Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn salmonella s1

Trong những năm gần đây, vấn đề ngộ độc thực pham càng trở nên cấp thiết, các báo cáo cho thấy phần lớn các vụ ngộ độc thức ăn của ngƣời và thức ăn gia xúc là do vi sinh vật. Đã có nhiều cảnh báo nhƣng tình trạng ngộ độc thực pham ngày càng leo thang, diễn biến phức tạp và ngày càng nghiêm trọng cho cả ngƣời và động vật vị nhiễm bệnh do vi sinh vật gây nên. Có rất nhiều vi sinh vật gây ngộ độc thực pham và gây bệnh lý đƣờng ruột, ví dụ nhƣ Salmonella, Clotridium butolinum, Escherichia Coli, Literia monocytogenes…Trong đó, Salmonella là loài vi sinh vật gây ngộ độc rất nguy hiểm. Salmonella thuộc họ Enterobacteriaceae, gây ra bệnh thƣơng hàn, nhiễm trùng huyết và nhiều bệnh nghiêm trọng khác không chỉ đối với con ngƣời mà cả gia xúc, gia cầm hay các loài động vật khác. Theo dự đoán của WHO, trên toàn thế giới có hơn 16 triệu ca bệnh thƣơng hàn hàng năm, hơn nửa triệu trong số đó là tử vong. Riêng tại Việt Nam đã có nhiều trƣờng hợp ngộ độc hàng loạt vì trực khuan Salmonella, nhƣ là tại Thành phố Đồng Hới với gần 250 ngƣời phải nhập viện từ ngày 14 tháng 10 năm 2015 vì bánh mì thịt, bánh mì trứng nhiễm khuan, gần 800 công nhân tại Tiền Giang phải nhập viện từ ngày 3 tháng 10 năm 2013.Tại TP Hồ Chí Minh, trong đợt giám sát thí điểm năm 2013, sau khi lấy 1.618 mẫu tại chợ đầu mối Bình Điên, Hóc Môn, Thủ Đức đã phát hiện Salmonella trong 30% mẫu thịt heo và 45% trong mẫu thịt gà. Các thực pham đƣợc chế biến nhƣ thịt, cá, trứng, sữa, các sảm pham làm từ dừa cũng bị nhiễm khuan Samonella. Trƣờng hợp nhƣ cơ quan An toàn thực pham Canada cảnh báo ngƣời dân ngƣng dùng sản pham dừa Diwa Brand Grated vì có nguy cơ nhiễm khuan Salmonella(2013). Đây là sản pham dừa đông lạnh, xuất xứ từ Philippines, có ghi chú chỉ dành xuất khau. Sữa nhiễm huan salmonella của Pháp ảnh hƣởng đến 83 quốc gia hơn 12 triệu hộp sữa đƣợc thu hồi (2018). Tuy nhiên việc thu hồi thực sự là một thách thức lớn bởi Lactalis, một trong những công ty sữa lớn nhất thế giới, xuất hau sản pham đến 83 quốc gia trên toàn thế giới từ châu u, châu Phi đến châu Á. Vẫn đề nhiễm khuan và ngộ độc thực pham từ vi sinh vật là vẫn đề lớn không chỉ đối với trong nƣớc mà trên toàn cầu. Xuất phát từ nhu cầu tìm hiểu về độc tố, khả năng gây bệnh và cách phát hiện cũng nhƣ cách phòng chống bệnh nhiễm vi khuan salmonella, tôi thực hiện nghiên cứu đề tài “ Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuẩn Salmonella S1 ” để có cái nhìn tổng quan hơn về vi khuan Salmonella. Chủng Salmonella là chủng do bộ môn Vi Sinh – Hóa Sinh thuộc viện Công Nghệ Sinh học Lâm Nghiệp cung cấp.

TỔNG QUAN VỀ VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

Tổng quan về Salmonella

- Năm 1874 nhà nghiên cứu bệnh học Ba Lan Tadeusz Browicz mô tả một loại vi khuan là nguyên nhân gây ra bệnh thương hàn.

