TỔ NG QUAN
Gi ớ i thi ệ u chung v ề rong bi ể n
Rong biển là nhóm thực vật sống trong môi trường nước biển hoặc nước lợ
Giống như thực vật trên cạn, rong biển cũng chứa các sắc tố quang hợp và sử dụng ánh sáng mặt trời cùng với chất dinh dưỡng có trong nước biển để thực hiện quá trình quang hợp, từ đó tạo ra thức ăn.
Rong biển sinh sống chủ yếu ở khu vực ven biển và vùng cận triều, nơi có ánh sáng quang hợp chỉ đạt 0,01% Sự kết hợp của các yếu tố như sắc tố thực vật, ánh sáng, độ phơi sáng, độ sâu, nhiệt độ, thủy triều và đặc tính bờ tạo ra các môi trường khác nhau, quyết định sự phân bố và đa dạng của các loài rong biển.
Rong biển có hình dạng tương tự thực vật bậc cao nhưng cấu trúc và chức năng lại khác biệt Chúng không có rễ, thân hay lá thật; toàn bộ cây được gọi là tản, bao gồm holdfast, stipe và blade Holdfast giống như rễ nhưng chỉ có chức năng gắn chặt mà không hấp thụ dinh dưỡng, có thể có nhiều hình dạng khác nhau Stipe tương tự như thân cây, chủ yếu hỗ trợ blade trong quá trình quang hợp và hấp thụ dinh dưỡng từ nước biển Blade, giống lá, có nhiều hình dạng và chức năng chính là quang hợp và hấp thụ dinh dưỡng Điểm khác biệt lớn nhất giữa rong biển và thực vật bậc cao là cơ quan sinh dục và túi bào tử thường đơn bào, và nếu đa bào, giao tử và bào tử không được bao bọc trong lớp tế bào không sinh sản.
Rong biển chứa các thành phần hóa học quan trọng như carbohydrate, protein, khoáng chất và lipid Phân tích chất khô cho thấy hàm lượng protein trong rong lục dao động từ 6-26%, trong khi rong đỏ từ 3-29% Hàm lượng lipid của rong lục nằm trong khoảng 0,3-3,2% và rong đỏ từ 0,1-1,8% Ngoài ra, hàm lượng tro của rong lục có thể từ 12-31%, trong khi rong đỏ dao động từ 4-47%.
Rong biển được sử dụng rộng rãi trên toàn thế giới trong nhiều ngành công nghiệp, chủ yếu để bổ sung dinh dưỡng nhờ vào thành phần dồi dào các chất dinh dưỡng đa lượng như Na, Mg, K, vi lượng như I, Fe, Zn và vitamin B12, A, K Ngoài vai trò dinh dưỡng, rong biển còn được ứng dụng trong sản xuất thuốc, mỹ phẩm, thức ăn chăn nuôi và phân bón Hiện có khoảng 221 loài rong biển có giá trị thương mại cao, trong đó nổi bật là Saccharina japonica, Undaria pinnatifida và Sargassum fusiforme thuộc rong nâu, cùng với Porphyra spp., Eucheuma spp., Kappaphycus alvarezii và Gracilaria spp thuộc rong đỏ.
Enteromorpha clathrata, Monostroma nitidum và Caulerpa spp thuộc rong lục
Phân lo ạ i rong bi ể n
Rong biển được chia thành ba ngành chính theo sắc tố: rong nâu (Heterokontophyta), rong đỏ (Rhodophyta) và rong lục (Chlorophyta).
Khoảng 1.750 loài rong nâu, hay phaeophyte (Heterokontophyta), đã được biết đến [6] Những sinh vật này phổ biến ở vùng nước lạnh dọc theo bờ biển lục địa, loài nước ngọt rất hiếm Màu sắc của các loài thay đổi từ nâu sẫm đến xanh ô liu, tùy thuộc vào tỷ lệ sắc tố nâu (fucoxanthin) với sắc tố xanh (chlorophyll)
Rong nâu, với các bóng chứa đầy khí (pneumatocyst), giúp các bộ phận quang hợp nổi trên hoặc gần bề mặt nước Chúng có hình dạng và kích thước đa dạng, từ biểu mô sợi nhỏ như Ectocarpus đến tảo bẹ khổng lồ phức tạp, có thể dài từ 1 mét đến hơn 100 mét như Laminaria và Macrocystis.
Rong nâu, bao gồm các loại như Nerocystis và Rockweed, thường bám trên bờ đá ở vùng ôn đới hoặc trôi nổi tự do Chúng sinh sản bằng cả phương pháp vô tính và hữu tính, với động bào tử và giao tử có hai roi không đồng đều Rong nâu là nguồn cung cấp algin quan trọng, được sử dụng làm chất ổn định trong ngành công nghiệp thực phẩm như bánh và kem Ngoài ra, một số loài rong nâu cũng được sử dụng làm phân bón và thực phẩm, đặc biệt là ở Đông Á, với Laminaria là một ví dụ điển hình.
Hình 1.1 Hình ảnh về rong nâu: Sargassum ilicifolium và Sargassum polycystum
Rong đỏ, hay rhodophyte (Rhodophyta) thường được phát hiện bám trên các thực vật bờ biển khác Hơn 6.000 loài rong đỏkhác nhau đã được mô tả [6]
Hình thái của chúng đa dạng, bao gồm dạng sợi, phân nhánh, có lông và tản thành tấm Ở hầu hết các loài, sự kết nối chất nguyên sinh mỏng giữa các tế bào tạo ra sự liên tục Màu sắc của chúng, đỏ hoặc xanh, xuất phát từ việc che lấp chlorophyll bởi các sắc tố phycobilin như phycoerythrin và phycocyanin.
Cơ quan sinh sản của rong đỏ không di động, trong đó cơ quan sinh sản cái gọi là carpogonium, bao gồm một vùng đơn nhân như trứng và lông noãn bào để tiếp nhận giao tử đực Giao tử đực (spermatia) không di động được sản xuất đơn lẻ trong túi giao tử đực.
