Đánh giá tác dụng chống oxy hóa và ức chế enzym xanthine oxidase in vitro của lá cây gai (boehmeria nivea l gaudich)

T Ổ NG QUAN

Tăng acid uric máu

1.1.1 Sinh tổng hợp và chuyển hóa acid uric

Acid uric là sản phẩm cuối cùng từ chuyển hóa purin ngoại sinh và nội sinh Chế độ ăn uống là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sản xuất acid uric Kinh nghiệm từ các cuộc chiến tranh thế giới đã cho thấy sự gia tăng bệnh gout, đặc biệt là ở Nhật Bản, nơi lượng protein trên đầu người đã tăng gấp đôi sau Thế chiến II Sản xuất acid uric chủ yếu diễn ra tại gan, ruột và các mô khác như cơ bắp, thận và nội mô mạch máu.

Acid uric ở người bình thường chủ yếu được bài tiết qua thận, chiếm 2/3 tổng lượng acid uric sản xuất hàng ngày Một tỷ lệ nhỏ nhưng đáng kể acid uric cũng được bài tiết qua dịch tiêu hóa vào ruột, trong khi chỉ dưới 1% tổng lượng acid uric được bài tiết qua mồ hôi.

Acid uric là một hợp chất hữu cơ dị vòng có công thức C5H4N4O3 (7,9- dihydro-1H-purine-2,6,8 (3H) -trione), trọng lượng phân tử 168 Dalton

Several enzymes are involved in the conversion of the purine nucleic acids adenine and guanine into uric acid, including deaminase, nucleotidase (NT), purine nucleoside phosphorylase (PNP), xanthine oxidase (XO), and hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase (HGPRT).

Hình 1 2: Quá trình hình thành acid uric trong cơ thể [33]

Tăng acid uric máu xảy ra khi nồng độ acid uric vượt quá giới hạn tối đa của độ hòa tan của urat trong dung dịch natri, như trong huyết tương, cụ thể là trên mức cho phép.

7,0 mg/dl (tức trên 420 mol/l) đối với nam giới và trên 6,0 mg/dl (360 mol/l) đối với nữ giới [5]

Tại Mỹ, tỷ lệ tăng acid uric máu (> 0,40 mmol/l hoặc 6,8 mg/dl) đạt 14,6% dân số, tương đương khoảng 32,5 triệu người, với sự phổ biến cao hơn ở nam giới (24,7%) so với nữ giới (5,2%) Ngoài ra, tình trạng này ít phổ biến hơn ở người Mỹ gốc Mexico so với người da trắng và người Mỹ gốc Phi.

▪ Tại Trung Quốc, tỷ lệ tăng acid uric máu chiếm 18,1% dân số, trong đó, 16,0% đối với nam giới và 19,4% đối với nữ giới Tỷ lệ tăng acid uric máu

5 của người Hán thấp hơn một chút so với các nhóm dân tộc khác (18,0% so với 19,5%) [41]

Nghiên cứu Yamagata (2016) tại Nhật Bản cho thấy nồng độ acid uric huyết thanh có mối liên hệ với tỷ lệ tử vong, với tỷ lệ tăng acid uric máu là 17,4% ở nam giới và 2,2% ở nữ giới.

Nghiên cứu tại Việt Nam cho thấy mối liên hệ giữa tăng acid uric máu và bệnh tiểu đường type 2, với nồng độ acid uric cao hơn ở những người bị rối loạn đường huyết lúc đói, rối loạn dung nạp glucose và tiểu đường so với nhóm có dung nạp glucose bình thường Không có sự khác biệt đáng kể về nồng độ acid uric giữa hai nhóm dung nạp glucose bình thường và kém Đặc biệt, nam giới có tỷ lệ tăng acid uric máu cao hơn nữ giới trong các nhóm này.

Tăng acid uric có sự khác biệt giữa các quốc gia và tộc người, cũng như giữa người khỏe mạnh và người có bệnh lý Đặc biệt, tỷ lệ tăng acid uric ở nam giới thường cao hơn so với nữ giới.

1.1.2.3 Nguyên nhân tăng acid uric máu

Nguyên nhân gây tăng aciduric máu là do tăng sản xuất acid uric, thận giảm bài tiết acid uric hoặc kết hợp cả hai nguyên nhân trên [42, 74]

Tăng tổng hợp acid uric dưới 5% có thể do nhiều nguyên nhân như khiếm khuyết enzym, hoạt động quá mức của phosphoribosilpyrophosphate synthetase, và giảm hoạt động của hypoxanthine phosphoribosiltransferase Ngoài ra, các bệnh như lưu trữ glycogen (loại I, III, V, VII), tình trạng bệnh dẫn đến sản xuất purine quá mức, rối loạn tủy, bệnh ác tính, tan máu, và bệnh vẩy nến cũng góp phần vào sự gia tăng này Thêm vào đó, các yếu tố như tăng dị hóa hoặc giảm tổng hợp ATP, nghiện rượu, thiếu oxy mô, tập thể dục cơ bắp quá mức, cũng như thói quen ăn uống và sử dụng thuốc có thể ảnh hưởng đến mức acid uric trong cơ thể.

B12, fructose, tiêu thụ purine quá mức

Giảm bài tiết acid uric ở thận (trên 95%) có thể do nhiều nguyên nhân, bao gồm khiếm khuyết di truyền của chức năng ống thận, các tình trạng bệnh lý như suy thận, mất nước, nhiễm toan, và bệnh cường cận giáp Ngoài ra, suy giáp, hội chứng Bartter, sản giật, cùng với các yếu tố liên quan đến thuốc và thói quen ăn uống như thuốc lợi tiểu, ethanol, pyrazinamid, lạm dụng thuốc nhuận tràng và salicylat (ở liều thấp) cũng góp phần làm giảm bài tiết acid uric.

