Nghiên cứu tạo isomaltooligosaccharide (imo) từ tinh bột khoai lang bằng đường hóa gắn nhánh đồng thời

TỔNG QUAN VỀ ISOMALTOOLIGOSACCHARIDE

KHÁI NI ỆM, VAI TRÒ, THỊ TRƯỜNG CỦA ISOMALTOOLIGOSACCHARIDE

Isomaltooligosaccharides (IMOS) là các phân tử ngắn tuyến tính của D-glucose liên kết bằng các liên kết α-1,6 glycosidic, nhưng cũng bao gồm glucooligosacaride phân nhánh và vòng với các liên kết α-1,6, α-1,3 hoặc α-1,2 glycosidic Cấu trúc và tính chất của IMOS phụ thuộc vào mức độ trùng hợp (DP) từ 2 đến 10 đơn vị glucose, loại liên kết glycosidic và tỷ lệ giữa các liên kết Đặc tính prebiotic của IMOS đến từ các liên kết glycosidic, trong đó chỉ có liên kết α-1,4 dễ bị thủy phân bởi enzyme đường ruột, trong khi các liên kết còn lại là cơ chất cho vi sinh vật có lợi như lactobacilli và bifidobacteria Mức độ trùng hợp và tỷ lệ giữa các loại liên kết ảnh hưởng đến khả năng tiêu hóa và chuyển hóa của IMOS trong hệ vi sinh vật đường ruột Danh sách IMOS bao gồm isomaltose, isomaltotriose, isomaltotetraose, panose, isopanose, glucose-maltotriose, nigerose, nigerotriose, kojibose và centose Một nhóm quan trọng khác là isomaltooligosaccharide mạch vòng (CIs), được hình thành từ các đơn vị glucose chỉ liên kết bằng các liên kết α-1,6 glycosidic, với DP từ 7 đến 12.

Hình 1.1: Cấu trúc của các loại isomaltooligosaccharide [78]

Bảng 1.1: Danh sách các maltooligosacchrides (MOS) và isomaltooligosacchrides

Tên thông thường Công thức phân tử Tên hóa học

Maltotriose (DP3) C 18 H 32 O 16 O-α-D-glucopyranosyl-(1,4)-O-α-D-glucopyranosyl-(1,4)-D- glucose

D-glucopyranosyl-(1,4)-O-α-D-glucopyranosyl-(1,4)-O-α-D- glucopyranosyl-(1,4)-O-α-D-glucopyranosyl-(1,4)-D-glucose

D-glucopyranosyl-(1,6)-O-α-D-glucopyranosyl-(1,6)-O-α-D- glucopyranosyl-(1,6)-O-α-D-glucopyranosyl-(1,6)-D-glucose

Maltooctaose (DP8) C48H82O41 O-α-D-glucopyranosyl-(1,4)-O- α-D-glucopyranosyl-(1,4)-O- α-D-glucopyranosyl-(1,4)-O-α-D-glucopyranosyl-(1,4)-O-α-D- glucopyranosyl-(1,4)-O-α-D-glucopyranosyl-(1,4)-O-α-D- glucopyranosyl-(1,4)-D-glucose

D-glucopyranosyl-(1,6)-O-α-D-glucopyranosyl-(1,6)-O-α-D- glucopyranosyl-(1,6)-O-α-D-glucopyranosyl-(1,6)-O-α-D- glucopyranosyl-(1,6)-D-glucose

D-glucopyranosyl-(1,4)-O-α-D-glucopyranosyl-(1,4)-O-α-D- glucopyranosyl-(1,4)-O-α-D-glucopyranosyl-(1,4)-O-α-D- glucopyranosyl-(1,4)-O-α-D-glucopyranosyl-(1,4)-D-glucose

D-glucopyranosyl-(1,6)-O-α-D-glucopyranosyl-(1,6)-O-α-D- glucopyranosyl-(1,6)-O-α-D-glucopyranosyl-(1,6)-O-α-D- glucopyranosyl-(1,6)-O-α-D-glucopyranosyl-(1,6)-D-glucose

Isomaltose (IMO) đã được con người sử dụng từ hàng trăm năm qua, chủ yếu từ các sản phẩm tự nhiên và truyền thống như mật ong, miso, rượu sake và nước tương Trong mật ong, isomaltose thường có mặt với hàm lượng khoảng 1.17‒2.49%.

Mật ong được tiêu thụ phổ biến trên toàn cầu, với mức tiêu thụ trung bình khoảng 300 gram mỗi người mỗi năm ở Nhật Bản Isomaltose (IMO) đã được phát hiện trong miso, một sản phẩm từ đậu tương và gạo, thường được sử dụng hàng ngày trong súp và nước sốt Qua quá trình lên men, hàm lượng isomaltose trong miso tăng từ 0.31% ban đầu lên 1.11% sau 5 ngày và đạt 1.17% vào ngày thứ 50 Ngoài ra, rượu Sake cũng chứa isomaltose với nồng độ 2.4-4.1 mg/ml, panose 0.7-0.9 mg/ml và isomaltotriose 0.4-1.4 mg/ml.