- Năm 1880 Karl Joseph Eberth và Robert Koch phát hiện tác nhân gây bệnh sốt thương hàn ở người.

- Năm1884, Georg Gaff y thành công trong việc cấy mầm bệnh trong môi trường nuôi cấy thuần khiết.

Năm 1885, Slamon và Smith (Mỹ) đã phát hiện Salmonella từ lợn mắc dịch bệnh tả và đặt tên là Bacilus cholerasuis, hiện nay được gọi là Salmonella Tuy nhiên, vào năm 1903, Schweinittz và Dorset đã chứng minh rằng dịch bệnh tả là do một loại virus gây ra và xác định s.choleraesui là vi khuẩn gây bệnh phó thương hàn.

Vào năm 1888, A Garter đã phân lập mầm bệnh từ thịt bò và lách của người bệnh, đặt tên cho vi khuẩn này là Bacilus enteritidis Hiện nay, vi khuẩn này được biết đến với tên gọi tương tự.

S.enteritidis Vi khuan này cũng đƣợc gọi bằng nhiều tên hác nhƣ: Bacterium enteritidis, Bacilus gartner,

- Năm 1889 Klein phân lập đƣợc S.gallinarum và Rettger cũng đã phân lập đƣợc

S.pullorum năm 1909 Trước đây người ta cho rằng đây là hai loại vi khuan gây ra hai loại bệnh hác nhau nên đã gọi chung là bệnh phó thương hàn gà (Typhus avium) và căn bệnh đó có tên chung là S.gallinarum-pullorum.

Vào năm 1896, C Archar và Robensauded đã phân lập thành công vi khuẩn S paratyphi equi và S paratyphi bacillus, hiện nay được biết đến với tên gọi S paratyphi B Đến năm 1898, N Guyn và H Keyser đã phát hiện ra vi khuẩn S paratyphi A.

Về phân loại khoa học Salmonella đƣợc xếp vào:

Giống: Salmonella lignieres 1900, Salmonella bongori,

 Các loại Salmonella điển hình:

- Salmonella typhi: Gây bệnh thương hàn.

- Salmonella paratyphi: Gây bệnh phó thương hàn.

- Salmonella cholera – suis: Gây nhiễm trùng máu.

- Salmonella entertidis: Gây rối loạn tiêu hóa.

 Một số chủng Salmonella khác: S.thompson, S.derby, S.newport, S.meleagnidis, S.anatum, S.panama, S.dublin, S.gallinarum, S.pullorum…

Ban đầu, các loài Salmonella được đặt tên theo hội chứng lâm sàng như S.typhi và S.paratyphi A, B, C, hoặc theo vật chủ như S.typhimurium gây bệnh ở chuột Tuy nhiên, sau này, người ta nhận thấy rằng một loài Salmonella có thể gây ra nhiều hội chứng khác nhau và có thể được phân lập từ nhiều loài động vật khác nhau.

Salmonella mới phát hiện đƣợc đặt tên theo nơi mà nó đƣợc phân lập nhƣ S.teheran, S.congo, S.lodon.[ 1 BibekRay (2009)]

Salmonella has historically been classified into various subspecies and species, each with the potential for further subspecies differentiation For instance, the species Salmonella enterica is divided into six subspecies, which include S enterica, S salamae, S arizonae, S diarizonae, and S houtenae.

Các nghiên cứu hiện đại bằng kỹ thuật sinh học phân tử đã cho phép phân loại tất cả các loài Salmonella vào cùng một loài duy nhất Mặc dù quan điểm này đã được đưa ra, nhưng phương pháp truyền thống vẫn được sử dụng phổ biến và có giá trị riêng, do đó chưa được chấp nhận rộng rãi.