Một số loài rong đỏ được sử dụng làm thực phẩm nhờ khả năng giữ màu sắc và tính chất gelatin khi nấu Trong lĩnh vực công nghiệp, rêu Ailen cũng đóng vai trò quan trọng.
Chondrus được sử dụng như một chất thay thế gelatin trong các sản phẩm như bánh pudding, kem đánh răng và kem Ngoài ra, một số loài thuộc chi Corallina, cùng với san hô động vật, đóng vai trò quan trọng trong việc hình thành rạn san hô và đảo Agar, một chất tương tự gelatin, chủ yếu được chiết xuất từ các chi Gracilaria.
Gelidium, còn đóng vai trò làm môi trường nuôi cấy vi khuẩn và nấm [6]
Hình 1.2 Hình ảnh vềrong đỏ: Porphyra vietnamensis và Gelidium pusillum
Khoảng 1.200 loài rong lục (Chlorophyta) đã được mô tả [6] Các sắc tố quang hợp (chlorophylls a và b, carotene và xanthophyll) của rong lục có cùng tỷ lệ với các sắc tốở thực vật bậc cao hơn Tế bào rong lục điển hình có một không bào trung tâm, các sắc tố chứa trong các plastid có hình dạng khác nhau ở các loài khác nhau, và một thành tế bào cellulose và pectin hai lớp Thực phẩm được lưu trữ dưới dạng tinh bột trong pyrenoid (lõi protein trong lạp thể) Rong lục có kích thước và hình dạng khác nhau, bao gồm dạng đơn bào (Chlamydomonas,
Desmids), dạng cụm (Hydrodictyon, Volvox), dạng sợi (Spirogyra, Cladophora) và dạng ống (Actebularia, Caulerpa) Sinh sản hữu tính phổ biến hơn, với các
Hoàng Trúc Tâm - CA190106 13 là một loại giao tử có hai hoặc bốn lông roi Rong lục có khả năng sinh sản vô tính thông qua quá trình phân chia tế bào (Protococcus) hoặc sản xuất bào tử di động và không di động (Ulothrix).
Rong lục chủ yếu sống trong môi trường nước ngọt, thường bám vào đá hoặc gỗ ngập nước, cũng như nổi trên mặt nước tĩnh Các loài rong lục nhỏ bé này không chỉ cung cấp thức ăn mà còn tạo ra oxy cho các sinh vật dưới nước Hơn nữa, rong lục đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu tiến hóa thực vật, với ví dụ điển hình là Chlamydomonas đơn bào, được coi là hình thức tổ tiên của cây cối trên cạn.
Hình 1.3 Hình ảnh về rong lục: Enteromorpha clathrata và Enteromorpha intestinalis.
Ngu ồ n l ợ i rong bi ể n
Rong biển đã được sử dụng làm thực phẩm từ hơn 2500 năm trước, chủ yếu tại châu Á Hiện nay, Trung Quốc, Nhật Bản và Hàn Quốc là những quốc gia tiêu thụ rong biển lớn nhất, thường dùng để gói cơm, nấu canh, súp và salad Ngoài ra, rong biển cũng được tiêu thụ với lượng lớn ở châu Âu và Nam Mỹ.
Mỹ và Hoa Kỳ đang chứng kiến sự gia tăng tiêu thụ rong biển nhờ vào lợi ích sức khỏe nổi bật của nó Rong biển chứa nhiều iodine, calcium, copper, iron, vitamin C, vitamin B12, vitamin K và protein, giúp cải thiện sức khỏe tổng thể Các thành phần quan trọng như fucoidan và glutamate trong rong biển còn hỗ trợ chức năng não và tim mạch, góp phần vào sự phát triển bền vững của ngành công nghiệp này.
Nhiều loại rong đỏ và nâu được sử dụng để sản xuất ba loại hydrocolloid chính: agar, alginate và carrageenan Hydrocolloid là những chất không kết tinh với phân tử lớn, hòa tan trong nước, tạo ra dung dịch đặc (nhớt) Agar, alginate và carrageenan là các carbohydrate tan trong nước, giúp làm đặc dung dịch, tạo gel với độ cứng khác nhau và hình thành màng tan trong nước Chúng được sử dụng để ổn định các sản phẩm như kem, ngăn chặn sự hình thành tinh thể băng lớn, và trong các loại đồ ngọt như pudding, kẹo cao su và kẹo dẻo Carrageenan và alginate cũng đóng vai trò quan trọng trong ngành công nghiệp thực phẩm.
Hoàng Trúc Tâm - CA190106 14 là một loại dược phẩm được sử dụng làm chất kết dính, ổn định, giữ ẩm và tạo khuôn trong nha khoa Hiện nay, khoảng 1 triệu tấn rong biển ướt được thu hoạch và chiết xuất để sản xuất ba loại hydrocolloid này Tổng sản lượng hydrocolloid đạt khoảng 55.000 tấn, với giá trị lên đến 585 triệu USD.
Bột cám rong biển, một phụ gia dinh dưỡng cho thức ăn chăn nuôi, đã được sản xuất tại Na Uy từ thập niên 1960 Rong nâu được thu hái, sấy khô và xay nhỏ thành bột, với khoảng 50.000 tấn rong biển ướt được thu hoạch hàng năm, tạo ra 10.000 tấn bột cám rong biển có giá trị khoảng 5 triệu USD.
Việc sử dụng rong biển làm phân bón đã bắt đầu từ thế kỷ XIX, nhờ vào hàm lượng chất xơ cao giúp điều hòa đất và giữ ẩm, cùng với khoáng chất cung cấp các nguyên tố vi lượng cần thiết cho cây trồng Tuy nhiên, vào đầu thế kỷ XX, ngành công nghiệp này suy giảm do sự xuất hiện của phân bón tổng hợp hóa học Hiện nay, với xu hướng canh tác hữu cơ ngày càng phát triển, ngành công nghiệp phân bón từ rong biển đang dần hồi sinh, mặc dù quy mô vẫn còn hạn chế do chi phí sấy khô và vận chuyển cao.
