Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học cây na biển 100

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

M ẪU THỰC VẬT

Mẫu lá, quả loài na biển (Annona glabra) được thu hái vào tháng 5 năm

Vào năm 2013, tại thành phố Hồ Chí Minh, mẫu tiêu bản (AG1605) đã được TS Bùi Văn Thanh, thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, giám định Hiện tại, mẫu này đang được lưu trữ tại Viện Hóa sinh biển, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Hình 2.1 M ẫu thực vật và mẫu tiêu bản khô của loài na biển (A glabra)

PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT

2.2.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60

F 254 (Merck 1,05715) và RP 18 F 254 (Merck) được sử dụng để phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm Ngoài ra, có thể sử dụng dung dịch sulfuric acid 10% phun đều lên bản mỏng, sau đó sấy khô và hơ nóng từ từ cho đến khi xuất hiện màu sắc.

2.2.2 Sắc ký lớp mỏng điều chế

Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn silica gel 60G

F 254 (105875, Merck) được sử dụng để phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm Để xác định vùng chất, có thể cắt rìa bản mỏng và phun dung dịch axit sulforic 10%, sau đó hơ nóng Sau khi xác định vệt chất, lớp silica gel có chất sẽ được cạo ra, giải hấp phụ và tinh chế lại bằng cách kết tinh trong dung môi thích hợp.

Sắc ký cột sử dụng chất hấp phụ là silica gel pha thường với kích thước hạt từ 0,040-0,063 mm (240-430 mesh) Đối với pha đảo, loại YMC có kích thước hạt từ 30-50 µm (Fuji Silysia Chemical Ltd.) và Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd.) được áp dụng.

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC HÓA HỌC

Để xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất, cần kết hợp việc xác định các thông số vật lý với các phương pháp phổ hiện đại Đồng thời, việc phân tích và tra cứu tài liệu tham khảo cũng rất quan trọng Các thiết bị và phương pháp sử dụng trong quá trình này rất đa dạng và chuyên sâu.

2.3.1 Điểm nóng chảy (Mp) Điểm nóng chảy được đo trên máy Kofler micro-hotstage của Viện Hóa sinh biển - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.3.2 Độ quay cực ([α] D ) Độ quay cực được đo trên máy JASCO DIP-1000 KUY polarimeter của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phổ khối lượng phun mù điện tử ESI-MS được đo trên máy Agilent 1100 của

Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS được đo bằng máy FT-ICR-Mass spectrophotometer tại Viện Hóa học, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

2.3.4 Phổ cộng hưởng từ nhân (NMR)

Phổ NMR đo trên máy Brucker avance 500 MHz (Chất chuẩn nội là TMS), tại Viện Hoá học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được sử dụng bao gồm:

• Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1 H-NMR, 13 C-NMR và DEPT

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều bao gồm các kỹ thuật HSQC, HMBC, COSY và NOESY, sử dụng các dung môi như C5D5N, CD3OD và CDCl3 Việc lựa chọn dung môi phù hợp tùy thuộc vào bản chất của mẫu thử, với nguyên tắc đảm bảo dung môi hòa tan hoàn toàn mẫu.

2.3.5 Phổ lưỡng sắc tròn (CD)

Phổ CD được đo trên máy Chirascan TM CD spectrometer (Applied Photophysics Ltd., Surrey, UK) tại Hàn Quốc

2.3.6 Phương pháp xác định đường

Các hợp chất được thuỷ phân trong môi trường axit, sau đó phần đường tách ra được silyl hoá để nhận dạng Để thực hiện, cân mỗi mẫu 2 mg và hoà tan trong 1,0 ml dung dịch HCl 1N (HCl trong dioxane/nước, tỉ lệ 1:1, v/v) Tiến hành đun nóng cách thuỷ với lắp sinh hàn hồi lưu ở nhiệt độ thích hợp.

Đun nóng dung dịch ở 80 độ C trong 3 giờ, sau đó để nguội và trung hòa bằng dung dịch bạc cacbonat Sau khoảng 1 giờ, khi AgCl đã kết tủa hoàn toàn, tiến hành lọc bỏ chất rắn để thu lấy dung dịch.

41 dịch Dung dịch thu được có thể làm khô bằng khí N2 (trong khoảng thời gian từ 2 -

Quá trình chiết xuất được thực hiện trong 3 giờ, hoặc bằng cách quay trong chân không ở nhiệt độ 40 oC Hỗn hợp được chiết bằng CHCl3, sử dụng 0,5 ml CHCl3 kết hợp với 0,5 ml nước và thực hiện chiết lặp lại hai lần.

Loại bỏ lớp CHCl3 và thu lấy lớp nước, sau đó làm khô bằng khí N2 và cô quay trong chân không Hòa tan cặn rắn bằng 0,1 ml pyridine và thêm L-cysteine metyl este hydrochloride 0,06 M Đun hỗn hợp ở 60°C trong bình cách thuỷ có lắp sinh hàn trong 2 giờ Tiếp tục thêm 0,1 ml trimethylsilylimidazole và đun hỗn hợp trong 1,5 giờ ở 60°C Phân bố hỗn hợp trong hệ dung môi n-hexan:nước (0,1 ml x 2 lần) và thu lấy phần n-hexan.

Với các đường chuẩn cũng tiến hành các thực nghiệm tương tự như trên

Các dẫn xuất silyl hóa của các đường được đối chiếu với các dẫn xuất silyl hóa của các đường chuẩn bằng phương pháp GC

Chương trình chạy GC: Máy GC - model: Shimazu-2010; cột: SPB-1 (0,25 mmx30m); detector FID: 300 o C; khí mang: He 30ml/phút; nhiệt độ cột: 210 o C; nhiệt độ buồng tiêm: 270 o C

Máy GC - model Shimazu-2010 Khoa Dược, Đại học Chungnam, Hàn Quốc.

PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH SINH HỌC

2.4.1.1 Thí nghiệm đánh giá hoạt tính gây độc tế bào

Hoạt tính gây độc dòng tế bào HL-60, HEL-299 được thực hiện tại Khoa Dược, Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc

Hoạt tính gây độc của các hợp chất đối với dòng tế bào LU-1, MCF-7, SK-Mel2, KB đã được nghiên cứu tại Phòng Thử nghiệm sinh học thuộc Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam Sự ảnh hưởng của các hợp chất này đến sự tăng trưởng của tế bào ung thư được xác định thông qua việc kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào bằng phương pháp MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyltetrazolium bromide).

42 và tế bào thường HEL-299 được nuôi cấy trong môi trường RPMI 1640 có bổ sung 10% FBS, 100 U/mL penicillin và 100 àg/mL streptomycin trong điều kiện 37 0 C và

Thí nghiệm MTT được thực hiện với các tế bào ung thư người (3x10^5 tế bào/mL) bằng cách xử lý với các nồng độ 0,01, 0,1, 1, 10, 50 và 100 àM của các hợp chất, bao gồm mitoxantrone và ellipticine, trong thời gian 3 ngày Sau khi ủ, 0,1 àg MTT được thêm vào mỗi giếng và tiếp tục ủ trong 4 giờ ở 37 độ C Các đĩa tế bào sau đó được ly tâm với tốc độ thích hợp để thu thập dữ liệu.

Quy trình thí nghiệm bắt đầu bằng việc quay ở 1000 rpm trong 5 phút ở nhiệt độ phòng, sau đó loại bỏ môi trường nuôi cấy Tiếp theo, 150 µL dimethylsulfoxide được thêm vào mỗi giếng để hòa tan các tinh thể formazan Các đĩa sau đó được đọc ở bước sóng 540 nm bằng máy đọc micro-plates (Amersham Pharmacia Biotech., USA) Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần và các giá trị trung bình được tính toán.

Giá trị CS là khả năng sống sót của tế bào ở nồng độ chất thử nhất định, được tính theo phần trăm so với mẫu đối chứng Để xác định giá trị này, chúng ta dựa vào kết quả đo OD (ngày 0) và nồng độ DMSO 10%, sau đó so sánh với giá trị OD của mẫu trộn để tính toán giá trị CS (%) theo công thức đã định.

Giá trị CS% được tính toán theo công thức và nhập vào Excel để xác định % trung bình ± độ lệch tiêu chuẩn từ ba phép thử lặp lại theo công thức của Ducan Các mẫu có hoạt tính biểu hiện (CS < 50%) sẽ được lựa chọn để tiếp tục thử nghiệm nhằm tìm ra giá trị IC50.

Giá trị IC50: Dùng giá trị CS của 10 thang nồng độ, dựa vào chương trình

Bảng đường cong theo thang giá trị logarit của sự phát triển tế bào và nồng độ chất thử được sử dụng để tính toán giá trị IC50 Kết quả thu được thể hiện bằng phần trăm ức chế, phản ánh hiệu quả của chất thử đối với sự phát triển của tế bào.

Nghiên cứu cho thấy rằng việc xử lý mẫu với chất thử dẫn đến giảm hấp thụ 43% so với mẫu đối chứng không được xử lý Đường cong hoạt tính theo nồng độ đã được xây dựng, và nồng độ gây ức chế 50% tế bào đã được xác định cho từng hợp chất.

2.4.1.2 Phân tích hình thái c ủa các tế bào chết theo chương trình sử dụng chất nhu ộm Hoechst 33342 Để xác định các tế bào chết theo chương trình, các tế bào HL-60 được cấy ở mật độ 3x10 5 tế bào/mL trên các đĩa 24 giếng Sau 24h ủ để các tế bào bám vào đáy giếng, các tế bào được xử lý trong 24h hoặc 48h với nồng độ IC50 của hợp chất 18 và 22 Các tế bào sau đó được ủ với Hoechst 33342 (chất này được pha loãng vào mụi trường nuụi cấy để đạt nồng độ 10àg/mL) ở 37 0 C trong 20 phỳt Sau đó cỏc đĩa nuôi cấy được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang IX-71 Olympus camera và ảnh được chụp lại (độ phóng đại x200) tại Khoa Dược , Đại học Qu ốc gia Chungnam, Hàn Quốc

Các tế bào HL-60 (3x10^5 tế bào/mL) được xử lý với hợp chất 18 và 22 ở nồng độ IC50 trong 24h và 48h Sau đó, các tế bào được thu lại và rửa hai lần bằng PBS lạnh Cuối cùng, các tế bào được phân giải bằng dung dịch đệm gồm 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaVO3, 10 mM NaF và 1 mM dithiothreitol.

1 mM phenylmethylsulfonylfluoride, 25 μg/mL aprotinin, 25 μg/mL leupeptin, 1%

Sau khi xử lý bằng Nonidet P-40 và giữ trên đá trong 30 phút, dung dịch tế bào được ly tâm ở 15000 rpm, 4°C trong 15 phút Phần dịch nổi được lưu trữ ở -20°C cho các thí nghiệm tiếp theo Nồng độ protein được xác định bằng phương pháp Bradford, sau đó một lượng bằng nhau protein được điện di trên gel SDS-PAGE 8-10% và chuyển lên màng polyvinylidene fluoride (PVDF) bằng dung dịch đệm glycine (192 mM glycine, 25 mM Tris-HCl [pH 8,8], và 20% MeOH [v/v]) với hiệu điện thế 100V trong 2 giờ Sau khi "blocking" bằng 5% nonfat dried milk, màng được ủ với kháng thể cấp 1 nhận biết PARP (1:1000), Caspase 3 dạng phân cắt (1:1000), Bcl-2 (1:500), Bax (1:1000), và P-AKT (1:1000).

