Tối ưu điều kiện sinh tổng hợp nattokinase theo phương pháp lên men chìm ở quy mô phòng thí nghiệm

TỔ NG QUAN

Enzym nattokinase

Natto đã thu hút sự chú ý khi tiến sĩ Sumi Hiroyuki công bố những phát hiện bất ngờ về khả năng làm tan huyết khối trong động mạch Vào năm 1980, trong một bữa ăn tại trường đại học Y khoa Chicago, ông đã thử nghiệm với natto bằng cách đặt nó vào khay thủy tinh chứa cục máu đông Sau 18 giờ, cục máu đông đã tan rã dễ dàng, cho thấy natto có thể chứa một hoặc nhiều hoạt chất enzym fibrinolytic, có khả năng phân hủy huyết khối thông qua quá trình thủy phân sợi fibrin.

Năm 1986, Sumi Hiroyuki đã công bố nghiên cứu cho thấy nattokinase (NK) là enzym có khả năng phân hủy huyết khối hiệu quả nhất, mạnh gấp 4 lần plasmin, enzym nội sinh làm tan máu đông NK hoàn toàn an toàn khi hấp thụ qua đường tiêu hóa.

Nattokinase (E.C.3.4.21.62) thuộc vào họ protease serine subtilisin với 275 axit amin và có khối lượng phân tử 27,27 kDa [26], enzym này bền trong dải pH từ 4 đến

11, tối ưu ở pH = 8, hoạt động tốt trong dải nhiệt độ từ 30 0 C đến 50 0 C, tối ưu ở 40 0 C

Hình 1.2 Cấu trúc của enzym nattokinase [26]

Fibrin là một protein dạng sợi có vai trò quan trọng trong quá trình cầm máu, được hình thành từ fibrinogen nhờ hoạt động của thrombin Khi fibrin được tạo ra, nó liên kết với nhân tố VIII để hình thành cục máu, hỗ trợ trong việc ngăn chặn chảy máu Bên cạnh đó, fibrin còn tham gia vào nhiều quá trình sinh học khác trong cơ thể như truyền tín hiệu, đông tụ máu trong mạch và polyme hóa protein.

Fibrinogen là glycoprotein 340-HD được tổng hợp tại gan, có nồng độ khoảng 1,5 ÷ 4,0 g/l trong huyết tương Những người mắc bệnh suy gan hoặc các rối loạn di truyền liên quan đến nhiễm sắc thể số 4 có thể gặp phải tình trạng giảm nồng độ và chất lượng fibrinogen, dẫn đến các bệnh lý nghiêm trọng về máu Fibrinogen đóng vai trò quan trọng trong việc kết nối các sợi tơ huyết, kết hợp với protein bề mặt GbIIb/IIa để hình thành fibrin, từ đó giúp cầm máu hiệu quả.

Fibrinogen có cấu trúc đối xứng với 6 cặp chuỗi polypeptit, bao gồm chuỗi alpha, beta và gamma Trên các chuỗi alpha và beta có chứa fibrinopeptid, là các trình tự peptid ngắn, đóng vai trò ngăn cản fibrinogen polyme hóa một cách tự do.

Thrombin cắt các fibrinogen của chuỗi alpha và để lộ ra một mặt của vùng

Phạm Thị Quỳnh 5, vùng E của domain có khả năng kết hợp với đầu cacbon cuối của chuỗi gamma Quá trình cắt chuỗi beta diễn ra từ từ, tạo ra các sợi fibrinogen, đánh dấu bước chuyển hóa fibrinogen thành fibrin.

1.1.2.3 Quá trình đông máu và hòa tan cục máu

Quá trình đông máu và hòa tan cục máu đông diễn ra song song trong cơ thể, giúp ngăn chặn các sự cố tim mạch Khi cục máu đông hình thành, các bước tiếp theo sẽ được kích hoạt để ngăn chặn sự phát triển của chúng, bảo vệ cơ thể khỏi các cuộc tấn công tim Tuy nhiên, nếu hai quá trình này bị rối loạn, sẽ dẫn đến những vấn đề nghiêm trọng khác Chẳng hạn, cục máu đông không được làm tan sẽ bám vào thành mạch, gây tắc nghẽn và tiềm ẩn nguy hiểm nếu không có sự can thiệp y tế kịp thời.

Khi cơ thể con người bị tổn thương hoặc trải qua những biến đổi, sẽ xảy ra sự hình thành các tiền thrombin phức tạp, dẫn đến việc sản sinh thrombin Thrombin sau đó tương tác với fibrinogen để tạo thành fibrin.

Trong quá trình đông máu, ion Ca2+ đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành tiền thrombin và thrombin Thiếu hụt Ca2+ trong cơ thể có thể gây ra rối loạn cân bằng, dẫn đến nguy cơ cao mắc các bệnh liên quan đến máu và tim mạch.

 Quá trình hòa tan máu đông

Trong huyết tương có một euglobulin gọi là plasminogen, khi được kích hoạt sẽ chuyển thành plasmin Plasmin là enzym phân hủy protein, có khả năng làm tan các sợi fibrin và các chất khác trong máu như fibrinogen và prothrombin Khi plasmin hình thành trong cục máu đông, nó giúp làm tan cục máu đông và giảm khả năng đông máu.

Quá trình này giúp loại bỏ các cục máu đông hình thành trong mô, nhưng cũng có thể làm cho các vết thương ở mạch máu đã được bịt bằng máu đông lại mở ra.

Trong cơ thể người, có hơn 20 loại enzym tham gia vào quá trình đông máu, nhưng chỉ có plasmin là enzym duy nhất có khả năng phá vỡ các cục máu đông Bên cạnh đó, sự hiện diện của vi khuẩn, virus, nấm mốc và độc tố trong máu cũng tạo ra những liên kết phức tạp, ảnh hưởng đến sức khỏe.

Phạm Thị Quỳnh 6 cho biết rằng sự chồng chéo fibrin gây quá tải cho hệ thống plasmin, dẫn đến việc các sợi fibrin này lưu thông trong máu và dính vào thành mạch, tạo ra cục máu đông Điều này làm giảm lưu thông máu và tăng độ nhớt, gây huyết áp cao Cục máu đông trong tim cản trở việc cung cấp máu và oxy tới mô cơ tim, dẫn đến thiếu máu cục bộ, có thể gây ra cơn đau thắt tim hoặc nhồi máu cơ tim Nếu tình trạng này kéo dài, có thể dẫn đến tử vong.

Quá trình chuyển đổi fibrin trong cơ thể người thành các sản phẩm phân hủy fibrin phụ thuộc chủ yếu vào khả năng sản xuất các chất kích thích như t-PA và u-PA.

PA trong gan là yếu tố chính kích thích sự tạo ra enzym plasmin, tuy nhiên, sự hiện diện của plasmin không đảm bảo hiệu quả phân giải fibrin và cục máu đông do có nhiều chất ức chế xung quanh Đặc biệt, ở người cao tuổi, sự giảm đi của các chất kích thích sản xuất plasmin và sự gia tăng của các chất ức chế là nguyên nhân chính dẫn đến tình trạng bệnh tim mạch thường gặp ở nhóm tuổi này.