Rong biển đã được nghiên cứu và ứng dụng thành công trong nông nghiệp, đặc biệt là dưới dạng phân bón hữu cơ lỏng Sản phẩm này có thể được sử dụng trực tiếp trên cây hoặc tưới quanh gốc, với khả năng pha loãng từ dạng cô đặc Năm 1991, khoảng 10.000 tấn rong biển tươi đã được chuyển đổi thành 1.000 tấn phân bón lỏng, mang lại giá trị 5 triệu USD Thị trường phân bón từ rong biển có thể đã tăng gấp đôi trong thập kỷ qua nhờ vào sự công nhận về tính hữu ích và xu hướng canh tác hữu cơ ngày càng phổ biến.
Các sản phẩm mỹ phẩm hiện nay thường chứa hydrocolloid chiết xuất từ rong biển như alginate hoặc carrageenan, giúp cải thiện khả năng giữ ẩm cho da Bột nhão rong biển, được chế biến bằng phương pháp nghiền lạnh hoặc nghiền đông, được sử dụng trong Thalassotherapy Phương pháp này bao gồm việc bôi bột nhão lên cơ thể và sưởi ấm bằng bức xạ hồng ngoại, kết hợp với thủy trị liệu bằng nước biển, mang lại hiệu quả giảm nhẹ cho bệnh thấp khớp và loãng xương.
Trong hai mươi năm qua, nhiều dự án lớn đã nghiên cứu ứng dụng rong biển làm nguồn nhiên liệu gián tiếp Ý tưởng là trồng một lượng lớn rong biển và lên men sinh khối này để tạo khí metan làm nhiên liệu Tuy nhiên, kết quả cho thấy cần nghiên cứu và phát triển thêm, vì đây là dự án dài hạn và chưa mang lại hiệu quả kinh tế ở thời điểm hiện tại.
Rong biển có khả năng ứng dụng hiệu quả trong xử lý nước thải, đặc biệt là trong việc hấp thụ các ion kim loại nặng như kẽm và cadmium từ nguồn nước ô nhiễm Sự sử dụng rong biển trong xử lý nước thải không chỉ giúp cải thiện chất lượng nước mà còn góp phần bảo vệ môi trường.
Hoàng Trúc Tâm - CA190106 15 cho biết rằng việc nuôi trồng thủy sản thường phát sinh lượng thải cao, gây ra vấn đề cho các sinh vật thủy sinh xung quanh Tuy nhiên, rong biển có khả năng hấp thụ phần lớn lượng thải này như một nguồn dinh dưỡng, vì vậy đã có nhiều thử nghiệm nuôi trồng rong biển ở các khu vực gần trại thủy sản.
Gi ớ i thi ệ u và phân lo ạ i rong l ụ c
Trên toàn cầu, ít nhất 40 loài rong lục thuộc tám họ đã được sử dụng để phân lập polysaccharide Trong số đó, các chi có số lượng loài lớn nhất có khả năng chiết polysaccharide là Ulva (38%), Enteromorpha (14%) và Monostroma.
(14%), Codium (16%) và Caulerpa (11%) Các chi khác, gồm Capsosiphon, Chaetomorpha, Bryopsis và Halimeda, chiếm 7% số lượng rong được báo cáo (Hình 1.4) [8]
B ảng 1.1 Đa dạng sinh học trong ba bậc phân loại (họ, chi, loài) của rong lục sử dụng làm nguyên liệu phân lập polysaccharide
Biểu đồ tỷ trọng rong lục cho thấy mức độ sử dụng của nó như nguyên liệu thô để điều chế polysaccharide, dựa trên dữ liệu được tính toán từ các tài liệu tham khảo hiện có.
Rong lục là nguồn nguyên liệu chính để phân lập polysaccharide, đặc biệt là các loài thuộc bộ Ulvales, bao gồm ba chi chính là Monostroma, Ulva và Enteromorpha, với sự phổ biến và sinh khối lớn.
Rong Ulva và Monostroma nổi bật với giá trị dinh dưỡng và lợi ích sức khỏe vượt trội, thường được trồng hoặc thu hái để làm thực phẩm Rong lục chi Codium cũng là một loại tảo biển có giá trị dinh dưỡng cao, góp phần vào chế độ ăn uống lành mạnh.
Caulerpa là một nhóm rong lục chứa polysaccharide, phân bố chủ yếu ở các vùng biển nhiệt đới như Địa Trung Hải, Úc và miền Nam California Những loài này có khả năng xâm lấn cao do khả năng phát triển mạnh mẽ trong môi trường nước ôn đới.
Gi ớ i thi ệ u chi Enteromorpha
1.5.1 Tên gọi và phân loại thực vật
Chi Enteromorpha thuộc họ Ulvaceae, bao gồm các loài rong lục có hình dạng tản phẳng hoặc hình ống Tế bào của chúng chứa một hoặc hai sắc tố bào và một pyrenoid đơn Chi này có khả năng sinh sản qua các thế hệ bào tử vô tính và tạo giao tử hữu tính.
Hoàng Trúc Tâm - CA190106 17 có đặc điểm hình thái học đồng nhất Chi Enteromorpha thuộc họ Ulvaceae, bao gồm các thành viên có hình dạng đơn sắc, có thể phân nhánh hoặc không, với cấu trúc rỗng và hình ống.
Cụ thểhơn, chi Enteromorpha thuộc:
1.5.2 Đặc điểm loài, phân bố, sử dụng
Chi rong này có hình ống trơn dài hoặc giống như ngón tay, mọc từ trung tâm của cây và gắn bởi một điểm bám duy nhất Các ống dài thường bị làm phẳng, uốn cong và mọc thành búi dày với bề mặt mềm mại, nhiều nhánh, trong khi không gian bên trong rỗng chứa chất dinh dưỡng và chất hữu cơ hòa tan Thuật ngữ Latin "enteromorpha" có nghĩa là hình ruột.