C-myc (1:1000) và β-actin, sau đó màng tiếp tục được ủ với kháng thể cấp 2 HRP (1:5000 Vector Laboratories, Burlingame, VT, USA) ở nhiệt độ phòng Cuối cùng màng được phơi sáng với X-ray film (AGFA, Bỉ) và các băng protein được xác định bởi WEST-ZOL ® plus Western Blot Detection System (iNtRON, Gyeonggi-do, Hàn

2.4.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính kháng viêm

Hoạt tính kháng viêm được thực hiện tại Khoa Dược , Đại học Qu ốc gia

Chungnam, Hàn Quốc Để đánh giá tác dụng ức chế của các hợp chất đã phân lập đối với sự sản sinh

Trong nghiên cứu này, các đại thực bào RAW 264.7 được kích thích bằng LPS và được cấy trên đĩa nuôi cấy 24 giếng với mật độ 5x10^5 tế bào/mL Sau 3 giờ, tế bào được xử lý với các hợp chất ở nồng độ khác nhau trong 24 giờ, với hoặc không có LPS ở nồng độ 1 µg/mL Nồng độ Nitrite trong môi trường nổi được xác định bằng phản ứng Griess Các hợp chất cũng được kiểm tra độ độc đối với tế bào ở nồng độ 30 µM.

Mỗi hợp chất đã được sàng lọc để đánh giá tác dụng của chúng đối với sự sản sinh NO ở tế bào RAW 264.7 khi kích ứng với LPS, thực hiện ở các nồng độ 3, 10 và 30 µM mà không gây độc tính đáng kể Trong điều kiện không có LPS, nồng độ NO sản sinh rất thấp (3,16 ± 0,27 µM), trong khi LPS làm tăng mạnh sản sinh NO lên 14,48 ± 0,43 µM Để xác định giá trị IC50 của các hợp chất ức chế, hoạt tính ức chế đã được kiểm tra phụ thuộc vào nồng độ, và các nồng độ thích hợp cho mỗi hợp chất được ước lượng từ kết quả sàng lọc để tiến hành thí nghiệm kiểm tra hoạt tính.

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

PHÂN L ẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ LOÀI NA BIỂN

Để phân lập hợp chất từ loài na biển (A glabra), mẫu lá và quả được rửa sạch, thái nhỏ, sấy khô ở 40°C, sau đó nghiền mịn và ngâm chiết bằng methanol với thiết bị siêu âm Các dịch chiết methanol từ lá và quả tiếp tục được chiết phân bố trong n-hexane, dichloromethane và ethyl acetate Kết quả thử sàng lọc hoạt tính trên hai dòng tế bào ung thư cho thấy các phân đoạn từ quả có hoạt tính mạnh hơn so với từ lá, đặc biệt là hai phân đoạn dichloromethane và nước từ quả thể hiện hoạt tính gây độc tế bào cao hơn Những kết quả này đã giúp định hướng phân lập các chất tập trung vào hai phân đoạn dichloromethane và nước từ quả loài na biển.

Quả loài na biển (A glabra) được chế biến bằng cách thái nhỏ, sấy khô và nghiền mịn để thu được 4,0 kg bột khô Bột này sau đó được ngâm chiết với methanol qua thiết bị chiết siêu âm ở nhiệt độ 50 oC trong ba lần, mỗi lần kéo dài một giờ Các dịch chiết được lọc qua giấy lọc và dung môi được thu hồi dưới áp suất giảm, cho ra 300 g cặn chiết methanol Cặn này được hòa tan trong 2 lít nước cất và tiếp tục chiết phân bố với n-hexane, dichloromethane và ethyl acetate Qua quá trình cất thu hồi dung môi, các phân đoạn thu được gồm n-hexane (AG1, 51,0 g), dichloromethane (AG2, 190,5 g), ethyl acetate (AG3, 3,5 g) và lớp nước (AG4, 54,0 g).

Phân đoạn dichloromethane AG2 được hòa tan với lượng tối thiểu dichloromethane, sau đó tẩm với silica gel theo tỷ lệ 1/2,5 (m/m) và trộn đều Sau khi cất loại dung môi đến khô, hỗn hợp được nghiền mịn và đưa lên cột sắc ký silica gel pha thường Hệ dung môi rửa giải sử dụng gradient n-hexane/ethyl acetate (100/1 → 1/100, v/v) đã thu được 4 phân đoạn AG2.1 đến AG2.4.

Phân đoạn AG2.2 tiếp tục được phân tách trên cột sắc ký silica gel pha thường với hệ dung môi rửa giải n-hexane/ethyl acetate (4/1, v/v) thu được 3 phân

Phân đoạn AG2.2.1 được xử lý trên cột pha đảo bằng hệ dung môi acetone/nước (3,0/1,0, v/v), thu được các hợp chất 6 (51,0 mg), 7 (321,0 mg) và 11 (217,0 mg) Trong khi đó, phân đoạn AG2.2.2 cũng được đưa lên cột pha đảo với hệ dung môi acetone/nước (4/1, v/v), dẫn đến việc thu được hợp chất 22.

Phân đoạn AG2.4 được chia thành ba phân đoạn nhỏ hơn là AG2.4.1, AG2.4.2 và AG2.4.3 thông qua phương pháp sắc ký cột silica gel pha thường, sử dụng dung môi n-hexane/acetone (tỉ lệ 2/1, v/v) Để tinh chế phân đoạn AG2.4.1, phương pháp sắc ký cột silica gel pha đảo với dung môi acetone/nước (tỉ lệ 5/1, v/v) được áp dụng, từ đó thu được hợp chất 8 (7,0 mg) và hợp chất 9.

Hợp chất 12 (9,0 mg) và 19 (7,0 mg) được tách chiết thành công sau khi tinh chế phân đoạn AG2.4.2 bằng phương pháp sắc ký silica gel pha đảo, sử dụng hệ dung môi acetone/nước với tỷ lệ 3/1 (v/v).

