Tổng hợp và thử tác dụng kháng tế bào ung thư của một số dẫn chất 1,3 dimethyl 1h indazol 6 amin

TỔNG QUAN

Indazol và các dẫn chất mang khung indazol

Indazol là một trong những hợp chất quan trọng thuộc họ dị vòng chứa nitơ, nổi bật với sự đa dạng trong cấu trúc của các dẫn xuất Chất này đã thu hút sự chú ý trong cả quá khứ và hiện tại nhờ vào nhiều ứng dụng sinh học và dược phẩm của nó.

Indazol là một hợp chất có cấu trúc vòng bicyclic, bao gồm vòng pyrazol và benzen Hợp chất này tồn tại dưới hai dạng đồng phân là 1H-indazol và 2H-indazol, trong đó 1H-indazol chiếm ưu thế hơn do tính ổn định nhiệt động học.

Hình 1.1 Các đồng phân của indazol

Indazol là một hợp chất rất hiếm gặp trong tự nhiên Chỉ có một số ít alkaloid được chiết xuất từ thiên nhiên có chứa vòng indazol, như Nigellicin từ Nigella sativa và Nigeglanin từ Nigella routeulifera.

Hình 1.2 Các chất chứa vòng indazol trong tự nhiên

Hợp chất indazol đã được ứng dụng rộng rãi trong dược phẩm nhờ vào các tác dụng dược lý phong phú như kháng khuẩn, kháng nấm, chống ung thư và kháng HIV Các dẫn xuất indazol giữ vai trò quan trọng trong việc hình thành cấu trúc cơ bản của nhiều loại thuốc, điển hình là granisetron, một chất đối kháng thụ thể 5-HT3, được sử dụng để chống nôn trong quá trình hóa trị liệu ung thư.

[14], Benzydamin là một chất chống viêm [14], [40], hay như asitinib, một chất được FDA phê duyệt năm 2012 để điều trị ung thư biểu mô tế bào thận (hình 1.3) [16]

Hình 1.3 Một số thuốc mang cấu trúc indazol

Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất indazol

1.2.1 Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất indazol trên các đích khác nhau

1.2.1.1 Các dẫn chất indazol ức chế tyrosin kinase

Tyrosin kinase là một nhóm enzym quan trọng trong việc vận chuyển gốc phosphat từ ATP đến tyrosin của protein, có vai trò trong việc điều tiết sự tăng sinh, biệt hóa và tồn tại của tế bào Tuy nhiên, hoạt động quá mức của các tyrosin kinase có thể dẫn đến sự phát triển của tế bào ung thư, do đó, ức chế hoạt động của enzym này trở thành một chiến lược quan trọng trong điều trị ung thư Các thụ thể như thụ thể yếu tố tăng trưởng nguyên bào sợi (FFR), thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EFR) và thụ thể yếu tố tăng trưởng nội mô mạch máu (VEFR) là những mục tiêu chính mà các dẫn chất indazol nhắm tới trong điều trị.

Năm 2017, Zhu W và cộng sự đã tổng hợp một loạt dẫn chất 1H-indazol nhằm ức chế nhiều tyrosin kinase Chất 1 cho thấy khả năng ức chế mạnh mẽ FFR-1,2,3 với IC50 lần lượt là 18,0 nM; 1,6 nM và 27,5 nM, cũng như ức chế EFR và dạng đột biến T790M/L858R với IC50 là 4,7 nM và 6,0 nM Nhóm nghiên cứu đã thử nghiệm độc tính của chất 1 trên các dòng tế bào ung thư dạ dày, phổi, tủy xương, thận và bàng quang, và kết quả cho thấy chất 1 ức chế sự tăng sinh của 12 dòng tế bào ung thư với IC50 từ 0,4 nM đến 447,6 nM.

Hình 1.4 Dẫn chất 1H-indazol ức chế tyrokin kinase đa mục tiêu

Năm 2018, Qi Wang và các cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất của 1H-indazol nhằm ức chế nhiều tyrosin kinase Kết quả cho thấy chất 2 (hình 1.5) có khả năng ức chế enzym tốt, với giá trị IC50 đạt 31,1 nM cho từng phân tử đích.

1) và 3,2 nM (DDR2) Tiếp sau đó, nhóm nghiên cứu đã tiến hành thử độc tính của chất

Nghiên cứu cho thấy chất 2 ức chế sự tăng sinh của năm dòng tế bào ung thư, bao gồm ung thư dạ dày, ung thư bạch cầu, ung thư biểu mô tuyến đại trực tràng, ung thư biểu mô phổi và ung thư biểu mô thận, với giá trị IC50 dao động từ 31,8 đến 306,6 nM.

Hình 1.5 Cấu trúc dẫn chất mang khung indazol của Qi Wang và cộng sự

1.2.1.2 Các dẫn chất indazol ức chế indoleamin 2,3-dioxygenase 1

Indoleamin 2,3-dioxygenase 1 (IDO1) là enzym quan trọng trong quá trình chuyển hóa tryptophan qua con đường kynurenin, chiếm khoảng 95% quá trình này, làm cho nó trở thành con đường chính trong chuyển hóa tryptophan Quá trình chuyển hóa này đóng vai trò then chốt trong việc ức chế miễn dịch liên quan đến ung thư Ở các tế bào ung thư, hoạt tính của enzym IDO1 thường cao hơn so với tế bào bình thường, và sự hoạt động quá mức của IDO1 đã được xác nhận trong nhiều loại ung thư như ung thư đại trực tràng, ung thư biểu mô vòm họng, ung thư tuyến tụy và ung thư phổi không phải tế bào nhỏ.

Các nghiên cứu cho thấy IDO1 ức chế hệ miễn dịch thông qua hai cơ chế chính: giảm nồng độ tryptophan và độc tính của các chất chuyển hóa qua con đường kynurenin.

Hoạt động tăng cường của IDO1 dẫn đến sự gia tăng chuyển hóa tryptophan, làm giảm nồng độ tryptophan trong cơ thể, từ đó ngăn chặn chu trình tế bào và tăng cường nhạy cảm với sự chết tế bào theo chương trình ở tế bào lympho T Các chất chuyển hóa từ con đường kynurenin cũng đóng vai trò quan trọng trong việc ức chế chu trình tế bào, kích hoạt quá trình chết tế bào theo chương trình, hoặc gián tiếp ngăn chặn sự phát triển của tế bào.

IDO1 đóng vai trò quan trọng trong việc giúp tế bào ung thư lẩn tránh hệ miễn dịch và kháng lại các liệu pháp điều trị, thông qua việc biệt hóa tế bào T ức chế (Treg) Nghiên cứu lâm sàng cho thấy bệnh nhân có nồng độ IDO1 thấp thường đáp ứng tốt hơn với các liệu pháp điều trị Vì vậy, IDO1 trở thành một mục tiêu tiềm năng trong chiến lược điều trị ung thư, dẫn đến việc tổng hợp các chất ức chế IDO1 đang được tiến hành mạnh mẽ.

Hình 1.6 Cơ chế lẩn tránh miễn dịch thông qua IDO

Vào năm 2017, Manna và các cộng sự đã thực hiện nghiên cứu tổng hợp các dẫn chất 1H-indazol nhằm mục tiêu ức chế enzym IDO1 Kết quả nghiên cứu cho thấy trong số các dẫn chất được tổng hợp, có những chất đáng chú ý với khả năng ức chế enzym này.