1.1.2 Vai trò của IMO với cơ thể

Xi-rô IMO có khả năng thay thế một phần hoặc toàn bộ xi-rô đường, tạo ra các sản phẩm đồ uống với độ ngọt đa dạng, trong đó độ ngọt của nó chỉ bằng một nửa so với đường saccarose Trong sản xuất bia, IMO được sử dụng như một xi-rô đường không lên men để điều chỉnh độ ngọt và cảm quan của bia Đặc biệt, IMO giúp ngăn ngừa sự gia tăng đột ngột của đường huyết, vì vậy nó được ứng dụng để thay thế đường trong nhiều sản phẩm bánh kẹo Ngoài ra, việc thay thế saccarose bằng IMO đã được chứng minh là làm giảm lượng mảng bám và axit tấn công men răng, góp phần giảm nguy cơ sâu răng.

Lợi thế cạnh tranh chính của IMO nằm trong lĩnh vực thực phẩm chức năng, đặc biệt là các sản phẩm prebiotic Tại Nhật Bản, nhiều sản phẩm thực phẩm chức năng sử dụng IMO đã được báo cáo mang lại lợi ích sức khỏe Prebiotic là carbohydrate không tiêu hóa, chúng đi qua ruột non và được lên men trong ruột kết, tạo ra các axit béo mạch ngắn như butyrate Các thử nghiệm lâm sàng cho thấy IMO không gây tiêu chảy khi sử dụng đúng liều lượng Hơn nữa, IMO là nguồn thực phẩm ưu tiên cho các vi khuẩn probiotics, như bifidobacteria, giúp cải thiện sự cân bằng vi khuẩn đường ruột.

Hiện nay, IMO đang được các công ty Hoa Kỳ phát triển như một nguồn chất xơ hòa tan và prebiotic cho nhiều loại đồ uống Nó có thể được sử dụng như một thành phần thực phẩm để pha chế trong các sản phẩm nước giải khát, kẹo và món tráng miệng.

1.1.2.1 IMO là một Prebiotics Đã có nhiều nghiên cứu về sự ảnh hưởng đến lượng vi sinh vật có lợi trong cơ thể khi được bổ sung IMO đều đặn mỗi ngày (từ 1 đến 2 tuần theo dõi) Kết quả phân tích vi khuẩn trong phân cho thấy sự gia tăng về số lượng Bifidobacteria trong phân tăng đáng kể [15]–[19], Lactobacilli [16], [17], Eubacteria [17], đồng thời ức chế vi khuẩn không có lợi như Clostridum perfriengenes[16] Mặt khác,

E coli và các vi khuẩn khác không sử dụng được IMO [15]

1.1.2.2 IMO có chỉ số đường huyết thấp

IMO chứa nhiều liên kết α-1,6 glycosidic khó tiêu hóa bởi enzyme của cơ thể, đặc biệt là các IMO chỉ liên kết bằng loại glycosidic này Chất này được coi là chất kháng tiêu hóa (RS) và hỗn hợp có hàm lượng cao IMO có khả năng giảm mức độ gia tăng đường huyết IMO được xem là thực phẩm tiêu hóa chậm, ít sinh năng lượng (SDS), và có tiềm năng lớn trong ngành công nghiệp đồ uống và bánh kẹo Nghiên cứu cho thấy IMO đại diện cho thực phẩm có chỉ số GI thấp.

1.1.2.3 IMO có tác động chống táo bón, giảm lượng Colesterol trong máu

Tiêu thụ IMO đã được chứng minh là cải thiện hiệu quả nhu động ruột, tăng cường lượng phân và vi khuẩn lên men trong đại tràng mà không gây tác dụng phụ, theo nghiên cứu của Chen và cộng sự (2001) Nghiên cứu của Wang và cộng sự (2001) cũng chỉ ra rằng IMO giúp giảm mức cholesterol, gia tăng số lần đi tiểu và cải thiện tình trạng táo bón của bệnh nhân trong suốt 4 tuần điều trị.

1.1.2.4 Vai trò c ủa IMO 2 , IMO 3 , IMO 4

Các sản phẩm IMO thương mại chủ yếu gồm IMO2, Panose và IMO3 Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc tiêu thụ các sản phẩm này có tác động tích cực đến hoạt động của hệ vi sinh vật đường ruột.

Sản phẩm BLB® IMO chứa hơn 90% IMO (so với chất khô), trong đó IMO2, Panose và IMO 3 chiếm trên 45% (so với chất khô), được dùng để nghiên cứu sự biến đổi của hệ vi sinh vật trong phân người Kết quả cho thấy số lượng bifidobacteria gia tăng và sự ổn định của phân được cải thiện (GRAS Notice (GRN) No.779), tương tự như chế phẩm Vitasugar TM (GRAS Notice (GRN) No.246) Nhiều nghiên cứu về IMO cũng chỉ ra vai trò quan trọng của các thành phần IMO2, Panose và IMO 3.

IMO 4 là những thành phần được quan tâm nhất và được xác định như đại diện cho hàm lượng IMO có trong sản phẩm Điều này có thể liên quan đến khả năng hoạt động của enzyme transglucosidase từ Aspergillus niger chủ yếu trên cơ chất

Trong nghiên cứu của Niu và cộng sự (2017), hàm lượng oligosaccharide mạch ngắn được xác định theo các chỉ số IMO2, IMO3 và panose Tương tự, Chockchaisawasdeea và cộng sự (2013) cũng đã tính toán hàm lượng IMO dựa trên các chỉ số IMO2, IMO3 và IMO4 Các nghiên cứu này góp phần làm rõ hơn về thành phần và giá trị dinh dưỡng của oligosaccharide mạch ngắn.