Tăng tổng hợp và giảm đào thải acid uric bao gồm: nghiện rượu, thiếu men

Glucose-6-phosphatase, thiếu men Fructose-1-phosphate-aldolase

1.1.2.4 Hậu quảtăng acid uric máu

▪ Tăng acid uric máu và bệnh gout

Khi nồng độ acid uric trong máu vượt quá 7 mg/dl, urat sẽ kết tủa thành các vi tinh thể mono sodium urat, gây ra tổn thương tại nhiều vị trí khác nhau Các vi tinh thể này lắng đọng ở mô mềm, đặc biệt là tại gân, tạo thành hạt tophi Cơn gout cấp khởi phát khi các hạt tophi tại sụn khớp bị vỡ, dẫn đến sự lắng đọng vi tinh thể xung quanh khớp, trong màng hoạt dịch, mô sụn và mô xương, gây ra bệnh xương khớp mạn tính do gout Cuối cùng, viêm thận kẽ, hay bệnh thận do gout, xảy ra khi tinh thể urat lắng đọng tại tổ chức kẽ của thận.

▪ Tăng acid uric máu và các bệnh khác liên quan

Nghiên cứu dịch tễ học cho thấy rằng nồng độ acid uric máu cao có mối liên hệ với nhiều bệnh lý như đái tháo đường, rối loạn lipid máu, béo phì, tăng huyết áp, bệnh tim mạch và hội chứng chuyển hóa.

Như vậy, hạ acid uric máu là một mục tiêu điều trị trong bệnh gout và các bệnh lý khác liên quan đến tăng acid uric máu

1.1.3 Vai trò enzym xanthine oxidase trong quá trình tổng hợp acid uric

Vào năm 1902, Schardinger và các cộng sự đã phát hiện ra một chất chưa xác định trong sữa tươi nguyên chất, có khả năng làm mất màu xanh metylen khi thêm formaldehyd Gần 20 năm sau, chất này cũng được tìm thấy trong sữa bò.

Trong gan, thận, lá lách và phổi của chuột, có khả năng oxy hóa hypoxanthin thành xanthin và sau đó chuyển đổi xanthin thành urate trong cả điều kiện hiếu khí và kỵ khí Những phát hiện này đã thu hút sự chú ý đáng kể từ các nhà nghiên cứu enzym và sinh hóa, dẫn đến việc phân lập, tinh chế và nghiên cứu enzyme xanthin oxyoreductase (XOR).

Enzym XO được phát hiện trong nhiều loài động vật có vú, chim, bò sát và vi khuẩn Trong số các động vật có vú được nghiên cứu, enzym này có mặt ở gan, ruột, thận, phổi, cơ tim, não, huyết tương và hồng cầu Đặc biệt, gan và ruột là hai bộ phận có hoạt động XOR cao nhất.

Enzym xanthine oxidase

1.2.1 Cấu trúc, đặc điểm lý hóa

Xanthine oxidase là một protein có khối lượng khoảng 300 kDa, bao gồm 2 tiểu đơn vị Mỗi tiểu đơn vị chứa 4 trung tâm oxy hóa khử, bao gồm một phần phụ molybden (Mo-co), một FAD và hai trung tâm Fe 2 S 2 Phần phụ molybden bao gồm một dẫn xuất pterin hữu cơ liên kết cộng hóa trị với 2 nguyên tử lưu huỳnh của molybdopterin, 2 nguyên tử oxy và 1 nguyên tử lưu huỳnh khác.

Hình 1 3: Cấu trúc không gian xanthine oxidase

FAD (màu đỏ), Fe2S2 (màu cam), phần phụ molypden (màu vàng)

Enzym XO xúc tác quá trình hydroxyl hóa hypoxanthin thành xanthin và xanthin thành acid uric tại trung tâm Mo-co Ở trạng thái oxy hóa, proton từ nhóm

Mo-OH tấn công trung tâm ái nhân của cơ chất, dẫn đến việc chuyển hai electron từ Mo VI sang Mo IV trong Mo-co Quá trình vận chuyển electron diễn ra nhanh chóng qua hai trung tâm Fe/S, tạo ra Mo V Cuối cùng, Mo V được tái sinh bởi hydroxyd từ dung môi khi phản ứng kết thúc.

Hình 1 4: Cơ chế hoạt động của xanthine oxidase [20]

1.2.2 Các yếu tốảnh hưởng đến hoạt động của enzym xanthine oxidase

Khi nồng độ chất xanthin tăng, tốc độ phản ứng cũng tăng theo, dẫn đến việc sản xuất acid uric gia tăng Tuy nhiên, khi đạt đến một mức độ nhất định, tốc độ phản ứng sẽ không tăng thêm nữa do enzym đã bão hòa cơ chất.

Khi nồng độ enzym tăng, tốc độ phản ứng cũng sẽ tăng theo Tuy nhiên, khi nồng độ enzym đạt đến một mức nhất định, sự gia tăng sản phẩm sẽ tác động vào trung tâm dị lập thể của enzym, dẫn đến hiện tượng bão hòa và tốc độ phản ứng không còn tăng lên nữa.

Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến hoạt động của enzym, với việc tăng 10°C có thể làm tăng tốc độ phản ứng lên 2-3 lần Tuy nhiên, nhiệt độ quá cao có thể dẫn đến sự biến tính của enzym Để bảo quản enzym hiệu quả, nhiệt độ lý tưởng là từ 2-8°C.

10 pH: pH ảnh hưởng đến hoạt động của enzym Với XO, pH thích hợp từ 7,5- 8,0 [16]

1.2.3 Allopurinol và ức chế enzym xanthine oxidase

Allopurinol (1,5-dihydro-4H-pyrazolo [3,4-d] pyrimidin-4-one) được tổng hợp lần đầu bởi Falco vào giữa những năm 50 với mục tiêu phát triển các chất chống ung thư mới Tuy nhiên, nó đã được phát hiện có khả năng ức chế xanthine oxidase, giúp giảm nồng độ acid uric trong huyết thanh và nước tiểu Năm 1963, Rundles và cộng sự đã thực hiện thành công thử nghiệm lâm sàng đầu tiên về việc sử dụng allopurinol để điều trị bệnh gout, và thuốc được FDA phê duyệt vào năm 1966.

Cả allopurinol và oxypurinol đều ức chế enzym xanthine oxidase, giúp giảm sản xuất acid uric và hạ nồng độ acid uric trong máu Điều này không chỉ thúc đẩy quá trình thải trừ hypoxanthin và xanthin qua nước tiểu mà còn giảm nguy cơ hình thành sỏi thận và các cơn đau thận.

