VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
VẬT LIỆU
Chuối sứ, loại chuối phổ biến ở Việt Nam, được sử dụng để lên men giấm chuối Chúng ta nên chọn những quả chuối sứ chín, có chiều dài khoảng 10-12 cm, đảm bảo không bị bầm dập hay sâu mọt.
Xử lý nguyên liệu chuối
Giai đoạn xử lý chuối giúp loại bỏ vi sinh vật có hại, ngăn chặn quá trình oxy hóa khi chuối tiếp xúc với không khí Sau khi xử lý, chúng ta thu được dịch chuối để tiến hành lên men rượu.
Lọc Điều chỉnh độ Bx
Giống vi khuẩn acetic dùng để lên men giấm chuối được tách ra từ các mẫu giấm thu thập tại Chợ Lớn và siêu thị Co.opmart ở Tp Hồ Chí Minh.
+ Mẫu giấm từ Chợ Lớn là giấm táo nuôi, ký hiệu A
+ Mẫu giấm từ siêu thị Co.opmart là giấm gạo, ký hiệu B
Vi khuẩn acetic sau khi thu thập được làm giàu sinh khối, phân lập trên môi trường chọn lọc để thu nhận chủng vi khuẩn acetic thuần khiết
Một số môi trường được sứ dụng trong bài nghiên cứu:
M0: môi trường làm giàu sinh khối
Yeast extract (Cao nấm men) : 0,2%
Dịch lúa10 0 Bx a (Dịch cà chua b ) : 10%
Để thực hiện quy trình dịch lúa 10 0 Bx (môi trường M1-2), đầu tiên, lấy 200g lúa nảy mầm nghiền với 800ml nước cất, sau đó lọc và định mức đến 1000ml Sau khi hoàn thành định mức, ủ mẫu ở 4 mức nhiệt độ khác nhau: 53 0 C trong 20 phút, 63 0 C trong 30 phút, 73 0 C trong 30 phút và cuối cùng là 100 o C trong 30 phút.
Để chuẩn bị môi trường M1-1, đầu tiên, hòa tan 1% (NH4)2SO4 và 1,8% agar vào 1000ml dung dịch sau khi điều chỉnh đến 10°Bx Đối với dịch cà chua, sử dụng 25-30g cà chua cho vào bình tam giác 250ml, thêm nước sao cho thể tích nước bằng thể tích bình Thủy phân cà chua ở nhiệt độ 70-80°C trong 30-45 phút, lắc đều trong quá trình này, sau đó làm nguội 20 phút, lọc và định mức đến 250ml Ngoài ra, bromocresol green sẽ đổi màu từ xanh dương sang vàng trong khoảng pH 3,8 – 5,4.
Thành phần tương tự M1 nhưng không có Bromocresol green
Yeast extract (Cao nấm men) : 0,5%
2.1.4 Thiết bị máy móc dùng cho quá trình thí nghiệm
10) Một số dụng cụ thí nghiệm: petri, ống nghiệm, erlen, pipep, becher, buret, ống đong, đền cồn, que cấy…
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
+ Phân lập vi khuẩn acetic từ mẫu giấm để sản xuất giấm chuối
+ Nghiên cứu sự ảnh hưởng của nồng độ đường, ethanol đến khả năng sinh acid acetic trong quá trình lên men giấm chuối
+ Xác định một số chỉ tiêu của giấm chuối
2.2.1 Phân lập vi khuẩn acetic thuần khiết từ mẫu giấm
+ Thu nhận mẫu giấm : Các mẫu giấm thu thập từ chợ và siêu thị phải đảm bảo là giấm nuôi và có vị chua
Làm giàu sinh khối bằng phương pháp nuôi cấy tĩnh trong 100ml môi trường M0, sử dụng 10% thể tích mẫu giấm thu nhận, trong vòng 48 giờ ở nhiệt độ 30 độ C cho đến khi xuất hiện lớp váng trắng mỏng trên bề mặt.