3 và 4 (hình 1.7) cho hoạt tính ức chế enzym mạnh nhất với giá trị IC50 tương ứng là

Hình 1.7 Dẫn chất 1H-indazol ức chế IDO1

1.2.1.3 Các dẫn chất indazol ức chế serin/threonin kinase (STK)

Serin/threonine kinase là nhóm enzym quan trọng trong hoạt động sinh lý tế bào, nhưng sự biểu hiện quá mức của chúng có thể gây ra một số loại ung thư Vì vậy, một chiến lược điều trị ung thư hiệu quả là phát triển các chất ức chế cho một số loại STK như CDK, PLK-4 và ERK1/2.

Nhóm nghiên cứu của Mallinger đã phát triển một loạt dẫn chất 1H-indazol nhằm ức chế CDK, trong đó chất 5 (hình 1.8) cho thấy khả năng ức chế chọn lọc mạnh đối với CDK8 (IC50 = 2,3 ± 0,8 nM) và CDK9 (IC50 = 2,6 ± 0,4 nM) Ngoài ra, chất 5 còn có tác dụng ức chế con đường truyền tín hiệu WNT trong tế bào ung thư biểu mô tuyến trực tràng.

Hình 1.8 Dẫn chất 1H-indazol ức chế CDK

Nhóm nghiên cứu của Cao đã tổng hợp các dẫn chất từ chất đường 6 và thử nghiệm tác dụng ức chế hoạt động của enzym ERK1/2 Kết quả cho thấy ba chất 7, 8, 9 (hình 1.9) có khả năng ức chế enzym rất tốt, với giá trị IC50 dao động từ 9,3 đến 25,8 nM Khi thử độc tính trên dòng tế bào ung thư đại trực tràng, ba chất này cũng cho kết quả khả quan, với IC50 từ 0,9 đến 6,1 µM.

Hình 1.9 Dẫn chất 1H-indazol ức chế ERK1/2

1.2.2 Hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol trên các đích khác nhau

1.2.2.1 Các dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế tyrosin kinase

Nhiều dẫn chất tại vị trí số 6, đặc biệt là pazopanib, có hoạt tính chống ung thư hiệu quả Pazopanib, một chất ức chế tyrosin kinase được FDA phê duyệt năm 2009, được chỉ định điều trị ung thư biểu mô tế bào thận tiến triển và ức chế chọn lọc VEFR - 1,2,3 Nghiên cứu cho thấy sự kết hợp giữa 3-methylindazol và chuỗi pyrimidin qua cầu nối nitơ ở vị trí số 6 quan trọng cho hoạt tính và tăng sinh khả dụng đường uống Trong thử nghiệm lâm sàng pha III, pazopanib đã chứng minh hiệu quả vượt trội trong việc cải thiện tỷ lệ đáp ứng và kéo dài thời gian không tiến triển của bệnh ở cả bệnh nhân chưa điều trị và những người đã điều trị bằng cytokin trước đó.

Hình 1.10 Cấu trúc của pazopanid

Năm 2018, Zang và các đồng nghiệp đã tổng hợp các dẫn chất dựa trên cấu trúc của pazopanid nhằm ức chế đồng thời cả VEFR và HDAC, trong đó có chất 10.

Chất 10 cho thấy tác dụng ức chế VEFR gần tương đương với pazopanib (IC50 = 0,037 μM so với pazopanib, IC50 = 0,034 μM) Đồng thời, chất này ức chế HDAC mạnh hơn nhiều so với SAHA, một chất ức chế HDAC đã được FDA cấp phép (HDAC IC50 0,0033 μM so với SAHA, HDAC IC50 = 0,13 μM) Kết quả thử độc tính tế bào cũng cho thấy chất 10 ức chế tế bào ung thư đại trực tràng HT29 hiệu quả hơn so với SAHA (HT29 IC50 = 1,07 μM so với SAHA, HT29 IC50 = 1,51 μM).

Hình 1.11 Dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol ức chế nhiều tyrosin kinase

Một số phản ứng liên quan đến tổng hợp dẫn chất indazol

1.3.1 Các phản ứng hóa học cơ bản

1.3.1.1 Phản ứng N-alkyl hóa theo Hoffman Đây là phản ứng thế ái nhân lưỡng phân tử (SN2) giữa tác nhân ái nhân là amoniac hoặc amin với các alkyl halogenid [1]

Các amin có tính ái nhân yếu cần chất xúc tác là base để chuyển đổi từ dạng phân tử sang dạng anion, từ đó tăng cường tính ái nhân và làm cho phản ứng diễn ra dễ dàng hơn.

Tỷ lệ mol của các chất tham gia phản ứng đóng vai trò quan trọng trong mức độ alkyl hóa sản phẩm, ảnh hưởng trực tiếp đến tỷ lệ tạo thành các bậc amin Việc lựa chọn tỷ lệ mol phản ứng ban đầu là yếu tố quyết định cho sự hình thành các sản phẩm mong muốn Thông thường, các alkyl halogenid có mạch carbon ngắn như methyl halogenid và ethyl halogenid được sử dụng, với ưu điểm là chúng có nhiệt độ sôi thấp, chẳng hạn như CH3I có nhiệt độ sôi 42 °C.

1.3.1.2 Phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm

Khử hóa là quá trình giảm độ oxy hóa của chất, trong đó hợp chất hữu cơ nhận thêm nguyên tử hydro, loại bỏ các dị tố như oxy hoặc nhận thêm điện tử Trong ngành công nghiệp hóa dược, quá trình khử nitro thơm thành amin là đặc biệt quan trọng.

Tác nhân khử hóa được phân loại thành ba nhóm chính: thứ nhất, tác nhân khử hóa hóa học, bao gồm kim loại trong môi trường acid và kiềm, hỗn hống kim loại, kim loại kết hợp với amin, và các hydride kim loại; thứ hai, tác nhân khử là hydro phân tử kết hợp với xúc tác; và thứ ba, tác nhân khử hóa điện hóa.

Tác nhân phổ biến để chuyển đổi nhóm nitro thơm thành amin là sử dụng kim loại trong môi trường acid, chẳng hạn như Fe/HCl hoặc Sn/HCl, cùng với hydro phân tử và xúc tác.

• Sắt trong môi trường acid (phản ứng Bechamp)

Phản ứng khử hóa bằng tác nhân Fe trong môi trường acid HCl, được gọi là phản ứng Bechamp, đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất các amin thơm trong ngành công nghiệp Phản ứng này diễn ra theo một phương trình cụ thể, mang lại ý nghĩa thực tiễn lớn trong quá trình chế biến hóa chất.

Sơ đồ 1.1 Phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm bằng sắt trong môi trường acid

• Thiếc trong môi trường acid

Tác nhân khử thiếc có khả năng khử nhiều hợp chất khác ngoài hợp chất nitro, nhưng do giá thành cao nên việc sử dụng trong công nghiệp còn hạn chế Trong khi đó, hydro phân tử, ở điều kiện thường, ít phản ứng nhưng khi có xúc tác, nó được hoạt hóa và có khả năng phản ứng tốt hơn Do đó, phản ứng hydro hóa luôn cần sự có mặt của xúc tác Độ hoạt hóa của xúc tác thể hiện qua lượng hydro hấp phụ trên một đơn vị khối lượng, và xúc tác có thể được sử dụng riêng hoặc gắn lên chất mang để giảm chi phí, đặc biệt trong trường hợp sử dụng kim loại quý.

1.3.1.3 Phản ứng amin hóa khử

Khi các hợp chất carbonyl như aldehyd và ceton phản ứng với amoniac hoặc amin bậc 1, 2 trong sự hiện diện của tác nhân khử, sẽ tạo ra amin bậc 1, 2, 3 tương ứng Phản ứng này diễn ra qua hai giai đoạn.