1.1.2.4 Cơ chế tác dụng của nattokinase

Nattokinase có tác dụng làm tan fibrin theo 3 con đường:

 Theo con đường 1, NK trực tiếp thủy phân fibrin tạo ra các sản phẩm thủy phân có thể hòa tan trong máu

 Ở con đường 2, nó kích thích quá trình tạo enzym urokinase từ tiền tố pro- urokinase, từđó hình thành các phân tử plasminogen và hình thành nên plasmin

 Đối với con đường 3, NK có tác dụng kích thích các tiền tố t - PA là tác nhân hoạt hóa plasmin

Hình 1.3 Cơ chế tác dụng của nattokinase [25 ]

Vi sinh v ậ t t ổ ng h ợ p nattokinase

Vi sinh vật là những tác nhân quan trọng trong việc hình thành các enzym làm tan cục máu đông Streptokinase từ Streptocuoccus hemolyticus và staphylokinase từ

Streptococcus aureus đã được phát hiện có hiệu quả trong điều trị các bệnh huyết khối Nhiều enzym thủy phân fibrin từ các vi sinh vật khác, như nattokinase từ Bacillus natto và subtilisin DJ-4 từ Bacillus amyloliquefaciens, đã được phát hiện và cho thấy hiệu quả cao hơn trong điều trị.

Bacillus là một loại vi khuẩn gram dương, thường được tìm thấy trong các thực phẩm lên men từ đậu tương, có khả năng sinh NK Chúng có hình dạng que, kích thước từ 0,7 đến 0,8 µm chiều rộng và 2 đến 3 µm chiều dài, thường xuất hiện đơn lẻ hoặc ít khi xếp thành chuỗi Bacillus phát triển tốt trong môi trường có độ pH biến động cao và có thể sinh trưởng trong cả điều kiện hiếu khí lẫn kị khí không bắt buộc Chúng có khả năng tạo bào tử oval khi gặp điều kiện khắc nghiệt như thiếu dinh dưỡng hoặc nhiệt độ cao, với bào tử thường phình ra ở một đầu Quần thể của giống vi khuẩn này thường rất lớn và có hình dạng không xác định, đang trên đà phát triển mạnh mẽ.

M ộ t s ố y ế u t ố ảnh hưởng đế n quá trình lên men chìm sinh t ổ ng h ợ p nattokinase

1.3.1 Ảnh hưởng của nguồn cacbon

Trong nghiên cứu của Liu và cộng sự (2005), điều kiện dinh dưỡng được tối ưu hóa để sinh tổng hợp NK bởi Bacillus natto NLSSE đã sử dụng 5 nguồn cacbon: glucose, saccarose, maltose, xylose và glycerol với hàm lượng 20 g/l Kết quả của nghiên cứu được thể hiện trong hình 1.4.

Hình 1.4 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp nattokinase [22]

B subtilis NLSSE cho thấy khả năng sinh tổng hợp NK cao khi được nuôi trong môi trường có nguồn cacbon từ maltose, saccarose và glucose Ngược lại, xylose và glycerol không phù hợp và gần như không có hoạt tính.

Một nghiên cứu của tác giả Wang và cộng sự (2009) đã tiến hành tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy nhằm tăng hoạt lực NK sinh tổng hợp từ Bacillus natto Nghiên cứu sử dụng 6 nguồn cacbon khác nhau, bao gồm crystal sugar, maltose, saccarose, glycerol, bột đậu tương và glucose, với hàm lượng 20g/l Kết quả của nghiên cứu được trình bày trong hình 1.5 [36].

Hình 1.5 Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến khả năng tổng hợp nattokinase [36]

Maltose được xác định là nguồn carbon tối ưu nhất cho Bacillus natto trong quá trình tổng hợp NK, tiếp theo là glucose, glycerol, saccarose, đường tinh thể và bột đậu tương.

Nghiên cứu cho thấy maltose là nguồn cacbon tối ưu cho vi khuẩn Bacillus, tiếp theo là glucose Do đó, trong các thí nghiệm tại phòng thí nghiệm, glucose đã được chọn làm nguồn cacbon bổ sung để tiến hành nghiên cứu.

1.3.2 Ảnh hưởng của nguồn nitơ

Nghiên cứu của Liu và cộng sự (2005) đã khảo sát ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp NK của B natto NLSSE trong môi trường chứa glucose 10 g/l.

K2HPO4.3H2O 1,0 g/l và MgSO4.7H2O 0,5 g/l, với nguồn nitơ dùng để khảo sát là: (NH4)2SO4 3,5 g/l, NaNO3 10 g/l, sodium glutamate 21 g/l, casein 10 g/l, bột đậu tương 20 g/l, peptone đậu tương10 g/l Kết quảđược thể hiện ở hình 1.6

Hình 1.6 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp nattokinase [22]

Hình 1.6 chỉ ra rằng nguồn nitơ tối ưu cho B natto NLSSE trong việc tổng hợp NK là pepton đậu tương, với hoạt lực enzym đạt 208,3 U/ml Tiếp theo là casein, sodium glutamate và bột đậu tương Đặc biệt, khi sử dụng nguồn nitơ vô cơ, hoạt lực enzym thu được rất thấp so với nguồn nitơ hữu cơ.

Nghiên cứu của AI-Juamily và cộng sự (2012) cho thấy ảnh hưởng của các nguồn nitơ đến khả năng sinh tổng hợp NK của Bacillus lichniformis B4, với kết quả tương tự như hình 1.7.

Hình 1.7 Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng tổng hợp nattokinase [7]

Hình 1.7 cho thấy, pepton đậu tương, pepton và casein là 3 nguồn nitơ ảnh hưởng nhiều nhất đến khả năng tổng hợp NK của Bacillus lichniformis B4 với hoạt lực

Phạm Thị Quỳnh 11 enzym sau lên men khoảng 50 U/ml, tiếp đến là các muối vô cơ có chứa nitơ: NH 4 Cl,

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng pepton làm nguồn nitơ để khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng nitơ bổ sung vào môi trường lên men đối với khả năng tổng hợp.

1.3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ giống

Nghiên cứu của AI-Juamily và cộng sự (2012) cho thấy tỉ lệ giống có ảnh hưởng đến khả năng sinh enzym của Bacillus lichniformis B4 trong điều kiện lên men lỏng Môi trường lên men được sử dụng có thành phần nitơ và cacbon là 10 g/l, cùng với sự bổ sung K2HPO4.3H2O.

1 g/l, MgSO4.7H2O 0,5 g/l, lên men 24h, 37 0 C, nuôi lắc 180rpm Kết quả được thể hiện ở hình 1.8

Hình 1.8 Ảnh hưởng của tỉ lệ giống đến hoạt lực enzym [7]

Hình 1.8 cho thấy ở mật độ tế bào là 10 5 CFU/ml thì hoạt lực NK thu được cao nhất đạt 19,185 U/ml [7]

1.3.4 Ảnh hưởng của pH ban đầu

Bacillus sinh trưởng thích hợp trong khoảng trung tính (pH = 7) Điểm đẳng điện của enzym NK là 8,6 và enzym này bền ở pH 7÷8 [23]

Nghiên cứu của AI-Juamily và cộng sự (2012) đã chỉ ra ảnh hưởng của pH ban đầu đến quá trình lên men lỏng với chủng Bacillus lichniformis B4, như thể hiện trong kết quả hình 1.9.

Hình 1.9 Ảnh hưởng của pH đến khả năng tổng hợp nattokinase [7]

Hình 1.9 đã chỉ ra rằng, pH thích hợp nhất để vi khuẩn Bacillus lichniformis B4 tổng hợp NK cho hoạt lực cao là pH = 7,2 [7]

1.3.5 Ảnh hưởng của thời gian lên men

Al-Juamily và cộng sự (2012) cũng đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt lực NK Kết quảđược thể hiện ở hình 1.10

Hình 1.10 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt lực nattokinase [7]

Hoạt lực NK sau quá trình lên men đạt 10,819 U/ml vào ngày đầu tiên và tăng cao nhất lên 15,766 U/ml vào ngày thứ hai, sau đó giảm dần trong các ngày tiếp theo [7].