(2017) tính theo IMO 2 , IMO 3 và panose [24]

IMO2, IMO3 và IMO4 là các thành phần chính của hỗn hợp IMO, phản ánh hàm lượng IMO trong sản phẩm Vai trò và tính chất của sản phẩm IMO chủ yếu được thể hiện qua các thành phần này Nghiên cứu và phân tích các thành phần IMO khác với mức độ trùng hợp cao hơn yêu cầu các kỹ thuật phân tích hiện đại và chi phí lớn hơn.

1.1.3 Thị trường IMO trên thế giới

IMO đã được sản xuất và sử dụng trong ngành thực phẩm ở châu Á khoảng 15-20 năm, đặc biệt phổ biến tại Nhật Bản, Trung Quốc và Hàn Quốc Theo nghiên cứu của Teruo (2003), IMO là loại oligosaccharide khó tiêu hóa được ưa chuộng nhất tại Nhật Bản, với mức tiêu thụ ước tính khoảng 11.000 tấn vào năm 2003 Nó đã được sử dụng như một chất làm ngọt trong nhiều sản phẩm thực phẩm và cũng đóng vai trò quan trọng trong việc chế biến thực phẩm lên men truyền thống tại Nhật Bản.

S ẢN XUẤT ISOMALTOOLIGOSACCHARIDE (IMO)

1.2.1 Quy trình sản xuất IMO thông thường (không đồng thời)

IMO có mặt tự nhiên trong các sản phẩm như mật ong, bia và thực phẩm lên men như tương miso, nước tương và rượu sake Tuy nhiên, việc thu nhận IMO với quy mô lớn từ những nguồn thực phẩm này không khả thi về mặt kinh tế.

Các IMO thương mại được sản xuất từ tinh bột thông qua quá trình biến tính, sử dụng enzyme gắn nhánh làm chất xúc tác Các enzyme chủ yếu bao gồm glucanotransferase, hydrolase và transglucosidase Quy trình sản xuất IMO từ tinh bột thường trải qua các bước dịch hóa, đường hóa, gắn nhánh và tinh chế.

Tinh bột được hòa với nước tạo thành huyền phù có nồng độ từ 20-30% (w/w), sau đó thêm enzyme α-amylase chịu nhiệt Trong quá trình dịch hóa, enzyme này xúc tác thủy phân ngẫu nhiên các liên kết α-1,4 glycosidic của amylose và amylopectin, dẫn đến sự hình thành các dextrin với độ dài mạch phân tử khác nhau Cuối cùng, để kết thúc quá trình dịch hóa, enzyme α-amylase được diệt bằng axit cho đến pH = 3.0.

Trong quá trình thủy phân, enzyme β-amylase đóng vai trò quan trọng trong giai đoạn đường hóa, sản xuất ra hỗn hợp oligosaccharide mạch ngắn Enzyme này cắt đứt các liên kết α-1,4 glycosidic từ đầu không khử của amylose và amylopectin, dẫn đến sự gia tăng hàm lượng maltose theo thời gian Sau 24 giờ đường hóa với β-amylase từ đại mạch, maltose chiếm khoảng 45% tổng hàm lượng đường trong hỗn hợp phản ứng Cuối cùng, để kết thúc quá trình đường hóa, enzyme được bất hoạt bằng cách đun ở nhiệt độ 95°C trong 10 phút.

Hình 1.2: Quy trình sản xuất IMO thông thường từ tinh bột

Dịch sau quá trình đường hóa tiếp tục được thêm enzyme transglucosidase ở nhiệt độ khoảng 50 – 60 o C, thời gian phản ứng khoảng 12 – 48 giờ

Transglucosidase là enzyme có khả năng thủy phân liên kết α-1,4 và α-1,6 glycosidic, đồng thời tạo liên kết α-1,6 glycosidic trên oligosaccharide IMO được hình thành thông qua việc chuyển các đơn vị glucosyl từ vị trí α-1,4 sang α-1,6 glycosidic trong oligosaccharide Sản phẩm chính của quá trình này bao gồm isomaltose (IMO 2), isomaltotriose (IMO 3), isomaltotetraose (IMO 4) và một lượng đáng kể glucose tự do do sự giải phóng glucosyl vào nước.

Sản xuất IMO theo phương pháp thông thường trải qua ba giai đoạn, mỗi giai đoạn đều cần diệt enzyme và điều chỉnh thông số phản ứng Quá trình này kéo dài thời gian, tăng chi phí nâng nhiệt và gây lãng phí năng lượng khi làm nguội để chuyển sang giai đoạn tiếp theo Hơn nữa, sản phẩm tạo thành còn ức chế hoạt động của enzyme trong giai đoạn đó.

Nghiên cứu quy trình sản xuất enzyme IMO cho phép kết hợp các giai đoạn sản xuất, tạo điều kiện thuận lợi khi sản phẩm của enzyme này trở thành cơ chất cho enzyme khác Điều này giúp ngăn chặn sự ức chế hoạt động của enzyme do chính sản phẩm của nó tạo ra Nhờ vậy, năng lượng và thời gian được tiết kiệm hơn so với quy trình sản xuất không đồng thời.