Chi Enteromorpha bao gồm nhiều loài, trong đó một số chỉ có thể nhận diện bằng kính hiển vi Các loài này có khả năng thay đổi để thích nghi với môi trường sống; chiều rộng ống rất đa dạng, có thể chỉ lớn hơn sợi tóc hoặc lên đến 2-5 cm Chiều dài của ống cũng biến đổi trong khoảng rộng, thể hiện sự đa dạng của chi này.
Hình 1.5 Một số loài Enteromorpha: A, E.intestinalis; B, E.plumosa; C,
E.clathrata; D, E.lingulata; E, E.flexuosa; F, E.linza var linza; G, E.lanza var bicornuta (ngọn); H, E.linza var bicornuta; I, E.compressa; J, E.tubulosa; K,
Chemical analysis indicates that Enteromorpha spp contains 9-14% protein, 2-3.6% ether, and 32-36% ash, along with omega-3 and omega-6 fatty acids at 10.4 and 10.9 g per 100 g of total fatty acids, respectively The protein in this seaweed has a high digestibility rate of 98%, while the presence of alkaloids, cyanogenic glycosides, saponins, and tannic acid is minimal.
Enteromorpha spp có một số thành phần có lợi, chẳng hạn như khoáng chất, protein, amino acid thiết yếu, acid béo thiết yếu và chất xơ
Chi Enteromorpha thường xuất hiện ở vùng gian triều, bờ biển, cửa sông và các công trình nhân tạo trên toàn cầu Chúng bám chặt vào các bề mặt cứng như đá, đá cuội và vỏ sò Phân bố chủ yếu ở vùng nước ấm của Ấn Độ Dương - Tây Thái Bình Dương, Enteromorpha có mặt ở nhiều quốc gia như Philippines và Malaysia.
Rong biển Enteromorpha phân bố rộng rãi tại Việt Nam, đặc biệt ở các trang trại nuôi tôm lớn và các khu vực nước lợ của đồng bằng sông Cửu Long Các khu vực như Indonesia, Guam, Borneo, Australia, Micronesia, Marianas, Nhật Bản, và Hawaii cũng góp phần vào sự đa dạng sinh học của rong biển trong khu vực.
Enteromorpha spp là loại rong biển xuất hiện gần như suốt năm, thường tạo ra cảnh quan khó chịu và mùi hôi khi bị phân hủy bởi vi sinh vật Sự hiện diện của chúng gây tốn kém cho công tác dọn dẹp bãi biển.
Chi rong lục Enteromorpha có tiềm năng thương mại lớn nhờ vào thành phần hóa học phong phú và chất lượng dinh dưỡng cao Tại các quốc gia như Trung Quốc, Nhật Bản, Mỹ, Pháp và Chile, loại rong này được thu hoạch để sản xuất aonori, một nguyên liệu quan trọng trong nhiều món ăn như salad, súp, bánh quy, gia vị và món chính.
Các loài Enteromorpha được sử dụng rộng rãi như nguồn dược phẩm và thực phẩm chăm sóc sức khỏe, cung cấp vitamin, protein, carbohydrate, khoáng chất vi lượng và hợp chất hoạt tính sinh học, đặc biệt là sulfate polysaccharide phong phú Chúng chứa 9 trong 10 amino acid thiết yếu và hemicellulose, giúp cải thiện tiêu hóa, tăng cường đào thải và sản xuất mật để tiêu hóa acid béo Với mức năng lượng thấp và ít tác nhân kháng dinh dưỡng, chúng hỗ trợ sự phát triển vi sinh vật tích cực trong cơ thể.
Enteromorpha spp làm thức ăncho người [12]
Chúng là nguồn tocopherol, thức ăn chăn nuôi và phân bón, đồng thời có khả năng chịu đựng kim loại nặng, nên thường được sử dụng làm chỉ thị độ ô nhiễm Thành tế bào của chúng rất giàu sulfate polysaccharide, góp phần tạo ra các chất trao đổi ion mạnh.
Polysaccharide chi ế t xu ấ t t ừ rong bi ể n
Polysaccharide chiết xuất từ rong biển, bao gồm alginate, agar, agarose và carrageenan, đang thu hút sự quan tâm lớn từ các nhà nghiên cứu và nhà đầu tư, góp phần mở rộng ngành công nghiệp toàn cầu, đặc biệt trong lĩnh vực chế biến thực phẩm.
Hình 1.6 Các quốc gia sản xuất rong biển (theo FAO, 2017)
Giá trị thương mại của rong biển đang gia tăng nhờ vào nghiên cứu sâu về các thành phần hóa học có lợi như alginate, carrageenan và agar Các polysaccharide từ rong biển được ứng dụng rộng rãi trong ngành thực phẩm và các ngành công nghiệp khác, tạo ra doanh thu hàng triệu đô la Quy trình chính bao gồm trồng trọt, chế biến, thu hái, và chiết xuất polysaccharide Các ứng dụng hiện đại như alginate và carrageenan trong kỹ thuật mô và hệ thống dẫn truyền thuốc hứa hẹn sẽ nâng cao giá trị thương mại của polysaccharide rong biển.
Polysaccharide là các phân tử carbohydrate có khối lượng phân tử lớn chứa nhiều đơn vị monosaccharide Hầu hết các polysaccharide có nhiều hơn giới hạn
Oligosaccharide bao gồm 20 đơn vị, trong khi số đơn vị monosaccharide trong polysaccharide được gọi là mức độ trùng hợp (degree of polymerization - DP), và mức độ này thay đổi tùy theo loại polysaccharide Chỉ một số ít polysaccharide tự nhiên có DP dưới 100, trong khi hầu hết nằm trong khoảng từ 200 đến 3000 Thuật ngữ khoa học chung cho polysaccharide là glycan, xuất phát từ "glyc-" có nghĩa là đường và "-an" chỉ polymer.