Salmonella được phân loại thành các nhóm và type huyết thanh dựa trên cấu trúc kháng nguyên, chủ yếu là kháng nguyên thân O và kháng nguyên lông H Hiện tại, đã xác định được hơn 2500 type huyết thanh Salmonella.

1.1.3.1 Đặc điểm chung và đặc điểm nuôi cấy

Salmonella là vi khuẩn Gram âm, hình que, có khả năng sống trong môi trường hiếu khí và kỵ khí Kích thước của chúng dao động từ 2 – 3 micromet chiều dài và 0,5 – 1 micromet chiều rộng Hầu hết các chủng Salmonella đều có lông bao quanh thân, giúp chúng di chuyển bằng cách sử dụng tiên mao.

S.gallimarum và S.pullorum, không tạo bào tử, không có vỏ và không sinh nha bào Chúng phát triển tốt ở nhiệt độ 6°C - 42°C, thích hợp nhất ở 35°C - 37°C, pH từ 6 – 9 và thích hợp nhất ở pH = 7,2 Ở nhiệt độ từ 18°C - 40°C vi khuan có thể sống tới 15 ngày.

Sức đề kháng của Salmonella:

Salmonella có khả năng sống lâu trong môi trường tự nhiên, cụ thể là 1 tuần trong nước và 2 tháng trong phân Điều này góp phần làm bệnh lây lan thành dịch lớn Chúng có thể tồn tại từ 2 đến 3 tháng trong xác động vật chết, đất bùn và cát hô, cũng như 1 đến 2 tháng trong nước tự nhiên Ánh sáng mặt trời trực tiếp có thể tiêu diệt vi khuẩn này trong nước sau 5 giờ, nhưng cần đến 9 giờ trong nước đục.

-Với nhiệt độ cao: Salmonella bị tiêu diệt ở nhiệt độ 50 trong 1 giờ,

Vi khuẩn có khả năng sống sót trong nhiều điều kiện khắc nghiệt, như chịu đựng nhiệt độ 70°C trong 15 phút và 100°C trong 5 phút Chúng có thể tồn tại trong môi trường thạch ở nhiệt độ -10°C lên đến 115 ngày, và sống từ 4 đến 8 tháng trong thịt ướp muối với tỷ lệ 29% ở nhiệt độ từ 6 đến 12°C.

-Với các hoá chất sát trùng: Bị tiêu diệt bởi các thuốc sát trùng ở nồng độ thông thường như phenol 5%, HCl 1/500, clorua thủy ngân 1%, formol 0,5%, acid fenic 3%

Salmonella là vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, có khả năng phát triển trên các môi trường nuôi cấy thông thường Sau 24 giờ trong điều kiện thích hợp, vi khuẩn này sẽ phát triển Salmonella có thể mọc trên các môi trường có chất ức chế chọn lọc như DCA (deoxycholate citrate agar) và XLD (xylose lysine deoxycholate), trong đó môi trường XLD ít chất ức chế hơn, do đó thường được sử dụng để phân lập Salmonella.

Khuẩn Salmonella có đặc điểm nhận diện rõ ràng trên môi trường nuôi cấy, với khuan lạc hình tròn, lồi, trong suốt và có tâm đen, đôi khi tâm đen lớn bao trùm toàn bộ khuan lạc, khiến môi trường xung quanh chuyển sang màu đỏ Trên môi trường LB (Lysogeny Broth), khuan lạc của Salmonella thể hiện hình dạng tròn, bờ đều, trơn láng, lồi và có màu trắng đục.

Hình 1.1: Vi khuẩn Salmonella [Wattal , C., Kaul, V, Chugh, T.T, Kler, N,

Salmonella có khả năng lên men đường mannitol và glucose, tạo ra khí và gây hiện tượng nứt thạch hoặc đay thạch, đồng thời sinh H2S làm cho thạch chuyển sang màu đen Ngoài ra, Salmonella cũng có khả năng dịch hóa gelatin, nhưng thường không lên men lactose, saccarose, salicin và inositol Vi khuẩn này có thể sử dụng citrate trong môi trường Simmons nhưng không phân giải được urea trong môi trường lỏng RSU.

