Nghiên cứu tác dụng chống suy giảm tiểu cầu của carpain và flavonoid từ lá đu đủ trên mô hình gây suy giảm tiểu cầu bằng cyclophosphamid

BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ NINH NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG CHỐNG SUY GIẢM TIỂU CẦU CỦA CARPAIN VÀ FLAVONOID TỪ LÁ ĐU ĐỦ TRÊN MÔ HÌNH GÂY SUY GIẢM TIỂU CẦU BẰNG CYCLOPHOSPH

TỔNG QUAN

Giảm tiểu cầu

Tiểu cầu là tế bào hình đĩa nhỏ được sản xuất từ tủy xương bởi các megakaryocytes, với số lượng bình thường trong máu dao động từ 150.000 đến 450.000/µL, chủ yếu được điều hòa bởi hormon thrombopoietin Đời sống trung bình của tiểu cầu kéo dài từ 7 đến 10 ngày và chức năng chính của chúng là tham gia vào quá trình cầm máu Giảm tiểu cầu nghiêm trọng có thể dẫn đến các biến chứng nghiêm trọng như chảy máu trong, chảy máu não và tử vong.

Giảm tiểu cầu là tình trạng số lượng tiểu cầu trong máu thấp hơn 150.000/µL Triệu chứng chảy máu chỉ xuất hiện khi số lượng tiểu cầu giảm xuống dưới 50.000/µL, và khi tiểu cầu nhỏ hơn 10.000/µL, chảy máu có thể đe dọa tính mạng Những người bị giảm tiểu cầu có nguy cơ chảy máu tương tự như bệnh nhân máu khó đông, nhưng chảy máu chủ yếu xảy ra từ tiểu tĩnh mạch và mao mạch, trong khi bệnh nhân máu khó đông thường chảy máu từ các mạch máu lớn hơn.

1.1.2 Chẩn đoán Để chẩn đoán giảm tiểu cầu, bác sỹ cần kiểm tra tiền sử gia đình, tình trạng sức khỏe, công thức máu toàn phần và tiêu bản máu ngoại vi của người bệnh Sức khỏe tổng thể và thuốc dùng kèm của bệnh nhân có thể ảnh hưởng tới chẩn đoán phân biệt

Hình 1.1 Quy trình chẩn đoán bệnh nhân giảm tiểu cầu [37]

Số lƣợng tiểu cầu < 150 000/mm3

Hemoglobin và số lƣợng bạch cầu

Tiêu bản máu ngoại vi Tiểu cầu: Xác định lại trong natri citrat hoặc heparin

Hình thái hồng cầu bình thường, tiểu cầu bình thường hoặc tăng kích thước

Tế bào hồng cầu bị phân mảnh

Thiếu máu tan máu vi mạch (DIC,

Giảm tiểu cầu do thuốc

Giảm tiểu cầu do nhiễm trùng

Giảm tiểu cầu miễn dịch tự phát

Giảm tiểu cầu bẩm sinh

Giảm tiểu cầu ở người thường xảy ra khi tủy xương sản xuất ít tiểu cầu, tiểu cầu bị giữ lại nhiều ở lách (thường do lách to) hoặc bị phá hủy nhiều hơn Cần lưu ý hiện tượng giảm tiểu cầu giả, có thể do sự kết dính tiểu cầu qua các kháng thể hoặc do chất chống đông EDTA.

Giảm sản xuất tiểu cầu tại tủy xương có thể do nguyên nhân bẩm sinh hoặc mắc phải, với các tác nhân như u ác tính dòng tủy, hóa chất, hoặc nhiễm trùng ức chế chức năng tủy xương Để chẩn đoán tình trạng này, cần đánh giá số lượng và hình thái tế bào megakaryocytic Mặc dù giảm tiểu cầu do di truyền thường hiếm gặp, nhưng cần xem xét chẩn đoán trong trường hợp có tiền sử gia đình liên quan đến giảm tiểu cầu, chảy máu kéo dài, hoặc giảm tiểu cầu không giải thích được ở trẻ sơ sinh và trẻ nhỏ.