Các đơn vị monosaccharide trong polysaccharide được kết nối với nhau thông qua các liên kết glycoside theo kiểu đầu-đuôi Tương tự như oligosaccharide, các phân tử polysaccharide có thể có cấu trúc thẳng hoặc phân nhánh.
Hình 1.7 Một sốđơn vị monomer có mặt trong polysaccharide ở thực phẩm: (a) α- và β- D -Galactopyranosyl; (b) 3,6-anhydro α- D -Galactopyranosyl; (c) α- D -Galactopyranosyluronic acid; (d) β- D -Glucopyranosyluronic acid
Nếu tất cả các đơn vị glycosyl trong polysaccharide đều là cùng loại đường, nó được gọi là homoglycan Các homoglycan có thể có cấu trúc thẳng hoặc phân nhánh Một ví dụ điển hình của homoglycan là cellulose, được cấu tạo chỉ từ các đơn vị D-glucopyranosyl.
Polysaccharide được phân loại là heteroglycan khi chứa hai hoặc nhiều đơn vị monosaccharide khác nhau Trong polysaccharide thực vật, nếu có ba hoặc nhiều loại đơn vị monosaccharide, polymer thường có cấu trúc phân nhánh Trong cấu trúc này, sự sắp xếp đơn vị glycosyl vẫn đơn giản, với một loại tạo thành chuỗi chính và các đơn vị khác nằm trong các nhánh ngắn hoặc trộn lẫn trong các nhánh ngắn khác nhau.
Triheteroglycan từ vi khuẩn như xanthan và gellan thường có cấu trúc mạch thẳng Đến nay, chưa phát hiện glycan nào trong thực phẩm chứa hơn bảy loại đơn vị đường cơ bản.
Glycan mạch thẳng là polysaccharide phổ biến nhất trong tự nhiên, chủ yếu do cellulose là thành phần cấu trúc chính của thành tế bào thực vật bậc cao Mặc dù vậy, polysaccharide phân nhánh lại có số lượng lớn hơn, với nhiều kiểu phân nhánh và đa dạng loại đường trong cấu trúc.
Polysaccharide xuất phát từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm tự nhiên như rừng và đại dương, cũng như nhân tạo qua nuôi trồng, lên men và biến đổi hóa học Hơn 90% khối lượng carbohydrate trên trái đất tồn tại dưới dạng polysaccharide, và chúng cũng chiếm hơn 80% trọng lượng khô của thực vật Vai trò của polysaccharide rất quan trọng trong các sinh vật sống, không chỉ là thành phần cấu trúc của thành tế bào thực vật mà còn là vật liệu dự trữ cho động và thực vật.
Quá trình điều chế polysaccharide, cho dù là trong phòng thí nghiệm hay sản xuất thương mại, bắt đầu bằng việc phân lập từ nguyên liệu, như polysaccharide thực vật, hoặc từ môi trường nuôi cấy lên men.
Hoàng Trúc Tâm - CA190106 22 polysaccharide vi khuẩn) Trong phòng thí nghiệm, người ta thường loại bỏ các chất gây nhiễu nhưlipid và lignin trước khi tiến hành chiết
Việc phân lập polysaccharide thường sử dụng dung môi nước hoặc dung dịch kiềm Sau khi chiết xuất từ môi trường lên men, quá trình tinh chế được thực hiện để tách polysaccharide mong muốn khỏi các chất không phải carbohydrate như protein Phương pháp tinh chế chủ yếu là kết tinh, có thể là kết tinh phân đoạn, thường sử dụng alcohol tan trong nước như ethanol hoặc 2-propanol Sự kết tinh có thể bị ảnh hưởng bởi tác nhân tạo phức hoặc thay đổi pH Trong phòng thí nghiệm, kỹ thuật sắc ký rây phân tử và trao đổi ion cũng được áp dụng để thu được sản phẩm mong muốn.
Các tính chất vật lý của polysaccharide chủ yếu phụ thuộc vào hình dạng phân tử và cấu trúc hóa học, bao gồm bản chất các đơn vị monomer, cách sắp xếp và kết nối giữa chúng, cũng như sự phân nhánh Môi trường xung quanh, như độ ẩm, pH, nhiệt độ, và nồng độ muối hay các chất hòa tan khác, cũng ảnh hưởng đáng kể đến cấu trúc của polysaccharide Quá trình xử lý, đặc biệt là đun nóng và tác động cơ học, có thể làm thay đổi hình dạng và liên kết liên phân tử của polysaccharide Sau khi đun nóng trong nước, các polymer thường trở nên vô định hình và kém bền Lượng nước và nhiệt độ là yếu tố quyết định độ linh động của polymer, các pha hiện diện, và các đặc tính của sản phẩm như kết cấu và độ ổn định.
Dung dịch polysaccharide có thành phần phức tạp do cấu trúc đa phân tử và đa phân tán, cùng với sự đa dạng hình dạng của các phân tử polysaccharide khi tương tác với nước và các phân tử khác Động lực học của dung dịch này cũng phức tạp, vì các mảnh trong chuỗi polysaccharide có mức độ chuyển động khác nhau trong vùng dung dịch, dẫn đến sự hình thành kết tinh và cấu trúc vô định hình.
1.6.2 Polysaccharide chiết xuất từ rong lục chi Enteromorpha
Ulvan là một trong những sulfate polysaccharide chính chiết xuất từ thành tế bào của rong lục thuộc bộ Ulvales, chủ yếu là hai chi Ulva và Enteromorpha
Nghiên cứu gần đây cho thấy ulvan là polysaccharide với nhiều đặc tính quý báu như khả năng chống oxy hóa, chống đông máu, điều hòa miễn dịch và giảm lipid máu Những đặc điểm này khiến ulvan trở thành một ứng viên tiềm năng trong các lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm và mỹ phẩm.
Ulvan có thể chiếm từ 8-29% trọng lượng khô của rong lục, tùy thuộc vào loài, mùa vụ, địa điểm thu hái và các yếu tố như điều kiện sinh trưởng, quy trình xử lý và chiết tách Điều này cho phép lựa chọn các điều kiện tối ưu để thu được ulvan với thành phần hóa học và đặc tính cao phân tử đáp ứng yêu cầu, đồng thời mang lại hiệu quả kinh tế cao.
