA Bên cạnh đó, sEHI đang nổi lên như một phương pháp điều trị tiềm năng cho bệnh Alzheimer và bệnh trầm cảm.
Trong nghiên cứu mô hình gây tiểu đường trên chuột, ba nhóm chuột đã được khảo sát, bao gồm nhóm chứng, nhóm chuột tiểu đường và nhóm chuột tiểu đường được điều trị bằng t-AUCB Kết quả đo glucose trong nước tiểu của các nhóm này lần lượt là 0 mg/dL.
Nghiên cứu cho thấy nồng độ glucose máu của ba nhóm lần lượt là 300 ± 112 mg/dL, 110 ± 89 mg/dL và sau 2 tuần là 180 mg/dL, 245 mg/dL, 200 mg/dL, chứng tỏ sEHI có tác dụng giảm đáng kể nồng độ glucose trong máu và nước tiểu Trong thí nghiệm Morris Water Maze Test (MWM), thời gian chuột bơi trong góc phần tư đích là 46 ± 3 giây, 22 ± 2 giây và 40 ± 2 giây cho nhóm chứng, nhóm tiểu đường và nhóm tiểu đường được điều trị bằng chất sEHI mạnh TPPU Kết quả cho thấy sEHI không chỉ cải thiện khả năng ghi nhớ mà còn bảo vệ thần kinh khỏi biến chứng của bệnh tiểu đường.
sEHI đóng vai trò quan trọng trong nhiều bệnh lý liên quan đến viêm, các hội chứng đau, cũng như các bệnh tim mạch, xương khớp và thần kinh.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu
Cúc hoa vàng, được thu hái tại Mê Linh, Hà Nội vào năm 2014, đã được sấy khô và bảo quản trong túi hút chân không Mẫu hoa này được giáo sư Young Ho Kim xác định với tên khoa học là Chrysanthemum indicum L Hiện tại, mẫu tiêu bản (CNU-11102) đang được lưu trữ tại khoa Dược, Đại học quốc gia Chungnam, Hàn Quốc.
Hình 1: Nguyên liệu nghiên cứu cúc hoa vàng
Nguyên liệu
Hóa chất và thuốc thử đƣợc sử dụng đạt tiêu chuẩn phân tích theo DĐVN V, đƣợc trình bày cụ thể trong bảng 2
Bảng 2 Tên hóa chất và nguồn gốc
STT Tên hóa chất Nguồn gốc Tiêu chuẩn
2 CH 2 Cl 2 Trung quốc DĐVN V
- Cột sắc kí với đường kính trong 4,0; 3,0; 2,0; 1,7 cm
- Dụng cụ thủy tinh trong phòng thí nghiệm (pipet, phễu thủy tinh, cốc thủy tinh, ống đong, ống nghiệm)
- Thiết bị ngâm dƣợc liệu
- Máy cất quay chân không BUCHI Toledo AB204S (Thụy Sĩ)
- Bản mỏng TLC Silica gel 60 F254 (Merch)
- Chất hấp phụ: silica gel (0.063-0.200mm (Merck), YMC RP-18 resins (75μm, Fuji Silysia Chemical Ltd., Kasugai, Japan).
Nội dung nghiên cứu
1 Chiết xuất dịch chiết tổng và dịch chiết phân đoạn của cúc hoa vàng và đánh giá tác dụng sEHI của cắn chiết tổng và các phân đoạn chiết
2 Phân lập và xác định cấu trúc 1-2 hợp chất từ phân đoạn có tác dụng ức chế enzym sEH tốt.
Phương pháp nghiên cứu
Phương pháp ngâm phân đoạn 3 lần với dung môi EtOH 96% được sử dụng để thu được cắn chiết EtOH Sau đó, cắn chiết EtOH được phân tán vào nước và chiết phân bố lần lượt bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần như CH2Cl2 và EtOAc, tạo ra các phân đoạn chiết tương ứng Cuối cùng, các phân đoạn chiết này được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được cắn CH2Cl2, EtOAc và phân đoạn nước.
2.4.2 Phương pháp đánh giá tác dụng ức chế enzym sEH
Tại Khoa Dược, Trường Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc, các thí nghiệm đã được thực hiện để sàng lọc tác dụng ức chế enzyme sEH của chiết xuất ethanol và các phân đoạn chiết.