Dịch nước được cô quay loại bỏ ethyl acetate sau đó đưa lên cột Diaion HP-

20, loại bỏ đường bằng nước sau đó tăng dần nồng độ methanol trong nước (25, 50,

75 và 100% methanol) thu được 4 phân đoạn, AG4.1− AG4.4

Phân đoạn AG4.1 được tách trên cột sắc ký silica gel pha đảo RP-18 với dung môi acetone/nước (1/2, v/v), tạo ra ba phân đoạn nhỏ AG4.1.1, AG4.1.2 và AG4.1.3 Phân đoạn AG4.1.1 được phân tách thêm bằng cột sắc ký silica gel pha thường với dung môi dichloromethane/methanol (15/1, v/v), thu được hợp chất 10 (10,0 mg) và hợp chất 13 (5,0 mg) Từ phân đoạn AG4.1.2, sau khi tinh chế bằng cột sắc ký silica gel pha thường với dung môi tương tự, thu được hợp chất 16 (6,0 mg) và hợp chất 18 (5,0 mg) Cuối cùng, phân đoạn AG4.1.3 cho ra hợp chất 14 (8,0 mg), 20 (6,0 mg) và 21 (7,0 mg) sau quá trình tinh chế.

AG4.1.3 bằng cột sắc ký silica gel pha đảo sử dụng hệ dung môi rửa giải acetone/nước (3/1, v/v)

Phân đoạn AG4.3 được tách ra bằng cột sắc ký silica gel pha thường với dung môi dichloromethane/methanol (6/1, v/v), tạo ra ba phân đoạn nhỏ hơn là AG4.3.1, AG4.3.2 và AG4.3.3 Trong đó, phân đoạn AG4.3.1 được xử lý bằng cột sắc ký silica gel pha đảo RP-18 với dung môi methanol/nước (1/1,5, v/v), dẫn đến việc thu được hợp chất 1 (5,0 mg) và hợp chất 4.

(3,0 mg) Phân đoạn AG4.3.2 được phân tách bằng cột silica gel với hệ dung môi

Phân đoạn AG4.3.2.1 và AG4.3.2.2 được tách ra từ dung môi dichloromethane/ethyl acetate (10/1, v/v), trong đó phân đoạn AG4.3.2.1 chứa ba hợp chất, bao gồm hợp chất 2 (4,0 mg), 3 (3,0 mg) và 5 (6,0 mg), được chiết xuất bằng cột silica gel pha đảo với dung môi methanol/nước (1/1, v/v) Tương tự, từ phân đoạn AG4.3.2.2, hai hợp chất 15 (5,0 mg) và 17 (5,0 mg) cũng được thu được qua cột silica gel pha đảo với hệ dung môi methanol/nước (1/1, v/v).

Hình 3.1 Sơ đồ chiết các phân đoạn mẫu na biển (A glabra)

Hình 3.2 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết dichloromethane

Hình 3.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ cặn chiết nước

H ẰNG SỐ VẬT LÝ VÀ DỮ KIỆN PHỔ CỦA CÁC HỢP CHẤT

3.2.1 Hợp chất 1: 7β,16α,17-Trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (mới)

Chất bột vô định hình, màu trắng Độ quay cực[ ] α 25 D : –64,9 (c 0,1, MeOH)

1H-NMR (500 MHz, CD 3 OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD): xem Bảng 4.1 HR-ESI-MS: m/z 375,2159 [M+Na] +

Tính toán lý thuyết [C20H 32 O 5 Na] + : 375,2142

3.2.2 Hợp chất 2: 7β,17-Dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β- D - glucopyranoside ester (mới)

Chất bột vô định hình, màu trắng

3.2.3 Hợp chất 3: 7β,17-Dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid 19-O-β- D - glucopyranoside ester (mới)

Chất bột vô định hình, màu trắng Độ quay cực[ ] α 25 D : –38,5 (c 0,1, MeOH)

3.2.4 Hợp chất 4: 16α-Hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid 17,19-di-O-β- D - glucopyranoside ester (mới)

Chất bột, màu trắng Độ quay cực[ ] α 25 D : – 40 (c 0,1, MeOH)

1H-NMR (500 MHz, CD 3 OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD): xem Bảng 4.4 HR-ESI-MS: m/z 681,3095

Tính toán lý thuyết cho công thức [C32H 50 O 14 Na] + : 681,3093

Chất bột, màu trắng Độ quay cực[ ] α 31 D : +56 (c 0,1, MeOH) Nhiệt độ nóng chảy: 192-193 o C

1H-NMR (500 MHz, CD 3 OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD): xem Bảng 4.5 Công thức phân tử C26H 42 O 9 , M = 498

3.2.6 Hợp chất 6: 16α,17-Dihydroxy-ent-kaurane

Tinh thể hình kim, không màu Độ quay cực[ ] α 31 D : -25 (c 0,1, CHCl 3 )

1H-NMR (500 MHz, CDCl 3 ) và 13 C-NMR (125 MHz, CDCl 3 ): xem Bảng 4.6 Công thức phân tử C20H 34 O 2 , M = 306

3.2.7 Hợp chất 7: 16β,17-Dihydroxy-ent-kaurane

Tinh thể hình kim, không màu Độ quay cực[ ] α 31 D : -32 (c 0,1, CHCl 3 )

1H-NMR (500 MHz, CDCl 3 ) và 13 C-NMR (125 MHz, CDCl 3 ): xem Bảng 4.7 ESI-MS: m/z 329,2 [M+Na] +

3.2.8 Hợp chất 8: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-al

Tinh thể hình kim, không màu Độ quay cực[ ] α 31 D : – 45 (c 0,1, CHCl 3 )

1H-NMR (500 MHz, CDCl 3 ) và 13 C-NMR (125 MHz, CDCl 3 ): xem Bảng 4.8 ESI-MS: m/z 319,2 [M-H] -

3.2.9 Hợp chất 9: 16β,17-Dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid

Tinh thể hình kim, không màu Độ quay cực[ ] α 31 D : – 57 (c 0,01, MeOH)