Allopurinol được sử dụng trong lâm sàng để điều trị bệnh gout và các trường hợp tăng acid uric thứ phát, chẳng hạn như do sử dụng thuốc chống ung thư hoặc thuốc lợi tiểu thiazid.

Sử dụng thuốc có thể gây ra các tác dụng không mong muốn như kích ứng tiêu hóa, độc gan và dị ứng da, đồng thời có thể dẫn đến cơn gout cấp trong giai đoạn đầu điều trị Để khắc phục tình trạng này, nên kết hợp thuốc với colchicin hoặc các loại thuốc chống viêm khác.

1.2.4 Phương pháp xác định hoạt độ của enzym xanthine oxidase in vitro

Các phương pháp xác định hoạt độ enzyme XO in vitro chủ yếu đo lường sản phẩm chuyển hóa từ hypoxanthine thành xanthine và từ xanthine thành axit uric, đồng thời cũng đánh giá sự sản xuất của các gốc superoxide, hydro peroxide hoặc NADH.

Phương pháp đo quang dựa trên định lượng acid uric

Phương pháp đo quang dựa trên lượng acid uric tạo thành từ quá trình oxy hóa xanthin dưới tác dụng xúc tác của XO theo phản ứng:

Lượng acid uric được xác định bằng phương pháp đo quang ở bước sóng 290 nm, lượng acid uric tạo thành tỷ lệ thuận với hoạt độ enzym [60]

Phương pháp này thường được dùng trong thử nghiệm in vitro do tính thuận tiện, nhạy đối với enzym tinh khiết

Phương pháp hóa phát quang phát hiện O 2- gây ra bởi XO

Luminol là một hợp chất phát quang hóa học, trong đó lucigenin (LDCL) là một chất phát quang phổ biến được sử dụng để phát hiện O2- trong môi trường in vitro, do hệ thống enzyme hoặc tế bào nguyên vẹn sản xuất.

Phương pháp xác định O 2 - bằng thử nghiệm Cytochrom c

Việc sản xuất O2 - có thể được phát hiện trong các tế bào nguyên vẹn nhờ dạng sắt có trong cytochrom c:

Các tếbào được ủ với Fe 3+ -Cyt c và độ hấp thụ là đo ở 550 nm [19]

1.3 Quá trình oxy hóa trong cơ thể và chất chống oxy hóa

Chất chống oxy hóa là những hợp chất có khả năng ngăn chặn quá trình oxy hóa do các chất khác gây ra Chúng đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ các thành phần tế bào trong cơ thể bằng cách trung hòa các gốc tự do, là sản phẩm tự nhiên của quá trình chuyển hóa tế bào, được hình thành khi oxy được chuyển hóa.

Gốc tự do là những phân tử có electron chưa ghép cặp, khiến chúng có khả năng phản ứng cao với protein, lipid, carbohydrate và DNA Chúng tấn công các phân tử ổn định xung quanh để “đánh cắp” electron, nhằm đạt được trạng thái bền vững Khi một phân tử bị tấn công mất electron, nó trở thành một gốc tự do mới, khởi động phản ứng dây chuyền và cuối cùng dẫn đến sự phá hủy tế bào.

Các gốc tự do bao gồm các dẫn xuất oxy (ROS) và nitơ (RNS), trong đó các phân tử oxy phản ứng đóng vai trò quan trọng trong nhiều quá trình sinh học.

Superoxide (O2-), hydroxyl (HO), hydroperoxyl (HO2), peroxyl (ROO), and alkoxyl (RO) are examples of free radicals, along with hydrogen peroxide (H2O2) The primary nitrogen species involved in reactions include nitric oxide (NO), peroxynitrite (ONOO), nitrogen dioxide (NO2), and dinitrogen trioxide (N2O3).

Cây lá gai (Boehmeria nivea L Gaudich)

Cây lá gai (Boehmeria nivea (L.) Gaudich), còn được biết đến với các tên gọi như Gai tuyết, Trữ ma, Tầm Ma, là một loài thực vật có hoa thuộc họ Urticaceae Loài cây này được trồng phổ biến ở nhiều quốc gia Đông Á, bao gồm Hàn Quốc và Ấn Độ.

Cây gai, xuất xứ từ Trung Quốc, hiện được trồng rải rác tại Việt Nam, đặc biệt ở các tỉnh miền Bắc, miền Trung và Trung Nam bộ Trong dân gian, lá gai đã được sử dụng từ lâu như một loại thuốc lợi tiểu và cầm máu, đồng thời được cho là có khả năng bảo vệ gan, chống oxy hóa và chống viêm.

Plantae Magnoliophyta Magnoliopsida Urticales Urticaceae Boehmeria

Gai tuyết, Trữ ma, Tầm ma, Co pán (Thái), Bẩu pán (Tày), Chiểu đủ

Cây nhỏ cao từ 1,5-2m, có gốc hoá gỗ và rễ dạng củ, hình trụ thường cong queo, màu vàng chứa nhiều nhựa gôm Cành cây màu nâu nhạt và có lông Lá lớn, mọc so le, hình trái xoan, dài từ 5-16 cm và rộng từ 9,5-14 cm, mép lá khía răng, mặt trên màu xanh, mặt dưới màu trắng bạc phủ lông mềm và mịn; lá kèm hình dải nhọn thường rụng, cuống lá màu đỏ Hoa cây đơn tính cùng gốc, hoa đực có 4 lá đài và 4 nhị, trong khi hoa cái có đài hợp chia làm 3 răng Quả bế mang đài tồn tại, mùa hoa từ tháng 5 đến tháng 8 và mùa quả từ tháng 8 đến tháng 11.

Hình 1 5: Cây lá gai (Boehmeria nivea L Gaudich)

Cây có nguồn gốc ở khu vực nhiệt đới châu Á, phân bốởcác nước Bhutan, Campuchia, Trung Quốc (Nam An Huy, Phúc Kiến, Nam Cam Túc, Quảng Đông,

Quảng Tây Quý Châu, Nam Hà Nam, Hải Nam, Hồ Bắc, Hồ Nam, Giang Tây,

Nam Thiên Tây, Tứ Xuyên, Vân Nam, Chiết Giang), Ấn Độ, Indonesia, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Nepal, Sikkim, Đài Loan, Thái Lan, Việt Nam [17, 34, 40, 65]

Cây mọc phổ biến ở Việt Nam, thường xuất hiện ở rìa rừng, bụi cây và những khu vực ẩm ướt ven suối, ven đường Ngoài ra, cây cũng được trồng ở một số tỉnh miền Bắc và khu vực miền Trung đến các tỉnh Trung Nam bộ.