Giai đoạn 1 của phản ứng là sự tương tác giữa hợp chất chứa nhóm carbonyl với amoniac hoặc amin, dẫn đến sự hình thành imin và thải ra một phân tử nước Phản ứng này thực chất là một phản ứng cộng hợp ái nhân vào nhóm carbonyl Thông thường, acid được sử dụng để proton hóa nguyên tử oxy của nhóm carbonyl, giúp amin dễ dàng tấn công hơn.

Việc sử dụng quá nhiều acid có thể làm giảm tính ái nhân của amin, dẫn đến hiệu suất phản ứng thấp hơn Do đó, phản ứng nên được thực hiện trong môi trường acid yếu để tối ưu hóa kết quả.

Sơ đồ 1.2 Giai đoạn tạo hợp chất trung gian imin

Giai đoạn 2 của quá trình tổng hợp cho thấy rằng các imin mạch hở thường không ổn định và dễ bị khử hóa thành amin Quá trình này có thể xảy ra dưới tác động của nhiều yếu tố, trong đó có hydro phân tử kết hợp với xúc tác kim loại nặng như platinum (Pt).

NaBH3CN, một trong những dẫn chất của boron như NaHB4 và NaBH(OAc)3, là chất xúc tác phổ biến trong các phản ứng amin hóa khử Chất này có ưu điểm nổi bật là khả năng khử chọn lọc liên kết C=N của nhóm imin trong môi trường acid yếu, giúp hạn chế sự hình thành sản phẩm phụ là các alcol.

Sơ đồ 1.3 Giai đoạn khử hóa tạo sản phẩm amin

1.3.2 Một số phương pháp tổng hợp dẫn chất ở vị trí số 6 của indazol

Năm 1996, nhóm nghiên cứu của Morel đã khử nhóm nitro thơm của 1-methyl-6-nitro-1H-indazol bằng SnCl2 trong môi trường acid ở nhiệt độ 100-110 °C trong 2 giờ Sau phản ứng, hỗn hợp được kiềm hóa bằng KOH và chiết với diethyl ether Dung môi hữu cơ được làm khan bằng Na2SO4, sau đó cất quay chân không để loại dung môi Sản phẩm cuối được kết tinh lại bằng hệ dung môi EtOH:H2O = 90:10 với hiệu suất phản ứng đạt 86%.

Sơ đồ 1.4 Tổng hợp 1-methyl-1H-indazol-6-amin bằng tác nhân khử hóa hóa học

Vào năm 2019, nhóm nghiên cứu của Terentjeva S và cộng sự cũng đã tiến hành phản ứng khử nhóm nitro thơm của 6-nitro-1,3-dimethyl-1H-indazol với tác nhân khử

Phản ứng hydro hóa 12 hóa chất bằng hydro phân tử với xúc tác Pd/C trong dung môi MeOH được thực hiện ở nhiệt độ phòng Sau khi hoàn tất, xúc tác được lọc bỏ, tạo ra muối với HCl và thu được sản phẩm là chất rắn màu trắng với hiệu suất đạt 81%.

Sơ đồ 1.5 Tổng hợp 1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin bằng khí H 2 với xúc tác Pd/C

NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu, thiết bị sử dụng

Các dung môi và hóa chất cho tổng hợp hóa học chủ yếu đến từ các hãng Merck (Đức), AKSci (Mỹ) và Trung Quốc Những hóa chất này được sử dụng trực tiếp mà không qua tinh chế, như được trình bày trong bảng 2.1 dưới đây.

Bảng 2.1 Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu

STT Tên nguyên liệu Nguồn gốc, xuất xứ

1 3-methyl-6-nitro-1H-indazol Trung Quốc

10 Ethyl acetat (EtOAc) Trung Quốc

13 Acid acetic (AcOH) Trung Quốc

22 Bản mỏng silicagel 60 F254 Merck - Đức

Trong phòng thí nghiệm, các dụng cụ thủy tinh như bình cầu đáy tròn, đũa thủy tinh, bình chịu áp Sigma-Aldrich, sinh hàn, pipet chia vạch, cốc thủy tinh, phễu lọc, phễu Buchner, bình nón, bình chiết và ống đong đóng vai trò quan trọng trong việc thực hiện các thí nghiệm chính xác và hiệu quả.

- Cân kĩ thuật điện tử Shimadzu (Nhật Bản)

- Máy khuấy từ gia nhiệt IKA-RTC (Đức)

- Bơm hút chân không DIVAC.1.21 (Mỹ)

- Máy cất quay Buchi R-210 (Thụy Sĩ)

- Máy sinh khí Hydro PH200 (Mỹ) tại Bộ môn Hóa Dược – Trường Đại học Dược

- Thiết bị Hydrogen hóa 3911-PAR (Mỹ) tại bộ môn Hóa Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 MHz được sử dụng tại khoa hóa, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, với chất chuẩn nội Tetramethylsilan (TMS) từ hãng Bruker BioSpin (Thụy Sĩ).

Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân JEOL JNM-LA 300 MHz và máy đo phổ Bruker Avance 500 MHz cùng 125 MHz, sử dụng TMS làm chất chuẩn nội tại, đang được sử dụng tại Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc.

- Sắc kí lớp mỏng (TLC): được tiến hành trên bản mỏng Silicagel kieselgel 60

- Máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện MPA 120 (Mỹ) tại bộ môn Hóa Hữu Cơ – Trường Đại học Dược Hà Nội

Máy đo phổ khối lượng LTQ-Orbitrap của hãng Thermo-Scientific (Mỹ) hiện đang được sử dụng tại Khoa Hóa Học, Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội Đồng thời, máy đo phổ khối LC-MSD-Trap-SL của Agilent (Mỹ) cũng được trang bị tại Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc.

- Máy đo phổ hồng ngoại FTIR Affinity-IS-Shimadzu (Nhật Bản) tại Khoa Hóa Học – Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội

Nội dung nghiên cứu

- Tổng hợp 7 dẫn chất của 1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin, bao gồm:

+ 1,3-dimethyl-N-(pyridin-3-ylmethyl)-1H-indazol-6-amin

- Kiểm tra độ tinh khiết của các chất tổng hợp được

- Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được

2.2.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư

Sau khi tổng hợp, tinh chế và khẳng định cấu trúc các dẫn chất 1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin, chúng đã được thử nghiệm độc tính trên nhiều loại tế bào ung thư, bao gồm A549 (ung thư phổi), SK-HEP-1 (ung thư gan), SNU-638 (ung thư dạ dày), MDA-MB-231 (ung thư vú) và HCT116 (ung thư đại trực tràng).

Phương pháp nghiên cứu

Dựa trên các nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ, việc tổng hợp các dẫn chất theo thiết kế được thực hiện thông qua các phản ứng khác nhau Những phản ứng này đóng vai trò quan trọng trong quá trình tạo ra các hợp chất cần thiết.

+ Phản ứng N-methyl hóa với tác nhân CH3I trong dung môi DMF, dùng K2CO3 làm tác nhân hoạt hóa, tiến hành ở 60 o C

+ Phản ứng khử hóa nhóm nitro thơm dùng tác nhân khử là H2 phân tử với xúc tác 10% Pd/C ở nhiệt độ phòng

+ Phản ứng amin hóa khử với các aldehyd hoặc ceton, sử dụng tác nhân khử hóa hóa học NaBH3CN, tiến hành ở 40 o C

+ Một số phản ứng cơ bản khác

- Theo dõi tiến trình phản ứng bằng TLC

- Tinh chế các chất tổng hợp được bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng hoặc sắc kí cột hở

2.3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Kiếm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và đo nhiệt độ nóng chảy

2.3.1.3 Khẳng định cấu trúc của chất tổng hợp được

Sau khi tổng hợp và tinh chế, các chất được đánh giá độ tinh khiết và xác định cấu trúc bằng các phương pháp phổ như phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), và phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) và carbon (13C-NMR).