+ Khuấy trộn để phá vỡ và phân tán đều lớp váng trong toàn bộ thể tích canh trường
+ Phân lập trên đĩa petri chứa mội trường M1 theo phương pháp dùng que cấy vòng cấy ria theo vết cấy cạn dần
Trong nghiên cứu này, vi khuẩn được nuôi cấy trong 48 giờ ở 30°C trong môi trường M1 không có glucose và dịch chiết lúa hoặc cà chua Các khuẩn lạc tạo ra vùng chuyển màu xung quanh do sinh acid, dẫn đến giảm pH của môi trường, được xác định là ứng viên tiềm năng cho vi khuẩn sinh acid acetic.
Sau 48 giờ, chúng tôi chọn những khuẩn lạc riêng rẽ trên đường cấy, làm đổi màu môi trường xung quanh từ xanh dương sang vàng và tiếp tục cấy ria trên môi trường tương tự Quá trình này được lặp lại 5 lần để đảm bảo chủng thu được hoàn toàn thuần khiết Để kiểm tra tính thuần khiết của các chủng, chúng tôi thực hiện làm tiêu bản giọt ép, tiêu bản nhuộm đơn và nhuộm Gram, sau đó quan sát trên kính hiển vi.
Các chủng sau khi phân lập được bảo quản trên ống thạch nghiêng (môi trường M1a) ở nhiệt độ 5°C và được cấy chuyền định kỳ mỗi tháng Trước khi sử dụng, các chủng sẽ được kích hoạt trên môi trường thạch đĩa (M1) trong thời gian 48 giờ.
Sau khi cấy ria vi khuẩn acetic trên môi trường M1 và ủ trong 48 giờ, chúng tôi đã quan sát một số đặc điểm bên ngoài của chủng vi khuẩn đã được phân lập.
+ Quan sát và mô tả hình dạng khuẩn lạc
+ Quan sát hình thái vi khuẩn, trạng thái liên kết
Dựa vào kết quả ghi nhận, ta chọn được chủng thuần khiết để lên men giấm chuối
2.2.2 Tìm hiểu ảnh hưởng của một số yếu tố đến khả năng sinh acid acetic
Chủng vi khuẩn acetic được thu nhận và làm giàu sinh khối trong 100ml môi trường M0 ở nhiệt độ 30°C trong 48 giờ Sau đó, 10% mẫu sinh khối được đưa vào dịch rượu chuối đã được điều chỉnh để bắt đầu quá trình lên men giấm chuối và tiến hành khảo sát.
2.2.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường đến khả năng sinh acid acetic
Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường bổ sung trong rượu chuối ban đầu đến nồng độ acid tổng, hàm lượng ethanol dư và hàm lượng đường khử trong quá trình lên men giấm Các mức hàm lượng đường được khảo sát là 0, 25, 50 và 75 g/l.
2.2.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol trong rượu ban đầu đến khả năng sinh acid acetic
Nghiên cứu này nhằm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol trong rượu chuối ban đầu đến nồng độ acid tổng, hàm lượng ethanol dư và hàm lượng đường khử trong quá trình lên men giấm Các nồng độ ethanol được khảo sát bao gồm 5%, 7% và 9% Kết quả sẽ cung cấp thông tin quan trọng về sự biến đổi của các thành phần này trong quá trình lên men.
CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH
2.3.1.Phương pháp định lượng acid tổng số Định lượng acid tổng số bằng phương pháp chuẩn độ [30]
Dựa trên phản ứng trung hòa giữa các acid trong mẫu và dung dịch kiềm NaOH 0,1N với chất chỉ thị phenolphtalein 1%, chúng ta có thể xác định lượng acid tổng có trong mẫu thông qua lượng dung dịch kiềm tiêu hao.