1H-NMR (500 MHz, C 5 D 5 N) và 13 C-NMR (125 MHz, C 5 D 5 N): xem Bảng 4.9 ESI-MS: m/z 335,2 [M-H] -

Chất bột, màu trắng Độ quay cực[ ] α 31 D : – 70 (c 0,07, MeOH)

1H-NMR (500 MHz, CD 3 OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD): xem Bảng 4.10 ESI-MS: m/z 319 [M-H] −

Chất bột, màu trắng Độ quay cực[ ] α 31 D : – 40 (c 0,1, CHCl 3 )

1H-NMR (500 MHz, CDCl 3 ) và 13 C-NMR (125 MHz, CDCl 3 ): xem Bảng 4.11 ESI-MS: m/z 361 [M-H] -

3.2.12 Hợp chất 12: 19-nor-ent-kauran-4α-ol-17-oic acid

Chất bột, màu trắng Độ quay cực [ ] α 31 D : -61 (c 0,1, MeOH)

1H-NMR (500 MHz, C 5 D 5 N) và 13 C-NMR (125 MHz, C 5 D 5 N): xem Bảng 4.12 Công thức phân tử C19H 30 O 3 , ,M = 306

3.2.13 Hợp chất 13: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 1,3′-di-O-β-

Chất bột, màu trắng Độ quay cực [ ] α 25 D : −25,0(c 0,1, MeOH)

1H-NMR (500 MHz, CD 3 OD) và 13 C-NMR (125 MHz, CD 3 OD): xem Bảng 4.13 HR-ESI-MS: m/z 629,2431[M+Na] +

Tính toán lý thuyết: [C27H 42 O 15 Na] + 629,2416

3.2.14 Hợp chất 14: (2E,4E,1′R,3′S,5′R,6′S)-Dihydrophaseic acid 3′-O-β- D - glucopyranoside

Nhiệt độ nóng chảy: 199-200 o C Độ quay cực [ ] α 31 D : -110 (c 1,0, MeOH)

Dạng dầu màu vàng nhạt Độ quay cực[ ] α 31 D : + 35 (c 0,1, MeOH)

Chất bột, màu trắng Độ quay cực[ ] α 31 D : +25 (c 0,3, CHCl 3 )

Chất bột, màu trắng Độ quay cực[ ] α 31 D : -42 (c 0,05, MeOH)

XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT

4.1.1 Hợp chất 1: 7β,16α,17-Trihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (mới)

Hình 4.1 C ấu trúc hóa học của 1 và hợp chất tham khảo

Hợp chất 1 xuất hiện dưới dạng bột màu trắng với công thức phân tử C20H32O5, được xác định dựa trên kết quả từ phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI.

MS xuất hiện pic ion tại m/z 375,2159 [M+Na] + (tính toán lý thuyết cho công thức [C 20 H 32 O 5 Na] + : 375,2142)

Trên phổ 1 H-NMR xuất hiện tín hiệu proton của 2 nhóm methyl bậc ba dưới dạng singlet tại δH 1,00 (3H, s) và 1,18 (3H, s), 1 nhóm oxymethine tại δH 3,63 (1H, br s), 1 nhóm oxymethylene tại δH 3,62 (1H, d, J = 11,5 Hz) và 3,72 (1H, d, J = 11,5 Hz)

Phổ 13 C-NMR và DEPT của hợp chất 1 cho thấy tín hiệu của 20 nguyên tử carbon, bao gồm 1 cacbon cacboxylic, 4 cacbon không có hydro, 4 nhóm methine, 9 nhóm methylene và 2 nhóm methyl Dữ liệu phổ này chỉ ra rằng hợp chất này là một diterpenoid có cấu trúc khung ent-kaurane So sánh với hợp chất tương tự 16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (9), số liệu 13 C-NMR của hợp chất 1 càng khẳng định tính chất của nó.

[138] gợi ý 1 có cùng cấu trúc khung ent-kaurane

Các tương tác HMBC giữa H-18 (δH 1,18) với C-3 (δC 34,23)/C-4 (δC

44,25)/C-5 (δC 48,09)/C-19 (δC 182,00) khẳng định vị trí của nhóm methyl và cacboxylic tại C-4 Nhóm methyl tại C-4 được xác định có cấu hình β bởi tương tác NOESY giữa H-18 (δH 1,18) với H-5 (δH 1,77) Tương tác HMBC từ H-13 (δH

2,08)/H-15 (δH 1,56 và 1,74) tới C-16 (δC 82,86)/C-17 (δC 66,71) khẳng định vị trí của 2 nhóm hydroxyl tại C-16 và C-17

Bảng 4.1 Số liệu phổ NMR của hợp chất 1 và hợp chất tham khảo

# δ C c ủa 16β ,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (9) đo trong CDCl 3 [138], $ δ C c ủa 16α ,17- dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid (1a) đo trong CDCl 3 [138], @ đo trong CD 3 OD

Cấu hình của nhóm hydroxyl tại C-16 được xác định là α thông qua so sánh độ chuyển dịch C-13, C-16 và C-17 của hợp chất với các hợp chất khác như 16β,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid và 16α,17-dihydroxy-ent-kauran-19-oic acid Vị trí của nhóm hydroxyl tại C-7 được xác định nhờ tương tác HMBC giữa H-5 và H-15.

1,74) với C-7 (δC 78,05) cùng với đó là tương tác COSY giữa các proton H-5 (δH

Tương tác NOESY giữa H-7 (δH 3,63) và H-14 (δH 1,70), cùng với tín hiệu broad singlet của H-7, xác nhận cấu hình α của H-7 ở vị trí equatorial Qua các phân tích này, hợp chất 1 được xác định là 7β,16α,17-trihydroxy-ent-kauran-19-oic Kiểm tra trên Science Finder cho thấy đây là một hợp chất mới.