Rễ củ-Radix Boehmeriae thường gọi là Trữ ma căn và lá-Folium Boehmeriae

Rễ có thể thu hái quanh năm, nhưng thời điểm tốt nhất là vào mùa hạ hoặc mùa thu Sau khi đào rễ, cần rửa sạch đất cát, loại bỏ rễ con, sau đó thái mỏng hoặc để nguyên và phơi hoặc sấy khô; cũng có thể sử dụng tươi Lá cũng có thể thu hái quanh năm.

Qualitative analysis of the extract from B nivea leaves reveals the presence of various chemical components, including anthraquinones, phenols, essential oils, steroids, terpenes, amino acids, polysaccharides, organic acids, lactones, and coumarins.

Nghiên cứu của Yongsheng Chen và cộng sự (2014) chỉ ra rằng lá Gai chứa nhiều hợp chất có tác dụng chống oxy hóa, kháng khuẩn và kháng nấm, đồng thời có khả năng chống ung thư, đặc biệt là đối với ung thư phổi và gan, bao gồm các phenolic và flavonoid.

Nghiên cứu tại Hàn Quốc về thành phần hóa học của lá gai bằng phương pháp HPLC đã phát hiện nhiều hợp chất dược lý quan trọng Lá B nivea chứa hàm lượng lớn các hợp chất phenolic có khả năng ức chế men chuyển angiotensin, cùng với các polyphenolic và flavonoid như epicatechin, epicatechin gallate, rutin và acid chlorogenic, nổi bật với đặc tính chống oxy hóa, chống viêm, chống khối u, kháng khuẩn, kháng virus và chống dị ứng Các nghiên cứu của Mi-Ran Park và cộng sự (2010) cũng như Ah-Ra Kim và cộng sự (2014) đã khẳng định những lợi ích sức khỏe này.

Sunghun Cho và cộng sự (2017) đều chỉ ra rằng lá Gai chứa nhiều loại amino acid, acid béo, acid hữu cơ, carbohydrat, vitamin, khoáng chất [14, 23, 52]

Trong đó, các phenolic bao gồm: chlorogenic acid, caffeic acid, 4-coumaric acid, ferulic acid, benzoic acid

Các flavonoid bao gồm: epicatechin, rutin, isoquercetin, hyperoside

Các carbohydrate bao gồm: sucrose, glucose, fructose, galactose, mannitol Các amino acid bao gồm: threonine, glutamic acid, proline, methionine, tyrosine, phenylalanine, histidine, lysine, arginine

Các acid béo bao gồm: palmitic acid, margaric acid, oleic acid, linoleic acid, linolenic acid, arachidic acid, behenic acid, tricosylic acid, lignoceric acid

Các acid hữu cơ bao gồm: oxalic acid, citric acid, succinic acid

Các vitamin bao gồm: vitamin A (retinol), vitamin E (α- tocopherol), vitamin C

Các khoáng chất bao gồm: Ca, Fe, K, Mg, Mn, Zn, Na

Hình 1.6: Cấu trúc một số hợp chất của B Nivea [22]

Trong y học cổ truyền tại Cộng hòa Dân chủ Congo, toàn bộ cây được nghiền nát và ngâm trong nước để tạo ra thuốc bôi điều trị các bệnh như thấp khớp, phong, bệnh ngoài da và vết thương Ngoài ra, dịch từ cây còn được dùng để nhỏ vào mắt, điều trị các vấn đề về mắt, và thấm vào mũi để chống viêm mũi Tại Malaysia, lá gai được sử dụng để đắp lên mụn nhọt và giảm triệu chứng đầy bụng.

Cây 18 hơi, với rễ và lá được sắc làm thuốc bổ, thường được sử dụng trong điều trị kiết lỵ và các vết loét Tại Ấn Độ, rễ và lá của cây này được coi là có tác dụng làm mát, lợi tiểu và hỗ trợ điều trị một số rối loạn như rối loạn tiểu tiện, viêm niệu sinh dục và sa tử cung Ở Trung Quốc và Đài Loan, cây được sử dụng chủ yếu để lợi tiểu, hạ sốt và bảo vệ gan.

Một số bài thuốc sử dụng lá gai:

1 Lá gai dùng riêng hoặc giã đắp với cây cứt lợn có tác dụng cầm máu, làm lành vết thương; lá gai phối hợp với lá vông, lạc tiên, rau má, nấu thành cao, pha đường uống, làm thuốc an thần, gây ngủ [11]

2 Rễ và lá gai còn là thuốc lợi tiểu, chữa đi tiểu ra máu với liều dùng trung bình 10 – 30g mỗi ngày, sắc nước uống [11]

1 Dịch chiết bằng cồn từ cây gai trên ống nghiệm có tác dụng thúc đẩy quá trình đông máu, trên thí nghiệm cắt đuôi chuột nhắt để xác định thời gian chảy máu, thuốc có tác dụng cầm máu Trong thí nghiệm lấy máu từ tĩnh mạch sau hố mắt trên chuột nhắt trắng, dạng thuốc trên với liều 0,3ml bằng đường tiêm phúc mạc hoặc với liều 0,5ml bằng đường uống có tác dụng rút ngắn thời gian đông máu Trên những chó thí nghiệm gây xuất huyết dưới da bằng cách dùng chất cobalt để chiếu xạ thì dạng chế phẩm trên của gai có tác dụng làm giảm hiện tượng xuất huyết một cách rõ rệt [11]

2 Acid chlorogenic có trong dược liệu là một chất ít độc, có tác dụng tăng cường hiệu lực của adrenalin, thông tiểu tiện, kích thích sự bài tiết mật và có khảnăng ức chế tác dụng của pepsin và trypsin Acid chlorogenic còn có tác dụng diệt nấm và kháng khuẩn [11]