Dụng cụ: Bình tam giác, Buret
-Dung dịch NaOH 0,1N : pha từ ống chuẩn
-Dung dịch phenolpatalein 1% : cân 1g phenolphatalein cho vào 80 ml dung dịch cồn 96%, sau đó thêm 20ml nước cất và lắc đều
Để tiến hành chuẩn độ mẫu giấm, cho vào bình tam giác 10ml dung dịch mẫu và thêm vài giọt chỉ thị phenolphtalein 1% Sử dụng buret để chuẩn độ dung dịch mẫu với NaOH 0,1N cho đến khi màu hồng xuất hiện, sau đó ghi nhận thể tích NaOH 0,1N đã tiêu hao.
Thực hiện tương tự khi thay mẫu giấm bằng nước cất
Tổng lượng acid (Ta,g/l), xem như acid acetic là acid chủ yếu tích lũy trong dịch lên men, được tính theo công thức sau:
Trong đó: V: số ml dung dịch NaOH 0,1N dùng trung hòa 10 ml mẫu giấm
V0: số ml dung dịch NaOH 0,1N dùng trung hòa 10 ml nước cất
2.3.2 Phương pháp định lượng đường tổng, đường khử Định lượng đường tổng, đường khử theo phương pháp DNS [15]
Phản ứng tạo màu giữa đường khử và thuốc thử axit dinitrosalicylic (DNS) cho thấy cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỷ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một khoảng nhất định Bằng cách sử dụng đồ thị đường chuẩn với glucoza tinh khiết, chúng ta có thể xác định hàm lượng đường khử trong mẫu phân tích một cách chính xác.
Dụng cụ: Máy so màu
- Thuốc thử axit dinitrosalicylic DNS
Cho 5g DNS và 300 ml nước cất vào cốc, hòa tan hoàn toàn ở 50°C Sau đó, thêm 50ml dung dịch NaOH 4N và 150g muối tartrat kép, hòa tan hoàn toàn Chuyển dung dịch vào bình định mức 500ml và thêm nước cất tới vạch định mức, bảo quản trong lọ thủy tinh màu sẫm Nếu sau 1-2 ngày có cặn lắng, tiến hành lọc cặn Chuẩn 3ml thuốc thử DNS bằng HCl 0,1N với chỉ thị phenolphtalein, nếu tiêu tốn 5-6ml HCl là đạt yêu cầu.
-Dựng đồ thị chuẩn glucoza:
+Cân glucoza tinh khiết từ 0,12-0,42g , hòa tan bằng nước cất và định mức đến 1 lít
Để đo OD ở bước sóng 540nm, thực hiện với mẫu phân tích gồm 2ml dịch đường và 1ml DNS, cho vào ống nghiệm và đun sôi cách thủy trong 5 phút Sau đó, làm nguội mẫu và tiến hành đo OD Mẫu đối chứng sử dụng nước cất.
+Vẽ đồ thị chuẩn với trục tung là OD, trục hoàng là nồng độ dường (mg/l)
-Xác định hàm lượng đường khử trong mẫu:
Pha loãng mẫu sao cho hàm lượng đường khữ trong khoảng 0,12-0,42 rồi đem đo OD Dựa vào đồ thị chuẩn tra được hàm lượng đường khử
Kết quả: Lượng đường được tính
X:lượng đường trong dung dịch cần xác định, g a: lượng đường khử torng mẫu đo, g n: hệ số pha loãng dịch, V: số thể tích dịch đo, ml