Hình 4.2 Các tương tác HMBC và COSY quan trọng của hợp chất 1

Hình 4.3 Ph ổ HR-ESI-MS của hợp chất 1

Hình 4.4 Ph ổ 1 H-NMR c ủa hợp chất 1

Hình 4.5 Ph ổ 13 C-NMR c ủa hợp chất 1

Hình 4.6 Ph ổ DEPT của hợp chất 1

Hình 4.7 Ph ổ HSQC của hợp chất 1

Hình 4.8 Ph ổ HMBC của hợp chất 1

Hình 4.9 Ph ổ COSY của hợp chất 1

Hình 4.10 Ph ổ NOESY của hợp chất 1

4.1.2 Hợp chất 2: 7β,17-Dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β- D - glucopyranoside ester (mới)

Hình 4.11 C ấu trúc hóa học của hợp chất 2 và hợp chất tham khảo

Hợp chất 2 được phân lập dưới dạng bột màu trắng với công thức phân tử C26H42O9, xác định qua phổ HR-ESI-MS với pic ion phân tử tại m/z 521,2732 [M+Na]+ Phổ 1H-NMR của hợp chất này tương tự như hợp chất 1, cho thấy sự xuất hiện của 2 nhóm methyl bậc 3 tại δH 0,99 (3H, s) và 1,22 (3H, s), cùng với 1 nhóm oxymethine.

61 tại δH 3,50 (1H, br s), 1 nhóm oxymethylene tại δH 3,35 (2H, m) gợi ý 2 cũng có cấu trúc khung ent-kaurane Bên cạnh đó, tín hiệu 1 proton anome tại δH 5,42 (1H, d, J

= 8,0 Hz) cho thấy sự có mặt của 1 phân tử đường

Phổ 13 C-NMR của 2 xuất hiện tín hiệu của 26 nguyên tử cacbon, bao gồm 1 nhóm cacboxyl, 3 cacbon bậc 4, 10 cacbon methine (trong đó có 6 nhóm oxymethine), 10 cacbon methylene (trong đó có 2 nhóm oxymethylene) và 2 nhóm methyl Phổ 1 H- và 13 C-NMR của 2 khá tương đồng với hợp chất helikauranoside A (2a) [13], ngoại trừ 2 xuất hiện thêm nhóm hydroxyl tại C-7

Vị trí nhóm hydroxyl tại C-7 được xác định thông qua tương tác HMBC giữa proton H-5, H-9 và H-15 với C-7 Cấu trúc lập thể của proton H-7 trong hợp chất thứ hai được xác định là α nhờ tín hiệu broad singlet của H-7 Tương tác HMBC giữa H-17 với C-13, C-15 và C-16 cho thấy sự hiện diện của nhóm hydroxyl tại C-17 Ngoài ra, cấu trúc lập thể của nguyên tử hydro tại C-16 cũng được xác định là α bằng cách so sánh giá trị độ chuyển dịch của C-12 và C-13.

39,46), C-16 (δC 44,66) và C-17 (δC 67,66) với dữ kiện của 16α-ent-kaurane: helikauranoside A (2a) [δC 32,5 (C-12), 39,5 (C-13), 44,5 (C-16) và 67,7 (C-17)]

[13] và 16β-ent-kaurane: 17-hydroxy-16β-ent-kauran-19-al (2b) [δC 25,8 (C-12), 36,9 (C-13), 43,1 (C-16), và 64,1 (C-17)] [138] Tương tác HMBC giữa H-18 (δH

1,22) với C-3 (δC 39,09)/C-4 (δC 44,69)/C-5 (δC 49,50)/C-19 (δC 178,67) khẳng định nhóm cacboxyl tại C-4

Thủy phân hợp chất 2 trong môi trường axit tạo ra đường D-glucose, được xác định bằng dẫn xuất TMS Tương tác HMBC giữa proton anome H-1′ (δH 5,42) và C-19 (δC 178,67) cho thấy D-glucose liên kết với aglycone tại C-19 Hằng số tương tác J H-1′/2′ = 8,0 Hz chứng minh mối quan hệ giữa H-1′ và H-2′.

H-2′ đều nằm ở vị trí axial, do đó nhóm hydroxyl tại cacbon anomeric có cấu hình β Dựa trên các dữ liệu phổ, hợp chất 2 được xác định là 7β,17-dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-D-glucopyranoside ester, đây là một hợp chất mới.

Hình 4.12 Các tương tác HMBC quan trọng của hợp chất 2 Bảng 4.2 Số liệu phổ NMR của hợp chất 2 và hợp chất tham khảo

# δ C của helikauranoside A (2a) đo trong CD 3 OD [13], $ δ C của 17-hydroxy-16β-ent-kauran-19-al

(2b) đo trong CDCl 3 [138], @ đo trong CD 3 OD

4.1.3 Hợp chất 3: 7β,17-Dihydroxy-ent-kaur-15-en-19-oic acid 19-O-β- D - glucopyranoside ester (mới)

Hình 4.18 C ấu trúc hóa học và các tương tác HMBC quan trọng của hợp chất 3

Hợp chất 3 xuất hiện dưới dạng bột màu trắng với công thức phân tử C26H40O9, được xác định qua sự xuất hiện của pic ion phân tử tại m/z 519,2550 trên phổ HR-ESI-MS Giá trị tính toán lý thuyết cho công thức [C26H40O9 Na]+ là 519,2565.