- Gần 1/3 tiểu cầu bị bắt giữ ở lách, số lượng này tăng lên theo tỷ lệ kích thước của lỏ lỏch nhưng ớt khi giảm xuống dưới 40000/àL [37]

Tăng phá hủy tiểu cầu có thể xảy ra qua trung gian miễn dịch (giảm tiểu cầu miễn dịch - ITP) hoặc không Giảm tiểu cầu miễn dịch là một bệnh tự miễn, do sự phát triển của tự kháng thể kháng tiểu cầu và sự tăng phá hủy tiểu cầu non, với số lượng tiểu cầu thường nhỏ hơn 150.000/µL và xuất hiện các tự kháng thể trong huyết tương Các kháng thể IgG gắn vào màng tiểu cầu, khiến chúng bị giữ lại bởi đại thực bào trong lá lách, dẫn đến giảm số lượng tiểu cầu trong tuần hoàn Để chẩn đoán ITP, cần khai thác tiền sử bệnh và thực hiện công thức máu toàn phần Nguyên nhân gây ITP thường liên quan đến thuốc, heparin, giảm tiểu cầu do dị ứng ở trẻ sơ sinh, hoặc nhiễm trùng mãn tính như viêm gan C, HIV Tăng phá hủy tiểu cầu không qua trung gian miễn dịch thường gặp ở bệnh nhân thay van cơ học, tiền sản giật, đông máu rải rác nội mạch (DIC) và huyết khối vi mạch.

1.1.4 Một số bệnh lý gây giảm tiểu cầu thường gặp

Nhiều bệnh lý có thể gây giảm tiểu cầu, trong đó các bệnh thường gặp bao gồm xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch, giảm tiểu cầu do bệnh gan mạn tính và sốt xuất huyết Dengue.

Xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch:

Bệnh xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch (ITP) là tình trạng tiểu cầu trong máu bị phá hủy do tự kháng thể kháng tiểu cầu Ở trẻ em, ITP thường xảy ra cấp tính sau một nhiễm trùng, với số lượng tiểu cầu giảm đáng kể và các triệu chứng xuất huyết niêm mạc như xuất huyết miệng, tiêu hóa, kéo dài kinh nguyệt và xuất huyết võng mạc Tình trạng xuất huyết này có thể đe dọa tính mạng người bệnh.

Căn nguyên của ITP (tiểu cầu thấp) vẫn chưa được xác định rõ ràng, nhưng có thể liên quan đến các yếu tố virus hoặc mắc phải Nhiều trường hợp ITP xuất hiện sau khi nhiễm virus, khi kháng thể chống virus có thể liên kết với glycoprotein trên bề mặt tiểu cầu Một số virus như HIV, HCV, CMV và VZV có thể tạo ra những kháng thể này, dẫn đến tình trạng ITP thứ phát Thêm vào đó, sự thay đổi trong phản ứng miễn dịch có thể làm mất khả năng dung nạp và kích thích sự phát triển của tự kháng thể, như trong các bệnh như hội chứng kháng phospholipid, lupus ban đỏ hệ thống, hội chứng Evans, ITP sau ghép tế bào tạo máu, bệnh bạch cầu lympho mạn tính và các rối loạn tăng sinh bạch huyết cấp thấp khác.

Bệnh được chẩn đoán dựa trên các triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng như hội chứng thiếu máu, hội chứng xuất huyết, gan, lách, hạch ngoại vi không to, và số lượng tiểu cầu giảm dưới 100 g/l Mật độ tế bào tủy có thể bình thường hoặc tăng, kèm theo thời gian chảy máu kéo dài Ngoài ra, kháng thể đặc hiệu kháng GPIIb-IIIa (hoặc GPIb) trên bề mặt tiểu cầu hoặc trong huyết thanh cũng cho kết quả dương tính Hiện tại, chẩn đoán xuất huyết giảm tiểu cầu miễn dịch vẫn cần phải loại trừ các nguyên nhân khác gây giảm tiểu cầu.

Giảm tiểu cầu do thuốc (DITP) là nguyên nhân phổ biến gây giảm tiểu cầu cấp qua trung gian miễn dịch ở người lớn, và là một vấn đề lâm sàng quan trọng đối với các chuyên gia huyết học DITP thường xuất hiện đột ngột, có thể trở nặng, gây chảy máu lớn và đe dọa tính mạng bệnh nhân Nhiều bệnh nhân không được chẩn đoán đúng ngay từ lần đầu, thường bị nhầm lẫn với ITP nguyên phát, dẫn đến điều trị không hiệu quả Ngay cả khi DITP được xem xét, việc xác định tác nhân gây bệnh có thể gặp khó khăn, vì bệnh nhân thường không nhận thức được mối liên hệ giữa thuốc và triệu chứng của mình.