2.2.3.Phương pháp định lượng hàm lượng ethanol dư (sót) Định lượng hàm lượng ethanol dư bằng phương pháp hóa học[15] và dựa trên cơ sở phản ứng sau:
3C2H5OH + 2K2Cr2O7 + 8H2SO4 3CH3COOH + 2K2SO4 + 2Cr2(SO4)3 + 11H2O (2.1 a )
Lượng bicromat kali dư được xác định theo phương trình phản ứng :
K2Cr2O7 + 6KI + 7H2SO4 3I2 + 4K2SO4 + Cr2(SO4)3 + 7H2O (2.2 a )
Lượng I2 giải phóng ra được định phân bằng Na2S4O6
- Dung dịch Na2S2O3 0,1N (sử dụng ống chuẩn)
Lấy 100ml dịch lên men đem chưng cất cho đến khi gần cạn Dịch cất thu được thêm nước cất cho đủ 100ml (bằng bình định mức)
Lấy 20 ml bicromat kali cho vào bình cầu 500ml cộng thêm 5ml H2SO4 Tiếp theo dùng pipet cho vào bình 10 ml dung dịch rượu đã pha loãng tới 0,3-0,6% , lắc đều và để cho phản ứng 15 phút Sau đó cân khoảng 1-2g KI hòa với ít nước rồi cho cả vào bình phản ứng, lắc đều rồi đặt vào chỗ tối để tránh tác dụng của ánh sáng Sau 10 phút pha thêm vào bình khoảng 100ml nước cất rồi định phân I2 vừa được tạo thành bằng dung dịch Na2S2O3 0,1N ( hoặc 0,01N) với chỉ thị là dung dịch tinh bột 0,5% cho đến xuất hiện màu xanh da trời (màu của Cr2(SO4)3)
Song song với mẫu thí nghiệm, ta làm mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm chứng trắng và thay dung dịch rượu bằng nước cất
Căn cứ hiệu số lượng Na2S2O3 giữa mẫu thí nghiệm và mẫu kiểm chứng, ta suy ra lượng rượu trong mẫu thí nghiệm và % rượu sót sẽ là :
EtOH (%v/v) : số ml ethanol tinh khiết trong 100 ml dung dịch
V0 : số ml Na2S2O3 tiêu hao trong thí nghiệm
Vt : số ml Na2S2O3 tiêu hao trong kiểm chứng
1,15 : cứ 1 ml Na2S2O3 0,1 N thì có 1,15 mg ethanol
2.3.4 Phương pháp tiệt trùng dụng cụ
Tiệt trùng dụng cụ bằngp hương pháp khử trùng ẩm bằng autoclavage [15]
Khử trùng bằng hơi ở nhiệt độ 121°C trong 20 phút là phương pháp hiệu quả để tiêu diệt vi khuẩn Phương pháp này thích hợp cho các môi trường có khả năng chịu nhiệt, bao gồm dụng cụ thủy tinh, màng lọc, và các dụng cụ làm từ cao su hoặc nhựa chịu nhiệt.
Các bình chứa môi trường cần được nút kín bằng nút đậy hoặc bông không thấm nước, và được bọc trong giấy chống thấm dầu như giấy Kraft hoặc giấy nhôm Lượng dịch trong bình không vượt quá 1 lít khi khử trùng, và cần có khoảng trống đủ lớn để tránh hiện tượng trào bọt ra ngoài.
Các dụng cụ cần được bọc trong giấy chống thấm dầu (giấy Kraft) hoặc đặt vào các túi tiệt trùng Hãy sắp xếp dụng cụ và các bình chứa môi trường một cách hợp lý, không quá đầy, để tạo khoảng trống cho hơi ẩm có thể lưu thông.