Hoạt tính của sEH được xác định qua phản ứng thủy phân của cyano-(6-methoxynaphthalen-2-yl)methyl] 2-(3-phenyloxiran-2-yl)acetate (PHOME) trong môi trường có sEH Sản phẩm thủy phân tạo ra một chất phát huỳnh quang cao, cho phép theo dõi nồng độ thông qua đo độ hấp thụ quang ở bước sóng 330 nm (kích thích) và 465 nm (phát xạ) Quy trình đo được thực hiện với tổng thể tích phản ứng 200 μL, bao gồm 25 mM đệm Bis-Tris (có 0,1% Albumin huyết thanh bò, pH 7,0), 1.0 μM PHOME, 3.0 nM enzyme sEH và các nồng độ khác nhau của mẫu thử hoặc chất đối chứng AUDA.
(150 nM) Phản ứng đƣợc duy trì ở 30°C trong vòng 1 giờ Độ hấp thụ đƣợc đo mỗi
3 phút bằng máy Genios microplate reader (Tecan, Mannedorf, Switzerland) Tác dụng sEHI của mỗi mẫu đƣợc xác định nhƣ sau: sEHi (%) = 100 – ( ∫
∫ × 100) Trong đó ∫SA và ∫CA là diện tích dưới đường cong lần lượt của mẫu thử và mẫu chứng
Xác định nồng độ của mẫu thử mà tại đó khả năng ức chế enzym sEH là 50%, nồng độ này là giá trị IC50
2.4.3 Phương pháp phân lập và xác định cấu trúc phân tử hợp chất hóa học
+ Sử dụng phương pháp sắc ký cột để phân lập các hợp chất sạch từ phân đoạn chiết đã lựa chọn
- Chất hấp phụ: silica gel, YMC-RP18
Dung môi rửa giải là hỗn hợp được pha chế từ các dung môi phổ biến như n-hexan, CH2Cl2, aceton, ethyl acetat, methanol và EtOH, với tỷ lệ được điều chỉnh phù hợp thông qua nghiên cứu sắc ký lớp mỏng.
Để chuẩn bị cột thủy tinh cho quá trình thí nghiệm, cần chọn cột có khóa với đường kính và chiều dài phù hợp với lượng chất cần đưa lên cột Sau đó, rửa sạch cột, tráng bằng aceton và để khô Cột cần được cố định trên giá theo phương thẳng đứng, và một lớp bông nên được cho vào đáy cột để đảm bảo hiệu quả trong quá trình lọc.
Để nhồi cột hiệu quả, trước tiên cần cân lượng chất hấp phụ phù hợp cho vào cốc có mỏ, sau đó thêm dung môi rửa giải và ngâm trong khoảng 30 phút Khuấy đều cho đến khi hết bọt, rồi cho hỗn dịch vào cột đã chuẩn bị Mở khóa cột và tiếp tục rót dung môi, gõ nhẹ quanh thành cột, đồng thời nén cột bằng áp suất để loại bỏ bọt khí, giữ cột ổn định trong khoảng 1 giờ Cuối cùng, cho dung môi chảy cho đến khi mực dung môi còn cách lớp silica gel khoảng 2-4mm, sau đó khóa cột và chuẩn bị đưa mẫu lên cột.
Mẫu cần được hòa tan hoàn toàn trong một lượng dung môi tối thiểu, sau đó trộn đều với chất hấp phụ tối thiểu Tiếp theo, bốc hơi cho đến khi thu được bột khô tơi, và cuối cùng đưa bột này lên cột.
Để thực hiện quá trình rửa giải, hãy cho hệ dung môi rửa giải phù hợp vào cột đã nạp mẫu, đồng thời thêm một lớp bông để giữ cho bề mặt không bị xáo trộn khi cho dung môi vào Trong suốt quá trình rửa giải, cần liên tục bổ sung dung môi để đảm bảo rằng mức dung môi luôn cao hơn bề mặt của chất hấp phụ.
Hứng dịch rửa giải vào các lọ có thể tích phù hợp và kiểm tra dịch thu được bằng sắc ký lớp mỏng để nhóm các lọ có thành phần tương đồng Sau đó, bay hơi dung môi thu được để cắn.
Cấu trúc các chất phân lập được xác định thông qua phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1H-NMR, 13C-NMR) và được so sánh với các dữ liệu phổ đã được công bố trước đó.
THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ
Kết quả đánh giá tác dụng ức chế enzym sEH của cắn chiết EtOH và phân đoạn chiết từ cúc hoa vàng
Bài viết đánh giá tác dụng của sEHI từ chiết xuất EtOH và phân đoạn chiết của cúc hoa vàng thông qua phương pháp phản ứng thủy phân của PHOME trong môi trường có sEH Kết quả được trình bày chi tiết trong bảng 3.