2.3.2 Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư invitro

Thử nghiệm hoạt tính kháng tế bào ung thư người (thử độc tính tế bào) in vitro được thực hiện tại Khoa Dược, Trường Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc, sử dụng phương pháp Sulforhodamin B (SRB) Giá trị IC50 được xác định thông qua phần mềm Probits.

Hàm lượng protein tổng số trong tế bào tỷ lệ thuận với mật độ quang (Optical Density - OD) đo được sau khi nhuộm bằng Sulforhodamin B, cho phép xác định lượng tế bào sống sót dựa trên khả năng gắn kết của các acid amin trong protein với thuốc nhuộm.

2.3.2.2 Các dòng tế bào thử nghiệm

Các dòng tế bào thử nghiệm bao gồm:

- A549 (tế bào ung thư phổi)

- SK-HEP-1 (tế bào ung thư biểu mô tế bào gan)

- SNU-638 (tế bào ung thư dạ dày)

- MDA-MB-231 (tế bào ung thư vú)

- HCT116 (tế bào ung thư đại trực tràng)

Các dòng tế bào được mua từ Viện bảo tàng giống chuẩn Hoa Kỳ (ATCC, Manassas, VA, USA) và được nuôi cấy trong môi trường DMEM hoặc RPMI 1640, với sự bổ sung của penicillin, streptomycin, amphotericin B, heparin, chất kích thích tăng trưởng tế bào và huyết thanh bò chửa (FBS).

2.3.2.3 Chất chuẩn đối chiếu dương tính

Etoposide pha trong DMSO được sử dụng làm chất đối chiếu dương tính

Các tế bào ở pha logarit được trypsin hóa và phân tán thành hỗn dịch đơn tế bào trong môi trường DMEM hoặc RPMI có bổ sung 10% FBS, với nồng độ điều chỉnh là 2 x 10^4 tế bào Sau đó, hỗn dịch này được chia đều vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng chứa 180 μL Các đĩa được ủ trong điều kiện 37°C và 5% CO2.

Sau 24 giờ ủ, các mẫu thử được chuẩn bị trong 20 μL môi trường DMEM/RPMI bổ sung 10% FBS từ dung dịch gốc trong dimethylsulfoxid (DMSO) rồi được thêm vào các đĩa ở nhiều nồng độ khác nhau, các đĩa này sau đó được ủ thêm 48 giờ Tất cả các mẫu được chuẩn bị sao cho nồng độ cuối cùng của DMSO là nhỏ hơn 0,1%

Các tế bào được cố định bằng 50 μL dung dịch tricloroacetic 50% lạnh, sau đó ủ ở 4°C trong 1 giờ Sau quá trình ủ, tế bào được rửa sạch 5 lần bằng nước máy.

Các đĩa được để khô tự nhiên và sau đó được nhuộm bằng sulforhodamin B 0,4% trong dung dịch acid acetic 1% trong thời gian 30 phút Sau khi nhuộm, các đĩa được rửa bằng acid acetic 1% để loại bỏ thuốc nhuộm không kết dính.

Sau khi để khô ở nhiệt độ phòng, các đĩa sẽ được xử lý bằng 200 μL dung dịch 10 mM Tris-base không đệm (pH 10,0) để hòa tan phần thuốc nhuộm còn sót lại Độ hấp thụ của dung dịch này sẽ được đo bằng thiết bị ELISA tại bước sóng 515 nm.

Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử tại đó độ hấp thụ giảm 50% so với nhóm chứng, trong đó nhóm trắng âm tính chỉ chứa dung môi Kết quả cuối cùng được tính là giá trị trung bình của bốn lần đo độc lập, với độ hấp thụ không chênh lệch quá 5% Giá trị IC50 được xác định thông qua phần mềm Probits.

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ

Hóa học

Quá trình tổng hợp 7 chất Va-g trong khóa luận được thực hiện theo sơ đồ quy trình chung như sau:

Sơ đồ 3.1 Sơ đồ tổng hợp chung

Trong đó, các nguyên liệu IVa-g được trình bày trong bảng 3.1

Bảng 3.1 Các nguyên liệu IVa-g

3.1.1.1 Tổng hợp dẫn chất trung gian 1,3-dimethyl-6-nitro-1H-indazol (II)

Hợp chất 1,3-dimethyl-6-nitro-1H-indazol (II) được tổng hợp từ 3-methyl-6-nitro-1H-indazol (I) thông qua phản ứng N-methyl hóa với tác nhân CH3I, sử dụng K2CO3 làm xúc tác.

Sơ đồ 3.2 Sơ đồ tổng hợp chất II

- Hòa tan 0,708 g (4 mmol) chất I vào 20,00 mL DMF khan trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 mL, sau đó thêm 1,106 g (8,0 mmol) K2CO3

- Khuấy hỗn hợp trong bình ở 60 o C trong khoảng 1 giờ

- Thêm 0,5 mL (8 mmol) CH3I vào bình phản ứng Tiếp tục khuấy hỗn hợp ở 60 o C trong 3 giờ

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là EtOAc:n-hexan = 1:1

- Làm lạnh bình phản ứng đến nhiệt độ phòng

- Phân tán khối phản ứng vào 25 mL nước cất

- Chiết thu sản phẩm bằng dung môi EtOAc (3 lần, mỗi lần 40 mL), gộp dịch chiết chung của cả 3 lần chiết

- Lắc dịch chiết với NaCl bão hòa, sau đó làm khan bằng Na2SO4

- Tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột hở với hệ dung môi EtOAc:n-hexan, chất II thu được ở hệ EtOAc:n-hexan = 15:85

- Cất quay chân không ở 70 o C loại dung môi

- Sấy khô trong tủ sấy chân không thu được 0,399 g sản phẩm II

- Cảm quan: Chất rắn màu vàng

- Rf = 0,56 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)

3.1.1.2 Tổng hợp dẫn chất trung gian 1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (III)

Hợp chất 1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (III) được tổng hợp từ chất II thông qua phản ứng hydrogen hóa, sử dụng khí H2 hấp phụ lên Pd/C.

Sơ đồ 3.3 Sơ đồ tổng hợp chất III

- Hòa tan 0,382 g (2 mmol) chất II vào 10,00 mL MeOH trong bình phản ứng

Thêm từ từ 50 mg 10% Pd/C Lắp bình phản ứng vào thiết bị Hydrogen hóa,

- Khí H2 được tạo thành trong máy sinh khí hydro và chuyển vào thiết bị Hydrogen hóa

- Đuổi không khí khỏi bình phản ứng bằng cách sục khí H2 từ thiết bị Hydrogen hóa vào bình phản ứng nhiều lần

- Thêm khí H2 vào bình phản ứng đến áp suất 3,5 bar Hỗn hợp được hydro hóa ở nhiệt độ phòng trong 4 giờ

- Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động EtOAc:n-hexan = 1:1

- Khối phản ứng được lọc qua Celite, rửa bằng MeOH

- Dịch lọc được cất quay chân không ở 50 o C để loại dung môi

- Tinh chế sản phẩm bằng sắc ký cột silicagel với pha động EtOAc:n-hexan, chất

III thu được ở hệ EtOAc:n-hexan = 50:50

- Cất quay chân không ở 50 o C loại dung môi

- Sấy khô trong tủ hút chân không thu được 0,290 g sản phẩm III

- Cảm quan: Chất rắn màu nâu đỏ

- Rf = 0,36 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)

3.1.1.3 Tổng hợp các dẫn chất 1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin

Các dẫn chất Va-g được tổng hợp thông qua phản ứng amin hóa khử giữa chất III và các aldehyd hoặc ceton (IVa-g), sử dụng tác nhân khử hóa NaBH3CN Cụ thể, quá trình tổng hợp chất Va diễn ra hiệu quả nhờ vào phản ứng này.