Các phương pháp phát hiện Salmonella

Salmonella có thể đƣợc phát hiện (phân tích định tính) bằng một quy trình bao gồm 4 bước là tăng sinh, tăng sinh chọn lọc, phân lập và khẳng định.

Salmonella thường xuất hiện với số lượng nhỏ và dễ bị tổn thương, đồng thời cạnh tranh với các vi sinh vật thuộc họ Enterobacteriaceae có khả năng ức chế sự phát triển của Salmonella.

Bước tăng sinh là quá trình quan trọng trong nghiên cứu, trong đó cần chọn quy trình phù hợp dựa trên đặc tính hóa học của mẫu Thông thường, tỷ lệ giữa mẫu và môi trường tăng sinh là 1:9, nhưng tỷ lệ này có thể điều chỉnh tùy thuộc vào từng trường hợp cụ thể.

Bước tăng sinh chọn lọc là quá trình quan trọng trong việc phát hiện Salmonella trong thực phẩm, với các môi trường như Rappaport Vassiliadis (RV), Selenite Cystein Borth và Tetrathionate Muler Kauffmanm Borth (TT) Nghiên cứu gần đây cho thấy môi trường RV có thể thay thế các môi trường khác để phân tích nhiều mẫu khác nhau Tuy nhiên, môi trường TT thường được ưu tiên cho các mẫu thịt tươi sống và những mẫu có mật độ nhiễm cao Để đảm bảo phát hiện đầy đủ các serotype Salmonella, khuyến cáo sử dụng ít nhất hai loại môi trường tăng sinh chọn lọc trong quá trình phân tích.

Bước phân lập Salmonella là quá trình tách và nhận dạng vi khuẩn này khỏi các sinh vật khác trong mẫu Để thực hiện điều này, nhiều loại môi trường rắn khác nhau được sử dụng, giúp nhận diện các giống Salmonella dựa trên các đặc tính riêng Hiện nay, các tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm khuyến khích sử dụng hai loại môi trường khác nhau nhằm nâng cao khả năng phát hiện tất cả các dòng Salmonella, trong đó môi trường XLD (Xylose Lysine Deoxycholate) được đặc biệt khuyến cáo.

Bước khẳng định là quá trình xác định các đặc trưng của Salmonella trong môi trường phân lập, dựa trên các thử nghiệm sinh hóa và huyết thanh Các thử nghiệm sinh hóa khuyến khích bao gồm KIA/TSI, Indol, LDC (Lysine decarboxylase), ODC (Ornithine decarboxylase), Ure, manitol và sobitol, cùng với các thử nghiệm huyết thanh O và H đa giá.

- Môi trường và hóa chất:

+ Birllian Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS)

+ Kháng huyết thanh Salmonella đa giá

1.2.1.2 Phương pháp thực hiện a) Tăng sinh Đối với các loại mẫu thông thường, tiến hành cân 25g mẫu vào túi PE vô trùng, bổ sung 225 ml dung dịch BPW và đồng nhất mẫu trong 15 hoặc 30 giây. Ủ ở 37 trong 18 – 24 giờ Đối với một số loại mẫu có chứa chất gây độc hoặc ức chế sự phát triển của Salmonella cần tiến hành quy trình đặc biệt.

Để xử lý thịt gia cầm tươi sống, bạn cần cho gia cầm vào một túi PE lớn, sau đó thêm 1 lít BPW và lắc đều trong 30 giây bằng máy lắc Điều này giúp môi trường thấm đều vào toàn bộ mẫu thịt.

Để chuẩn bị mẫu sữa khô, bạn cần cân 25g mẫu PE vào túi vô trùng, sau đó thêm 225ml BPW Hãy để hỗn hợp này ở nhiệt độ phòng khoảng 60 phút và lắc đều cho đến khi tan hoàn toàn.