Bảng 3: Tác dụng sEHI của cắn chiết EtOH và các phân đoạn chiết từ cúc hoa vàng
Phân đoạn Tỉ lệ sEH bị ức chế (%) ở liều 50 àg/mL
Dịch chiết EtOH và các phân đoạn chiết từ cúc hoa vàng đều cho thấy khả năng ức chế enzym sEH, trong đó phân đoạn chiết EtOAc có hiệu quả mạnh nhất với khả năng ức chế lên đến 163.90% ± 21.99% ở liều 50 µg/mL và giá trị IC50 là 4.56 ± 2.16 µg/mL Phân đoạn chiết CH2Cl2 và phân đoạn nước có hiệu lực ức chế enzym sEH trung bình, với tỷ lệ ức chế lần lượt là 88.83% ± 3.63% và 87.31% ± 1.50% ở liều 50 µg/mL Trong khi đó, dịch chiết tổng EtOH cho thấy khả năng ức chế yếu nhất với giá trị IC50 cao lên đến 23.92 ± 6.89 µg/mL Dựa trên những kết quả này, phân đoạn EtOAc được lựa chọn để tiếp tục nghiên cứu về thành phần hóa học.
Phân lập các hợp chất từ phân đoạn EtOAc của cúc hoa vàng
Từ cắn chiết EtOAc (1g) được tinh chế qua cột YMC RP-18 với dung môi EtOH: nước tỉ lệ 1:2, thu được 3 phân đoạn (ET-1.1 đến ET-1.3) Phân đoạn ET-1.1 (500mg) tiếp tục tinh chế qua cột silica gel bằng dung môi CH2Cl2: EtOAc tỉ lệ 1,5:1, cho ra 3 phân đoạn (ET-1.1.1 đến ET-1.1.3), trong đó phân đoạn ET-1.1.2 (100mg) được tách riêng.
18 tiếp tục đƣợc tinh chế qua cột silica gel, dung môi rửa giải là CH2Cl2: EtOAc tỉ lệ 1,5: 1 thu đƣợc hợp chất CI-2 (11 mg)
Phân đoạn ET-1.2 (200mg) đã được tinh chế qua cột YMC-RP18 với dung môi rửa giải là EtOH: nước tỉ lệ 1:2, tạo ra 3 phân đoạn từ ET-1.2.1 đến ET-1.2.3 Tiếp theo, phân đoạn ET-1.2.3 (90mg) được tinh chế qua cột silica gel bằng dung môi n-hexan: EtOAc tỉ lệ 1:1, thu được 3 phân đoạn từ ET-1.2.3.1 đến ET-1.2.3.3 Cuối cùng, phân đoạn ET-1.2.3.1 (40mg) được tinh chế thêm qua cột silica gel với dung môi n-hexan: EtOAc tỉ lệ 1:2, cho ra sản phẩm CI-1 (27mg).
Quy trình phân lập các hợp chất từ các phân đoạn có hoạt tính tốt đƣợc mô tả trong sơ đồ 2
Sơ đồ 2 Quy trình phân lập các hợp chất từ phân đoạn EtOAc
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập đƣợc từ cúc hoa vàng
Hợp chất CI-1 đã được phân lập dưới dạng chất kết tinh màu vàng nhạt
Trong phổ 1 H-NMR của hợp chất CI-1, tín hiệu singlet của proton olefinic xuất hiện tại δ H 6.83 (s, H-3) Hai tín hiệu doublet của proton thơm ở vòng A được ghi nhận tại δ H 6.25 (d, J = 1.8Hz, H-6) và 6.54 (d, J = 1.8Hz, H-8), cho thấy hai proton này ở vị trí meta Ngoài ra, hai tín hiệu kép của 4 proton thơm ở vòng B tại δ H 6.98 (dd, J = 6.6; 1.8 Hz, H-5’) và 7.97 (dd, J = 6.6; 1.8 Hz, H-6’) xác nhận sự hiện diện của hệ tương tác spin A2B2 của vòng thơm.
Hình 2: Phổ 1 H-NMR của hợp chất CI-1
Trên phổ 13 C-NMR cho thấy sự có mặt của 15 carbon trong cấu trúc của CI-1 bao gồm: một nhóm C=O tại δ C 181.75 (C-4); ba nhóm cacbon methin tại δ C
102.83 (C-3), 98.84 (C-6), 93.97 (C-8); bảy carbon bậc bốn tại δ C 161.17 (C-5), 164.14 (C-7), 157.31 (C-9), 163.76 (C-2), 161.44 (C-4’), 103.69 (C-10) và 121.17 (C-1’); hai tín hiệu kép ở δ C 128.47 (C-2’ và C-6’) và 115.97 (C-3’ và C-5’) của vòng B Các dữ liệu phổ cho thấy CI-1 là một flavonoid (Xem bảng 4 và hình 3)
Bảng 4: Số liệu phổ 1 H-NMR (DMSO- d 6 , 600 MHz) và 13 C-NMR (DMSO- d 6 , 150 MHz) của hợp chất CI-1.