Tổng hợp N-isopropyl-1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (Va) từ nguyên liệu 1,3- dimethyl-1H-indazol-6-amin (III) và aceton (IVa) theo sơ đồ 3.4 như sau:

Sơ đồ 3.4 Sơ đồ tổng hợp chất Va

- Hòa tan 0,161 g (1 mmol) chất III và 0,058 g (1 mmol) chất IVa vào hỗn hợp dung môi gồm 0,28 mL (5 mmol) AcOH và 10,0 mL MeOH trong bình cầu đáy tròn dung tích 100 mL

- Khuấy hỗn hợp trong bình ở nhiệt độ phòng trong 5 phút, sau đó thêm 0,314 g (5,0 mmol) NaBH3CN

- Khuấy hỗn hợp ở 40 o C trong 4 giờ Theo dõi phản ứng bằng TLC với pha động là EtOAc:n-hexan = 1:1

- Pha loãng khối phản ứng với 25 mL DCM

- Chiết với dung dịch NaHCO3 bão hòa (3 lần, mỗi lần 30 mL), gộp pha dung môi hữu cơ của cả 3 lần chiết

- Lắc với NaCl bão hòa, sau đó làm khan bằng Na2SO4

- Tinh chế sản phẩm bằng sắc kí cột hở với hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 6:4

- Cất quay chân không ở 50 o C loại dung môi

- Sấy khô trong tủ sấy chân không thu được 0,182 g sản phẩm Va

- Cảm quan: Chất rắn màu hồng

- Rf = 0,49 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)

Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể ở mục 3.1.3 b) Tổng hợp chất Vb

Tổng hợp N-cyclopentyl-1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (Vb) từ nguyên liệu

1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (III) và cyclopentanon (IVb) theo sơ đồ 3.5 như sau:

Sơ đồ 3.5 Sơ đồ tổng hợp chất Vb

➢ Các bước tiến hành và xử lý phản ứng tương tự như chất Va, thay 0,058 g chất IVa bằng 0,084 g (1 mmol) chất IVb Thu được 0,216 g sản phẩm Vb

- Cảm quan: Chất rắn màu trắng

- Rf = 0,51 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)

Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể ở mục 3.1.3 c) Tổng hợp chất Vc

Tổng hợp N-cyclohexyl-1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (Vc) từ nguyên liệu 1,3- dimethyl-1H-indazol-6-amin (III) và cyclohexanon (IVc) theo sơ đồ 3.6 như sau:

Sơ đồ 3.6 Sơ đồ tổng hợp chất Vc

➢ Các bước tiến hành và xử lý phản ứng tương tự như chất Va, thay 0,058 g chất IVa bằng 0,098 g (1 mmol) chất IVc Thu được 0,212 g sản phẩm Vc

- Cảm quan: Chất rắn màu trắng

- Rf = 0,53 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)

Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể ở mục 3.1.3

Tổng hợp N-benzyl-1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (Vd) từ nguyên liệu 1,3- dimethyl-1H-indazol-6-amin (III) và benzaldehyd (IVd) theo sơ đồ 3.7 như sau:

Sơ đồ 3.7 Sơ đồ tổng hợp chất Vd

➢ Các bước tiến hành và xử lý phản ứng tương tự như chất Va, thay 0,058 g chất IVa bằng 0,106 g (1 mmol) chất IVd Thu được 0,231 g sản phẩm Vd

- Cảm quan: Chất rắn màu hồng

- Rf = 0,42 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)

Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể ở mục 3.1.3 e) Tổng hợp chất Ve

Tổng hợp 1,3-dimethyl-N-(pyridin-3-ylmethyl)-1H-indazol-6-amin (Ve) từ nguyên liệu 1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (III) và 3-pyridincarboxaldehyd (IVe) theo sơ đồ 3.8 như sau:

Sơ đồ 3.8 Sơ đồ tổng hợp chất Ve

➢ Các bước tiến hành và xử lý phản ứng tương tự như chất Va, thay 0,058 g chất IVa bằng 0,107 g (1 mmol) chất IVe Thu được 0,207 g sản phẩm Ve

- Cảm quan: Chất rắn màu hồng

- Rf = 0,58 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)

Khẳng định cấu trúc bằng phổ MS, 1 H-NMR Kết quả được trình bày cụ thể ở mục 1.1.3 f) Tổng hợp chất Vf

Tổng hợp N-(4-florobenzyl)-1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (Vf) từ nguyên liệu 1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (III) và 4-florobenzaldehyd (IVf) theo sơ đồ 3.9 như sau:

Sơ đồ 3.9 Sơ đồ tổng hợp chất Vf

➢ Các bước tiến hành và xử lý phản ứng tương tự như chất Va, thay 0,058 g chất IVa bằng 0,124 g (1 mmol) chất IVf Thu được 0,245 g sản phẩm Vf

- Cảm quan: Chất rắn màu trắng

- Rf = 0,47 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)

Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể ở mục 1.1.3 g) Tổng hợp chất Vg

Tổng hợp N-(3-florobenzyl)-1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (Vg) từ nguyên liệu 1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin (III) và 3-florobenzaldehyd (IVg) theo sơ đồ 3.10 như sau:

Sơ đồ 3.10 Sơ đồ tổng hợp chất Vg

➢ Các bước tiến hành và xử lý phản ứng tương tự như chất Va, thay 0,058 g chất IVa bằng 0,124 g (1 mmol) chất IVg Thu được 0,234 g sản phẩm Vg

- Cảm quan: Chất rắn màu trắng

- Rf = 0,46 (TLC, silica gel 60 F254, hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)

Khẳng định cấu trúc bằng phổ IR, MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR Kết quả được trình bày cụ thể ở mục 1.1.3

Kết quả tổng hợp được các dẫn chất như sau (Bảng 3.2):

Bảng 3.2 Thông số cảm quan và hiệu suất tổng hợp các dẫn chất Va-g

TT Kí hiệu R Cảm quan Hiệu suất (%)

1 Va Chất rắn màu hồng 89,5

2 Vb Chất rắn màu trắng 94,2

3 Vc Chất rắn màu trắng 87,1

4 Vd Chất rắn màu hồng 91,9

5 Ve Chất rắn màu hồng 82,0

6 Vf Chất rắn màu trắng 91,0

7 Vg Chất rắn màu trắng 86,9

3.1.2 Kiểm tra độ tinh khiết

Sau khi tổng hợp và tinh chế, các chất Va-g được kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng với bản mỏng Silica gel 60 F254 Các chất này được hòa tan trong dung môi EtOAc và chấm lên bản mỏng Hệ dung môi pha động sử dụng là EtOAc:n-hexan với tỷ lệ 1:1 Sau khi thực hiện sắc kí, bản mỏng được sấy khô và quan sát dưới đèn tử ngoại với bước sóng 254 nm, cho thấy một vết tròn rõ ràng Giá trị Rf của các chất được xác định và tổng hợp trong Bảng 3.3.

3.1.2.2 Đo nhiệt độ nóng chảy Đo nhiệt độ nóng chảy của các chất Va-g bằng máy đo nhiệt độ nóng chảy nhiệt điện MPA 12 Kết quả cụ thể được trình bày ở Bảng 3.3 Kết quả nhiệt độ nóng chảy cho thấy: các chất Va-g có điểm chảy rõ ràng, khoảng chênh lệch từ điểm bắt đầu nóng chảy đến nóng chảy hoàn toàn hẹp

Bảng 3.3 Thông số nhiệt độ nóng chảy và giá trị R f của các dẫn chất Va-g

TT Kí hiệu R Nhiệt độ nóng chảy ( o C)

R f (hệ dung môi EtOAc:n-hexan = 1:1)

Kết quả từ sắc kí lớp mỏng và nhiệt độ nóng chảy chỉ ra rằng tất cả các hợp chất tổng hợp được Va-g đều đạt tiêu chuẩn tinh khiết và sẵn sàng cho việc đo phổ.