Để tối ưu hóa quá trình tăng sinh, các mẫu gia vị và thực phẩm chứa nhiều gia vị nên được đồng nhất với tỷ lệ 1:100 trong BPW, thay vì tỷ lệ 1:10 như thông thường Biện pháp này giúp giảm nồng độ các chất ức chế sự tăng trưởng.

Salmonella trong bước tăng sinh.

Đối với các sản phẩm như casein, phomat, bơ và các sản phẩm tương tự, cần thực hiện việc đồng nhất mẫu trong môi trường tăng sinh đã được làm ấm đến 40 độ.

Đối với sản phẩm từ dừa và các mẫu có hàm lượng chất béo cao, cần đồng nhất mẫu trong môi trường BPW và thêm 2-3 giọt Triton X-100 trước khi tiến hành ủ tăng sinh Việc này giúp tăng sinh chọn lọc cho các vi sinh vật mong muốn.

Lắc đều dịch tăng sinh và chuyển 0,1 ml vào 10 ml môi trường tăng sinh chọn lọc RV đã được ủ ấm ở 42 độ C Tiến hành ủ trong khoảng thời gian 18 đến 24 giờ, có thể kéo dài thêm 24 giờ nếu cần thiết.

Một số môi trường tăng sinh chọn lọc khác cũng được ử dụng, mỗi loại môi trường chỉ có tác dụng chọn lọc dựa trên đặc điểm tăng sinh của

Để phát hiện tất cả các loài Salmonella có trong thực phẩm, cần sử dụng ít nhất hai loại môi trường tăng sinh chọn lọc khác nhau cho cùng một mẫu, vì một số dòng Salmonella chỉ phát triển trong môi trường nhất định Mỗi môi trường cần được ủ ở các nhiệt độ khác nhau để tối ưu hóa khả năng phân lập và nhận diện.

Sử dụng que cấy vòng để thực hiện kỹ thuật cấy phân lập khuẩn lạc đơn với giống từ dịch tăng sinh chọn lọc trên đĩa môi trường phân lập đặc trưng cho Salmonella như XLD, HE, và BS Cường độ chọn lọc và mức độ phân biệt của Salmonella thể hiện qua hình thái khuẩn lạc trên từng môi trường khác nhau Để đảm bảo việc chọn lọc và nhận dạng tất cả các dòng Salmonella, cần sử dụng ít nhất hai loại môi trường chọn lọc phân biệt khác nhau cho cùng một mẫu.

Salmonella trên từng môi trường khác nhau như sau:

Môi trường XLD khuan lạc có hình dạng tròn, lồi và trong suốt, có thể có hoặc không có tâm đen Đôi khi, tâm đen có kích thước lớn, làm cho môi trường xung quanh chuyển sang màu hồng.

Hình 1.2: Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella trên môi trường XLD [Wu, S.X, Tang, Y

Các iện pháp iểm soát Salmonella trong thực ph m

Xác định được một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuan đường ruột

Salmonella S 1 nhằm cung cấp những thông tin và cơ sở khoa học cần thiết cho các phát hiện, chuan đoán có liên quan.

Nghiên cứu về một số đặc điểm sinh học của vi khuan Salmonella S 1

- Hoạt hóa và nhân giống chủng vi khuan Salmonella S1 và nhuộm Gram

- Xác định hoạt tính của chủng Salmonella S1:

+ Lên men đường glucose, lactose và sinh H2S

+ Thử nghiệm khả năng phân giải Urea

+ Thử nghiệm phân giải đường Manitol

+ Khả năng đề kháng kháng sinh

2.3 Địa điểm và thời gian nghiêm cứu

-Thời gian: Từ ngày 15/1/2018 đến ngày 2/5/2018

- Địa điểm: Bộ môn công nghệ Vi sinh - Hóa sinh – Viện Công Nghệ Sinh học, trường Đại Học Lâm nghiệp Việt Nam.