Vị trí δ H (độ bội, J = Hz) δ C δ C *
Dựa trên dữ liệu phổ NMR và đối chiếu với tài liệu tham khảo [29], chúng tôi xác định cấu trúc hóa học của hợp chất CI-1 là Apigenin (hình 4).
Hợp chất CI-2 thu được dưới dạng chất kết tinh màu vàng
Hình 4: Công thức cấu tạo của hợp chất CI-1
Hình 3: Phổ 13 C-NMR của hợp chất CI-1
Phổ 1 H-NMR của hợp chất CI-2 cho thấy độ chuyển dịch hóa học của proton olefinic tại δ H 6,66 (s, H-3) và hai tín hiệu proton thơm của vòng A tại δ H 6,18 (d, J = 1,8Hz, H-6) và 6,44 (d, J = 1,8Hz, H-8), cho thấy chúng ở vị trí meta Proton hydroxyl tại C-5 có độ chuyển dịch hóa học là δ H 12,97 Ngoài ra, vòng B cũng ghi nhận tín hiệu của ba proton với kiểu tương tác spin ABX tại 113,3 (H-2’), 119,0 (H-6’) và 116,0 (H-5’).
Phổ 13 C-NMR của CI-2 đã xác nhận sự xuất hiện của 15 carbon bao gồm: 1 nhóm C=O tại δ C 181.6 (C-4), sáu methin carbon tại δ C 102,83 (C-3), 98.9 (C-6) và 93.9 (C-8), 113.3 (C-2’), 113.3 (C-5’), 113.3 (C-6’), 6 tín hiệu của cacbon liên kết với nhóm oxy tại δ C 162,5 (C-5), 164,3 (C-7), 157,3 (C-9), 163,9 (C-2), 149,8 (C-
Hình 5: Phổ 1 H-NMR của hợp chất CI-2
4’) và 145,8 (C-3’) Và 2 carbon bậc 4 khác tại δ C 103.7 (C-10), 121.5 (C-1’) (xem bảng 5 và hình 6)
Dữ liệu phổ NMR cho thấy hợp chất CI-2 có khả năng là một flavonoid, và so sánh với tài liệu tham khảo [6] cho thấy cấu trúc hóa học của hợp chất này được xác định là luteolin (hình 7).
Hình 6: Phổ 13 C-NMR của hợp chất CI-2
Hình 7: Cấu trúc hợp chất CI-2
Bảng 5: Số liệu phổ 1 H-NMR (DMSO- d 6 , 600 Hz) và 13 C-NMR (DMSO- d 6 ,
150 Hz) của hợp chất CI-2.
Vị trí δ H (độ bội, J = Hz) δ C δ C *
5-OH 12.97 (s) δ C * tham khảo tài liệu [6]
Từ phân đoạn chiết EtOAc, hai hợp chất apigenin (CI-1) và luteolin (CI-2) đã được phân lập và xác định cấu trúc thông qua dữ liệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR.
BÀN LUẬN
Về tác dụng ức chế enzym sEH của dịch chiết và phân đoạn chiết từ cúc hoa vàng
Kết quả đánh giá tác dụng sEHI của dịch chiết tổng và dịch chiết phân đoạn từ cúc hoa vàng cho thấy dịch chiết EtOH tổng có tác dụng thấp nhất, trong khi phân đoạn EtOAc cho tác dụng tốt nhất Nguyên nhân là do dịch chiết EtOH tổng chứa nhiều nhóm hợp chất, dẫn đến hàm lượng hoạt chất có tác dụng sEHI thấp Qua quá trình trích ly lỏng – lỏng bằng dung môi có độ phân cực tăng dần, các hợp chất được phân bố vào các phân đoạn tương ứng, làm gia tăng hàm lượng hoạt chất trong từng phân đoạn và nâng cao tác dụng sEHI.