Bảng 4.3 Số liệu phổ NMR của hợp chất 3

Phổ 1 H-NMR của 3 xuất hiện tín hiệu 1 proton olefin tại δH 5,81 (1H, s) và 2 nhóm methyl tại δH 1,02 (3H, s) và 1,22 (3H, s), gợi ý sự có mặt của cấu trúc khung ent-kaurane; tín hiệu 1 proton anome tại δH 5,42 (1H, d, J = 7,5 Hz) cho thấy 3 có cấu trúc khung ent-kaurane đính đường

Phổ 13 C-NMR và DEPT xuất hiện tín hiệu của 26 nguyên tử cacbon, trong đó có 20 nguyên tử cacbon thuộc khung ent-kaurane diterpenoid và 6 nguyên tử cacbon của một phân tử đường Phổ 1 H- và 13 C-NMR của 3 khá giống với 7β,17- dihydroxy-16α-ent-kauran-19-oic acid 19-O-β-D-glucopyranoside ester (2), ngoại trừ sự xuất hiện thêm liên kết đôi tại C-15/C-16 Liên kết đôi này được xác định dựa trên các tương tác HMBC giữa H-14 (δH 1,42 và 2,06)/H-17 (δH 4,13) với C-15 (δC 132,13)/C-16 (δC 148,11); giữa H-15 (δH 5,81) với C-7 (δC 75,62)/C-8 (δC

54,25)/C-9 (δC 43,56)/C-14 (δC 43,51)/C-16 (δC 148,11)/C-17 (δC 61,21) Cấu hình của nhóm hydroxyl tại C-7 dược xác định tương tự như 7β,17-dihydroxy-16α-ent- kauran-19-oic acid 19-O-β-D-glucopyranoside ester (2) Từ những dữ kiện phổ trên,

3 được xác định là một hợp chất mới có tên khoa học 7β,17-dihydroxy-ent-kaur-15- en-19-oic acid 19-O-β-D-glucopyranoside ester

4.1.4 Hợp chất 4: 16α-Hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid 17,19-di-O-β- D - glucopyranoside ester (mới)

Hình 4.24 C ấu trúc hóa học của hợp chất 4 và hợp chất tham khảo

Hợp chất 4 được phân lập dưới dạng bột màu trắng với công thức phân tử C32H50O14, được xác định nhờ sự xuất hiện của pic ion phân tử tại m/z.

Phổ HR-ESI-MS cho thấy hợp chất có công thức [C32H50O14Na]+ với giá trị 681,3095 (tính toán lý thuyết là 681,3093) Phổ 1H-NMR của hợp chất 4 ghi nhận tín hiệu của hai nhóm methyl bậc ba tại δH 0,97 (3H, s) và 1,24 (3H, s), chỉ ra sự hiện diện của cấu trúc khung ent-kaurane Ngoài ra, hai proton anome tại δH 5,43 (d, J = 8,0 Hz) và 5,53 (d, J = 8,0 Hz) cho thấy có sự xuất hiện của hai phân tử đường.

Phổ 13 C-NMR và DEPT của hợp chất 4 xuất hiện tín hiệu của 32 nguyên tử cacbon gồm 2 cacbonyl, 3 cacbon bậc bốn, 14 nhóm methine, 11 nhóm methylene và 2 nhóm methyl Số liệu phổ 1 H- và 13 C-NMR của hợp chất 4 giống với của hợp chất 16α-hydro-ent-kauran-17,19-dioic acid (4a) [71], ngoại trừ sự xuất hiện tín hiệu của 2 phân tử đường tại C-17 và C-19

Tương tác HMBC giữa H-18 (δH 1,24) với C-3 (δC 39,04)/C-4 (δC 45,11)/C-5 (δC 58,61)/C-19 (δC 178,43) gợi ý sự có mặt của nhóm methyl và cacboxyl tại C-4; giữa proton H-13 (δH 2,55)/H-15 (δH 1,59 và 1,97)/H-16 (δH 3,06) với C-17 (δC

175,32) khẳng định nhóm cacboxyl tại C-16; giữa H-1′ (δH 5,53) với C-17 (δC

K ẾT QUẢ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC

4.2.1 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các phân đoạn

Bảng 4.24 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của dịch chiết và các phân đoạn từ lá và quả loài na biển (A glabra)

Dịch chiết IC 50 (àg/mL)

Bộ phận na biển Lá Quả Lá Quả

Dịch chiết MeOH 32,43 ± 2,12 14,59 ± 3,16 38,19 ± 1,23 12,57 ± 3,62 Phân đoạn n-hexane 25,15 ± 2,70 16,15 ± 1,04 30,35 ± 1,08 13,10 ± 1,23 Phân đoạn dichloromethane 9,02 ± 1,34 2,21 ± 0,15 6,85 ± 0,11 1,08 ± 0,14

Phân đoạn ethyl acetate > 100 > 100 > 100 > 100 Phân đoạn nước > 100 3,47 ± 0,29 > 100 3,70 ± 0,98

Dịch chiết methanol từ quả và lá loài na biển (A glabra) đã được nghiên cứu để đánh giá hoạt tính gây độc tế bào trên hai dòng tế bào ung thư LU-1 và KB Kết quả cho thấy dịch chiết methanol này có khả năng gây độc tế bào với giá trị IC50 dao động từ 12,57 ± 3,62 đến 38,19 ± 1,23 µg/mL Ngoài ra, các phân đoạn chiết xuất từ lá và quả, bao gồm n-hexane, dichloromethane, ethyl acetate và nước, cũng đã được kiểm tra về hoạt tính gây độc tế bào.

Nghiên cứu so sánh khả năng ức chế sự phát triển của hai dòng tế bào ung thư LU-1 và KB cho thấy các phân đoạn từ quả có hoạt tính mạnh hơn so với các phân đoạn từ lá Đặc biệt, hai phân đoạn dichloromethane và nước từ quả thể hiện hoạt tính gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50 trong khoảng 1,08 ± 0,14 ÷ 3,70 ± 0,98, tạo nền tảng cho các nghiên cứu về thành phần hóa học.

4.2.2 Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của các hợp chất

Tất cả các hợp chất đã được đánh giá khả năng độc tế bào trên năm dòng tế bào ung thư: LU-1, MCF-7, SK-Mel2, KB và HL-60, với ellipticine và mitoxantrone được sử dụng làm chất đối chứng Kết quả nghiên cứu được trình bày chi tiết trong bảng dưới đây.

Trong nghiên cứu về 12 hợp chất thuộc khung ent-kaurane từ quả loài na biển (A glabra), hợp chất 3, 4 và 6 đã cho thấy hoạt tính gây độc tế bào mạnh, với giá trị IC50 đáng chú ý.