Tình hình nghiên c ứ u trong và ngo ài nướ c
Chi rong lục Enteromorpha tại Việt Nam đã được nghiên cứu về trữ lượng, thành phần và điều kiện sinh thái bởi nhóm khoa Thủy sản, Đại học Cần Thơ Thành phần sinh hóa của rong cho thấy carbohydrate chiếm tỷ lệ cao nhất (37,64-52,29%), tiếp theo là tro (28,08-47,53%), protein (7,93-16,83%), xơ (2,69-6,19%) và lipid thấp nhất (0,71-2,90%) Tuy nhiên, hiện chưa có công bố nào về quy trình chiết tách, thành phần, cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của polysaccharide từ các loài Enteromorpha trong nước.
Một số kết quả về thành phần, cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của các loài rong lục chi Enteromorpha được tóm tắt trong bảng 1.2
B ảng 1.2 Thành phần, cấu trúc và hoạt tính của polysaccharide từ một số loài rong chi Enteromorpha đã nghiên cứu
Loài Tên Thành phần/cấu trúc đường Thành phần rong Hoạt tính TLTK
Carbohydrate (57,6-62,5%), sulfate (14,5-18,8%), uronic acid (13,8-16,6%); protein (1,0-11,3%)
PEP Rha:Glc:Gal:Xyl:Ara =
LEP Rha:Glc:Gal:Xyl:Ara =
EPF2 Rha:Xyl:Man:Gal:Glu =
Carbohydrate 53,2%, protein 11,5%, sulfate 18,6%, uronic acid 12,4%
ACP Rha:GlcA:Glc:Xyl =
D-GlcUAp-α-(1→4)-3- sulfate-l-Rhap-β-(1→4)-D- Xylp-β-(1→4)-3-sulfate-l-
DAEB Rha:Xyl:Gal:Glu =
5.36:1.00:0.57:0.64 (1→4)- β -l-Rha và (1→4)-Xyl với nhóm sulfate ở C-3 rhamnose
Chống ung thư, kích thích miễn dịch
WE-11 Rha:Xyl = 0.71:0.29 Chống oxy hóa
WE-21 Man:GlcA = 0.75:0.25 Carbohydrate 48,54%, sulfate 16,03%
WE-41 Rha:GlcA:Glc:Xyl:Ara
WEB Rha:Xyl:Gal:GlcA =
Sulfate 19.98%, tổng hàm lượng đường 80,99% Chống ung thư, kích thích miễn dịch
Sulfate 6,25% Kích thích miễn dịch [39]
Sulfate 24,5%, protein 0% Kích thích mi ễ n d ị ch
WE Rha:Xyl:Gal:Glc =
8% protein và nhiều amino acid
E clathrata FEP Ara:Rha:Gal:Glc =
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U
Đối tượ ng nghiên c ứ u
Luận văn nghiên cứu polysaccharide chiết xuất từ hai loài rong lục Enteromorpha intestinalis và Enteromorpha torta thuộc họ Ulvaceae, do chúng có hàm lượng polysaccharide cao và nguồn thu hái phong phú.
Hình 2.1 Đặc điểm hình thái của 2 mẫu rong Enteromorpha intestinalis và
Vào tháng 3 năm 2018, các mẫu rong nghiên cứu đã được thu hái tại vùng biển Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa Các mẫu này được định danh bởi TS Võ Thành Trung và hiện được lưu giữ tại Trung tâm các phương pháp phổ ứng dụng thuộc Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Hóa ch ấ t và thi ế t b ị
Nước cất (H2O), cồn 96 o (C2H5OH), methanol (CH3OH), chloroform (CHCl3), n-butanol (n-BuOH), acid hydrochloric (HCl), cetavlon… dạng tinh khiết phân tích
• Dụng cụ: Cốc thủy tinh 2L, bình cầu 2L, con từ, sinh hàn, hệ thống giá đỡ, xoong nhôm, bình ổn nhiệt, phễu sứ, bình tam giác,
• Bếp khuấy từ gia nhiệt String hotplate
• Máy li tâm đa năng EBA21
• Máy hút chân không RV3 loại 24kg
• Thiết bị phổ hồng ngoại FT-IR Affinity-1S Shimadzu
• Thiết bị phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance III 500 MHz.
Phương pháp chiế t
2.3.1 Cơ sở của phương pháp chiết
Chiết là phương pháp dùng một hoặc hỗn hợp dung môi để tách lấy một hoặc một nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu
Phương pháp này dựa trên sự phân bố (hay hòa tan) khác nhau của chất phân tích trong các pha (dung môi) không trộn lẫn
Để chiết xuất hợp chất từ cây cỏ, việc chọn dung môi phù hợp là rất quan trọng và phụ thuộc vào đặc tính của chất cần cô lập Dung môi nên có tính trung tính, không độc hại, không dễ cháy và có khả năng hòa tan chất cần khảo sát; sau khi hoàn tất quá trình chiết tách, dung môi này cũng phải dễ dàng loại bỏ.
Polysaccharide thường được chiết xuất bằng nước nóng do tính hòa tan cao của chúng trong môi trường này Phương pháp chiết xuất này đảm bảo polysaccharide bền vững và ít bị phá hủy, với thời gian chiết từ 2 đến 6 giờ Nếu dung dịch chiết có độ nhớt thấp, bã có thể dễ dàng được lọc bỏ, trong khi đối với dung dịch có độ nhớt cao, quá trình ly tâm sẽ được áp dụng để tách bã.
Một số polysaccharide có tính acid hoặc có khối lượng phân tử cao thường khó hòa tan trong nước nóng Độ hòa tan của chúng trong dung dịch kiềm loãng thường cao hơn so với nước nóng, vì vậy dung dịch NaOH hoặc NaCO3 5% ~ 15% (w/w) thường được sử dụng để chiết thay cho nước nóng Thực tế, quy trình chiết polysaccharide thường bắt đầu bằng nước nóng, sau đó sử dụng dung dịch kiềm loãng để chiết các polysaccharide còn lại trong bã.