Bảy loại thuốc, thực phẩm chức năng, thức ăn và đồ uống mà họ sử dụng có liên quan đến các triệu chứng xuất huyết, nhưng họ không thông báo cho bác sĩ điều trị.

DITP là một phản ứng miễn dịch đặc trưng, trong đó các kháng thể liên quan đến thuốc là những kháng thể bất thường, gắn chặt với các epitop trên glycoprotein của tiểu cầu khi có mặt thuốc gây mẫn cảm Những kháng thể này rất đặc hiệu với cấu trúc thuốc và xuất phát từ một nhóm globulin miễn dịch tự nhiên, vốn không đủ ái lực để liên kết với glycoprotein trên màng tiểu cầu trong điều kiện bình thường Có giả thuyết cho rằng, các thuốc gây giảm tiểu cầu có cấu trúc tích điện hoặc kỵ nước, cho phép chúng liên kết với cả kháng thể và protein trên bề mặt tiểu cầu, tạo ra sự liên kết chặt chẽ Kháng thể này thường xuất hiện sau 1 đến 2 tuần phơi nhiễm thuốc hoặc sau thời gian dài sử dụng không liên tục một loại thuốc Nguyên nhân khiến tiểu cầu là mục tiêu chính của các kháng thể này thay vì bạch cầu trung tính hay hồng cầu vẫn chưa rõ Giảm tiểu cầu do thuốc thường diễn ra đột ngột và phục hồi nhanh chóng.

Giảm tiểu cầu do bệnh gan mạn tính

Giảm tiểu cầu là biến chứng huyết học phổ biến ở bệnh nhân mắc bệnh gan mạn tính, với số lượng tiểu cầu giảm dưới 15000/µL, tỷ lệ này chỉ khoảng 6% ở bệnh nhân viêm gan mạn tính nhưng lên tới 78% ở bệnh nhân xơ gan Nguy cơ giảm tiểu cầu cao hơn ở bệnh nhân xơ gan cần thực hiện thủ thuật, ảnh hưởng lớn đến việc điều trị Hướng dẫn điều trị viêm gan C khuyến cáo không sử dụng interferon cho bệnh nhân giảm tiểu cầu nặng hoặc ngừng điều trị nếu số lượng tiểu cầu dưới 25000/µL Giảm tiểu cầu liên quan chặt chẽ đến xơ gan, ngoại trừ một số ít trường hợp nhiễm HCV Các cơ chế gây giảm tiểu cầu bao gồm giảm hoạt động của thrombopoietin (TPO), ung thư biểu mô gan, ức chế tủy xương do rượu, cường lách thứ phát do tăng áp lực tĩnh mạch cửa, và kháng thể kháng tiểu cầu Tuy nhiên, nguyên nhân chính gây giảm tiểu cầu ở bệnh nhân xơ gan là giảm sản xuất TPO và sự bắt giữ tiểu cầu ở lách, dẫn đến mất chức năng tế bào gan và tăng áp lực tĩnh mạch cửa.

Cường lách thứ phát dẫn đến tình trạng giữ lại máu lâu hơn trong lách, làm gia tăng số lượng tiểu cầu bị bắt giữ, với thể tích lách có thể đạt tới 1000 ml so với mức bình thường 50 - 200 ml Cắt lách và thuyên tắc động mạch lách đã được áp dụng hiệu quả để cải thiện tình trạng giảm tiểu cầu ở bệnh nhân, mặc dù sự tăng trưởng tiểu cầu chỉ mang tính tạm thời Thuyên tắc động mạch lách có thể hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân xơ gan do HCV kèm cường lách, giúp thuận lợi cho việc điều trị bằng interferon Trong khi đó, truyền tiểu cầu là phương pháp chính cho bệnh nhân giảm tiểu cầu nặng, nhưng cần cân nhắc kỹ do thời gian hiệu quả ngắn và nguy cơ phản ứng khi truyền cũng như sự phát triển kháng thể kháng tiểu cầu.