CH 2 Cl 2 của cúc hoa vàng chứa chủ yếu là các thành phần ít phân cực bao gồm: steroid, terpenoid, acid béo đã thể hiện tác dụng ức chế enzyme sEH trung bình với giỏ trị IC50 là 21.07 ± 3.40 àg/mL Trong khi đú, cỏc nghiờn cứu về thành phần húa học của cúc hoa vàng đã cho thấy, hai phân đoạn EtOAc và nước chứa các thành phần phân cực là các hợp chất flavonoid, các phenolic và các glycoside nên tác dụng ức chế enzyme sEH cao với giá trị IC 50 lần lƣợt là 4.56 ± 2.16 và 11.23 ± 1.17 àg/mL Tuy nhiờn trong phõn đoạn EtOAc chủ yếu là cỏc flavonoid dạng aglycon, chứa nhiều nhóm hydroxyl trong cấu trúc hóa học nên tác dụng sEHI tốt hơn so với phân đoạn nước chứa chủ yếu là các flavonoid glycoside và các phenolic glycoside khác Kết quả này cho thấy các hợp chất phân cực có tác dụng sEHI tốt hơn các hợp chất kém phân cực Nhận định này cũng tương ứng với nhiều nghiên cứu trên thế giới khi cho thấy các hợp chất có tác dụng ức chế enzyme sEH chủ yếu là các hợp chất thuộc nhóm flavonoid [34] Đã có rất nhiều nghiên cứu về tác dụng kháng viêm, chống oxi hóa, chống ung thƣ, bảo vệ gan… của cúc hoa vàng [27], [6], [24], [35] Tuy nhiên, cho tới thời điểm hiện tại, chƣa có bất kì một nghiên cứu nào về tác dụng trên enzym sEH của
Nghiên cứu về cúc hoa vàng cho thấy dƣợc liệu này có vai trò quan trọng trong việc ức chế enzyme sEH, liên quan đến nhiều bệnh lý như viêm, tim mạch, tiểu đường và các bệnh thần kinh Kết quả nghiên cứu giúp làm sáng tỏ cơ chế tác dụng của cúc hoa vàng, đồng thời lý giải việc sử dụng dƣợc liệu này trong y học dân gian.
Về thành phần hóa học
Nghiên cứu này đã sử dụng phương pháp sắc ký cột với chất nhồi silicagel pha thuận, pha đảo YMC RP-18 và sephadex LH-20, kết hợp với sắc ký lớp mỏng để phân lập hai hợp chất CI-1 và CI-2.
Hợp chất CI-1 đã được xác định là Apigenin, một flavonoid thuộc nhóm flavon, được phân lập từ cúc hoa vàng Luteolin cũng có mặt trong nhiều sản phẩm thực vật như quả tía tô xanh và lá cây mã rạng Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra các tác dụng dược lý của Apigenin, bao gồm khả năng ngăn ngừa tổn thương thận do cyclosporin ở chuột, mối liên hệ giữa chế độ ăn giàu Apigenin và giảm nguy cơ mắc các bệnh ung thư như ung thư vú, đường tiêu hóa, da, tuyến tiền liệt và một số bệnh ác tính về huyết học Apigenin còn có tác dụng chống oxy hóa, giúp dọn gốc tự do và kích thích vận chuyển mono amin, cải thiện một số rối loạn tâm thần kinh Đặc biệt, Apigenin đã được chứng minh có tác dụng ức chế enzym sEH với khả năng ức chế 92,4% ở liều 100 µM và giá trị IC50 là 7,2 µM.
Hợp chất CI-2 đã đƣợc xác định cấu trúc là Luteolin (3,4,5,7-tetrahydroxy flavone), là một thành phần flavonoid chính có trong cúc hoa vàng Bên cạnh đó,
Luteolin là một hợp chất có trong nhiều loại thực vật như bông cải xanh, hạt tiêu, cỏ xạ hương và cần tây, nổi bật với khả năng chống ung thư hiệu quả đối với các loại khối u ác tính như ung thư phổi, vú, tuyến tiền liệt, ruột kết và tuyến tụy Ngoài tác dụng chống ung thư, luteolin còn có hoạt tính chống viêm mạnh mẽ, giúp điều trị các bệnh liên quan đến viêm Nhiều nghiên cứu đã chứng minh luteolin có tác dụng bảo vệ thần kinh trong các mô hình in vitro và in vivo Hơn nữa, luteolin còn tăng cường hệ miễn dịch bằng cách kích thích sản xuất kháng thể từ tế bào lách, làm tăng nồng độ IgG và IgM trong huyết thanh, từ đó nâng cao sức đề kháng của cơ thể Tác dụng sEHI của luteolin cũng được ghi nhận với cơ chế ức chế cạnh tranh, có giá trị IC50 là 14.4±1.5 µg/mL.