CÁC PHƯƠNG PHÁP TÍNH TOÁN
2.4.1 Hàm lượng ethanol được sử dụng để chuyển hóa (ΔEtOH) ΔEtOH = EtOH0 – EtOH (2.4) Trong đó: ΔEtOH : Hàm lượng ethanol được sử dụng để chuyển hóa (%v/v)
EtOH0 : Hàm lượng ethanol ban đầu (%v/v)
EtOH : Hàm lượng ethanol sót (dư) (%v/v)
2.4.2 Xử lý các số liệu trong nghiên cứu thử nghiệm
Xử lý số liệu bằng phần mềm Excel 2010
KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN
PHÂN LẬP VI KHUẨN ACETIC TỪ MẪU GIẤM
Tiến hành phân lập vi khuẩn acetic từ 2 mẫu giấm thu thập thì chỉ có mẫu giấm táo nuôi
A cho ra kết quả ngay từ lần cấy ria đầu tiên để tiếp tục quá trình phân lập
Trong quá trình phân lập, chúng tôi nhận thấy rằng:
+ Chủng phân lập có khả năng sinh acid làm đổi màu chất chỉ thị trong môi trường nuôi cấy (màu xanh sang màu vàng)
+ Chủng phân lập có những đặc điểm tế bào sau ( quan sát qua kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần) ( hình 3.1 và 3.2):
Hình thái khuẩn lạc : Khuẩn lạc màu trắng ngà Bìa tròn, bề mặt khuẩn lạc nhám
Kích thước khuẩn lạc: 0,5-1 mm
Hình thái tế bào: Hình bầu dục, đơn
Từ hình dạng khuẩn lạc và hình thái tế bào quan sát được, chúng tôi có dự đoán ban đầu là chủng phân lập được thuộc giống Gluconobacter
Hình 3.1 - Hình dạng khuẩn lạc của chủng vi khuẩn trên môi trường phân lập
Hình 3.2 - Hình thái tế bào của chủng vi khuẩn được quan sát dưới kính hiển vi
LÊN MEN RƯỢU CHUỐI
Rượu chuối được lên men trong 7 ngày với nguyên liệu là chuốisứ chín (chuối đã được xử lý) với nấm men (tỉ lệ 1% theo thể tích)(Hình 3.3)
Sau 7 ngày, rượu chuối thu được có độ rượu là 10 0 (10% v/v) Rượu chuối được lọc, điều chỉnh lại độ rượu thành 5%, 7%, 9% sau đó là lên men giấm chuối với vi khuẩn acetic đã được phân lập
Hình 3.3- Lên men rượu chuối (sau 7 ngày)
TÌM HIỂU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ ĐẾN KHẢ NĂNG SINH ACID ACETIC
Theo nghiên cứu, lượng đường ban đầu trong môi trường lên men giấm đóng vai trò quan trọng, kích thích quá trình lên men Tuy nhiên, nồng độ đường quá cao có thể ức chế vi sinh vật sản xuất acid acetic Bài nghiên cứu này khảo sát ảnh hưởng của nồng độ đường và ethanol đến khả năng sinh acid acetic trong quá trình lên men giấm chuối.
Trong thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường bổ sung đến khả năng sinh acid acetic, chúng tôi khảo sát 4 nồng độ đường khác nhau: 0, 25, 50 và 75 g/l Theo Nguyễn Đức Lượng (2004), nồng độ ethanol tối ưu cho quá trình lên men giấm là từ 5-12% Rượu thu được có nồng độ cồn 10%, do đó trong nghiên cứu về ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến khả năng sinh acid acetic, chúng tôi sử dụng 3 nồng độ ethanol ban đầu: 5%, 7% và 9% Các chỉ tiêu đầu ra bao gồm nồng độ acid acetic sinh ra, hàm lượng đường tiêu hao và hàm lượng ethanol dư trong quá trình lên men giấm chuối.
Chúng tôi đã xác định nồng độ ethanol tối ưu cho quá trình lên men dựa trên các nồng độ đường khác nhau (0, 25, 50, 75 g/l) Qua việc phân tích hàm lượng ethanol sót, hàm lượng acid acetic sinh ra cao nhất và thời gian lên men, chúng tôi đã chọn ra nồng độ ethanol và đường phù hợp nhất từ bốn kết quả đã thu được.
3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanolban đầu với hàm lượng đườngbổ sung là 0 g/l
Hình 3.4- Sự ảnh hưởng của nồng độ ethanol ban đầu với hàm lượng đường 0g/l đến khả năng sinh acid acetic theo thời gian
Hàm lượng đường ban đầu trong rượu chuối rất thấp (phụ lục 1) nên cơ chất chính của vi khuẩn acetic là ethanol
Thời gian lên men (tuần)
Vi khuẩn acetic chuyển hóa ethanol thành acetaldehyde và sau đó thành acid acetic, dẫn đến việc hàm lượng ethanol giảm tương ứng với sự gia tăng acid acetic Hàm lượng acid acetic (Ta) đạt đỉnh vào tuần thứ 3 với 0,9 (g/l), trong khi hàm lượng ethanol sót (EtOH) là 3,22 (%v/v) Tuy nhiên, sau tuần thứ 3, Ta giảm nhanh xuống 0,51 (g/l) và EtOH tăng lên 3,5 (%v/v), hiện tượng này được gọi là "oxy hóa ngược".