Phương pháp chiết bằng enzyme bắt đầu với việc phân tán nguyên liệu thô trong nước, sau đó thiết lập nhiệt độ và pH tối ưu cho enzyme Tiếp theo, một lượng enzyme nhất định được thêm vào và phản ứng diễn ra trong thời gian quy định Thực tế cho thấy, phương pháp kết hợp chiết bằng nước nóng và phân giải enzyme rất phổ biến, trong đó chiết bằng nước nóng diễn ra trước, sau đó là chiết bằng enzyme, giúp nâng cao hiệu suất thu polysaccharide.
Ngoài các phương pháp truyền thống, hiện nay còn có nhiều quy trình khác như chiết xuất hỗ trợ siêu âm và chiết xuất bằng vi sóng để thu được polysaccharide Những phương pháp này giúp tối ưu hóa hiệu quả chiết xuất và nâng cao chất lượng sản phẩm.
Hoàng Trúc Tâm - CA190106 34 môi khác như acid,dimethyl sulfoxide Nhược điểm của chúng là chi phí cao và khó sử dụng ở quy mô lớn [42].
Phương pháp xác đị nh c ấ u trúc
2.4.1 Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC)
GPC (Gel Permeation Chromatography) là một kỹ thuật sắc ký dùng để phân tách các phân tử kích thước lớn dựa trên sự rửa giải của chúng trên cột sắc ký Kỹ thuật này hoạt động bằng cách giữ lại các phân tử nhỏ hơn trong các lỗ của hạt, trong khi các phân tử lớn hơn không thể vào các lỗ đó và do đó chảy qua cột nhanh hơn Điều này có nghĩa là các phân tử càng nhỏ thì thời gian lưu càng lớn.
GPC được sử dụng để nghiên cứu các chất phân tử lớn như polymer tổng hợp và polymer tự nhiên như polysaccharide Phương pháp này xác định các thông số cấu trúc quan trọng bao gồm khối lượng phân tử trung bình khối (Mw), khối lượng phân tử trung bình số (Mn), khối lượng phân tử trung bình Mz, và đặc trưng cơ bản nhất của polymer là sự phân bố khối lượng phân tử (Mw/Mn) Ngoài việc cung cấp thông tin về sự phân bố khối lượng phân tử, GPC còn tách một hợp chất phân tử lớn phức tạp thành các thành phần như polymer, oligomer, monomer và các chất phụ gia.
Sơ đồ khối tổng quát của thiết bị GPC như sau:
Thiết bị GPC được thực hiện trên máy HPLC Agilent 1100, sử dụng dung dịch NaNO3 0,1N làm pha động và cột Ultrahydrogel 500 (300 mm x 7.8 mm ID) làm pha tĩnh Tốc độ dòng chảy là 1 ml/phút, và đầu dò RID được sử dụng tại Trung tâm Phân tích - Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh.
Ghi và phân tích số liệu
2.4.2 Phương pháp phổ hồng ngoại (IR)
Phổ hồng ngoại (IR) là một kỹ thuật phân tích dựa trên sự dao động của các nguyên tử trong phân tử Kỹ thuật này thường được thực hiện bằng cách truyền bức xạ hồng ngoại qua mẫu vật và xác định phần bức xạ bị hấp thụ ở các mức năng lượng cụ thể Năng lượng tại đó xuất hiện các đỉnh trong phổ hấp thụ tương ứng với tần số dao động của các phần trong phân tử mẫu.
Phổ hồng ngoại là công cụ hữu ích trong việc phân tích các polysaccharide từ rong biển như alginate, fucoidan, laminaran, agar, carrageenan và alvan Phương pháp này còn cho phép xác định hàm lượng phenolic và khả năng kháng oxy hóa của một số hợp chất từ rong biển Tuy nhiên, mặc dù có hiệu quả trong việc xác định vị trí nhóm sulfate trong cấu trúc polysaccharide, phương pháp này vẫn có những hạn chế, như không xác định được dạng hỗn hợp monosaccharide, vị trí liên kết của vòng glycoside, cũng như sự khác biệt giữa hai đồng phân quang học D và L của các gốc đường.
Bảng 2.1 cho thông tin về các nhóm đặc trưng của phổ IR trong phân tích polysaccharide [45]
B ảng 2.1 Các peak xuất hiện trong phổ IR của các loài rong biển và liên kết tương ứng
Bước sóng (cm -1 ) Liên kết
2900-2920 C-H (liên hệhàm lượng đường tổng)
2845 O-CH3 (điểm uốn của dải ở 2920 ở các agar methylate hóa)
1640-1650 H2O và protein CO-NH / amide II của protein
S=O của ester-sulfate (liên hệhàm lượng sulfate tổng)
1180 P-O-C (phosphate hữu cơ thế trong alkane)
1040 C-O của ester-sulfate và hydroxyl
1037-1071 Dao động C-O đối xứng liên kết với một C-O-SO3 của heterofucan
970-975 Galactose: peak với iota carrageenan, cũng xuất hiện ở agar 930-940 C-O-C của 3,6-anhydrogalactose
905 C-O-SO4 tại C2 của 3,6-anhydrogalactose (điểm uốn)
890-900 Unsulfate β- D -galactose (hoặc với 6-0-methylgalactose / pyruvate); dải đặc trưng của agar
845-850 C-O-SO4 tại C4 của galactose / floridean starch
825-830 C-O-SO4 tại C2 của galactose (hẹp khi có xi-carrageenan)
790 Đặc trưng của dạng agar trong 2 nd derivative spectra
730-750 Dao động biến dạng C-S / C-O-C trong liên kết glycosidic của agar
717 Đặc trưng của agar-type trong 2 nd derivative spectra / dao động biến dạng C-O-C trong liên kết glycosidic của agar
Phổđặc trưng của ulvan thể hiện sự hấp thụ mạnh ở khoảng 1650, 1250 và
Trong phổ IR của ulvan, có sự xuất hiện của các dải hấp thụ quan trọng, bao gồm 1070 cm -1 và các đỉnh yếu ở 1400, 850 và 790 cm -1, được gán cho các nhóm carboxylate và sulfate ester Nhóm carboxylate thể hiện hai dao động, với dao động hóa trị bất đối xứng gần 1650 cm -1 và dao động hóa trị đối xứng yếu hơn gần 1400 cm -1 Sulfate ester có dao động chính ở khoảng 1250 cm -1 Các dao động ở 850 và 790 cm -1 thường liên quan đến vòng đường, trong khi vùng 1200-1000 cm -1 bị chồng chéo giữa dao động của vòng đường và các dao động hóa trị của nhóm biên (C-OH) cũng như liên kết glycosidic (C-O-C) Đặc biệt, tất cả các phổ IR của ulvan đều có dải hấp thụ cực đại ở khoảng 1055 cm -1, thường do dao động hóa trị của C-O từ hai đường chính là rhamnose và glucuronic acid, với phổ IR riêng của chúng cũng xuất hiện cực đại ở bước sóng này.