Từ phân đoạn EtOAc của cúc hoa vàng, hai hợp chất apigenin và luteolin đã được phân lập và xác định cấu trúc, cho thấy tác dụng ức chế enzyme sEH tốt Hai hợp chất này là thành phần hóa học chính trong phân đoạn chiết, do đó, khả năng ức chế enzyme sEH của chúng cũng ảnh hưởng đến hiệu quả chung của toàn bộ phân đoạn chiết, góp phần giải thích kết quả ức chế enzyme sEH hiệu quả từ cúc hoa vàng.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Sau thời gian tiến hành nghiên cứu, khóa luận đã thu đƣợc các kết quả sau:
1 Đã chiết xuất đƣợc dịch chiết EtOH toàn phần và các dịch chiết phân đoạn CH 2 Cl2, EtOAc và nước từ cúc hoa vàng, xác định được tác dụng sEHI của phõn đoạn chiết EtOAc là mạnh nhất với giỏ trị IC 50 là 4,56 ± 2,16 àg/ml, dịch chiết EtOH tổng và các phân đoạn CH2Cl2, nước cũng thể hiện tác dụng ức chế trung bỡnh với giỏ trị IC 50 lần lƣợt là 21,07 ± 3.40 àg/ml và 11,23 ± 1.17 àg/ml
2 Từ phân đoạn EtOAc đã phân lập đƣợc hai hợp chất CI-1 và CI-2 Sử dụng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR và 13 C-NMR và so sánh với dữ liệu phổ đã công bố, đã xác định đƣợc cấu trúc của hai hợp chất cụ thể là: hợp chất CI-1 có cấu trúc hóa học là Apigenin và hợp chất CI-2 có cấu trúc hóa học là Luteolin
Do thời gian hạn chế trong việc thực hiện đề tài, kết quả nghiên cứu chỉ đóng góp một phần nhỏ vào công trình nghiên cứu về cúc hoa vàng Vì vậy, đề tài kiến nghị cần tiếp tục nghiên cứu thêm về một số vấn đề liên quan để làm phong phú thêm hiểu biết về loài hoa này.
1 Tiếp tục phân lập các hợp chất mới từ các phân đoạn chiết có tác dụng tốt của cúc hoa vàng
2 Đánh giá tác dụng ức chế enzyme sEH của các hợp chất phân lập đƣợc từ cúc hoa vàng
Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, và Trần Toàn (2004) đã nghiên cứu về cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, cung cấp thông tin quý giá cho việc bảo tồn và phát triển nguồn dược liệu tự nhiên.
Việt Nam, Nhà xuất bản khoa học và kĩ thuật, Hà Nội, 576-580
[2] Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản y học,
[3] Amrani, A., O Benaissa, N Boubekri, K Biod, R Djabari, N Beroal, D Zama, F Benayache and S Benayache (2016), “Impact of Chrysanthemum fontanesii extract on sodium valproate mediated oxidative damage in mice kidney”,
[4] Bai, L., X Li, L He, Y Zheng, H Lu, J Li, L Zhong, R Tong, Z Jiang and J Shi (2019), “Antidiabetic potential of flavonoids from traditional Chinese medicine: A review”, Am J Chin Med 47(5), 933–957
[5] Chen, L.; Fan, C.; Zhang, Y.; Bakri, M.; Dong, H.; Morisseau, C.; Maddipati,
K R.; Luo, P.; Wang, C Y.; Hammock, B D.; Wang, M H (2013), “Beneficial effects of inhibition of soluble epoxide hydrolase on glucose homeostasis and islet damage in a streptozotocin-induced diabetic mouse model”, Prostaglandins Other Lipid Mediators 104, 42−48
In 2019, a study conducted by Doan Tran Duy Cuong and colleagues focused on the isolation and characterization of six flavonoids derived from the leaves of Sterculia foetida Linn This research highlights the potential of Sterculia foetida as a source of bioactive compounds, contributing to the understanding of its phytochemical properties.
“Major flavonoids with antioxidant activity from Teucrium polium L.”, Food chemistry, 112(40), 885-888
[8] Gang Zhao, Guo-Wei Qin, Jie Wang, Wen-Jing Chu (2016), “Functional activation of monoamine transporters by luteolin and apigenin isolated from the fruit of Perilla frutescens (L.) Britt”, Neurochemistry International, 56(1), 168-176
[9] Gu, Q., Y.Y Chen, H Cui, D Huang, J.W Zhou, T.Z Wu, Y.P Chen, L.N Shi and J Xu (2013), “Chrysanolide A, an unprecedented sesquiterpenoid trimer from the flowers of Chrysanthemum indicum L”, RSC Adv 3, 10168–10172
[10] Imig, J D.; Zhao, X.; Zaharis, C Z.; Olearczyk, J J.; Pollock, D M.; Newman, J W.; Kim, I H.; Watanabe, T.; Hammock, B D (2005), “An orally active epoxide hydrolase inhibitor lowers blood pressure and provides renal protection in salt-sensitive hypertension”, Hypertension 46, 975−981
[11] I Ahmad, S Girgis, M M Hassanane (2017), “Impact of Chrysanthemum indicum on genotoxicity and hepatic and kidney function in anticancer drug adriamycin ex-posed mice”, Int J Biol Macromol 102, 813-821
[12] In, S.R., B.D Zhu and X.H Qin (2005), “Effects of Chrysanthemum indicum injection on proliferation of human tumor cells SMMC7721, PC3 and HL60”,
Pharm Clin Chinese Mater Med 21, 39–40
[13] Kato, T., K Noguchi, Y Miyamoto, M Suekawa, M Aburada, E Hosoya and
M Sakanashi (1987), “Effects of Chrysanthemum indicum Linn on coronary, vertebral, renal and aortic blood flows of the anesthetized”, Archives Internationales de Pharmacodynamie et de Therapie 285(2), 288–300
A study by Kim et al (2013) demonstrated that Chrysanthemum indicum L extract effectively induces apoptosis in human prostate cancer DU145 cells by inhibiting the constitutive activation of STAT3 This research highlights the potential of Chrysanthemum indicum L as a therapeutic agent in cancer treatment, specifically targeting prostate cancer cell lines.