Đu đủ

1.2.1 Đặc điểm thực vật Đu đủ có tên khoa học là Carica papaya, thuộc họ Đu đủ Papayaceae, có nguồn gốc từ vùng nhiệt đới châu Mỹ, sau đƣợc phổ biến đi khắp nơi Tại Việt Nam, Đu đủ đƣợc trồng ở khắp nơi nhƣng việc trồng cây trên quy mô lớn chƣa đƣợc đặt ra Đu đủ đƣợc biết đến nhƣ một loại cây ăn quả trên khắp thể giới [1] Đặc điểm hình thái: cây nhỏ hoặc nhỡ, cao từ 2 đến 4 mét, thân thẳng, không phân nhánh, mang nhiều nốt sẹo do cuống lá rụng để lại Lá to, mọc so le, tập trung ở ngọn, cuống lá rất dài, xẻ 5 - 7 thùy sâu, gốc hình tim, đầu nhọn, mỗi thùy lại chia tiếp thành những thùy nhỏ không đều, gân hình chân vịt, hai mặt nhẵn Hoa màu vàng lục nhạt, mọc ở kẽ lá, hoa đực và hoa cái cùng gốc hoặc khác gốc, cụm hoa đực dài, phân nhánh thùy xim Tràng 5 cánh hàn liền hình phễu, nhị xếp thành hai vòng trên ống tràng Cụm hoa cái có từ 2 đến 3 hoa, đài tràng hơi dính nhau ở gốc, không có nhị lép, bầu một ô, nhiều lá noãn Quả mọng, to, hình trứng ngƣợc hoặc thuôn dài, khi chín màu vàng đỏ, hạt nhiều, màu đen [9]

1.2.2 Thành phần hóa học của cây Đu đủ

Trong những thập kỷ gần đây, nghiên cứu về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của đu đủ đã có những bước tiến đáng kể Các hợp chất như alcaloid, phenol, flavonoid, tanin và glycosid đã được phân lập từ lá cây đu đủ, cho thấy tiềm năng ứng dụng của loại cây này trong y học và dinh dưỡng.

Lá Đu đủ chứa nhiều thành phần quan trọng như alcaloid, bao gồm carpain, pseudocarpain, macrocyclic piperidin, hedydrocapain I và II, cùng với nicotin Capain, với công thức phân tử C28H50N2O4, có khả năng giảm các vấn đề tim mạch và ức chế vi khuẩn lao trong các thí nghiệm in vitro Ngoài ra, lá Đu đủ còn chứa các acid phenolic như acid protocatechuic, acid coumaric, acid caffeic, acid chlorogenic và coumarin, những chất này đều có đặc tính chống oxy hóa mạnh mẽ.

Hình 1.2 Một số acid phenolic có trong lá Đu đủ

1: acid protocatechuic, 2: acid coumaric, 3: acid caffeic, 4: acid chlorogenic Một nghiên cứu về hợp chất caroten trong một số thực vật ở Việt Nam năm 2006 tại khoa sinh học, đại học KHTN-DHQGHN cho thấy, quả Đu đủ có hàm lƣợng β- caroten cao nhất trong 30 mẫu nghiên cứu Carotenoit là một nhóm các hợp chất thực vật thứ sinh phân bố phổ biến trong giới thực vật Chúng đƣợc biết đến nhƣ là các hợp chất có khả năng chống oxi hóa, do đó có thể có chức năng trong phòng chống các bệnh lão hóa Chính vì thế mà ngày nay các nhà khoa học đang rất quan tâm đến khả năng đƣa các chất này ứng dụng trong điều trị bệnh [10]

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử β -caroten

1.2.3 Carpain trong lá Đu đủ

Cấu trúc phân tử của carpain:

Carpain là alcaloid chính có trong cây Đu đủ, đặc biệt tập trung ở lá và hạt Được phân lập lần đầu vào năm 1890 bởi Greshoff, cấu trúc hóa học của carpain đã thu hút sự chú ý trong nghiên cứu, mặc dù tính chất dược lý của nó vẫn chưa được khai thác nhiều Sau 75 năm, cấu trúc hóa học của carpain được xác định là amin bậc 2, với hai vòng piperidin liên kết qua hai nhóm ester, và có dạng đồng phân quang học dextran Nghiên cứu gần đây của Coke và Rice tại Đại học Bắc Carolina, dưới sự tài trợ của Viện tim mạch quốc gia Hoa Kỳ, đã xác định cấu hình tuyệt đối của carpain.

Ngay sau khi phân lập được carpain, Merck và cộng sự đã công bố công thức ban đầu là C14H27NO2, nhưng Van Rjin đã điều chỉnh thành C14H25NO2 Công thức này hiện vẫn được sử dụng trong hầu hết các tài liệu và sách tham khảo mới Trong nhiều năm, đã có nhiều phương pháp được công bố để phân lập và tinh chế carpain.