3.1.3 Khẳng định cấu trúc Để xác định cấu trúc các chất đã tổng hợp được, chúng tôi tiến hành phân tích phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR), và phổ cổng hưởng từ hạt nhân 13 C ( 13 C-NMR) Kết quả được trình bày dưới đây:

Phổ hồng ngoại được thu thập bằng máy FTIR Affinity-IS của Shimadzu (Nhật Bản) tại Khoa Hóa học, Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN Các phổ đồ chi tiết được trình bày trong các Phụ lục 1-6, trong khi kết quả phân tích số liệu phổ hồng ngoại được tóm tắt ở Bảng 3.4.

Bảng 3.4 Số liệu phổ hồng ngoại của các dẫn chất Va-g

Các dẫn chất tổng hợp được phân tích bằng phương pháp phun mù điện tử (ESI-MS) trên máy LTQ - Orbitrap của Thermo - Scientific tại Khoa Hóa học, Đại học Khoa học Tự nhiên - ĐHQGHN, và máy LC-MSD-Trap-SL của Agilent tại Đại học Quốc gia Seoul, Hàn Quốc Kết quả phân tích được ghi lại trong các Phụ lục 7-13 và được tóm tắt trong Bảng 3.5.

Bảng 3.5 Số liệu phổ khối lượng của các dẫn chất Va-g

TT Kí hiệu R CTPT KLPT m/z (ESI-MS)

3.1.3.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR)

Bảng 3.6 Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1 H-NMR của các dẫn chất

TT Kí hiệu Công thức cấu tạo Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 1 H-NMR

7,33 (d, J = 8,61 Hz, 1H, H4); 6,39 (dd, J = 8,58; 1,83 Hz, 1H, H5); 6,23 (d, J = 1,83 Hz, 1H, H7); 3,85 (s, 3H, H8); 3,69 (hep, J = 6,21 Hz, 1H,H14); 2,44 (s, 3H, H9); 1,24 (d,

3.1.3.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C ( 13 C-NMR)

Bảng 3.7 Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C-NMR của các dẫn chất Va-g

TT Kí hiệu R Số liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton

163,7–161,8 (d, 1 J C-F = 241,8 Hz); 148,2; 143,8- 143,8 (d, 3 J C-F = 6.8 Hz); 143,0; 140,1; 130,7- 130,6 (d, 3 J C-F = 8,3 Hz); 123,8-123,8 (d, 4 J C-F 2,7 Hz); 120,8; 115,7; 114,4-114,3 (d, 2 J C-F 21,3 Hz); 113,9-113,8 (d, 2 J C-F = 20.9 Hz);

Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro

Các dẫn chất Va-g đã được đánh giá về khả năng kháng tế bào ung thư trên năm dòng tế bào, bao gồm A549 (ung thư phổi), SK-HEP-1 (ung thư biểu mô gan), SNU-638 (ung thư dạ dày), MDA-MB-231 (ung thư vú) và HCT116 (ung thư đại trực tràng) Kết quả cụ thể về giá trị IC50 của các dẫn chất này được trình bày trong Bảng 3.8.

Bảng 3.8 Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất Va-g

TT Kí hiệu R Độc tính tế bào (IC 50 ) (μM)

BÀN LUẬN

Về tổng hợp hóa học

4.1.1 Phản ứng tổng hợp chất II

Phản ứng tổng hợp chất II là một phản ứng thế ái nhân lưỡng phân tử (SN2) giữa amin thơm bậc 2 (I) và alkyl halogenid CH3I, sử dụng K2CO3 làm xúc tác Phản ứng này được thực hiện trong dung môi DMF và ở nhiệt độ 60 độ C.

Chất I là một amin thơm bậc 2 có tính ái nhân yếu, do đó việc sử dụng K2CO3 tạo môi trường base nhận proton để chuyển chất I từ dạng phân tử sang dạng anion, từ đó làm tăng tính ái nhân của chất I giúp phản ứng xảy ra dễ dàng hơn Ngoài ra, khi vắng mặt môi trường base, sản phẩm alkyl hóa ở vị trí N2 chiếm ưu thế hơn [20] do đó base góp phần định hướng sản phẩm có nhóm CH3 gắn vào N1

CH3I, một alkyl halogenid với cấu trúc ít cản trở không gian, có khả năng alkyl hóa mạnh mẽ và nhanh chóng hơn so với các tác nhân methyl hóa khác Nguyên tử iod có bán kính nguyên tử lớn, dẫn đến liên kết C-I kém bền, giúp iod dễ dàng tách ra khỏi phân tử, từ đó làm tăng khả năng xảy ra phản ứng alkyl hóa.

Dung môi DMF được lựa chọn cho phản ứng dựa trên nghiên cứu của Hunt và cộng sự, cho thấy rằng việc sử dụng DMF mang lại hiệu suất phản ứng cao hơn so với các dung môi khác Hơn nữa, tỷ lệ sản phẩm thế ở vị trí N1 cũng đạt mức cao hơn khi sử dụng DMF.

Tỷ lệ mol của các chất tham gia phản ứng đóng vai trò quan trọng trong quá trình alkyl hóa, ảnh hưởng đến tỷ lệ hình thành các bậc amin trong sản phẩm Việc sử dụng không đủ CH3I sẽ dẫn đến giảm tốc độ và hiệu suất của phản ứng, trong khi việc sử dụng thừa CH3I có thể làm tăng tốc độ phản ứng nhưng cần được cân nhắc cẩn thận.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã lựa chọn tỷ lệ mol phản ứng là 1 mol I tương ứng với 2 mol CH3I, mặc dù CH3I có giá thành cao và có thể gây lãng phí nguyên liệu Hơn nữa, trong quá trình phản ứng, một phần CH3I sẽ bay hơi và việc tăng thêm lượng CH3I không làm tăng hiệu suất phản ứng.

Sản phẩm từ phản ứng N-alkyl hóa là hỗn hợp hai đồng phân 1,3-dimethyl-6-nitro-1H-indazol (N1-chất II) và 2,3-dimethyl-6-nitro-2H-indazol (N2) Thời gian tối ưu cho phản ứng được xác định là 4 giờ Chúng tôi đã thực hiện tinh chế bằng sắc ký cột silicagel với pha động EtOAc:n-hexan, thu được chất II với hiệu suất 52% ở tỉ lệ EtOAc:n-hexan là 15:85 Đồng phân N2 được sử dụng cho việc tổng hợp dẫn chất trong một nghiên cứu khác.

4.1.2 Phản ứng tổng hợp chất III

Phương pháp của Morel mang lại hiệu suất cao hơn, nhưng quá trình phản ứng đòi hỏi kiểm soát nhiệt độ và xử lý phức tạp hơn Hơn nữa, các nghiên cứu trước đây đều sử dụng tác nhân hydro phân tử kết hợp với xúc tác.

Để tiết kiệm chi phí và thuận tiện cho việc thực hiện phản ứng, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp của Terentjeva S [33] với tác nhân khử hóa phù hợp.

Sử dụng xúc tác Pd/C và dung môi MeOH ở điều kiện thường, hỗn hợp sau phản ứng được lọc qua Celite để loại bỏ xúc tác Sau đó, dung môi được cất dưới áp suất giảm, thu được chất III với hiệu suất cao lên tới 90%.