Khô đậu tương

Khô đậu tương là sản phẩm phụ từ quá trình ép dầu đậu tương, chủ yếu được sử dụng trong ngành công nghiệp thức ăn chăn nuôi và thủy sản Năm 2013, tiêu thụ khô đậu tương ước đạt 3,8 triệu tấn, tăng 7% so với năm trước.

Hình 1.1 Số lượng tiêu thụ khô đậu tương của Việt Nam [42]

Mặc dù Việt Nam đã bắt đầu sản xuất khô đậu tương quy mô công nghiệp từ năm 2011, nhưng vẫn phải nhập khẩu một lượng lớn sản phẩm này Trong năm 2012-2013, nước ta đã nhập khẩu 3 triệu tấn khô đậu tương, tăng 13% so với năm trước Dự báo, tiêu thụ khô đậu tương tại Việt Nam sẽ tiếp tục gia tăng trong những năm tới.

Khô đậu tương hiện nay được sản xuất chủ yếu bằng hai phương pháp: chiết xuất bằng dung môi hexane và ép dầu cơ học Phương pháp chiết xuất bằng hexane, được coi là hiện đại và phổ biến ở các nước phát triển, cho ra khô đậu tương với hàm lượng protein cao (46-48%) và chất béo thấp (1%) Ngược lại, phương pháp ép cơ học, mặc dù đơn giản hơn, nhưng tỷ lệ dầu thu được thấp và hàm lượng chất béo còn lại trong khô đậu tương lên tới 7-10% Từ năm 2011, sự ra đời của hai nhà máy nghiền công nghiệp đã tạo ra bước chuyển mình mạnh mẽ cho ngành hạt có dầu và chăn nuôi gia súc tại Việt Nam, với sản lượng khô đậu tương nội địa đạt 732 nghìn tấn vào năm 2013, giảm 6% so với năm 2012.

Thành phần hóa học của khô đậu tương được chỉ ra ở bảng 1.1 cho thấy hàm

Khô đậu tương có hàm lượng protein cao và chất béo thấp, với giá thành chỉ bằng 1/3 đến 1/2 so với đậu tương Vì vậy, khô đậu tương có thể được sử dụng để thay thế đậu tương trong một số ứng dụng công nghiệp, đặc biệt là trong việc làm môi trường lên men cho vi sinh vật.

B ảng 1.1 Thành phần hoá học của khô đậu tương [40]

Thành phần hóa học % khối lượng

Các phương pháp lên men sinh tổ ng h ợp nattokinase

Để sản xuất nattokinase, có hai phương pháp lên men chính được sử dụng: lên men bề mặt và lên men chìm, mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng.

1.5 1 Phương pháp lên men bề mặt

Samruan và cộng sự (2012) đã nghiên cứu quá trình lên men rắn đậu tương Đậu tương được rửa sạch và ngâm trong nước ở 25°C trong 12 giờ để làm ẩm Sau đó, đậu tương được vớt ra, để ráo và chia nhỏ vào các túi 500g, rồi thanh trùng ở 121°C trong 15 phút Sau khi làm nguội, mỗi túi được bổ sung 1ml môi trường chứa bào tử B subtilis SB-MYP-1 và lên men ở 37°C trong 72 giờ Cuối cùng, đậu tương lên men được sấy đông khô, đóng gói chân không và bảo quản ở 4°C, nhằm tạo ra sản phẩm có thể sử dụng trực tiếp như thực phẩm.

Theo nghiên cứu của Chang và cộng sự (2012), để thu nhận enzym chế phẩm từ đậu tương qua quá trình lên men rắn, đậu tương được làm ẩm đến 60-70% và thanh trùng ở nhiệt độ 121°C trong 15 phút Sau khi làm nguội, đậu tương được trải đều trên các khay với độ dày khoảng 2-3 cm, sau đó cấy giống với tỷ lệ 1:10 (v/wt) và thực hiện quá trình lên men ở nhiệt độ 37°C trong 24 giờ.

- Đơn giản, dễ tiến hành

- Dễ xử lý khi bị nhiễm cục bộ

- Quy mô sản xuất nhỏ

1.5 2 Phương pháp lên men chìm

Saxena và cộng sự (2010) đã thực hiện quá trình lên men chìm để thu nhận NK, sử dụng môi trường chứa các thành phần gồm glucose 10,0%, bột đậu tương 10,0%, K2HPO4 5,0%, MgSO4.7H2O 0,5%, NaCl 0,5% và CaCl2 0,5% Quá trình lên men được thực hiện với chủng Bacillus sp trong 24 giờ ở nhiệt độ 37°C và tốc độ lắc 120rpm Sau khi ly tâm, hoạt lực thu được là 330 U/ml.

Zhou và cộng sự (2008) đã thực hiện quá trình lên men chìm để xác định điều kiện tối ưu cho việc thu nhận NK, sử dụng môi trường chứa 6% bột đậu tương, 2% dextrose, 0,06% CaCl2 và 0,07% MgSO4 Kết quả cho thấy, sau 48 giờ lên men ở nhiệt độ 38°C, hoạt lực NK đạt 306,46 IU/ml.

Hiện nay, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để tối ưu hóa thành phần môi trường lên men lỏng, nhằm thu được enzym với hoạt lực cao nhất, như nghiên cứu của Kwon và cộng sự (2011) [19].

Li và cộng sự (2011) [21] và còn nhiều nghiên cứu khác [17, 22, 29]

- Dễ tựđộng hóa và sản xuất ở quy mô công nghiệp

- Tốn ít diện tích xây dựng và lắp đặt dây chuyền

- Chi phí ban đầu cao

- Dễ nhiễm trùng toàn bộ

- Đòi hỏi công nhân phải có trình độ cao

K ỹ thu ậ t lên men có b ổ sung cơ chấ t (fed-batch) trong sinh t ổ ng h ợ p nattokinase

Bên cạnh các phương pháp tối ưu hóa điều kiện môi trường theo quy hoạch thực nghiệm, nhiều nghiên cứu đã chú trọng vào kỹ thuật lên men Lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch) là phương thức trung gian giữa lên men theo mẻ và lên men liên tục, trong đó cơ chất được bổ sung liên tục vào thiết bị lên men, trong khi sản phẩm được thu hồi gián đoạn Quá trình lên men fed-batch bắt đầu giống như lên men theo mẻ, nhưng đến một thời điểm nhất định, cơ chất sẽ được bổ sung vào môi trường để khởi động quá trình fed-batch Tùy thuộc vào cách bổ sung cơ chất, lên men fed-batch có thể được phân loại thành nhiều loại khác nhau.

- Substrate stat: cơ chất được cấp vào môi trường với tốc độ hoặc hàm lượng ổn định trong một khoảng thời gian

- pH stat: sử dụng tín hiệu pH để cấp cơ chất vào môi trường sao cho pH luôn ổn định

Dựa vào tín hiệu pH để cấp cơ chất, vì khi môi trường có đường, vi khuẩn chuyển đổi đường thành axit hữu cơ Khi hết đường, vi khuẩn sử dụng axit hữu cơ và protein để tạo ra NH3, làm tăng pH Do đó, tín hiệu pH cho biết thời điểm cần bổ sung đường khi môi trường đã cạn kiệt.