Chủng vi khuan đường ruột Salmonella S 1 do bộ môn Vi sinh - Hóa sinh thuộc

Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp cung cấp.

2.5 Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Mục tiêu nghiên cứu

Xác định được một số đặc điểm sinh học của chủng vi khuan đường ruột

Salmonella S 1 nhằm cung cấp những thông tin và cơ sở khoa học cần thiết cho các phát hiện, chuan đoán có liên quan.

Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu về một số đặc điểm sinh học của vi khuan Salmonella S 1

- Hoạt hóa và nhân giống chủng vi khuan Salmonella S1 và nhuộm Gram

- Xác định hoạt tính của chủng Salmonella S1:

+ Lên men đường glucose, lactose và sinh H2S

+ Thử nghiệm khả năng phân giải Urea

+ Thử nghiệm phân giải đường Manitol

+ Khả năng đề kháng kháng sinh

Địa điểm và thời gian nghiêm cứu

-Thời gian: Từ ngày 15/1/2018 đến ngày 2/5/2018

- Địa điểm: Bộ môn công nghệ Vi sinh - Hóa sinh – Viện Công Nghệ Sinh học, trường Đại Học Lâm nghiệp Việt Nam.

Đối tƣợng nghiên cứu

Chủng vi khuan đường ruột Salmonella S 1 do bộ môn Vi sinh - Hóa sinh thuộc

Viện Công nghệ Sinh học Lâm nghiệp cung cấp.

Thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

Bảng 2.1 : Hóa chất dùng trong nghiên cứu

2.5.2 Thiết bị và dụng cụ

Bảng 2.2: Các thiết bị máy móc

Cân điện Máy đo pH

Lò vi sóng Tủ lạnh

Tủ ấm 37 Máy ly tâm

Tủ sấy Máy nuôi lắc

Nồi hấp khử trùng 121 Tủ hút hóa chất

Box cấy vô trùng Máy lắc Vortex

Bảng 2.3: Các dụng cụ trong nghiên cứu Đĩa petri Que cấy thẳng, que cấy vòng

Ong nghiệm Ong nghiệm khử trùng

Bình tam giác Đèn cồn

Chai chịu nhiệt dung tích 200ml,

Kéo cắt mẫu Giá ống nghiệm inox

Pipet 1ml, 5ml, 10ml Bông không thấm Micropipet 10μl - 200μl Que trải

Túi PE vô trùng Cồn 70° , 90°

Vòng nịt Nước cất vô trùng

Phương pháp nghiên cứu

2.6.1 Phương pháp hoạt hóa và nhân giống chủng vi khuẩn Salmonella S 1

Chủng Salmonella S 1 đƣợc cung cấp bởi bộ môn Vi Sinh – Hóa Sinh viện

Công Nghệ Sinh học Lâm nghiệp.

- Chuan bị môi trường LB (Lysogeny Broth) gồm có:

Sau khi chuẩn bị xong môi trường LB và tiến hành hấp khử trùng đầu côn, bước tiếp theo là trải dịch vi khuẩn lên môi trường LB.

+ Từ ống đông khô hút 100 dịch VK Salmonella S 1 trải lên môi trường LB đặc.

+ Trải: Dùng que trải đều trên đĩa môi trường đến khi khô lại đậy nắp, bọc màng bọc thực pham và nuôi trong 18 - 24 giờ ở 37

- Sau khi VK đã phát triển trên đĩa thạch 24 giờ tiến hành cấy ria để tạo khuan lạc riêng rẽ:

Để tinh sạch chủng vi khuẩn Salmonella, tiến hành cấy ria bằng các kỹ thuật như kiểu chữ chi, chữ T, và ria 3 góc Quá trình cấy ria cần thực hiện cẩn thận, vết cấy phải cạn dần cho đến khi xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ và thuần khiết.