1.2.2 Quy trình sản xuất IMO bằng đường hóa và gắn nhánh đồng thời

Thị trường IMO đang trên đà phát triển mạnh mẽ, với nhiều nghiên cứu được thực hiện ở các cấp độ học thuật, thử nghiệm và công nghiệp nhằm tìm kiếm quy trình sản xuất hiệu quả hơn Các nhà nghiên cứu đang khám phá khả năng hoạt động của các loại enzyme mới cùng với công nghệ sản xuất tiên tiến Việc kết hợp quá trình đường hóa và gắn nhánh để sản xuất IMO từ tinh bột sau dịch hóa đã cho thấy hiệu quả cao hơn so với quy trình ba bước truyền thống, từ đó nâng cao hiệu suất tạo thành IMO.

Giai đoạn dịch hóa trong sản xuất IMO thông qua quá trình đường hóa – gắn nhánh đồng thời được thực hiện bằng enzyme alpha amylase chịu nhiệt, với các enzyme có nguồn gốc từ Bacillus amyloliquefaciens và Bacillus licheniformis Kết thúc quá trình thủy phân có thể được xác định bằng các chỉ số đơn giản như DE và DP trung bình của dịch thủy phân, và enzyme alpha amylase sẽ bị diệt bằng axit khi pH đạt 3.0.

Giai đoạn đường hóa – gắn nhánh đồng thời:

Khác với quy trình sản xuất IMO truyền thống với ba giai đoạn riêng biệt là dịch hóa, đường hóa và gắn nhánh, việc kết hợp hai giai đoạn đường hóa và gắn nhánh giúp tiết kiệm thời gian và năng lượng Các enzyme thường được sử dụng trong quy trình này bao gồm β-amylase từ đại mạch, pullulanase từ Bacillus licheniformis và transglucosidase từ A niger.

Nghiên cứu của Niu và cộng sự [34] cho thấy, sau 13 giờ đường hóa và gắn nhánh đồng thời, hiệu suất IMO đạt 49.09%, cho thấy sự cải thiện đáng kể so với quy trình sản xuất thương mại hiện tại chỉ đạt 39–41% [34].

Nghiên cứu này tập trung vào hiệu quả của quá trình đường hóa gắn nhánh đồng thời, được thể hiện qua phân tích sắc ký bản mỏng (TLC).

Hình 1.3: Quy trình sản xuất IMO bằng đường hóa và gắn nhánh đồng thời trong nghiên cứu của Niu và cộng sự [34]

Khi enzyme β-amylase hoạt động độc lập, hàm lượng maltose và maltotriose tăng nhanh trong khoảng thời gian 1-3 giờ Tuy nhiên, khi kết hợp ba enzyme β-amylase, pullulanase và transglucosidase trong cùng khoảng thời gian này, hàm lượng maltose và maltotriose lại duy trì ở mức thấp và giảm dần Điều này chứng tỏ transglucosidase hoạt động hiệu quả trên sản phẩm do β-amylase và pullulanase tạo ra, dẫn đến sự hình thành đáng kể của các sản phẩm IMO2 và IMO3.

Sản xuất IMO bằng phương pháp đường hóa và gắn nhánh đồng thời là một cải tiến quan trọng, giúp nâng cao hiệu suất tạo thành IMO và đa dạng hóa cấu trúc thành phần.

Hình 1.4: Thành phần đường trong dịch sau đường hóa và sau đường hóa - gắn nhánh đồng thời

Trong nghiên cứu này, cột 1 trình bày các chuẩn đường, trong khi cột 2, 3 và 4 ghi nhận thời gian thủy phân tinh bột sau quá trình dịch hóa bằng enzyme β-amylase trong khoảng thời gian 1h, 3h và 6h Cột 5 đến cột 10 mô tả thời gian đường hóa và gắn nhánh đồng thời, kéo dài từ 1h đến 36h.

Trang | 11 hỗn hợp IMO sản phẩm, giảm giá thành sản xuất nhờ tiết kiệm thời gian, năng lượng đồng thời cho hiệu suất tạo thành IMO cao hơn

1.2.3 Nguyên liệu trong sản xuất IMO

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

V ẬT LIỆU NGHIÊN CỨU

Giống khoai lang Hoàng Long được trồng tại xã Tự Lạn, Việt Yên, Bắc Giang, đã được chuyển giao từ Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển cây có củ HTX Thương mại & Dịch vụ Nông nghiệp Công nghệ cao là đơn vị phát triển giống khoai này Tinh bột từ củ khoai lang được tách ra ngay trong ngày thu hoạch tại Phòng thí nghiệm 209, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Đại học Bách Khoa Hà Nội.