3 Muối ammonium của acid cafeic được phân giải từ acid chlorogenic, trên thỏ thí nghiệm tĩnh mạch với liều lượng 7mg/kg có tác dụng rút ngắn thời gian đông máu 58%, rút ngắn thời gian chảy máu 52% Trên chuột nhắt trắng đã dùng cobaltđể chiếu xạ, dùng acid cafeic tiêm xoang bụng với liều lượng 14mg/kg, tiêm liên tục trong 2 tuần lễ thì số lượng bạch cầu tăng

76,4% và sốlượng tiểu cầu tăng 45,6% Với nồng độ pha loãng 1: 128 trên ống nghiệm, thuốc có tác dụng ức chế tụ cầu khuẩn vàng [11]

4 Về độc tính cấp trên chuột nhắt trắng bằng tiêm phúc mạc, thuốc có

𝐿𝐷 50 83 mg/kg, về độc tính bán mãn trên thỏ thí nghiệm với liều 14mg/kg tiêm liên tục trong 10 ngày qua kiểm tra thấy các cơ quan tim, gan, thận về mặt công năng và tổ chức học không có biểu hiện gì về biến đổi bệnh lý [11]

1.4.2.10 Một số nghiên cứu về tác dụng của lá gai trên thế giới liên quan đến tác dụng chống oxy hóa và bệnh gout

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨ U

Lá cây Gai được thu hái tại Hà Nội vào tháng 7 năm 2019, sau đó được rửa sạch và phơi trong bóng râm cho đến khi đạt khối lượng không đổi, rồi được bảo quản trong túi nilon.

Mẫu nghiên cứu của Bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược xác định tên khoa học là Boehmeria nivea (L.) Gaudich, thuộc họ Urticaceae Mẫu tiêu bản hiện đang được lưu giữ tại Bộ môn Dược liệu & Dược học cổ truyền, Khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội.

Hình 2 1: Cây lá gai tại Mê Linh, Hà Nội

2.1.2 Chuẩn bị các mẫu nghiên cứu

Chuẩn bị dịch chiết toàn phần ethanol

Lá Gai khô (300 g) được chiết xuất bằng dung môi ethanol 50% với tổng thể tích 9 lít, thực hiện 3 lần, sử dụng thiết bị siêu âm ở nhiệt độ 40°C trong 90 phút Sau khi gộp các dịch chiết ethanol, tiến hành lọc qua giấy lọc và cất loại dung môi.

22 áp suất giảm bằng máy cô quay chân không thu được cao chiết toàn phần ethanol

Hình 2 2: Cao toàn phần ethanol lá Gai

Chuẩn bịcác phân đoạn dịch chiết

Cao chiết được phân tán trong nước cất theo tỷ lệ 1:1 và chiết phân bố bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần như n-hexan, ethyl acetat và n-Butanol, mỗi dung môi được sử dụng 3 lần với 300 mL mỗi lần Sau đó, các phân đoạn được cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được các phân đoạn tương ứng là n-hexan, EtOAc và n-BuOH.

Quy trình chiết xuất dược liệu được thể hiện ở hình 2.3:

Hình 2 3: Quy trình chiết xuất dược liệu

Bảng 2.1: Các thuốc và hóa chất cần thiết

STT Nguyên liệu, hóa chất Nguồn gốc, xuất xứ

3 Enzym Xanthine oxidase Sigma Aldrich,

4 1,1 – diphenyl – 2 – picrylhydrazyl Ấn Độ TCNSX

6 Acid ascorbic Trung Quốc TCNSX

7 HCl đậm đặc 37%, NaOH Trung Quốc TCNSX

8 Dung môi: n-hexan, ethylacetat (EtOAc), n-butanol

(n-BuOH), DMSO, ethanol, methanol, nước cất

2.1.4 Máy móc, thiết bị, dụng cụ

- Máy đo quang UV Aligent technologies cary 60 UV-Vis, Mỹ

- Máy đo pH Metteler Toledo (Thụy Sỹ)

- Cân phân tích AY 220 (Shimadzu, Nhật Bản)

- Máy siêu âm Ultrasonic Cleaners AC-150H, MRC, Isareal

- Máy cô quay chân không Rovapor R-210 (Buchi- Đức)

- Máy khuấy từ (Shimadzu, Nhật Bản)

- Máy ly tâm (Shimadzu, Nhật Bản)

- Micro pipet đa kờnh 10-200àL, 100-1000àL

- Các dụng cụ khác sử dụng trong thực nghiệm: ống nghiệm, đầu côn, pipet, bình thủy tinh, cốc có mỏ, đũa thủy tinh

2.2 Nội dung nghiên cứu Đểđạt được những mục tiêu nghiên cứu đã đặt ra, đề tài nghiên cứu được thiết kế với các nội dung sau:

Nội dung 1: Đánh giá tác dụng chống oxy hóa của các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH

Nội dung 2: Đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai

2.3.1 Đánh giá tác dụng chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH

Phương pháp đánh giá khả năng quét gốc tự do 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) là một trong những phương pháp phổ biến nhất để đánh giá hoạt động chống oxy hóa Phương pháp này được ưa chuộng nhờ tính đơn giản, nhanh chóng và chỉ cần sử dụng máy quang phổ UV-VIS để thực hiện.

DDPH có khả năng tạo ra gốc tự do bền trong dung dịch MeOH bão hòa, với dung dịch DPPH có màu tím đậm và độ hấp thụ tối đa ở 517nm Khi có mặt chất chống oxy hóa, màu tím này sẽ chuyển thành màu vàng Việc cho các chất thử vào dung dịch sẽ làm giảm cường độ hấp thụ ánh sáng của DDPH nếu các chất đó có khả năng quét gốc tự do.

Chuẩn bị hóa chất cần thiết

- Dung môi MeOH đạt tiêu chuẩn phân tích

- Chất chuẩn dương acid ascorbic (Trung quốc) được hòa tan trong MeOH bóo hũa với nồng độ 50 àg/ml; 25 àg/ml; 20 àg/ml; 10àg/ml; 5 àg/ml; 2,5 àg/ml

- 1,1- diphenyl – 2 –picrylhydrazyl (DDPH, Ấn Độ) pha trong MeOH được nồng độ 4,0 mg/ml

- Mẫu thử: dược liệu được hòa tan trong MeOH bão hòa với các nồng độ

500 g/ml; 250 g/ml; 125 g/ml; 62,5 g/ml; 31,25 g/ml; 15,625 g/ml dùng cho thí nghiệm

Mẫu thử được pha trong dung môi MeOH thành các nồng độ khác nhau

Hỗn hợp phản ứng gồm: 630μL dung dịch DPPH (4,0 mg/ml trong methanol); 100

Mẫu thử 26 μL với các nồng độ khác nhau của dịch chiết được trộn với 270 μL MeOH Hỗn hợp này được ủ trong bóng tối ở nhiệt độ 25 °C trong 15 phút, sau đó tiến hành đo độ hấp thụ bằng máy quang phổ tại bước sóng 517 nm.