So với tác nhân khử hóa hóa học (SnCl2/HCl), việc sử dụng tác nhân hydro phân tử với xúc tác có một số ưu điểm sau:

- Phản ứng diễn ra ở điều kiện nhẹ nhàng hơn

- Quá trình tinh chế đơn giản hơn do sản phẩm ở dạng base

- Hiệu suất tổng hợp cao

- Sản phẩm khử hóa tương đối sạch nên thuận lợi để tiến hành các phản ứng sau đó

Trong quá trình thực hiện phản ứng với khí H2, cần chú ý kiểm tra kỹ lưỡng các điểm nối, hệ thống ống dẫn và van để ngăn ngừa rò rỉ, vì H2 là khí nhẹ và dễ bay hơi Đồng thời, cần loại bỏ hoàn toàn không khí trong thiết bị trước khi bắt đầu phản ứng, do H2 có nguy cơ cháy nổ khi tiếp xúc với oxy Sản phẩm thu được, amin thơm, cũng rất nhạy cảm với oxy, vì vậy trong quá trình cất chân không, cần kiểm soát nhiệt độ thấp và bảo quản sản phẩm ở nơi lạnh, tránh ánh sáng.

4.1.3 Phản ứng tổng hợp các dẫn chất Va-g

Các dẫn chất Va-g được tổng hợp thông qua phản ứng amin hóa khử giữa aldehyd hoặc ceton (IVa-g) và amin thơm bậc 1 (III), sử dụng NaBH3CN làm tác nhân khử.

Sơ đồ 4.2 Cơ chế phản ứng tổng hợp chất Va-g

Acid acetic được sử dụng để tạo ra môi trường acid yếu, giúp proton hóa nguyên tử oxy của nhóm carbonyl Quá trình này làm tăng tính ái điện tử của nhóm carbonyl, từ đó tạo điều kiện thuận lợi hơn cho amin trong việc tấn công vào nhóm này.

Việc lựa chọn NaBH3CN làm tác nhân khử được lý giải bởi nhiều ưu điểm, bao gồm khả năng khử yếu và định hướng khử nhóm C=N của imin trong môi trường pH acid yếu (5-7) Điều này giúp tránh hình thành các sản phẩm phụ không mong muốn như alcol, thường xảy ra khi sử dụng tác nhân khử mạnh hoặc môi trường acid mạnh Hơn nữa, NaBH3CN còn có độ bền cao trong môi trường acid của phản ứng và giá thành thấp hơn so với nhiều tác nhân khử khác.

Về khẳng định cấu trúc

Chúng tôi đã thực hiện đo phổ hồng ngoại cho các dẫn chất tổng hợp, từ đó phân tích phổ đồ của các chất (Phụ lục 1-6) để nhận diện các dải hấp thụ đặc trưng của nhóm chức và liên kết Kết quả biện giải phổ được trình bày chi tiết trong Bảng 3.4.

Phổ hồng ngoại của các dẫn chất đều xuất hiện dải hấp thụ nằm trong vùng 3435-

3254 cm -1 phù hợp với dao động hóa trị của nhóm N-H amin Dải hấp thụ của nhóm C=N trong 1638-1624 khoảng cm -1

Trên phổ đồ của các dẫn chất tổng hợp, có sự xuất hiện của dải phổ đặc trưng của nhóm C-H trong vòng thơm, nằm trong khoảng 3071-3032 cm-1 Dải hấp thụ này cho thấy sự hiện diện của cấu trúc vòng thơm trong các hợp chất.

39 đặc trưng của các nhóm C=C thuộc vòng thơm xuất hiện mũi đôi các dải hấp thụ trong vùng 1585-1450 cm -1

Phổ đồ của hai chất Vf và Vg xuất hiện dải hấp thụ mạnh lần lượt ở 1225 cm -1 và

1250 cm -1 phù hợp với dao động hóa trị của nhóm C-F thơm

Dưới đây là hình ảnh minh họa phổ đồ hồng ngoại của hợp chất Vf (Hình 4.1)

Hình 4.1 Phổ hồng ngoại của hợp chất Vf

Trên phổ đồ hồng ngoại của Vf thấy xuất hiện các pic của NH-amin hấp thụ tại

3253,91 cm -1 ; pic của C-H vòng thơm tại 3070,68 cm -1 ; pic của C=N tại 1637,56 cm -1 , pic của C=C tại 1562,34 cm -1 và 1452,40 cm -1 , pic của C-F thơm tại 1224,80 cm -1

4.2.2 Phổ khối lượng (MS) Để khẳng định thêm về cấu trúc của 7 dẫn chất tổng hợp được, chúng tôi đã tiến hành ghi phổ ESI-MS (Bảng 3.5) Trên phổ đồ của 7 chất Va-g (Phụ lục 7-13) đều xuất hiện pic ion có giá trị bằng [M+H] + với cường độ mạnh Do đó, có thể sơ bộ khẳng định các chất Va-g đã tổng hợp có đúng số khối như dự kiến

Ví dụ dưới đây trình bày phân tích phổ khối lượng của chất Vf, nhằm xác định sự phù hợp giữa công thức phân tử dự kiến và công thức phân tử thực tế của chất Vf được tổng hợp.

Chất Vf có công thức phân tử dự kiến là C16H16FN3, với khối lượng phân tử 269,32 Trên phổ đồ, pic [M+H]+ với cường độ mạnh nhất xuất hiện ở số khối 270,20, cho thấy rằng khối lượng phân tử của chất Vf phù hợp với dự kiến ban đầu.

Hình 4.2 Phổ khối lượng của hợp chất Vf

4.2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR)

Phổ 1 H-NMR cho thấy các tín hiệu đặc trưng của các proton của 7 dẫn chất tổng hợp được qua số liệu về độ dịch chuyển hóa học, độ bội, hằng số tương tác spin-spin J, và cường độ của các pic được trình bày ở Bảng 3.6 và Phụ lục 14-20

Trên phổ đồ của các chất, ta nhân thấy:

- Ba proton của vòng 1H-indazol nằm trong vùng dịch chuyển từ 7,40-6,20 ppm

- Ba proton của nhóm N 1 -CH3 nằm trong vùng dịch chuyển từ 3,85-3,77 ppm

- Ba proton của nhóm C 3 -CH3 nằm trong vùng dịch chuyển từ 2,46-2,40 ppm

- Ngoài ra còn có các tín hiệu proton của các nhóm thế khác nhau của nhóm amin thơm bậc hai:

Các proton trong nhóm -CH3 của isopropyl (chất Va) có độ dịch chuyển hóa học là 1,24 ppm, trong khi proton của nhóm -CH trong cùng nhóm isopropyl có độ dịch chuyển là 3,69 ppm.

+ Các proton của nhóm -CH2 (của nhóm cyclopentyl, chất Vb) có độ dịch chuyển là 2,06-1,48 ppm

Các proton trong nhóm -CH2 của cyclohexyl (chất Vc) có độ dịch chuyển nằm trong khoảng 2,15-1,24 ppm, trong khi proton của nhóm -CH trong cyclohexyl có độ dịch chuyển từ 3,35-3,25 ppm.

+ Các proton của vòng benzen và pyridin (chất Vd-g) nằm trong vùng dịch chuyển từ 7,40-6,96 ppm

Trên phổ đồ 1 H-NMR của các dẫn chất Va-g, tín hiệu proton của nhóm N-H không xuất hiện do H của nhóm này linh động và thường trao đổi với dung môi Trong khi đó, phổ hồng ngoại IR cho thấy dải hấp thụ tương ứng với dao động hóa trị của nhóm N-H amin Bên cạnh đó, phổ khối lượng MS xác nhận rằng các chất đều có số khối phù hợp với số khối dự kiến Như vậy, có thể kết luận rằng các dẫn chất Va-g có số H tương ứng với công thức dự kiến.