• Chế phẩm enzyme α-amylase (EC 3.2.1.1): Spezyme Alpha, Spezyme Xtra của hãng DuPont, Hoa Kỳ; Liquozyme SC DS và Termamyl SC DS của Novozyme

• Chế phẩm enzyme Transglucosidase (EC 3.2.1.20) (Aspergillus niger) từ hãng Megazyme

• Chế phẩm enzyme β-amylase (EC 3.2.1.2) (Barley) từ hãng Megazyme

• Chế phẩm Pullulanase (EC 3.2.1.41) (Bacillus licheniformis) từ hãng Megazyme

Các chế phẩm enzyme dịch hóa cho thấy khả năng hoạt động tối ưu trong khoảng pH 5.0 – 7.0 và nhiệt độ từ 80 - 85 o C Riêng chế phẩm β-amylase, pullulanase và transglucosidase hoạt động hiệu quả nhất ở pH 4.0 – 6.0 và nhiệt độ từ 45 - 70 o C.

Bảng 2.1: Thông số chế phẩm enzyme

Nhiệt độ hoạt động ổn định (°C) hoạt pH động định ổn

Nhiệt độ tối ưu (°C) pH tối ưu

Liều lượng khuyến cáo (nếu có)

% (kg enzyme/ tinh bột tấn khô)

0.4 - 0.8 (kg enzyme/ tinh bột tấn khô)

0.013 – 0.025 (% khối lượng enzyme/ khối lượng tinh bột)

0.013 – 0.025 (% khối lượng enzyme/ khối lượng tinh bột)

(Barley) Đại mạch (Hordeum vulgare)

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Phương pháp xác định hàm lượng carbohydrate tổng số

Để xác định hàm lượng carbohydrate tổng số, theo phương pháp của Dubois và cộng sự (1956), cần cân chính xác 10 mg mẫu và thêm 0.2 ml etanol 80 độ cùng 1 ml DMSO 90% Sau đó, lắc đều và để yên 10 phút ở nhiệt độ phòng Tiếp theo, thêm 2 ml nước cất, đun sôi trong 15 phút, làm lạnh và thêm nước cất cho đủ 10 ml, tạo thành dung dịch B Cuối cùng, lấy 1 ml dung dịch B, thêm 1 ml phenol 5% và 5 ml dung dịch để tiến hành phân tích.

H 2 SO 4 đậm đặc, để 20 phút cho phản ứng Đo ABS ở bước sóng 490 nm

2.2.2 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme α-amylase

Hoạt độ chế phẩm enzyme α-amylase được xác định bằng phương pháp Ceralpha theo kit của hãng Megazyme Cơ chất là một oligosaccharide đã được xác định

Trong nghiên cứu này, "non-reducing-end blocked p-nitrophenyl maltoheptaoside" (BPNPG7) được thủy phân bởi enzyme α-amylase nội mạch trong sự có mặt của α-glucosidase chịu nhiệt Quá trình thủy phân này tạo ra p-nitrophenyl maltosacaride, sau đó α-glucosidase sẽ tiếp tục thủy phân để sản sinh glucose và p-nitrophenol tự do Sản phẩm p-nitrophenol là chất chỉ thị, tạo ra màu vàng trong dịch sau phản ứng, cho phép định lượng chính xác thông qua hệ số chuẩn.

Lấy 0.2 ml dung dịch cơ chất vào ống nghiệm và ổn nhiệt ở 40 trong 5 phút Đồng thời, dịch enzyme đã pha loãng được ổn nhiệt ở 40 trong 5 phút Thêm 0,2 ml dịch enzyme pha loãng vừa ủ vào đáy ống nghiệm chứa cơ chất Ổn nhiệt ở 40 trong 10 phút Sau 10 phút, thêm chính xác 3ml dung dịch dừng phản ứng và lắc đều Đo độ hấp phụ của dung dịch và mẫu kiểm chứng tại bước sóng 400nm Một đơn vị hoạt độ được định nghĩa là lượng enzyme, với sự có mặt của α-glucosidase chịu nhiệt dư, cần thiết để giải phóng một micromole p- nitrophenol từ BPNPG7 trong một phút tại 40 , được gọi là đơn vị Ceralpha (CU)

2.2.3 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme β – amylase

Để xác định hoạt độ enzyme β-amylase trong chế phẩm đã pha loãng, phương pháp Betamyl-3 theo kit của Megazyme được sử dụng Phân tích này sử dụng β-glucosidase và p-nitrophenyl-β-D-maltotrioside (PNPβ-G3) có độ tinh khiết cao, với lượng β-glucosidase được điều chỉnh để đảm bảo độ nhạy tối đa của xét nghiệm Khi β-amylase thủy phân PNPβ-G3 thành maltose và p-nitrophenyl-β-D-glucose, p-nitrophenyl-β-D-glucose sẽ bị β-glucosidase phân cắt thành D-glucose và p-nitrophenol (PNP) tự do Tốc độ giải phóng p-nitrophenol do đó liên quan trực tiếp đến tốc độ giải phóng maltose bởi β-amylase Phản ứng sẽ dừng lại khi dung dịch đệm Tris có pH cao được bổ sung, tạo ra màu phenolat.

Lấy 0.2 ml dịch enzyme pha loãng vào ống nghiệm và ổn nhiệt ở 40 o C trong 5 phút Đồng thời, cơ chất PNPβ-G3 cũng được ổn nhiệt ở 40 °C trong 5 phút Thêm 0.2 ml dung dịch cơ chất vào ống nghiệm chứa enzyme, lắc đều và ổn nhiệt ở 40 ° C trong 10 phút Sau 10 phút, thêm 3ml dung dịch dừng phản ứng và lắc đều Đo độ hấp phụ của dung dịch và mẫu kiểm chứng tại bước sóng 400nm đã trừ nước cất

Đơn vị hoạt động của enzyme β-amylase được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để giải phóng một micromole p-nitrophenol từ PNPβ-G3 trong một phút, theo các điều kiện thí nghiệm cụ thể Đơn vị này được gọi là đơn vị Betamyl-3.