Nhuộm Gram là phương pháp phân loại vi khuẩn thành hai nhóm chính: Gram dương và Gram âm, dựa trên đặc tính hóa lý của thành tế bào Vi khuẩn Gram dương giữ lại phức hợp tím gentians-iod trong khi vi khuẩn Gram âm không giữ được phức hợp này do sự khác biệt trong cấu trúc vách tế bào.

Do vậy, kết quả sau khi nhuộm là vi khuan Gram dương vẫn giữ được màu tím của gentians, còn vi khuan Gram âm bắt màu hồng của fucshin.

- Làm tiêu bản mẫu cần nhuộm: Nhỏ một giọt nước cất lên tấm lam kính sạch, sau đó lấy 1/3 khuan lạc dàn đều tan hoàn toàn trong giọt nước.

Cố định mẫu bằng ngọn lửa đèn cồn là một bước quan trọng trong quá trình chuẩn bị tiêu bản Để thực hiện, bạn cần hơ cao tiêu bản trên ngọn lửa đèn cồn và kiểm tra độ nóng bằng cách đặt nhẹ trên mu bàn tay Lưu ý rằng nếu nhiệt độ quá cao hoặc hơ lâu, vi khuẩn có thể bị biến dạng, ảnh hưởng đến kết quả quan sát.

- Dùng thuốc nhuộm kiềm, tím tinh thể hay tím gentian nhuộm mẫu trong 1 phút.

- Rửa nước tối đa 5 giây.

- Thêm dung dịch Lugol (1% iot, 2% KI) trong 1 phút.

- Rửa bằng rƣợu trong 10 giây.

- Phủ lên mẫu với ethanol 95% (hoặc hỗn hợp acetone:ethanol 95% 5:1) vài lần cho đến khi không xuất hiện thêm màu trong mẫu (khoảng 1 phút).

- Nhuộm tiếp với safranin hoặc fuchsin Thời gian: 1 phút theo tài liệu mới nhất.

- Rửa qua nước, để khô.

- Soi dưới kính hiển vi vật kính 100x có giọt dầu.

2.6.3 Các phương pháp xác định hoạt tính của chủng Salmonella S 1

2.6.3.1 Phân giải đường glucose, lactose và sinh H 2 S

Môi trường KIA (Kiliger Iron Agar) được sử dụng để thử nghiệm khả năng sử dụng các nguồn carbon như glucose và lactose, cũng như khả năng sinh H2S Thông qua quá trình lên men glucose, lactose, sinh hơi và khử lưu huỳnh, KIA giúp phân biệt các thành viên trong họ Enterobacteriaceae, đặc biệt là giữa các vi khuẩn lên men và không lên men Các nhóm không lên men lactose thường có xu hướng gây bệnh đường ruột.

Môi trường KIA chứa hai loại đường là 1% Lactose và 0,1% Glucose, cung cấp nguồn carbon cho vi sinh vật Khi cấy chủng vi sinh vật lên môi trường này, có ba trường hợp khác nhau có thể xảy ra đối với sự tăng trưởng của vi sinh vật.

Khi chỉ sử dụng glucose, pH của môi trường sẽ giảm, dẫn đến việc chỉ thị phenol red chuyển từ màu đỏ sang màu vàng, và thạch nuôi cấy cũng sẽ thay đổi màu sắc từ đỏ sang vàng.

Vào thứ hai, quá trình sử dụng lactose và chuyển hóa acid amin tạo ra NH3 làm tăng pH môi trường, khiến chỉ thị Phenol Red chuyển từ màu vàng sang đỏ Sau 18 – 24 giờ nuôi cấy, môi trường sẽ phân chia thành hai phần rõ rệt: màu đỏ và màu vàng.

Trong quá trình nuôi cấy, không nên sử dụng cả hai đường này, vì acid amin là nguồn dinh dưỡng duy nhất, tạo ra NH3 và duy trì pH môi trường ổn định Chỉ thị phenol red không đổi màu, và thạch vẫn giữ nguyên màu đỏ suốt quá trình nuôi cấy.