Tiến hành đo mẫu chứng với cùng điều kiện và thành phần gồm: 630μL dung dịch DPPH ; 370μL MeOH

Thí nghiệm được lặp lại 3 lần

Cách đánh giá kết quả

Hoạt tính quét gốc tựdo DPPH được đánh giá thông qua giá trị phần trăm ức chế (I%) theo công thức:

𝐴𝑐−𝐴𝑜𝑥100 Trong đó: I%: phần trăm ức chế

Ac: độ hấp thụ của mẫu chứng

At: độ hấp thụ của mẫu thử

A0: độ hấp thụ của mẫu trắng (sử dụng methanol)

Dịch chiết được đánh giá về tác dụng chống oxy hóa bằng cách so sánh với acid ascorbic, chất chuẩn dương Giá trị IC 50 của mẫu được xác định thông qua đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ mẫu thử (C) và phần trăm ức chế (I%).

2.3.2 Đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase in vitro các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai

Phương pháp định lượng acid uric dựa trên sự chuyển đổi xanthin thành acid uric nhờ enzym XO Thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của M Umamaheswari và Đái Thị Xuân Trang, đã được điều chỉnh để phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm Nguyên tắc định lượng dựa trên phản ứng chuyển đổi này.

Hoạt độ enzyme XO được xác định bằng cách đo lượng acid uric tạo thành tại bước sóng 295nm ở nhiệt độ 37ºC và pH 7,5 hoặc 8,0 Một đơn vị enzym được định nghĩa là lượng enzym sản xuất ra 1 μmol acid uric trong mỗi phút ở nhiệt độ 37ºC.

Chuẩn bị hóa chất cần thiết

- Cơ chất: dung dịch xanthin 150àM trong đệm phosphat

- Hóa chất dừng phản ứng: dung dịch HCl 0,5M

- Chất chuẩn dương Allopurinol được hòa tan trong đệm phosphat với nồng độ

50 àg/ml; 25 àg/ml; 12,5 àg/ml; 10àg/ml; 5 àg/ml; 2,5 àg/ml

Mẫu thử cao dược liệu được hòa tan trong DMSO và pha với đệm để tạo ra các nồng độ 25 µg/mL, 50 µg/mL, 100 µg/mL, 200 µg/mL và 400 µg/mL cho thí nghiệm.

Thử nghiệm in vitro đánh giá khả năng ức chế enzym xanthine oxidase (XO) của các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai đã được thực hiện tại Bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, Khoa.

Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội

Bảng 2 2: Bố trí thí nghiệm đánh giá tác dụng ức chế enzym XO in vitro của các mẫu thử Mẫu chứng (àl) Mẫu đối chiếu (àl) Mẫu thử (àl)

Để chuẩn bị mẫu thử, các cao phân đoạn từ lá gai được hòa tan trong DMSO, tạo thành dung dịch gốc với nồng độ 1 mg/mL Sau đó, dung dịch gốc này được pha loãng bằng dung dịch đệm phosphat để đạt được các nồng độ 25 àg/mL, 50 àg/mL, 100 àg/mL, 200 àg/mL và 400 àg/mL.

Hỗn hợp phản ứng bao gồm 100 µL dung dịch mẫu thử, 400 µL dung dịch đệm phosphat 50 mM pH = 7.5, và 100 µL dung dịch enzym XO 0,2 U/mL được pha trong dung dịch đệm trước khi tiến hành Hỗn hợp này được ủ ở 37°C trong 15 phút, sau đó thêm 200 µL xanthin (0,15 mM) vào dung dịch đệm và ủ tiếp trong 30 phút Phản ứng được dừng lại bằng cách thêm 200 µL HCl 0,5M Độ hấp thụ của hỗn hợp phản ứng được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 295 nm Mẫu chứng được thực hiện tương tự nhưng thay dung dịch thử bằng dung dịch đệm, và thí nghiệm được lặp lại ba lần.

Quy trình thí nghiệm được mô tảở hình 2.4:

Hình 2 4: Sơ đồ quy trình thí nghiệm

Cách đánh giá kết quả

Tính I% (phần trăm ức chế) theo công thức:

Trong đó: OD: Độ hấp thụ quang

ODch ứ ng = ODch ứ ng – ODtr ắ ng ch ứ ng

Allopurinol được sử dụng để làm chứng dương trong nghiên cứu Giá trị IC50 được xác định dựa trên đồ thị và phương trình thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ (C) và phần trăm ức chế enzym.

2.3.3 Phương pháp xử lý số liệu

Số liệu được lưu trữ bằng phần mềm Microsoft Excel 2013 và phần mềm SigmaPlot 12.0

Số liệu được biểu diễn dưới dạng X ± SD (X: giá trị trung bình; SD: độ lệch chuẩn)

K Ế T QU Ả

Sau khi chiết xuất 300g lá gai khô bằng EtOH 50%, thu được 27g cao khô, đạt hiệu suất 9,00% Tiếp theo, chiết phân đoạn cao EtOH, kết quả thu được các phân đoạn n-Hexan, EtOAc, n-BuOH lần lượt là 0,93g, 1,00g và 2,53g, với hiệu suất chiết phân đoạn tương ứng là 3,44%, 3,70% và 9,37%.

3.2 Kết quảđánh giá tác dụng chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH

Kết quả đánh giá khả năng quét gốc tự do DPPH của cao toàn phần ethanol từ lá gai và các phân đoạn n-hexan, ethylacetat, n-butanol cùng với acid ascorbic được thể hiện trong bảng 3.1.