2.2.4 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme Pullulanase

Khi ủ cơ chất Red-Pullulan từ Megazyme với pullulanase, quá trình phân cắt nội mạch diễn ra, tạo ra các phân tử màu trọng lượng thấp Những phân tử này vẫn tồn tại trong dung dịch ngay cả khi ethanol được thêm vào hỗn hợp phản ứng.

Phần phân tử có khối lượng phân tử cao được ly tâm để loại bỏ và đo màu phần dịch nổi tại bước sóng 510 nm Hoạt độ Pullulanase được xác định bằng cách so sánh với đường chuẩn Enzyme được ổn nhiệt ở 40 °C trong 5 phút, sau đó thêm 1,0 ml dung dịch enzyme đã ổn nhiệt vào 0,5 ml dung dịch Red Pullulan đã ổn nhiệt Hỗn hợp được lắc đều và ủ ở 40 °C trong 10 phút Phản ứng được kết thúc và cơ chất cao phân tử được kết tủa bằng cách thêm 2,5 ml etanol (95% v/v) và lắc mạnh trong 10 giây Các ống phản ứng được để ổn định ở nhiệt độ phòng trong 10 phút, sau đó ly tâm ở 1000 g trong 10 phút Dịch phía trên được đo tại bước sóng 510 nm.

Hoạt độ enzyme được xác định dựa vào đường cong chuẩn, trong đó mẫu trắng được tạo ra bằng cách trộn ethanol với cơ chất Red-Pullulan trước khi thêm enzyme.

2.2.5 Phương pháp xác định hoạt độ enzyme Transglucosidase

Xác định hoạt tính transglucosidase sử dụng maltose làm cơ chất [30]

Enzyme được ủ ở nhiệt độ 40 ◦C với dung dịch maltose 1% (w/w) trong dung dịch đệm natri acetate 0.5 mM (pH 4.0) trong 15 phút Phản ứng được dừng lại bằng cách đun hỗn hợp với nước sôi trong 10 phút, sau đó lượng glucose giải phóng được đo bằng bộ kit GOD-POD (Megazyme).

Một đơn vị hoạt động của enzym được định nghĩa là số lượng enzym tạo ra 1 mol glucose mỗi phút trong điều kiện nêu trên

2.2.6 Phương pháp loại bỏ đường glucose, maltose, maltotriose trong hỗn hợp IMO sản phẩm bằng nấm men Saccharomyces cerevisiae

Hỗn hợp IMO sản phẩm chứa các thành phần đường không mong muốn như glucose, maltose, maltotriose Sử dụng chủng nấm men lên men bia

Saccharomyces cerevisiae var diastaticus BE 134 (hãng Fermentis) để loại bỏ các đường này

Nấm men được hòa tan trong nước cất và hoạt hóa ở nhiệt độ 28°C trong 15 phút Sau đó, thêm vào hỗn hợp IMO để đạt mật độ tế bào S cerevisiae là 2.0 x 10^8 tế bào/ml Hỗn hợp này được giữ ổn định ở 28°C Mỗi 12 giờ, lấy 1 ml mẫu và gia nhiệt đến 95°C trong 10 phút để tiêu diệt nấm men, sau đó ly tâm mẫu.

10000 ×g trong 15 phút để loại bỏ tế bào nấm men, dịch phía trên tiến hành định tính thành phần đường bằng sắc ký bản mỏng TLC

Sau khi kết thúc quá trình lên men (khoảng 6 ngày), diệt nấm men ở 95 °C trong

Sau 10 phút, tế bào nấm men được loại bỏ bằng cách ly tâm ở tốc độ 10000 ×g trong 15 phút Cuối cùng, dịch được lọc qua màng lọc 0.22 µm Thành phần IMO được định lượng bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - RI.

2.2.7 Phương pháp định tính thành phần hỗn hợp đường bằng sắc kí bản mỏng (TLC) Định tính thành phần hỗn hợp IMO bằng sắc ký bản mỏng (TLC) được nhiều tác giả sử dụng trong các nghiên cứu [29], [35], [75] Các thử nghiệm được kiểm chứng để chọn ra hệ dung môi phù hợp nhất cho phân tích thành phần oligosaccharide trong hỗn hợp IMO thu được Hệ dung môi từ nghiên cứu của S Chiba và T Shimomura [76] được chọn cho phân tích này

Mẫu phản ứng (1 àl) và cỏc mẫu chuẩn glucose, maltose, maltotriose, Isomaltose (IMO2), Isomaltotriose (IMO3) được chấm lên bản sắc ký mỏng TLC Silica gel

Mẫu được chấm trên bản sắc ký 60 F 254 (20 cm × 20 cm; Merck KGaA, Đức) với khoảng cách 10 mm từ dưới lên và giữa các vết chấm cũng là 10 mm Sau mỗi lần chấm, các vết chấm được sấy khô để giữ kích thước từ 3 đến 4 mm Bản sắc ký được ngâm trong hỗn hợp dung môi n-butanol: isopropanol: nước (50: 25: 20 v/v/v) trong bình sắc ký, nơi dung môi và chất phân tích di chuyển lên trên nhờ lực mao quản Nguyên lý phân tách dựa vào lực tương tác giữa dung môi, các thành phần phân tích và bản mỏng.