- DOT stat: sử dụng hàm lượng oxi hòa tan trong dịch lên men làm tín hiệu để bổ sung cơ chất vào môi trường

Phương pháp lên men fed-batch có ưu điểm nổi bật trong việc sử dụng mật độ tế bào cao, cho phép bổ sung cơ chất dần dần trong suốt quá trình lên men, từ đó tối ưu hóa hiệu suất sản xuất.

Phạm Thị Quỳnh 17 cho rằng trong quá trình lên men, việc không ức chế vi sinh vật và khả năng điều khiển tốc độ phát triển của chúng giúp lên men fed-batch đạt hiệu suất tạo sản phẩm cao hơn so với phương pháp lên men gián đoạn.

Các nghiên cứu về sản xuất nattokinase đã tập trung vào việc tối ưu hóa thành phần lên men thông qua kỹ thuật lên men trong bình tam giác hoặc theo mẻ trong các thiết bị lên men Tuy nhiên, số lượng công trình nghiên cứu về kỹ thuật lên men fed-batch nhằm nâng cao khả năng sinh tổng hợp nattokinase vẫn còn hạn chế.

Nghiên cứu của Cho và cộng sự (2010) cho thấy việc sử dụng phương pháp pH stat trong quá trình lên men fed-batch với chủng B subtilis đã giúp tăng mật độ tế bào lên 2,5 lần so với phương pháp lên men theo mẻ, đồng thời hoạt lực nattokinase thu được cũng tăng 2,1 lần.

Kwon và cộng sự (2011) đã áp dụng phương pháp pH stat fed-batch, trong đó glucose và pepton được bổ sung đồng thời vào môi trường lên men với tỷ lệ từ 0,2 đến 5 g glucose/g pepton Họ phát hiện rằng ở tỷ lệ 0,33, hoạt lực nattokinase tăng 4,3 lần so với quy trình lên men theo mẻ Tương tự, Unrean và cộng sự (2012) cho biết khi thực hiện lên men fed-batch với chủng B subtilis K-C3, hoạt lực nattokinase đã tăng gấp 20 lần so với phương pháp lên men theo mẻ.

Tình hình nghiên c ứ u và s ả n xu ấ t nattokinase ở trong nướ c

Nguyễn La Anh và Đặng Thu Hương (2006) đã tách chiết enzym nattokinase từ

B subtilis NT5, trọng lượng phân tử khoảng 27kDa, pI 7,04, nhiệt độ tối ưu 60 0 C và pH tối ưu 7,5; các điều kiện ổn định enzym là Ca 2+ và Mg 2+ với nồng độ 5-10mM, pH 7-7,8; fibrinase đã được áp dụng làm thực phẩm chức năng làm tan tơ huyết bệnh lý thử nghiệm trên 24 đối tượng và cho kết quả khả quan [1]

Nguyễn Lan Hương và cộng sự (2011) cũng đã lựa chọn được chủng B subtilis

M1 và D đã phát triển thành công phương pháp sinh tổng hợp natokinase cao từ các sản phẩm lên men truyền thống từ đậu tương Nghiên cứu xác định môi trường tối ưu cho quá trình lên men chìm, với thành phần bao gồm 4% bột đậu tương, 0,5% pepton, và 0,01% CaCl2, sử dụng giống 4% trong điều kiện không điều chỉnh pH Quá trình lên men diễn ra trong 22 giờ ở nhiệt độ 37°C và tốc độ lắc 170 vòng/phút, đạt được hoạt lực enzym cao nhất là 242.

Nhóm nghiên cứu đã áp dụng phương pháp lên men fed-batch để nâng cao hoạt lực sinh tổng hợp nattokinase, và kết quả cho thấy hoạt lực nattokinase trong môi trường fed-batch cao gấp 7 lần so với môi trường lên men theo mẻ.

Nghiên cứu của Lê Thị Bích Phượng và cộng sự (2012) cho thấy việc lên men bề mặt trên môi trường hạt đậu tương với quy mô 5 kg/mẻ đã tạo ra chế phẩm có hoạt lực nattokinase đạt khoảng 470 FU/g.

Nguyễn Lan Hương và cộng sự (2014) đã nghiên cứu lựa chọn điều kiện lên men bề mặt phù hợp ở quy mô pilot (100 kg nguyên liệu/mẻ) và hoàn thiện quy trình công nghệ sản xuất nattokinse Công ty CP Sao Thái Dương đã phối hợp thực hiện dự án sản xuất thử nghiệm nattokinase với quy mô 200 kg/tháng, xây dựng phân xưởng sản xuất tại nhà máy chi nhánh Hà Nam Hiện nay, nhà máy đã sản xuất thử 700 kg chế phẩm nattokinase với hoạt lực đạt yêu cầu.

Sản phẩm nattokinase có hoạt lực từ 7000-10.000 FU/g, nhưng vẫn gặp phải một số hạn chế như mùi đặc trưng của sản phẩm lên men chưa được ưa chuộng và giá thành chưa cạnh tranh do hoạt lực của chủng còn thấp Đến nay, nghiên cứu và sản xuất nattokinase chủ yếu sử dụng đậu tương, nguyên liệu truyền thống lý tưởng cho quá trình lên men Việc sử dụng khô đậu tương thay thế cho đậu tương là nghiên cứu đầu tiên được công bố tại Việt Nam.

Hàng năm, Việt Nam nhập khẩu nattokinase để sử dụng làm nguyên liệu cho sản xuất thuốc và thực phẩm chức năng Theo ước tính, khoảng 5-10 tấn chế phẩm nattokinase được nhập khẩu bởi 5 doanh nghiệp sản xuất dược phẩm trong nước.

Mỹ, Nhật Bản, Đài Loan và Trung Quốc cung cấp nattokinase với giá từ 2,5 – 6 triệu đồng/kg Các chế phẩm nattokinase nhập khẩu có hoạt lực khoảng 10,000 FU/g, thường được bổ sung tá dược và đóng thành viên nang với hoạt lực khoảng 300 – 500 FU/viên Hiện nay, sản phẩm chức năng chứa nattokinase nổi bật trên thị trường là Nattospec, được phân phối bởi công ty Dược Á Âu.

Nattotech (công ty DETECHBio), Tuần hoàn Não Thái Dương, Vai Gái, Tamado (công ty CP Sao Thái Dương), An Thọ Minh (công ty Nata- Hoa Linh), Phylcatol Extra (công ty CP SPM), Cardiospes (công ty Thiên Niên Kiện) cùng với nhiều sản phẩm nhập khẩu từ Đài Loan, Hàn Quốc, Nhật Bản, mang đến sự đa dạng và chất lượng cho người tiêu dùng.

VẬ T LI ỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

V ậ t li ệu, đối tượ ng nghiên c ứ u

Bột khô đậu được sản xuất tại nhà máy thức ăn gia súc Nam Thành, tọa lạc tại ga Tía, xã Văn Tự, huyện Thường Tín, Hà Nội Đậu được rang đến màu vàng nâu và xay nhuyễn thành bột mịn, tạo ra sản phẩm chất lượng cao phục vụ nhu cầu chăn nuôi.

Chủng B subtilis D được nuôi cấy và bảo quản tại phòng thí nghiệm thuộc bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm, Trường Đại học Bách khoa Hà Nội.