Phổ hồng ngoại được đo trên máy FT-IR Affinity-1S SHIMADZU tại Bộ môn Hóa vô cơ - Khoa Hóa học - Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Hà Nội
2.4.3 Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)
Tất cả các hạt nhân có số nguyên tử lẻ hoặc số khối lẻ đều mang momen lưỡng cực từ nội tại Khi được đặt trong từ trường, những hạt nhân này sẽ hấp thụ bức xạ điện từ trong vùng tần số vô tuyến Tần số cộng hưởng của chúng thay đổi theo môi trường hóa học, tạo ra tín hiệu đặc trưng cho từng hạt nhân trong phân tử.
Hoàng Trúc Tâm - CA190106 37 - NMR cho phép chúng ta quan sát các nguyên tử riêng lẻ trong phân tử, từ đó xác định cấu trúc của chúng Đồng vị chính của hydro, 1H, rất nhạy với NMR và 1H-NMR đã được sử dụng để làm sáng tỏ cấu trúc phân tử từ khi phổ kế NMR ra đời vào năm 1956 Đến những năm 1970, công nghệ NMR và điện toán đã tiến bộ, giúp phát hiện đồng vị carbon 13C, chiếm 1.1%, dễ dàng hơn 13C-NMR cho phép quan sát nhanh chóng và rõ ràng khung carbon của một phân tử, từ đó xác định cấu trúc của nó một cách trực tiếp, điều mà các kỹ thuật quang phổ khác không thể cung cấp, vì chúng chỉ xác nhận sự hiện diện của các nhóm chức nhất định trong phân tử như NO2, CO, CN.
Trong phổ H-NMR, tất cả proton của carbohydrate, bao gồm mono-, oligo- và polysaccharide, có độ dịch chuyển hóa học nằm trong khoảng 1-6 ppm Các proton anomeric của mỗi monosaccharide có độ dịch chuyển hóa học phụ thuộc vào cấu hình α- hoặc β- Cụ thể, hầu hết proton của α-anomeric xuất hiện trong vùng 5-6 ppm, trong khi proton β-anomeric xuất hiện ở vùng 4-5 ppm.
Mặc dù phổ 13C-NMR có tín hiệu yếu hơn so với phổ 1H-NMR, nhưng nó lại mang nhiều lợi thế trong việc phân tích cấu trúc polysaccharide Điều này là do các tín hiệu trong phổ 13C-NMR có độ dịch chuyển hóa học rộng hơn (0-220 ppm) so với phổ 1H-NMR, giúp giảm thiểu sự chồng lấp tín hiệu Các tín hiệu của C-anomeric trong phổ 13C-NMR thường xuất hiện trong vùng từ 90-100 ppm, trong khi các tín hiệu của C-nonanomeric nằm trong vùng từ 60-80 ppm.
Mẫu nghiên cứu được hòa tan trong dung môi D2O và đo phổ NMR ở nhiệt độ 70ºC với chế độ đo khử tín hiệu của nước, sử dụng máy Bruker AVANCE III 500MHz tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam DSS (acid 4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic) được sử dụng làm chất chuẩn nội.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều ^13C và ^1H của polysaccharide thường có độ phân giải thấp, dẫn đến nhiều tín hiệu trùng lặp do sự tương đồng giữa các gốc đường trong phân tử Điều này gây khó khăn trong việc giải thích chi tiết cấu trúc của polysaccharide Tuy nhiên, việc sử dụng phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều như COSY, HSQC và HMBC sẽ giúp xác định thêm thông tin về các liên kết trong phân tử, thông qua các tương tác giữa proton với proton và giữa proton với carbon.
Phổ H-1H COSY (Correlation Spectroscopy) thể hiện mối tương quan giữa các proton H-1, chủ yếu là các proton gắn liền với các carbon liền kề Nhờ vào phổ này, các phân tử có thể được ghép nối với nhau một cách hiệu quả.
Phổ l HSQC l (Heteronuclear l single l quantum l coherence l spectroscopy) l biểu ldiễn l mối l tương l quan l giữa l 1 H l và l 13 C l liên l kết l trực l tiếp l với l nhau
Phổ HMBC (Heteronuclear Multiple Bond Coherence Spectroscopy) thể hiện sự tương tác xa trong không gian phân tử, cung cấp thông tin về tương quan giữa hai hoặc bốn liên kết giữa proton và carbon Qua các tương tác trong phổ này, cấu trúc của từng phần và toàn bộ phân tử được xác định Tóm lại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều cung cấp thông tin cần thiết để xác định trình tự và vị trí của các liên kết trong phân tử polysaccharide thông qua các tương tác giữa proton với proton và proton với carbon trong các liên kết trực tiếp đồng hạt nhân hoặc các liên kết dị hạt nhân không trực tiếp.