Sau khi hoàn tất quá trình, bản sắc ký được làm khô trong không khí Để phân tích các thành phần, nhúng bản sắc ký vào dung dịch ethanol chứa 5g/l α-naphthol và 50 ml/l H2SO4 Sau đó, lấy bản mỏng ra, để khô trong không khí và sấy bằng không khí nóng ở 120°C trong 10 phút.

2.2.8 Phương pháp xác định hàm lượng thành phần oligosaccharides bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

B Ố TRÍ THÍ NGHIỆM

2.3.1 Lựa chọn chế phẩm Alpha amylase phù hợp cho quá trình dịch hóa

Lựa chọn chế phẩm alpha amylase phù hợp cho quá trình dịch hóa dựa trên thành phần oligosaccharide sau thủy phân từ các chế phẩm Spezyme Xtra, Liquozyme SC DS, Spezyme Alpha và Termamyl SC DS Thí nghiệm được thực hiện với nồng độ cơ chất 25% (theo khối lượng tinh bột khô), pH 5.8, nhiệt độ 80°C cho Spezyme Xtra và Liquozyme SC DS, 85°C cho Spezyme Alpha và Termamyl SC DS, thời gian phản ứng 30 phút và nồng độ enzyme alpha amylase 1CU/g Mỗi thí nghiệm được lặp lại hai lần để đảm bảo độ chính xác.

Cân 8.571g tinh bột khoai (độ ẩm 12.5%) vào ống fancol 50 ml, bổ sung dung dịch đệm natri acetate pH 5.8 vào ống fancol cho đến khi đạt khối lượng 30g (không bao gồm khối lượng ống fancol) Bổ sung enzyme alpha amylase từ các chế phẩm với nồng độ 1 CU/g cơ chất Thời gian nâng nhiệt là 25 phút Duy trì nhiệt độ phản ứng ở nhiệt độ 80°C (Spezyme Xtra và Liquozyme SC DS), 85°C (Spezyme Alpha và Termamyl SC DS) Sau 30 phút phản ứng, diệt enzyme ngay bằng axit lactic đặc đến pH 3.0

Sau khi tiến hành dịch hóa, hỗn hợp thu được sẽ được xử lý để xác định thành phần oligosaccharide bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC - RI và xác định hàm lượng tinh bột sót thông qua phương pháp xác định carbohydrate tổng số Dựa vào kết quả này, chúng ta sẽ lựa chọn chế phẩm enzyme phù hợp nhất với mục tiêu: đạt hàm lượng DP 1-10 (% w/w) và DP 2-6 (% w/w) lớn nhất, đồng thời giảm thiểu tinh bột sót.

2.3.2 Nghiên cứu các thông số của quá trình đường hóa và gắn nhánh đồng thời

Các thông số được lựa chọn dựa trên chỉ tiêu hàm lượng IMO234 thu được trong hỗn hợp sản phẩm Hàm lượng IMO234 (g/l) =IMO 2 (g/l) + IMO 3 (g/l) + IMO 4 (g/l)

Thông số được lựa chọn cho hàm lượng IMO234 là cao nhất mà vẫn đảm bảo được tính kinh tế

2.3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự tạo thành IMO bằng đường hóa - gắn nhánh đồng thời Để nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến sự tạo thành IMO bằng đường hóa - gắn nhánh đồng thời, tiến hành thay đổi pH tại 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0 Các thông số còn lại được cố định bao gồm nhiệt độ, nồng độ β-amylase, pullulanase, transglucosidase và thời gian phản ứng Lặp lại thí nghiệm 2 lần

Dịch thủy phân sau quá trình dịch hóa bằng chế phẩm Spezyme Xtra theo thông số mục 2.3.1 được điều chỉnh đến pH 4.0, 4.5, 5.0, 5.0, 6.0 bằng NaOH 5M Lấy

Trong quá trình xử lý, 3 ml dịch được cho vào ống fancol 15ml và ổn nhiệt ở 55°C, sau đó thêm enzyme beta amylase với nồng độ 3U/g, pullulanase 0.6 U/g và transglucosidase 15 U/g, để phản ứng diễn ra trong 12 giờ Sau khi kết thúc phản ứng, enzyme được diệt bằng cách đun sôi trong 10 phút Tiếp theo, đường đơn giản trong dịch sau đường hóa được loại bỏ bằng nấm men Saccharomyces cerevisiae var diastaticus BE 134 Thành phần IMO của dịch sau xử lý được xác định bằng hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – RI.

Chọn được pH= pHi khi cho hàm lượng IMO234 là cao nhất mà vẫn đảm bảo được tính kinh tế

2.3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo thành IMO bằng đường hóa - gắn nhánh đồng thời Để nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tạo thành IMO bằng đường hóa - gắn nhánh đồng thời, tiến hành thay đổi nhiệt độ tại 45, 50, 55, 60, 65, 70 °C Các thông số còn lại được cố định bao gồm pHi, nồng độ β-amylase, pullulanase, transglucosidase và thời gian phản ứng Lặp lại thí nghiệm 2 lần

Sau quá trình dịch hóa bằng chế phẩm Spezyme Xtra, dịch thủy phân được điều chỉnh đến pH đã chọn Lấy 3 ml dịch và cho vào ống fancol 15ml để ổn nhiệt ở các nhiệt độ khác nhau là 45, 50 và 55 độ C.