[15] Lee, H T.; Lee, K I.; Chen, C H.; Lee, T S (2019), “Genetic deletion of soluble epoxide hydrolase delays the progression of Alzheimer’s disease”, J Neuroinflammation 16, 267
[16] Lee, Y.S., E.J Son, S.H Kim, Y.M Lee, O.S Kim and D.S Kim (2017),
“Synergistic uric acid-lowering effects of the combination of Chrysanthemum indicum Linne flower and Cinnamomum cassia (L.) J persl bark extracts”, Evid Based Complement Altern 2017, 9764843
[17] Li, Z.F., Z.D Wang, Y.Y Ji, S Zhang, C Huang, J Li and X.M Xia (2009),
“Induction of apoptosis and cell cycle arrest in human HCC MHCC97H cells with Chrysanthemum indicum extract”, World J Gastroenterol 15, 4538–4546
[18] Liu, Y.; Dang, H.; Li, D.; Pang, W.; Hammock, B D.; Zhu, Y (2012),
“Inhibition of soluble epoxide hydrolase attenuates high-fat-diet induced hepatic steatosis by reduced systemic inflammatory status in mice”, PLoS One 7, 39165
[19] Lou, H., P Fan, R.G Perez and H Lou (2011), “Neuroprotective effects of linarin through activation of the PI3K/Akt pathway in amyloid-β-induced neuronal cell death”, Bio Med Chem 19, 4021–4027
[20] Luo, P., Y Cheng, Z Yin, C Li, J Xu and Q Gu (2019), “Monomeric and dimeric cytotoxic guaianolide type sesquiterpenoids from the aerial parts of Chrysanthemum indicum”, J Nat Prod 82, 349–357
[21] Madhuri Venigalla , Erika Gyengesi , Gerald Münch (2015), “Curcumin and Apigenin - novel and promising therapeutics against chronic neuroinflammation in Alzheimer's disease”, Neural Regen Research 10(8), 1181
[22] MuhammadImran , AbdurRauf TareqAbu-Izneid , MuhammadNadeem Mohammad , AliShariati Imtiaz , AliKhan , AliImran Ilkay , ErdoganOrhan MuhammadRizwan , MuhammadAtif, Tanweer AslamGondal, Mohammad S.Mubarak (2019), “Luteolin, a flavonoid, as an anticancer agent: A review”,
A study published in The American Journal of Chinese Medicine by Nepali et al (2018) investigates the effects of Chrysanthemum indicum on adipogenesis in obese mice induced by a high-fat diet The findings reveal that Chrysanthemum indicum not only inhibits fat cell formation but also activates the AMPK pathway, suggesting its potential as a therapeutic agent for obesity management.
[24] Nikolova, M and A Dzhurmanski (2009), “Evaluation of free radical scavenging capacity of extracts from cultivated plants”, Biotechnol Biotec Eq Volume 23, 109–111
[25] Ren, A.N., Z.G Wang, Z.C Lu, L.W Wang and Y.L Wu (1999), “Study on bacteriostasis and antivirotic activity of flosChrysanthemum indici”, Pharm Biotechno 6, 241–244
[26] Sang, J.C., M.K Sang, T.J Yong and H.S Chi (2013), “Hepatoprotective effect of water extract from Chrysanthemum indicum L flower”, Chin Med 8, 1–
[27] Schmelzer, K R.; Kubala, L.; Newman, J W.; Kim, I H.; Eiserich, J P.; Hammock, B D (2005), “Soluble epoxide hydrolase is a therapeutic target for acute inflammation”, Proc Natl Acad Sci U S A 102, 9772−9777
Luteolin has emerged as a significant anti-inflammatory and neuroprotective agent, as highlighted in a review by Nabavi et al (2017) published in Brain Research Bulletin This study discusses the potential therapeutic benefits of luteolin in mitigating inflammation and protecting neuronal health, emphasizing its relevance in neurological research and treatment strategies The findings suggest that luteolin could play a crucial role in developing interventions for various neurodegenerative conditions.