Theo lý thuyết, hàm lượng acid acetic sẽ tăng cho đến khi vi khuẩn acetic chuyển hóa gần hết ethanol, nhưng do vi khuẩn acetic trong thí nghiệm có chức năng sinh lý yếu, khả năng chuyển hóa thấp dẫn đến hiện tượng “quá oxy hóa” Vì vậy, nên dừng thí nghiệm ở tuần thứ 3 để đạt được hàm lượng acid acetic cao nhất.
Trong tuần đầu tiên, vi khuẩn acetic cho thấy khả năng thích nghi tốt với môi trường, cho phép chúng chuyển hóa ethanol thành acid acetic một cách hiệu quả, ngay cả khi không có đường bổ sung làm chất dinh dưỡng.
Trong tuần đầu tiên, Ta đạt giá trị cực đại là 1,2 (g/l) trong khi EtOH ở mức thấp nhất là 3,24% Tuy nhiên, do chức năng sinh lý giảm sút và sự cạn kiệt chất dinh dưỡng, hiện tượng “oxy hóa ngược” xảy ra, dẫn đến sự giảm của Ta và sự gia tăng của EtOH Do đó, thời gian tối ưu để lên men trong thí nghiệm này là 1 tuần.
Giá trị cao nhất đạt được là 1,4 (g/l) tương ứng với nồng độ EtOH thấp nhất là 3,84 (%v/v) trong tuần đầu tiên Tuy nhiên, sau đó xảy ra hiện tượng “oxy hóa ngược” do môi trường dinh dưỡng bị cạn kiệt, khiến vi khuẩn không thể tiếp tục sinh trưởng và phát triển.
Chúng tôi xác định nồng độ ethanol ban đầu thích hợp cho quá trình lên men dựa vào các yếu tố như thời gian lên men, hàm lượng ethanol được chuyển hóa (ΔEtOH), hàm lượng acid acetic sinh ra (Ta) và hàm lượng ethanol dư (EtOH).
Bảng 3.1- So sánh các giá trị giữa ba nồng độ ethanol với hàm lượng đường 0 (g/l)
Hàm lượng đường 0 g/l Nồng độ Ethanol 5% Nồng độ Ethanol 7% Nồng độ Ethanol 9%
Theo như kết quả trong bảng 3.1 thì chúng tôi chọn nồng độ ethanol ban đầu là 9% phù hợp cho quá trình lên men nhất với hàm lượng đường 0 g/l vì :
+ Thời gian lên men ngắn (1 tuần)
+ Sử dụng nguồn ethanol hiệu quả nhất (57,3%) để chuyển hóa thành acid acetic + Hàm lượng acid acteic sinh ra là cao nhất (1,4 g/l)
+ Tuy nhiên lượng cồn sót cao hơn tiêu chuẩn 2%
3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanolban đầu với hàm lượng đườngbổ sung là
Hình 3.5- Sự ảnh hưởng của nồng độ ethanol ban đầu với hàm lượng đường 25g/l đến khả năng sinh acid acetic theo thời gian
Trong tuần đầu tiên, khi đường được bổ sung vào môi trường lên men, vi khuẩn acetic sử dụng hết đường để sinh trưởng và phát triển (Phụ lục 2)
Sau khi thích nghi với môi trường mới, vi khuẩn acetic bắt đầu chuyển hóa ethanol thành acid acetic, với giá trị tối đa đạt 0,9 g/l vào tuần thứ 2, tương ứng với nồng độ ethanol thấp nhất là 3,21% (v/v).