2.1 3 Hóa chất và thiết bị

2.1.3.1 Các loại hóa chất chính dùng trong nghiên cứu

• Cao nấm men (Merk, Đức)

• Glucose, Peptone, NaOH; HCl; K2HPO4.3H2O; MgSO4.7H2O (Trung Quốc)

2.1.3.2 Các thiết bị được sử dụng

 Cân điện tử Scaltex 10-2 (Đức)

 Nồi hấp thanh trùng (HIRAYAMA, Đức)

 Đo quang Nanodrop (Thermo, Mỹ)

 Máy ly tâm Sorval Legend X1R (Soval, Đức)

 Tủ nuôi cấy lắc ổn nhiệt – dung tích lớn (Taitec corporation, Nhật)

 Máy lắc (Vision VS – 8480SF, Hàn Quốc)

 Hệ thống lên men 2 lít và 10 lít (Sartorius, Đức)

Phương pháp nghiên cứ u

M ật độ tế bào của canh trường hoạt hóa bằng phương pháp đo quang

Canh trường hoạt hóa được pha loãng đến nồng độ tế bào thích hợp, với OD 600nm trong khoảng 0.1 đến 1 Phương pháp định lượng mật độ tế bào vi sinh vật được thực hiện bằng cách đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm.

2.2.2.1 Phương pháp xác định hoạt lực nattokinase

Nguyên tắc: enzym nattokinase trong điều kiện thích hợp về nhiệt độ 37 0 C và pH

Enzyme 7 sẽ phân cắt các phân tử fibrin không tan thành các peptid ngắn hơn, giúp chúng có khả năng hòa tan trong dung dịch Những peptid ngắn này có khả năng hấp thụ ánh sáng tại một bước sóng nhất định.

Nattokinase có hoạt lực 275nm, được định nghĩa là lượng enzyme có khả năng thủy phân fibrin, tạo ra sản phẩm tương đương với 1 µg tyrosine trong 1 phút ở nhiệt độ nhất định.

M ẫu thí nghiệm Mẫu kiểm chứng

500 àl Fibrin + 1300 àl Tris-HCl 0.1M 500 àl Fibrin + 1300 àl Tris-HCl 0.1M

1giờ/37 0 C, thỉnh thoảng lắc 10 phút/37 0 C, thỉnh thoảng lắc

10 phút/37 0 C, thỉnh thoảng lắc 10 phút/37 0 C, thỉnh thoảng lắc

Ly tâm 10000 vòng/ 15 phút/ 4 0 C Ly tâm 10000 vòng/ 15 phút/ 4 0 C Đo quang 275 nm (ATN) Đo quang 275 nm (AKC)

Atn - giá trị đo OD của mẫu thí nghiệm

Akc - giá trịđo OD của mẫu kiểm chứng t - thời gian phản ứng (phút)

D - hệ số pha loãng enzym m - lượng enzym cho phản ứng (ml) a - hệ sốquy đổi, xác định bằng đường chuẩn tyrosine

2.2.2.2 Phương pháp xác định hàm lượng đường khử

Phương pháp xác định hàm lượng đường khử dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử và thuốc thử acid dinitrosalicylic (DNS), trong đó cường độ màu tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một khoảng nhất định Việc so màu được thực hiện ở bước sóng 540nm Qua đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử DNS, ta có thể tính toán hàm lượng đường khử trong mẫu nghiên cứu.

Dịch lên men được ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 10 phút tại 4°C để thu được dịch trong Sau đó, 200 µl dịch trong được cho vào ống Eppendorf và thêm 600 µl DNS (dinitrocalicylic axit), trộn đều và thực hiện phản ứng ở 95°C trong 5 phút Sau khi làm mát trong đá 5 phút, tiến hành đo OD tại bước sóng 540 nm Đường chuẩn được xây dựng với glucose làm chất chuẩn, từ đó xác định hàm lượng đường khử trong dịch lên men dựa trên đồ thị đường chuẩn.

N ộ i dung nghiên c ứ u

Chủng B subtisis D được hoạt hóa trong bình tam giác 250 mL chứa 50 mL môi trường NB [2] ở nhiệt độ 37 0 C, lắc 150rpm thời gian từ 18h

2.3.2 Khảo sát một số điều kiện lên men

• Nồng độ bột khô đậu tương: môi trường lên men % (wt/v): glucose 0,5%, pepton 0,5%, hàm lượng bột khô đậu tươngthay đổi từ5 đến 20%

• Ảnh hưởng của glucose bổ sung: thành phần môi trường % (wt/v): khô đậu tương 15%, pepton 0,5%, bổ sung thêm glucose từ0 đến 2%

• Ảnh hưởng của pepton bổ sung: thành phần môi trường % (wt/v): khô đậu tương 15%, glucose 1,5%, bổ sung thêm pepton trong khoảng từ0 đến 2%

• Ảnh hưởng của pH ban đầu: thành phần môi trường % (wt/v): glucose 1,5%, pepton 1,5%, khô đậu tương15%, pH ban đầu được điều chỉnh ở 6 đến 9

• Tỷ lệ giống: môi trường lên men % (wt/v): nguyên liệu 15%, glucose 1,5%, pepton 1,5%, hàm lượng giống bổ sung để lên men từ2,5 đến 15% (v/v)

• Thời gian lên men: môi trường lên men % (wt/v): khô đậu tương 15%, glucose 1,5%, pepton 1,5%, giống được cấp vào 10%, lên men từ1 đến 4 ngày

Dich sau lên men được ly tâm 6000 v/p, 15 phút, ở 4 o C, thu dịch trong để xác định hoạt lực nattokinase

2.3.3 Tối ưu hóa điều kiện lên men bằng quy hoạch thực nghiệm

Để xây dựng mô hình tối ưu cho quá trình tổng hợp nattokinase, các yếu tố quan trọng được xem xét bao gồm hàm lượng glucose bổ sung, hàm lượng peptone bổ sung và pH ban đầu Hàm mục tiêu trong nghiên cứu này là hoạt lực nattokinase trong dịch sau lên men Quá trình tối ưu hóa các yếu tố này được thực hiện theo phương pháp bề mặt đáp ứng kiểu tâm xoay, và kết quả được phân tích bằng phần mềm Design-Expert 7.1.5 (State-Ease, Inc., Minneapolis).

Mỹ), để phân tích các hệ số hồi quy, sựcó nghĩa của mô hình và bề mặt đáp ứng

B ảng 2.1 Miền biến thiên của các yếu tố

Các yếu tố Miền biến thiên

Hàm lượng glucose bổ sung %(wt/v) 1 ÷ 2

Hàm lượng pepton bổ sung %(wt/v) 1 ÷ 2 pH ban đầu 6 ÷ 9

2.3.4 Lên men sinh tổng hợp nattokinase của chủng B subtilis D trong thiết bị lên men quy mô PTN

 Lên men theo mẻ trên thiết bị lên men 2L

Quá trình lên men theo mẻ được thực hiện trong hệ thống lên men 2L (hình

2.1) với 1L môi trường lên men Giống được cấp 10% so với thể tích dịch lên men.

Hình 2.1 Hệ thống lên men 2L (Biostat B, Sartorius, Đức)

Các thông số trong quá trình lên men được kiểm soát bao gồm nhiệt độ 37°C và pH 7,5, được điều chỉnh tự động bằng bơm axit HCl 2N hoặc NaOH 2N Quá trình khuấy trộn diễn ra với tốc độ từ 200 đến 800 rpm, cùng với việc điều chỉnh lưu lượng khí để duy trì hàm lượng oxy dư trong dịch ở mức 30%.