Nghiên cứu được thực hiện ở nhiệt độ 60, 65, và 70 °C với nồng độ enzyme beta amylase 3U/g, pullulanase 0.6 U/g, và transglucosidase 15 U/g trong thời gian phản ứng 12 giờ Sau khi phản ứng kết thúc, enzyme được diệt bằng cách đun sôi trong 10 phút Tiếp theo, đường đơn giản trong dịch sau đường hóa được loại bỏ bằng nấm men Saccharomyces cerevisiae var diastaticus BE 134 Thành phần IMO của dịch sau xử lý được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – RI.

Chọn được nhiệt độ = Ti (°C) khi cho hàm lượng IMO234 là cao nhất mà vẫn đảm bảo được tính kinh tế

2.3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ β-amylase đến sự tạo thành IMO bằng đường hóa - gắn nhánh đồng thời Để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ β-amylase đến sự tạo thành IMO bằng đường hóa - gắn nhánh đồng thời, tiến hành thay đổi nồng độ β-amylase là 1 U/g,

Trong thí nghiệm, các thông số chính được điều chỉnh là 2 U/g, 3 U/g, 4 U/g và 5 U/g, trong khi các yếu tố khác như pH, nhiệt độ phản ứng, nồng độ β-amylase, pullulanase, transglucosidase và thời gian phản ứng được giữ cố định Thí nghiệm được lặp lại hai lần để đảm bảo tính chính xác của kết quả.

Sau quá trình dịch hóa bằng chế phẩm Spezyme Xtra, dịch thủy phân được điều chỉnh pH theo thông số đã chọn Lấy 3 ml dịch cho vào ống fancol 15ml và ổn nhiệt ở nhiệt độ đã chỉ định, thêm pullulanase 0.6 U/g, transglucosidase 15 U/g, và β-amylase với các nồng độ khác nhau từ 1 U/g đến 5 U/g, trong thời gian 12 giờ Sau khi phản ứng kết thúc, enzyme được diệt bằng cách đun sôi trong 10 phút Cuối cùng, đường đơn giản trong dịch sau quá trình đường hóa được loại bỏ bằng nấm men.

Saccharomyces cerevisiae var diastaticus BE 134 được mô tả tại mục 2.2.7

Dịch sau xử lý được xác định thành phần IMO bằng hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – RI

Chọn được nồng độ β-amylase là βi (U/g) khi cho hàm lượng IMO234 là cao nhất mà vẫn đảm bảo được tính kinh tế

2.3.2.4 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Pullulanase đến sự tạo thành IMO bằng đường hóa - gắn nhánh đồng thời Để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ pullulanase đến sự tạo thành IMO bằng đường hóa - gắn nhánh đồng thời, tiến hành thay đổi nồng độ pullulanase là 0.2 U/g, 0.4 U/g, 0.6 U/g, 0.8 U/g, 1 U/g Các thông số còn lại được cố định bao gồm pH, nhiệt độ phản ứng, nồng độ β-amylase (U/g), pullulanase, transglucosidase và thời gian phản ứng Lặp lại thí nghiệm 2 lần

Sau quá trình dịch hóa bằng chế phẩm Spezyme Xtra, dịch thủy phân được thực hiện theo thông số đã điều chỉnh pH và nhiệt độ đã chọn Một mẫu 3 ml dịch được cho vào ống fancol 15ml để ổn định nhiệt độ, với nồng độ β-amylase và transglucosidase cụ thể Nồng độ pullulanase được điều chỉnh từ 0.2 đến 1 U/g, và thời gian phản ứng kéo dài trong 12 giờ Sau khi kết thúc phản ứng, enzyme được diệt bằng cách đun sôi trong 10 phút, sau đó đường đơn giản trong dịch được loại bỏ bằng cách sử dụng nấm men Saccharomyces cerevisiae var diastaticus BE.

134 được mô tả tại mục 2.2.7 Dịch sau xử lý được xác định thành phần IMO bằng hệ sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC – RI

Chọn được nồng độ pullulanase là Pi (U/g) khi cho hàm lượng IMO234 là cao nhất mà vẫn đảm bảo được tính kinh tế

2.3.2.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ Transglucosidase đến sự tạo thành IMO bằng đường hóa - gắn nhánh đồng thời Để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ transglucosidase đến sự tạo thành IMO bằng đường hóa - gắn nhánh đồng thời, tiến hành thay đổi nồng độ

Trang | 33 transglucosidase có các mức hoạt động 3 U/g, 5 U/g, 10 U/g, 15 U/g, 20 U/g, 25 U/g, và 30 U/g Các thông số khác như pH, nhiệt độ phản ứng T °C, nồng độ β-amylase (U/g), nồng độ pullulanase (U/g), và thời gian phản ứng được giữ cố định Thí nghiệm được lặp lại hai lần để đảm bảo độ chính xác.