Sự “oxy hóa ngược” cũng xảy ra và bắt đầu ở tuần thứ 3 khi Ta giảm xuống còn 0,6 (g/l), EtOH tăng đến 4,79 (%v/v) vì vậy ta nên dừng thí nghiệm ở tuần thứ 2
Thời gian lên men (tuần)
Trong tuần đầu tiên, vi khuẩn acetic tiêu thụ hầu hết lượng đường để phát triển, sau đó chuyển sang sử dụng ethanol để chuyển hóa thành acid acetic.
Vi khuẩn sử dụng đường để phát triển, cho thấy khả năng chuyển hóa tốt Trong tuần đầu tiên, giá trị đạt cao nhất là 1,7 g/l, tương ứng với nồng độ EtOH là 4,03 %v/v Sau đó, mặc dù Ta giảm nhưng EtOH lại tăng, do đó chúng tôi quyết định dừng thí nghiệm tại thời điểm này.
Trong tuần đầu tiên, vi khuẩn sử dụng hết đường để sinh khối (Phụ lục 10) và bắt đầu sử dụng ethanol để chuyển hóa thành acid acetic
Do điều kiện dinh dưỡng thuận lợi, vi khuẩn có khả năng sinh trưởng và chuyển hóa cao chỉ trong 1 tuần, đạt giá trị tối đa 1,9 (g/l) tương ứng với nồng độ ethanol 4,89 %v/v Sau thời gian này, mặc dù vi khuẩn tiếp tục sử dụng ethanol làm cơ chất, nhưng do sức sống yếu, số lượng tế bào chết vượt quá tế bào sống, dẫn đến khả năng chuyển hóa ethanol thành acid acetic không hiệu quả Kết quả là, nồng độ ethanol giảm từ 4,89 xuống 3,74 %v/v trong 2 tuần, trong khi hàm lượng acid acetic không những không tăng mà còn giảm dần, khởi đầu cho quá trình "oxy hóa ngược".
Thí nghiệm được thực hiện trong 1 tuần để thu được hàm lượng acid acetic cao nhất là 1,9 g/l
Bảng 3.2- So sánh các giá trị giữa ba nồng độ ethanol với hàm lượng đường 25 (g/l)
Hàm lượng đường 25 g/l Nồng độ Ethanol 5% Nồng độ Ethanol 7% Nồng độ Ethanol 9%
Theo như kết quả trong bảng 3.2 thì chúng tôi chọn nồng độ ethanol ban đầu là 9% phù hợp cho quá trình lên men nhất với hàm lượng đường 25 g/l vì :
+ Thời gian lên men ngắn (1 tuần)
+Sử dụng nguồn ethanol hiệu quả nhất (45,7 %) để chuyển hóa thành acid acetic + Hàm lượng acid acetic sinh ra là cao nhất(1,9 g/l)
+ Tuy nhiên lượng cồn sót cao hơn tiêu chuẩn 2%
3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanolban đầu với hàm lượng đườngbổ sung là
Hình 3.6- Sự ảnh hưởng của nồng độ ethanol ban đầu với hàm lượng đường 50g/l đến khả năng sinh acid acetic theo thời gian
Trong tuần đầu tiên, vi khuẩn acetic tiêu thụ hoàn toàn đường để phát triển Sự phát triển mạnh mẽ này là nhờ vào hàm lượng bổ sung đáp ứng đủ nhu cầu của vi khuẩn, giúp quá trình chuyển hóa diễn ra nhanh chóng.
Trong tuần đầu tiên, chúng ta đạt cực đại với giá trị tương đối là 1,2 (g/l), trong khi nồng độ EtOH đạt mức thấp nhất là 1,77 (%v/v), sau đó xảy ra hiện tượng “oxy hóa ngược” Do đó, việc dừng thí nghiệm sau 1 tuần là cần thiết.
Thời gian lên men (tuần)