Bảng 3 1: Khả năng chống oxy hóa của các mẫu thử

Từ bảng kết quả, ta vẽ đường đồ thị và phương trình biểu diễn khả năng chống oxy hóa của các mẫu thử:

Hình 3 1: Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của các mẫu thử

Hình 3 2: Đồ thị biểu diễn khả năng chống oxy hóa của Acid ascorbic

Từphương trình biểu diễn giữa nồng độ (C) và giá trị phần trăm ức chế (%I) của các mẫu thử ta tính được giá trị IC50 như sau:

Bảng 3.2: Bảng giá trị IC50 tác dụng chống oxy hóa của các mẫu thử

Mẫu thử Cao EtOH Cao n-hexan Cao EtOAc Cao n-BuOH

Kết quả phần trăm ức chế (I%) của cao chiết phân đoạn lá Gai và acid ascorbic được trình bày trong bảng 3.1, cho thấy giá trị IC50 của các phân đoạn lá Gai dao động từ 81,58 ± 3,76 μg/ml đến 240,19 ± 3,56 μg/ml Phân đoạn n-BuOH có tác dụng chống oxy hóa cao nhất với IC50 81,58 ± 3,76 μg/ml, tiếp theo là cao chiết toàn phần EtOH và phân đoạn EtOAc với IC50 lần lượt là 112,98 ± 2,21 μg/ml và 187,86 ± 2,48 μg/ml Trong khi đó, phân đoạn n-Hexan thể hiện khả năng chống oxy hóa thấp nhất.

Kết quả nghiên cứu cho thấy giá trị IC50 của mẫu thử là 240,19 ± 3,56 µg/ml So sánh với mẫu chứng dương Acid ascorbic, có IC50 là 19,56 ± 2,89 µg/ml, cho thấy khả năng chống oxy hóa của mẫu thử thấp hơn đáng kể.

3.3 Kết quảđánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase in vitro của cao chiết phân đoạn lá Gai

Giá trị phần trăm ức chế I (%) của các phân đoạn lá gai ở các nồng độ khác nhau và Allopurinol được trình bày ở bảng 3.2

Bảng 3.3: Tác dụng ức chế enzym XO của các mẫu thử

Phần trăm ức chế (%) Nồng độ

Từ bảng kết quả, ta vẽ được đồ thị biểu diễn khảnăng ức chế enzym xanthine oxidase của các mẫu thử

Hình 3 3: Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế enzym XO của các mẫu thử

Hình 3.4: Đồ thị biểu diễn tác dụng ức chế enzym XO của Allopurinol

Từphương trình biểu diễn giữa nồng độ và giá trị phần trăm ức chế của các mẫu thử, ta tính được giá trị IC50 như sau:

N ồn g độ (  g /m l) N ồn g độ (  g /m l) N ồn g độ (  g /m l)

Bảng 3.4: Bảng giá trị IC50 tác dụng ức chế XO của các mẫu thử

Mẫu thử Cao EtOH Cao n-hexan Cao EtOAc Cao n-BuOH allopurinol

Giá trị phần trăm ức chế enzym XO của cao chiết phân đoạn lá Gai và allopurinol được thể hiện trong bảng 3.2, cho thấy rằng khi nồng độ cao chiết tăng từ 25 đến 400 µg/ml, phần trăm ức chế cũng tăng theo Điều này chứng tỏ tác dụng ức chế enzym XO của các cao chiết tỷ lệ thuận với nồng độ Trong số các phân đoạn cao chiết, phân đoạn n-BuOH có giá trị IC50 thấp nhất là 162,81 ± 6,87 µg/ml, cho thấy đây là phân đoạn có tác dụng ức chế enzym XO mạnh nhất, tiếp theo là phân đoạn EtOH với IC50 là 261,9 ± 7,82 µg/ml.

Kết quả nghiên cứu cho thấy IC50 của các phân đoạn khác nhau có sự khác biệt rõ rệt, với phân đoạn n-hexan có giá trị cao nhất là 455,53 ± 9,32 µg/mL, trong khi phân đoạn có hiệu quả nhất là 279,83 ± 8,65 µg/mL Thứ tự tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase (XO) của các phân đoạn được sắp xếp từ thấp đến cao như sau: n-Hexan < EtOAc < EtOH < n-BuOH Đối chiếu với mẫu chứng dương Allopurinol, giá trị IC50 đạt 7,38 ± 1,25 µg/mL, cho thấy hiệu quả ức chế enzym XO của Allopurinol vượt trội hơn so với các mẫu thử.

BÀN LUẬ N

Kết quả chiết xuất dược liệu lá gai từ huyện Mê Linh, Hà Nội cho thấy hiệu suất chiết cao với EtOH 50%, lần lượt là 9,00%, 3,44%, 3,70% và 9,37% cho các phân đoạn n-Hexan, EtOAc, n-BuOH Kết quả này tương tự như nghiên cứu của Phạm Ngọc Khôi (2019) tại Khánh Hòa với hiệu suất chiết 9% trong dung môi nước Tuy nhiên, nó thấp hơn so với nghiên cứu của Chikwang Kim (2015) tại Hàn Quốc với hiệu suất 17,68% trong dung môi EtOH 50% Sự khác biệt này có thể do địa điểm thu hái, giống dược liệu, điều kiện sinh sống và quy trình chiết xuất khác nhau, ảnh hưởng đến hàm lượng hoạt chất trong dược liệu.

4.2 Về kết quảđánh giá tác dụng chống oxy hóa các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai theo phương pháp DPPH

Nghiên cứu đã xác định các cao phân đoạn từ lá cây gai có hoạt tính kháng oxy hóa thông qua khả năng bắt gốc tự do DPPH Trong số đó, phân đoạn n-BuOH cho thấy khả năng kháng oxy hóa mạnh nhất với giá trị IC50 là 81,58 ± 3,76 (μg/ml).