Sau đây là phổ đồ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR) minh họa của hợp chất Va (Hình 4.3)

Hình 4.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton ( 1 H-NMR) của hợp chất Va

4.2.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C ( 13 C-NMR)

Các dẫn chất Va-g đã được phân tích bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon-13 (13C-NMR) Kết quả đo phổ 13C-NMR của các hợp chất Va-g được trình bày chi tiết trong Bảng 3.7 và Phụ lục 21.

Trên phổ đồ 13 C-NMR của các chất Ve,g, số lượng carbon trong phân tử được thể hiện rõ ràng với cường độ mạnh và sắc nét Ngược lại, phổ đồ của các chất Va,b,c,d,f cho thấy một số tín hiệu carbon không xuất hiện, có thể do lượng mẫu đo không đủ lớn hoặc thời gian đo không đủ dài Tuy nhiên, phổ đồ của cả 7 dẫn chất Va-g vẫn cho thấy độ dịch chuyển hóa học đặc trưng của các carbon nhân thơm, phù hợp với cấu trúc dự kiến Kết quả phân tích phổ 1 H-NMR cũng xác nhận các tín hiệu proton đặc trưng của 7 dẫn chất tổng hợp tương thích với công thức dự kiến Do đó, có thể kết luận rằng các dẫn chất Va-g có cấu trúc phù hợp với dự kiến.

Phổ đồ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C-NMR của hợp chất Ve (Hình 4.4) cho thấy 15 pic rõ ràng, tương ứng với 15 nguyên tử carbon trong công thức C15H16N4, với cường độ mạnh và sắc nét.

Hình 4.4 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C ( 13 C-NMR) của hợp chất Ve

Về thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro

Các dẫn chất Va-g đã được thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư người, bao gồm A549, SK-HEP-1, SNU-638, MDA-MB-231 và HCT116, theo phương pháp SRB Kết quả cho thấy dẫn chất Va có giá trị IC50 > 100 μM trên cả năm dòng tế bào, trong khi các dẫn chất Vb-g thể hiện tác dụng tốt trên ít nhất hai dòng tế bào ung thư Dẫn chất Vf có hoạt tính tốt nhất với giá trị IC50 dưới 60 μM trên tất cả các dòng tế bào thử nghiệm.

Các dẫn chất có nhóm thế cồng kềnh hơn hoặc có cấu trúc vòng cho thấy hiệu quả kháng tế bào ung thư tốt hơn Điều này có thể do các nhóm thế cồng kềnh ở vị trí số 6 của dẫn chất indazol, giúp chúng tương tác hiệu quả với enzym đích, từ đó ức chế sự phát triển của tế bào ung thư.

So sánh độc tính của 2 dẫn chất Vc và Vd trên 4 dòng tế bào A549, SK-HEP-1,

SNU-638 và HCT116 là hai dẫn chất cho thấy hoạt tính kháng ung thư mạnh mẽ hơn Điều này cho thấy rằng các dẫn chất chứa vòng thơm có hiệu quả chống ung thư tốt hơn so với các dẫn chất chứa vòng no.

Trên dòng tế bào MDA-MB-231, chỉ có hai dẫn chất Vf và Vg mang nhóm thế floro trên vòng thơm cho thấy độc tính ở ngưỡng dưới 100 μM Nguyên nhân có thể là do nhóm thế ở vị trí số 6 của hai dẫn chất này có kích thước đủ lớn để tương tác hiệu quả với enzym đích.

So sánh ba dẫn chất Vd, Vf và Vg trên dòng tế bào HCT116 cho thấy hoạt tính của Vf và Vg đều tốt hơn Vd, với Vf có giá trị IC50 là 0,4 μM và Vg là 2,2 μM Điều này gợi ý rằng nhóm thế floro trên vòng thơm có thể tăng cường hoạt tính của các dẫn chất này thông qua khả năng tạo liên kết hydro với mục tiêu tác động, phù hợp với nghiên cứu của Qian và cộng sự.

[31] về vai trò của nhóm halogen ở vị trí số 6 đối với tác dụng kháng ung thư

Nghiên cứu trên 4 dòng tế bào A549, SNU-638, MDA-MB-231 và HCT116 cho thấy dẫn chất Vf có hoạt tính ức chế mạnh hơn so với Vg, củng cố kết quả của Dược sỹ Phùng Huy Hiệu [3] về ảnh hưởng của vị trí nhóm floro trên vòng thơm đối với khả năng kháng ung thư của các dẫn chất 6-benzylamino của indazol Cụ thể, nhóm floro ở vị trí para cho khả năng ức chế tốt hơn so với vị trí meta Kết hợp với nghiên cứu của Qian và cộng sự [31] cùng với các nghiên cứu của DS Phùng Huy Hiệu [3] và DS Nguyễn Minh Hường [2], nhóm nghiên cứu của chúng tôi nhận định rằng các dẫn chất indazol có nhóm thế ở vị trí số 6, đặc biệt là nhóm thế halogen, đóng vai trò quan trọng trong hoạt tính chống ung thư.

Dẫn chất Vf là hợp chất duy nhất trong các dẫn chất tổng hợp có khả năng ức chế cả 5 dòng tế bào ung thư với giá trị IC50 dưới 100 nM Đặc biệt, Vf thể hiện tác dụng vượt trội trên dòng tế bào ung thư trực tràng HCT116 với IC50 = 0,4 μM, mạnh hơn 3,2 lần so với chất chứng dương etoposide (IC50 = 1,27 μM) Điều này cho thấy Vf có tiềm năng trở thành chất dẫn đường trong việc tìm kiếm các hoạt chất mới hiệu quả cho điều trị ung thư trực tràng và các loại ung thư khác.

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Từ các kết quả nghiên cứu đã trình bày có thể rút ra một số kết luận sau:

1.1 Về tổng hợp hóa học Đã tổng hợp được 7 dẫn chất như dự kiến và tất cả các dẫn chất đều chưa từng được công bố trong bất kỳ tài liệu nào trước đây:

+ 1,3-dimethyl-N-(pyridin-3-ylmethyl)-1H-indazol-6-amin

Cấu trúc của dẫn chất N-(3-fluorobenzyl)-1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin đã được xác định thông qua phân tích các dữ liệu phổ IR, MS, 1H-NMR và 13C-NMR.

1.2 Về thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro Đã thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất tổng hợp được, kết quả như sau: Dẫn chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt nhất là Vf với khả năng ức chế cả năm dòng tế bào ung thư A549, SK-HEP-1, SNU-638, MDA-MB-231 và HCT116 với giỏ trị IC50 tương ứng là 6,8 àM; 50,1 àM; 1,8 àM; 47,5 àM; 0,4 àM Dẫn chất Vd thể hiện hoạt tính mạnh trên ba dòng tế bào ung thư A549, SNU-638 và HCT116 với giá trị

Các dẫn chất Ve và Vg cho thấy hoạt tính mạnh mẽ trên các dòng tế bào ung thư HCT116 và SNU-638, với giá trị IC50 lần lượt là 2,7 àM và 2,5 àM; 2,2 àM Trong khi đó, các dẫn chất Va, Vb và Vc thể hiện hoạt tính yếu hơn.

Va không thể hiện độc tính trên cả 5 dòng tế bào

Từ các kết quả trên, chúng tôi xin có một số đề xuất như sau:

- Tiếp tục tổng hợp các dẫn chất 1,3-dimethyl-1H-indazol-6-amin, đặc biệt là các dẫn chất có nhóm thế ở vị trí số 6 mang nhóm thế là halogen

- Tiếp tục thử độc tính tế bào của các dẫn chất tổng hợp được trên một số dòng tế bào ung thư khác.