Trong suốt quá trình lên men, dịch lên men được định kỳ lấy mẫu xác định hoạt lực nattokinase và hàm lượng đường khử

 Lên men có bổsung cơ chất (fed-batch) trên thiết bị 2L

600 ml môi trường lên men được đưa vào thiết bị lên men, giống cấp vào 100 ml

Sau khoảng 7 giờ lên men, khi pH của dịch lên men vượt quá 7,5, bơm định lượng sẽ tự động bơm dịch đường (glucose 15%) vào thiết bị lên men để duy trì pH ổn định ở mức 7,5 Quá trình lên men kéo dài 36 giờ, với tổng thể tích kết thúc đạt khoảng 1 lít Trong suốt quá trình này, dịch lên men được lấy mẫu định kỳ để xác định hoạt lực nattokinase và hàm lượng đường khử.

 Lên men có bổsung cơ chất (fed-batch) trên thiết bị 10L

Quá trình lên men được thực hiện tương tự như phương pháp fed-batch trên thiết bị lên men 2L, với môi trường ban đầu là 3,6 lít và tổng thể tích sau khi kết thúc quá trình lên men đạt 6 lít Trong quá trình này, dịch lên men được định kỳ lấy mẫu để xác định hoạt lực nattokinase và hàm lượng đường khử.

KẾ T QU Ả VÀ TH Ả O LU Ậ N

Kh ả o sát ảnh hưở ng c ủ a m ộ t s ố y ế u t ố đế n kh ả năng sinh tổ ng h ợ p nattokinase t ừ khô đậu tương

3.1.1 Nồng độ khô đậu tương

Nghiên cứu này tập trung vào ảnh hưởng của nồng độ khô đậu tương đến quá trình sinh tổng hợp nattokinase thông qua phương pháp lên men chìm với chủng B subtilis D Nồng độ khô đậu tương được thay đổi từ 5% đến 20% (wt/v), và kết quả hoạt lực nattokinase trong môi trường lên men được thể hiện trong hình 3.1.

H oạt lự c nat tok in as e ( FU /m l)

Nồng độ khô đậu tương (%)

Hình 3.1 Ảnh hưởng của nồng độ khô đậu tương đến hoạt lực nattokinase

Theo hình 3.1, khi nồng độ khô đậu tương tăng từ 5% lên 10%, hoạt lực nattokinase tăng từ 30 đến 45 FU/ml Tuy nhiên, khi nồng độ khô đậu tương tiếp tục tăng từ 10% trở lên, hoạt lực này không còn tăng nữa.

Nghiên cứu cho thấy rằng khi nồng độ khô đậu tương đạt 15%, hoạt lực nattokinase tăng từ 45 FU/ml lên 62,5 FU/ml, đạt mức cao nhất Tuy nhiên, khi nồng độ khô đậu tương tăng lên 20%, hoạt lực nattokinase giảm xuống còn 54,5 FU/ml Do đó, nồng độ khô đậu tương 15% đã được lựa chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.

3.1.2 Nồng độ glucose bổ sung

Glucose đóng vai trò quan trọng như nguồn cacbon bổ sung trong quá trình sinh tổng hợp nattokinase, với nồng độ khô đậu tương là 15% Hình 3.2 minh họa kết quả hoạt lực của nattokinase trong môi trường lên men khi sử dụng các nồng độ glucose bổ sung khác nhau.

H oạt lự c nat tok in as e ( FU /m l)

Nồng độ glucose bổ sung (%)

Hình 3.2 Ảnh hưởng của nồng độ glucose bổ sung đến hoạt lực nattokinase

Nghiên cứu cho thấy khi nồng độ glucose bổ sung tăng từ 0,5% đến 1,5%, hoạt lực nattokinase cũng tăng từ 62,17 FU/ml đến 69,50 FU/ml, với mức tối đa đạt được tại 1,5% Tuy nhiên, khi nồng độ glucose đạt 2%, hoạt lực nattokinase bắt đầu giảm Ku và cộng sự (2009) đã chỉ ra rằng nồng độ glucose bổ sung 1,75% là tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp nattokinase.

3.1.3 Nồng độ pepton bổ sung

Nghiên cứu cho thấy, việc bổ sung pepton vào môi trường lên men không chỉ tăng cường hoạt lực nattokinase của các chủng B subtilis mà còn cho thấy sự khác biệt rõ rệt khi sử dụng nồng độ pepton khác nhau Hình 3.3 minh họa hoạt lực nattokinase sau quá trình lên men với sự bổ sung pepton.

H oạt lự c nat tok in as e ( FU /m l)

Nồng độ pepton bổ sung (%)

Hình 3.3 Ảnh hưởng của nồng độ pepton bổ sung đến hoạt lực nattokinase

Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi nồng độ pepton bổ sung trong môi trường lên men tăng từ 0,5% đến 1,5%, hoạt lực nattokinase tăng từ 71,33 FU/ml lên 75,83 FU/ml Tuy nhiên, khi nồng độ pepton tiếp tục tăng lên 2%, hoạt lực nattokinase lại giảm Do đó, nồng độ pepton tối ưu cho hoạt lực nattokinase cao nhất là 1,5%, đạt 75,83 FU/ml.

pH ban đầu của môi trường lên men là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp enzym của vi sinh vật Khi điều chỉnh pH ban đầu trong khoảng từ 6.0 đến 9.0, hoạt lực nattokinase trong môi trường sau lên men sẽ thay đổi, như thể hiện trong hình 3.4.

H oạt lự c nat tok in as e ( FU /m l) pH ban đầu

Hình 3.4 Ảnh hưởng của pH ban đầu đến hoạt lực nattokinase

Hoạt lực của nattokinase trong canh trường sau quá trình lên men đạt tối đa ở pH 8 với giá trị 72,56 FU/ml, trong khi pH ban đầu có tính kiềm từ 7-9 Nghiên cứu của AI-Juamily và cộng sự (2012) chỉ ra rằng pH tối ưu cho vi khuẩn B lichniformis B4 tổng hợp nattokinase với hoạt lực cao là pH 7,2.

Để xác định thời gian lên men tối ưu trong quy mô phòng thí nghiệm, nghiên cứu đã tiến hành lên men trong bình tam giác 250ml với 50ml môi trường trong khoảng thời gian từ 1 đến 4 ngày Hoạt lực của nattokinase trong canh trường được ghi nhận và biểu diễn qua hình 3.5 sau mỗi ngày lên men.

H oạt lự c nat tok in as e ( FU /m l)

Thời gian lên men (ngày)

Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hoạt lực nattokinase

Kết quả nghiên cứu cho thấy, hoạt lực nattokinase đạt mức tối đa sau 2 ngày lên men, với giá trị tăng từ 61,33 FU/ml lên 77,33 FU/ml, sau đó giảm xuống còn 72,17 FU/ml và 68,50 FU/ml khi thời gian lên men kéo dài đến 3-4 ngày Do đó, 48 giờ là thời gian tối ưu cho chủng B subtilis D để sản xuất nattokinase Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Al-Juamily và cộng sự (2012) với chủng B lichniformis B4, cũng như nghiên cứu của Long và cộng sự (2011) với chủng Bacillus nato BN4, đều cho thấy thời gian lên men thích hợp để tổng hợp nattokinase là 48 giờ.

T ối ưu điề u ki ệ n lên men sinh t ổ ng h ợ p nattokinase

Để tối ưu hóa điều kiện lên men sinh tổng hợp nattokinase trong phòng thí nghiệm, các yếu tố nghiên cứu bao gồm nồng độ glucose bổ sung, nồng độ pepton bổ sung và pH ban đầu Giá trị mã hóa các biến được trình bày trong bảng 3.1, trong khi ma trận thực nghiệm được thiết kế như ở bảng 3.2 Các thí nghiệm được thực hiện trong bình tam giác 250 ml với 50 ml môi trường lên men, và hoạt lực nattokinase trong môi trường lên men tại các điểm thí nghiệm được thể hiện trong bảng 3.2.