[29] Sofa Fajriah, Megawati, Akhmad Darmawan (2016), “Apigenin, an Anticancer Isolated from Macaranga gigantifolia Leaves”, J Trop Life Science; VOL 6, NO
[30] Srikumar Chakravarthi1), Chong Fu Wen1) and Nagaraja Haleagrahara2)
(2009), “Apoptosis and expression of bcl-2 in cyclosporine induced renal damage
37 and its reversal by beneficial effects of 4', 5', 7'- trihydroxyflavone”, Journal of Analytical Bio-Science, 32 (4)
[31] Sung-Eun, KimSoojin, JunMinji Song, Joo-Hwan, Kim, Yoon-JaeSong
(2012), “The extract of Chrysanthemum indicum Linne inhibits EBV LMP1 induced NF-κB activation and the viability of EBV-transformed lymphoblastoid cell lines”, Food and Chemical Toxicology Volume 50, Pages 1524-1528
[32] Wenming Cheng JunLi TianpaYou ChengmuHu (2005), “Anti-inflammatory and immunomodulatory activities of the extracts from the inflorescence of Chrysanthemum indicum Linné”, Journal of Ethnopharmacology 101(1-3), 334-
A study by Wu et al (2014) investigated the protective effects of supercritical carbon dioxide fluid extract from Chrysanthemum indicum against acute lung injury induced by lipopolysaccharide in mice The research highlighted the extract's ability to modulate the Toll-like receptor 4 signaling pathway, suggesting its potential therapeutic benefits in inflammatory lung conditions.
A study by Yi Wang et al (2019) published in the Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry investigates the inhibitory effects of phenolic compounds derived from the aerial parts of Tetrastigma hemsleyanum The research focuses on the potential of these constituents to inhibit soluble epoxide hydrolase and nitric oxide synthase, highlighting their significance in medicinal chemistry The findings, detailed in volume 34, issue 1, pages 753-760, contribute to the understanding of natural compounds in therapeutic applications.
[35] Yan, Y.C., X.E Lou and H.D Jiang (1999), “Experimental studies on the anti oxidation effects of water extract from Chrysanthemum indicum”, L Chinese J Mod Appl Pharm, 16–18
[36] Yang Hoon Kim and Chang Hyun Jin (2020), “Inhibitory Activity of Flavonoids, Chrysoeriol and Luteolin-7-O-Glucopyranoside, on Soluble Epoxide Hydrolase from Capsicum chinense”, Biomolecules 10(2), 180
[37] Ying He and Mr Carlos I Medeiros (2011), “An assessment of the interaction for three Chrysanthemum indicum flavonoids and α-amylase by surface plasmon resonance”, Food science and nutrition PMC6977516
[38] Zhang, L N.; Vincelette, J.; Cheng, Y.; Mehra, U.; Chen, D.; Anandan, S K.; Gless, R.; Webb, H K.; Wang, Y X (2009), “Inhibition of soluble epoxide hydrolase attenuated atherosclerosis, abdominal aortic aneurysm formation, and dyslipidemia”, Arterioscler., Thromb., Vasc Biol 29, 1265−1270
[39] Zhang, Z.Y., X.P Fang, Z.H Diao, R.H Zeng and X.G Mei.(2006), “Anti- respiratory syncytial virus effect of the extraction of Chrysanthemum indicum in vitro”, Pharm J Chinese People’s Liberat.Army 22, 37–40
Trong bài viết này, chúng tôi trình bày các phụ lục liên quan đến quang phổ NMR của các hợp chất CI-1 và CI-2 Phụ lục 1 và 2 cung cấp thông tin về phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất CI-1 Tương tự, phụ lục 3 và 4 giới thiệu phổ 1H-NMR và 13C-NMR của hợp chất CI-2 Những dữ liệu này là cần thiết để hiểu rõ hơn về cấu trúc và tính chất của các hợp chất này.
Phụ lục 1 Phổ 1 H-NMR của hợp chất CI-1
Phụ lục 2 Phổ 13 C-NMR của hợp chất CI-1
Phụ lục 3 Phổ 1 H-NMR của hợp chất CI-2
Phụ lục 4 Phổ 13 C-NMR của hợp chất CI-2