Vi sinh vật có khả năng khử lưu huỳnh thành H2S sẽ tạo ra kết tủa đen Những vi sinh vật này thường thuộc nhóm lên men glucose và không lên men lactose, dẫn đến sự phân biệt màu sắc đỏ hoặc vàng.

- Salmonella chỉ lên men được đường glucose nên phần nghiêng của môi trường có màu đỏ, phần sâu có màu vàng.

Salmonella thường có khả năng sinh H2S, dẫn đến sự xuất hiện các vệt màu đen trong môi trường nuôi cấy Hiện tượng sinh hơi có thể quan sát rõ qua việc thạch bị vỡ hoặc môi trường bị đẩy lên trên, tạo ra khoảng trống bên dưới đáy ống nghiệm.

Chuan bị môi trường KIA có pH = 6,8 0,2

Sau khi pha xong môi trường đem chuan độ pH từ 6,8 ± 0,2

Bảng 2.4: Công thức môi trường KIA

Sau khi pha và chuan độ xong pH đem hấp khử trùng ở 121

- Sau khi hấp khử trùng xong đổ môi trường vào các ống nghiệm mỗi ống ngiệm 3ml để nghiêng và chờ cho các ống nguội.

Khi môi trường đã nguội, sử dụng que cấy đã được nhúng cồn và hơ nóng cho đến khi đỏ để làm nguội Sau đó, lấy một lượng sinh khối lớn từ khuẩn lạc đã được chọn và cấy thấu xuống đáy của nghiệm, đồng thời ria trên bề mặt nghiêng.

- Sau khi cấy VSV xong nuôi ở 37 ủ từ 18 – 24 giờ có thể ủ đến 48 giờ để theo dõi kết quả.

2.6.3.2 Thử nghiệm khả năng phân giải Urea

Thử nghiệm khả năng phân giải urea được thực hiện trong môi trường urea lỏng RSU (Rustigian – Stuart’s Urea Borth), trong đó có chỉ thị phenol red Chỉ thị này sẽ chuyển màu từ vàng sang đỏ khi pH nằm trong khoảng 6.8 đến 8.4.

Nguyên tắc hoạt động của phương pháp này là phát hiện khả năng phân cắt Urea thành ammonia nhờ vào hoạt tính của vi sinh vật Quá trình này dẫn đến sự kiềm hóa môi trường, làm tăng pH do sự hình thành NH3.

Chuan bị môi trường RSU(Rustigian – Stuart – Urea

Bảng 2.5: Công thức môi trường RSU

- Sau khi pha xong môi trường đem chuan độ pH từ 6,8 ± 0,2

-Hấp khử trùng môi trường và đầu côn 20 - 100𝜇 𝜇 ở 121 trong 20 phút, sau đó lấy ra để nguội

-Tiến hành hút 100𝜇𝜇 dịch Salmonella nuôi lỏng lắc đều cho vào 30ml môi trường RSU đã nguội lắc đều và nuôi ở 37 trong 48 giờ.

- Môi trường có màu hồng nhạt

2.6.3.3 Thử nghiệm phân giải đường Manitol

 Thử nghiệm lên men đường được thực hiện trên môi trường lỏng chứa đường Manitol và chỉ thị Phenol Red.

Môi trường chứa chỉ thị Phenol Red được sử dụng để xác định khả năng phân giải đường Manitol của vi sinh vật Khi vi sinh vật lên men và phân giải đường này, các sản phẩm phụ có tính axit được tạo ra, làm giảm pH của môi trường Kết quả là màu sắc của môi trường chuyển từ đỏ cam sang vàng.

Bảng 2.6: Công thức môi trường phân giải Manitol

Hóa chất Khối lƣợng Đường Manitol 10 g

- Đem môi trường tiến hành chuan độ pH = 6,8 – 7,5.

- Sau khi pha xong môi trường đem chia môi trường vào các lọ thủy tinh chịu nhiệt nhỏ, rồi đi hấp khử trùng cùng với đầu côn.