B ảng 3.1 Giá trị mã hóa các biến

Kí hiệu Tên biến Đơn vị Cận dưới Cận trên

B ảng 3.2 Ma trận thực nghiệm và hoạt lực nattokinase của canh trường

Theo bảng 3.2, hoạt lực nattokinase trong canh trường sau lên men dao động từ 24,17 FU/ml đến 79,53 FU/ml, cho thấy hoạt lực này chịu ảnh hưởng của các yếu tố nghiên cứu.

Kết quả phân tích phương sai từ mô hình tối ưu sử dụng phần mềm DX7.1.5 (State-Ease) cho thấy sự có nghĩa của các hệ số và mức độ tương thích của mô hình thực tế.

Mô hình hồi quy của Phạm Thị Quỳnh 30 được trình bày trong bảng 3.3, với các hệ số hồi quy có ý nghĩa thống kê được xác định qua kiểm định chuẩn F và giá trị p, tất cả đều nhỏ hơn 0,05.

B ảng 3.3 Kết quả phân tích hồi quy

Thông số Phương sai Chuẩn F Mức có nghĩa prob (p) > F

Bảng phân tích hồi quy cho thấy chuẩn F của mô hình đạt 183,74 với mức có nghĩa nhỏ hơn 0,0001, cho thấy độ tin cậy của mô hình lên tới 99% Tất cả các thông số trong mô hình đều có ý nghĩa, với hệ số tương quan bội R² đạt 0,994, chứng tỏ mô hình phù hợp sát với thực nghiệm Chương trình quy hoạch thực nghiệm cung cấp phương trình bậc 2 thể hiện mối liên hệ giữa các yếu tố đầu vào và hoạt lực nattokinase sau lên men (Y).

Sựảnh hưởng của các yếu tốđến hoạt lực nattokinase sau lên men được thể hiện rõ nét qua hình 3.6a

H oạ tlự c na tt oki na se (F U /ml)

Hình 3.6a Ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt lực nattokinase

Theo hình 3.6a, yếu tố C (pH ban đầu) có ảnh hưởng lớn nhất đến hoạt lực nattokinase, tiếp theo là yếu tố A (nồng độ glucose), do giá trị p của yếu tố C là nhỏ nhất Trong khi đó, nồng độ pepton (yếu tố B) không ảnh hưởng nhiều đến hoạt lực nattokinase.

Bằng cách cố định một yếu tố và thay đổi hai yếu tố còn lại trong khoảng cận của chúng, chúng ta có thể tạo ra hình ảnh không gian 3 chiều của bề mặt đáp ứng hoạt lực nattokinase và các đường đồng mức Vùng màu đỏ trên bề mặt đáp ứng biểu thị khu vực có giá trị hoạt lực nattokinase cao nhất, trong khi các giá trị thấp hơn được thể hiện bằng màu vàng, vàng nhạt và xanh, nằm ở rìa của bề mặt này.

H oa t l uc nat tok inas e (F U /m L)

Hình 3.6b Bề mặt đáp ứng của hoạt lực nattokinase và mối quan hệ giữa nồng độ glucose (A) và nồng độ peptone (B)

H oa t l uc nat tok inas e (F U /m L)

Hình 3.6c Bề mặt đáp ứng của hoạt lực nattokinase và mối quan hệ giữa nồng độ glucose (A) và pH (C) ue

H oa t l uc nat tok inas e (F U /m L)

H ình 3.6d Bề mặt đáp ứng của hoạt lực nattokinase và mối quan hệ giữa nồng độ pepton (B) và pH (C)

Khi pH đạt 7,5, hoạt lực nattokinase cao nhất được ghi nhận trong vùng có hàm lượng glucose bổ sung từ 1,2% đến 1,8% và pepton bổ sung từ 1,0% đến 1,8% Phân tích trên các đường đồng mức và bề mặt đáp ứng cho thấy hoạt lực nattokinase tối đa đạt 80,40 FU/ml tại pH 7,76 với hàm lượng glucose bổ sung 1,5% và pepton bổ sung 1,36%.

Phần mềm còn đưa ra một số điểm tối ưu khác cho quá trình sinh tổng hợp nattokinase, những điểm này được đưa ra ở bảng 3.4

B ảng 3.4 Một số điểm tối ưu xung quanh điểm trung tâm

Pepton (%wt/v) pH Hoạt lực nattokinase

Theo bảng 3.4, có nhiều phương án tối ưu để lựa chọn, nhưng chúng tôi đã chọn phương án với nồng độ glucose 1,5%, nồng độ pepton 15% và pH 7,5 để dễ dàng điều chỉnh trong thí nghiệm Hoạt lực nattokinase đạt 79,55 FU/ml, tương thích với kết quả thực nghiệm tại điểm tối ưu Nghiên cứu của Deepak và cộng sự (2008) cũng đã tối ưu môi trường sinh tổng hợp nattokinase với chủng B subtilis, sử dụng phương pháp bề mặt đáp ứng, cho thấy pH 7,5, hàm lượng glucose 1% và pepton 5,5%.

MgSO4 0,2%; và CaCl2 0,5%; hoạt lực nattokinase tại điểm tối ưu cao gấp 2 lần so với trước khi tối ưu [14].

Nghiên c ứ u k ỹ thu ậ t lên men phù h ợ p sinh t ổ ng h ợ p nattokinase c ủ a ch ủ ng B

Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu nhằm nâng cao quy mô lên men và hoạt lực nattokinase trong môi trường sau lên men bằng cách sử dụng thiết bị lên men 2L và 10L Kỹ thuật lên men theo mẻ và lên men có bổ sung cơ chất đã được áp dụng để xác định phương pháp tối ưu cho quá trình sinh tổng hợp nattokinase từ chủng B subtilis D.

Quá trình lên men được thực hiện trên thiết bị lên men 2L với thểtích môi trường

Trong quá trình lên men 1 lít, các điều kiện đã được tối ưu hóa ở quy mô bình tam giác Quá trình này sử dụng cánh khuấy và bơm nén không khí sạch để duy trì hàm lượng oxy hòa tan đạt 30% Diễn biến của quá trình lên men được minh họa trong hình 3.7.

Ax ít H Cl 2 N ( m L ) pH pO 2 ( % )

Hình 3.7 Diễn biến của các thông số trong quá trình lên men theo mẻ trên thi ết bị lên men 2L

Trong quá trình lên men, pH được duy trì ổn định ở mức 7,5 nhờ vào việc tự động bơm dung dịch HCl 2N vào thiết bị sau 7 giờ Đồng thời, hàm lượng oxy hòa tan (pO2) trong môi trường giảm nhanh chóng sau 5 giờ lên men và tiếp tục giảm xuống 0, mặc dù thiết bị đã tự động tăng cường khuấy trộn.

Trong quá trình lên men từ 5 đến 18 giờ với tốc độ 200 đến 800 rpm, vi khuẩn sử dụng oxy để phát triển sinh khối, dẫn đến việc hàm lượng oxy hòa tan trong canh trường giảm mạnh sau 5 giờ Sau 18 giờ, tốc độ phát triển của vi khuẩn chậm lại, khiến hàm lượng pO2 dễ dàng được duy trì ở mức 30% nhờ thiết bị lên men Đến 34 giờ, hàm lượng oxy hòa tan có xu hướng tăng lên 40% Hoạt lực nattokinase trong canh trường cũng được theo dõi theo thời gian lên men.