Cao dược liệu từ lá gai cho thấy tác dụng chống oxy hóa mạnh mẽ, với giá trị IC50 đạt 19,56 ± 2,89 µg/ml, gấp 4 lần so với vitamin C Mặc dù vitamin C là một hợp chất đơn lẻ, cao chiết lá gai chứa nhiều hợp chất khác nhau, góp phần vào khả năng chống oxy hóa tốt của nó Các phân đoạn EtOH, EtOAc và n-Hexan có giá trị IC50 lần lượt là 112,98 ± 2,21; 187,86 ± 2,48; và 240,19 ± 3,56 µg/ml, cho thấy hoạt tính chống oxy hóa khác nhau giữa các phân đoạn Đặc biệt, hoạt tính oxy hóa chủ yếu tập trung ở phân đoạn n-BuOH Nghiên cứu của Yongsheng Chen và cộng sự (2014), Mi-Ran Park và cộng sự (2010), Ah-Ra Kim và cộng sự (2014), cùng Sunghun Cho và cộng sự (2017) đã chỉ ra rằng lá gai chứa nhiều hợp chất có lợi như phenolic, flavonoid, vitamin A, C và E, trong đó bao gồm các acid phenolic như acid 4-coumaric, acid caffeic, acid ferulic và acid chlorogenic, cùng với flavonoid như rutin.

38 epicatechin, isoquercetin) [67] đã được chứng minh thể hiện khả năng kháng oxy hóa mạnh

Phạm Ngọc Khôi và cộng sự (2019) đã nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của cao chiết lá Gai, sử dụng dung môi nước với tỷ lệ nguyên liệu 1:30 g/ml, thời gian chiết 30 phút và nhiệt độ 60°C Phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa là bắt gốc tự do DPPH, cho kết quả IC50 đạt 82,09 μg/ml, tương tự với phân đoạn n-BuOH.

Nghiên cứu của Jin Woo Nho và cộng sự (2010) đã khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của cao chiết lá Gai trong dung môi EtOH 70% Kết quả cho thấy giá trị IC50 của cao EtOH 70% là 688±0,002 µg/ml, cao hexan là 484±0,004 µg/ml, và cao ethylacetat.

Kết quả nghiên cứu cho thấy nồng độ chiết xuất là (97 ± 0.004 g/ml) và cao nước là (1127 ± 0,006 g/ml), có sự khác biệt so với hai nghiên cứu trước Sự khác biệt này có thể do ảnh hưởng của các điều kiện chiết xuất như loại dung môi, thời gian, nhiệt độ, tỷ lệ nguyên liệu và địa điểm thu hái dược liệu Vì vậy, việc tối ưu hóa các điều kiện chiết xuất và khảo sát các mẫu dược liệu khác nhau là cần thiết để cung cấp thêm bằng chứng cho việc lựa chọn dược liệu phù hợp, phục vụ cho phát triển thực phẩm chức năng và thuốc trong tương lai.

Lá Gai đã chứng minh khả năng chống oxy hóa, cung cấp cơ sở khoa học cho các ứng dụng y học trong tương lai Sự tích tụ quá nhiều chất oxy hóa có thể gây stress oxy hóa, dẫn đến mất cân bằng trong cơ thể và phát triển nhiều bệnh mãn tính như ung thư, bệnh tim mạch và bệnh thoái hóa thần kinh Do đó, nghiên cứu các hợp chất tự nhiên có khả năng kháng oxy hóa và điều trị bệnh là rất cần thiết.

4.3 Về kết quảđánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase in vitro các phân đoạn dịch chiết từ lá cây gai

Gout là một trong những bệnh rối loạn chuyển hóa phổ biến ở con người

Bệnh gout được đặc trưng bởi nồng độ acid uric máu cao, dẫn đến sự lắng đọng của tinh thể urate monohydrate trong khớp và thận, gây ra viêm khớp và hình thành sỏi thận.

Mức acid uric cao có liên quan đến sự phát triển của tăng huyết áp, tăng lipid máu, bệnh tiểu đường và béo phì, tất cả đều là các yếu tố nguy cơ tim mạch Kiểm soát acid uric là phương pháp quan trọng để phòng ngừa bệnh gout và các rối loạn khác Allopurinol, một loại thuốc ức chế enzym XO, hiện đang được sử dụng để điều trị bệnh gout mãn tính.

Mặc dù allopurinol có thể gây ra tác dụng phụ như viêm gan, tổn thương thận và hội chứng quá mẫn, nhưng các hợp chất hóa học trong thực vật, như flavonoid, lại mang nhiều tiềm năng dược lý Kinh nghiệm sử dụng trong y học cổ truyền cũng cho thấy đây là nguồn tài nguyên quý giá trong việc điều trị bệnh.

Trong y học cổ truyền tại DR Congo, cây Gai được nghiền nát và ngâm trong nước để tạo ra một loại thuốc bôi, có tác dụng điều trị bệnh thấp khớp hiệu quả.

Trong một nghiên cứu gần đây, Phạm Ngọc Khôi đã đánh giá tác dụng ức chế enzym xanthine oxidase (XO) in vitro của cao nước lá Gai, với kết quả cho thấy giá trị IC50 đạt 273.

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng cao chiết từ các phân đoạn khác nhau của lá cây Gai có khả năng ức chế enzym XO, trong đó phân đoạn n-BuOH cho thấy hiệu quả ức chế mạnh nhất với IC50 là 162,81 ± 6,87 (μg/ml), nhưng vẫn kém hơn 20 lần so với Allopurinol (IC50 là 7,38 ± 1,25 μg/ml) Các phân đoạn EtOH, EtOAc và n-Hexan có giá trị IC50 lần lượt là 261,91 ± 7,82; 279,83 ± 8,65; và 455,53 ± 9,32 (μg/ml) Điều này cho thấy các chất ức chế enzym XO chủ yếu nằm trong phân đoạn n-BuOH Thú vị là thứ tự ức chế enzym XO và khả năng chống oxy hóa của các cao phân đoạn lá Gai tương đồng: n-Hexan < EtOAc < EtOH < n-BuOH Kết quả này có thể được giải thích bởi sự hiện diện của các hợp chất phenolic và flavonoid trong lá gai, bao gồm caffeic acid, rutin và isoquercetin.

Chlorogenic acid được công nhận với khả năng ức chế enzym XO và có hoạt tính chống oxy hóa mạnh mẽ, theo nghiên cứu của Li-Na Huo và các cộng sự.

Năm 2015, một nghiên cứu đã xác định các thành phần ức chế xanthine oxidase từ lá cây tía tô, phát hiện ra 5 hợp chất, trong đó chủ yếu là axit caffeic.