Các hợp chất megastigmane 14 và 15, phenolic 18 và acetogenin 22 cho thấy hoạt tính gây độc tế bào mạnh trên các dòng tế bào ung thư LU-1, MCF-7, SK-Mel2 và KB với giá trị IC50 trong khoảng 2,79 đến 11,17 µM Trong khi đó, các hợp chất 1, 2, 5, 7, 19 và 17 thể hiện hoạt tính gây độc tế bào ở mức độ trung bình, còn lại các hợp chất khác không có hoạt tính gây độc tế bào.

Hợp chất 7, 8, 18 và 22 trên dòng tế bào ung thư HL-60 cho thấy hoạt tính gây độc tế bào mạnh với giá trị IC50 từ 6,94 đến 9,38 àM, so với mitoxantrone (IC50: 6,8 àM) Khi đánh giá trên dòng tế bào thường HEL-299, chỉ có hợp chất 18 và 22 thể hiện độc tính ít, với tỷ lệ sống sót tại nồng độ 9,02 và 8,72 àM lần lượt là 93,25% và 94,69% Hai hợp chất này sẽ được nghiên cứu sâu hơn về khả năng gây chết tế bào thông qua cơ chế apoptosis.

Khi xử lý với hợp chất 18 và 22, số lượng tế bào siêu lưỡng bội (hypodiploid cells) ở giai đoạn G1 tăng lên theo thời gian, cho thấy sự biến đổi rõ rệt trong quá trình này.

Họ protein Bcl-2 bao gồm hai loại chính: Bcl-2, một protein ức chế quá trình tự chết, và Bax, tiền protein kích thích tự chết Bax thúc đẩy quá trình tự chết tế bào bằng cách giải phóng Cytochrome c từ ty thể, trong khi Bcl-2 ngăn chặn sự giải phóng này Sự giải phóng Cytochrome c trong quá trình tự chết dẫn đến việc cắt Caspase-9, tiếp theo là sự phân cắt của Caspase-3 và PARP.

Chúng tôi đã nghiên cứu cơ chế gây ra quá trình tự chết của tế bào bằng cách kiểm tra độ biểu hiện của các protein liên quan Sau khi xử lý với hợp chất 18 (9,0 àM) và 22 (8,7 àM) trong 24 h và 48 h, chúng tôi nhận thấy sự thay đổi rõ rệt trong biểu hiện của các protein này, cụ thể là tăng cường biểu hiện của Bax, giảm biểu hiện của Bcl-2, cũng như sự phân cắt của Caspase 3 và PARP Kết quả cho thấy hợp chất 18 và 22 kích thích quá trình tự chết của tế bào thông qua việc điều chỉnh mức độ biểu hiện của các protein trong tế bào HL-60.

Bảng 4.25 Kết quả thử hoạt tính của các hợp chất 1-22

Hợp chất IC 50 (àM) % ss(*)

LU-1 $ MCF-7 $ SK-Mel2 $ KB $ HL-60 # HEL-299 #

Tại Khoa Dược, Đại học Quốc gia Chungnam, Hàn Quốc, nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ sống sót của tế bào HEL-299 ở nồng độ thử IC50 được thực hiện tại Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện.

Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

Con đường tín hiệu PI3K/AKT đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa sự sống, tăng trưởng và quá trình tự chết của tế bào AKT dạng hoạt hóa có liên quan đến sự sống và tăng trưởng của tế bào ung thư thông qua protein c-myc, mà thường biểu hiện mạnh mẽ ở nhiều loại khối u Để tìm hiểu tác động của hợp chất 18 và 22 lên con đường tín hiệu nội bào, chúng tôi đã tiến hành phân tích quá trình photphorin hóa của AKT và độ biểu hiện của c-myc bằng thí nghiệm Western-blot Kết quả cho thấy

Sau khi xử lý với hợp chất 18 và 22, quá trình photphorin hóa của AKT giảm, dẫn đến sự tự chết của các tế bào Đồng thời, mức độ biểu hiện của c-myc cũng giảm Điều này chứng tỏ rằng hợp chất 18 và 22 gây ra cái chết tế bào theo chương trình thông qua việc giảm mức độ biểu hiện của p-AKT và c-myc.

Hình 4.62 M ức độ chết theo cơ chế apoptosis của tế bào HL-60 dưới sự tác động của hợp chất 18 và 22 tại thời điểm 24 h và 48 h ở nồng độ IC 50

Hình 4.63 Ảnh hưởng của hợp chất 18 và 22 đến các biểu hiện ở cấp độ protein trên dòng t ế bào HL-60 ở nồng độ IC 50 t ại 24 h và 48 h

4.2.3 Kết quả thử hoạt tính kháng viêm của các hợp chất

Nitric oxit (NO) được sản xuất chủ yếu bởi enzyme tổng hợp nitric oxit (iNOS), đóng vai trò quan trọng trong việc giãn mạch máu và điều chỉnh huyết áp.

Nitric oxide (NO) đóng vai trò quan trọng trong quá trình nhiễm khuẩn và viêm, với khả năng ức chế sự sinh trưởng của tế bào và gây độc cho đại thực bào nhằm tiêu diệt vi khuẩn và tế bào ung thư NO là yếu tố trung gian trong nhiều hoạt động sinh học, bao gồm giãn mạch, dẫn truyền thần kinh, và ức chế sự kết dính của tiểu cầu Nó cũng tham gia vào quá trình tấn công các tác nhân gây bệnh của đại thực bào và bạch cầu trung tính Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng sự sản sinh NO có ảnh hưởng đáng kể đến các phản ứng miễn dịch.

NO, được kích hoạt bởi các Cytokine, có khả năng loại bỏ các tác nhân gây bệnh và tế bào ung thư, nhưng đồng thời cũng có thể gây hại cho các tế bào khỏe mạnh bình thường.

Định dạng
Số trang	341
Dung lượng	20,07 MB