H oạt lự c nat tok in as e ( FU /m l)

Thời gian lên men (giờ)

Hình 3.8 Hoạt lực nattokinase trong canh trường theo thời gian lên men

Trước 6 giờ lên men hoạt lực nattokinase hầu như chưa có (số liệu không đưa vào), tại 6 giờ hoạt lực đạt 40 FU/m, hoạt lực tăngnhanh từ 6 đến 12 giờ lên men, sau đó tiếp tục tăng chậm dần sau 18 giờ lên men và đạt cực đại sau 24 giờ lên men với hoạt lực nattokinase là 112,17 FU/ml Các giờ lên men tiếp theo dù chủng có phát triển mạnh (thể hiện qua lượng axít được bổ sung liên tục vào bình lên men để đưa pH canh trường về pH 7,5 và hàm lượngoxy hòa tan trở về 0) nhưng hoạt lực nattokinase giảm nhẹ sau 24 giờ lên men Như vậy có thể thấy khi lên men theo mẻ trong thiết bị lên men 2L hoạt lực nattokinase trong canh trường cao hơn so với lên men trong bình tam giác 1,4 lần, điều đó cho thấy việc duy trì pH 7,5 và hàm lượng oxy hòa tan trong canh trường lên men 30% trong suốt quá trình lên men là những yếu tố làm tăng hoạt lực nattokinase thu nhận được

Hàm lượng đường khử trong canh trường theo thời gian lên men được xác định ở hình 3.9

H àm lư ợng đư ờng k hử (g /L )

Hình 3.9 Hàm lượng đường khử trong canh trường theo thời gian lên men

Kết quả từ hình 3.9 cho thấy hàm lượng đường khử giảm nhanh chóng trong 6 giờ đầu của quá trình lên men, từ 14,94 g/L xuống 5,24 g/L, sau đó giảm chậm trong 6 giờ tiếp theo và ổn định từ 12-24 giờ với mức 2,17-1,99 g/L Sau 30 giờ lên men, hàm lượng đường khử giảm đáng kể còn 0,84 g/L Điều này cho thấy trong 12 giờ đầu, vi khuẩn phát triển sinh khối mạnh mẽ, trong khi từ 12-24 giờ là giai đoạn vi khuẩn tổng hợp enzym Sự giảm đáng kể hàm lượng đường khử sau 30 giờ có thể là nguyên nhân khiến hoạt lực nattokinase giảm so với sau 24 giờ lên men.

Kết quả nghiên cứu cho thấy việc duy trì hàm lượng đường khử trong canh trường ở nồng độ nhất định là cần thiết để vi khuẩn tiếp tục tăng sinh khối và kéo dài thời gian sinh tổng hợp nattokinase Do đó, chúng tôi đã áp dụng kỹ thuật lên men fed-batch, trong đó pH được duy trì ở mức 7,5 bằng dung dịch glucose 15%.

3.3.2 Lên men theo mẻ có bổ sung cơ chất (fed-batch) Đã tiến hành lên men fed-batch trên thiết bị lên men 2L, diễn biến quá trình lên men cho kết quảtương tự như lên men theo mẻ (hình 3.7), tuy nhiên lượng dịch đường bổ sung vào thiết bị lên men gấp khoảng 7,5 lần so với sử dụng axít để duy trì pH 7,5 (xem hình 3 – phụ lục) Hoạt lực nattokinase của dịch canh trường theo thời gian lên men được biểu diễn ở hình 3.10

H oạt lự c nat tok in as e ( FU /m l)

Thời gian lên men (giờ)

Hình 3.10 Hoạt lực nattokinase trong canh trường lên men fed-batch theo th ời gian lên men

Kết quả nghiên cứu cho thấy hoạt lực nattokinase trong canh trường lên men tăng liên tục từ giờ thứ 9 đến giờ thứ 24, đạt cực đại sau 30 giờ lên men, với mức tăng cao gấp 3,8 lần so với phương pháp lên men theo mẻ Việc bổ sung glucose vào quá trình lên men không chỉ làm tăng hoạt lực nattokinase mà còn kéo dài thời gian đạt cực đại từ 24 giờ lên 30 giờ Tuy nhiên, sau 30 giờ, hoạt lực nattokinase có xu hướng giảm Để xác nhận khả năng nâng cao hoạt lực nattokinase, quy mô lên men đã được tăng từ 1 lít lên 6 lít trong thiết bị lên men 10 L, và diễn biến của các thông số trong quá trình lên men fed-batch đã được ghi nhận.

D ung di ch g luc o se b o s ung ( m L ) pH p O 2 (%)

Hình 3.11 Diễn biến của các thông số trong quá trình lên men fed-batch trong thi ết bị lên men 10L

Trong 5 giờ đầu của quá trình lên men, quá trình diễn ra theo hình thức lên men theo mẻ Bắt đầu từ giờ thứ 5, pH của môi trường giảm xuống mức 7, dẫn đến việc bơm tự động hoạt động để bổ sung dung dịch glucose vào thiết bị lên men, nhằm duy trì pH ổn định ở mức 7,5.

Trong quá trình lên men, lượng glucose bổ sung đã giúp chủng vi khuẩn phát triển mạnh, duy trì pO2 ở mức 0 sau 20 giờ Tuy nhiên, sau thời gian này, sự phát triển của vi khuẩn chậm lại, dẫn đến hàm lượng oxy hòa tan tăng từ 5-15%, thậm chí có lúc lên đến 40% sau 33 giờ Lượng glucose được bổ sung tương tự như trong quy trình lên men fed-batch ở quy mô 2L, nhưng thời gian bổ sung sớm hơn Kết quả cho thấy chủng vi khuẩn phát triển tốt ở quy mô 6 lít/mẻ Hoạt lực nattokinase trong canh trường theo thời gian lên men được ghi nhận, với hoạt lực đạt cực đại 431±8,5 FU/ml sau 30 giờ ở quy mô 6 lít/mẻ, cho thấy sự tương đồng với các quy mô khác.

Nghiên cứu cho thấy, khi sử dụng hàm lượng bột khô đậu tương 15%, glucose 1,5% và peptone 1,5%, việc bổ sung thêm glucose 15% trong quá trình lên men đã tăng hoạt lực nattokinase lên gấp 3,8 lần so với mức hoạt lực nattokinase ban đầu.

Phạm Thị Quỳnh 39 thực hiện quá trình lên men theo mẻ, sử dụng kỹ thuật bổ sung cơ chất để duy trì pH 7,5 Kỹ thuật này rất phù hợp cho việc lên men sinh tổng hợp nattokinase bằng chủng B subtilis D.

Nghiên cứu của Cho và cộng sự (2010) cho thấy việc sử dụng kỹ thuật lên men với bổ sung cơ chất để duy trì pH 7,0 trên môi trường khô đậu tương bằng chủng B subtilus đã làm tăng hoạt lực nattokinase lên 2,1 lần so với phương pháp lên men theo mẻ.

Kwon và cộng sự (2011) đã nghiên cứu quá trình lên men bằng cách bổ sung glucose và pepton vào môi trường với tỉ lệ từ 0,2 đến 5 g glucose/g pepton, phát hiện tỉ lệ 0,33 giữa glucose và pepton giúp tăng hoạt lực nattokinase lên 4,3 lần so với phương pháp lên men theo mẻ tại pH 7,0 Năm 2012, Unrean và cộng sự tiếp tục cải tiến quy trình bằng cách sử dụng glycerol theo hàm số mũ trong môi trường lên men B subtilis K-C3, dẫn đến sự gia tăng hoạt lực nattokinase lên 20 lần so với quá trình lên men theo mẻ.