Carpain, một hợp chất có trong lá đu đủ với nồng độ cao lên tới 0,4%, cung cấp một nguồn nguyên liệu giá cả hợp lý trên thị trường Nghiên cứu về cấu trúc hóa học của carpain đã phát hiện ra một số dẫn xuất như methyl carpain, ethyl carpain, carpain chloroaurat và nitro-carpain Mặc dù carpain tinh khiết hòa tan rất ít trong nước, nhưng dẫn xuất hydrochlorid của nó lại dễ hòa tan hơn Ngoài ra, carpain tan trong các dung môi alcaloid thông thường và có nhiệt độ nóng chảy ở 121 °C.

Tác dụng dược lý của carpain:

Trong nghiên cứu về tính chất dược lý của carpain từ lá đu đủ, carpain ban đầu được cho là tương tự như digitalis và emetin, nhưng không có hầu hết tác dụng phụ của hai chất này Do đó, carpain được sử dụng như một chất kích thích tim và lợi tiểu, mặc dù không có mối liên quan hóa học với digitalis và emetin Tiến sỹ Noble đã chỉ ra rằng liều 20 mg carpain mỗi ngày có hiệu quả tương đương với liều chuẩn của digitalis Người Nhật đã báo cáo carpain là một chất diệt khuẩn hiệu quả trong điều trị bệnh kiết lỵ Ramsawamy và Sirsi đã kết luận rằng carpain có khả năng ức chế vi khuẩn lao ở nồng độ thấp là 10^-4 Nghiên cứu của VishwanathZunjar và cộng sự (2016) cũng chỉ ra rằng carpain kích thích sản sinh tiểu thông qua tác dụng của cao chiết phân đoạn carpain thô và carpain tinh khiết.

12 carpain tinh khiết có tác dụng chống giảm tiểu cầu vƣợt trội so với các cao chiết carpain thô [67]

Phan Thành Nhân và cộng sự (2020) đã thành công trong việc phân lập và tinh chế carpain từ cao chiết cồn lá Đu đủ thông qua phương pháp sắc ký cột chân không Quá trình này bắt đầu từ 8 kg bột lá Đu đủ, sau đó thực hiện chiết cao toàn phần bằng phương pháp ngấm kiệt với ethanol.

Bài viết trình bày quy trình chiết xuất alcaloid từ các cao phân đoạn bằng cách thay đổi pH và lắc với dung môi n-hexan và cloroform, thu được các phân đoạn khác nhau Để xác định phân đoạn chứa nhiều alcaloid, tiến hành chấm sắc ký lớp mỏng (SKLM) Phân đoạn có hàm lượng alcaloid cao hơn sẽ được chọn để phân lập Tiếp theo, các alcaloid được tách ra từ cao chiết toàn phần thông qua sắc ký cột chân không, sử dụng cột sắc ký kích thước 4,5x50 cm, lưới thủy tinh xốp, bình erlen hút chân không 2 lít, ống nghiệm 200 ml, và máy cô quay để thu hồi dung môi.

Sử dụng silica gel kích thước 40-63 để nạp vào cột theo phương pháp cột khô, ổn định bằng dung môi nền dưới áp suất âm với lượng silica gel gấp 10 lần mẫu Mẫu được trộn với silica gel, nghiền mịn và sấy khô ở 40-50 °C Khai triển cột đến khô bằng áp suất hút, mỗi lần sử dụng 100 ml pha động Các phân đoạn đơn giản được loại bỏ dung môi và hòa tan trong dung môi thích hợp để loại bỏ tạp chất Cuối cùng, tinh chế alcaloid trong các dung môi thích hợp, lọc và rửa tinh thể qua phễu thủy tinh xốp bằng dung môi lạnh cùng loại, sau đó kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp SKLM.

Kết quả nghiên cứu cho thấy hợp chất CP1, một alcaloid chính có tên là carpain, đã được phân lập từ 8 kg lá Đu đủ với số lượng 200 mg Sau khi tách và tinh chế bằng phương pháp sắc ký, cấu trúc của CP1 đã được xác định Thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn cho thấy cả cao alcaloid toàn phần và alcaloid chính đều có hiệu quả kháng khuẩn tốt, đặc biệt carpain có khả năng chống lại các vi khuẩn gây bệnh thường gặp Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng ethanol 70% là điều kiện chiết xuất tối ưu để thu được carpain từ lá Đu đủ, sử dụng phương pháp sắc ký cột chân không và dung môi thích hợp để phân lập và tinh chế hợp chất này.

1.2.3 Flavonoid trong lá Đu đủ

Cấu trúc phân tử của flavonoid:

Flavonoid là hợp chất polyphenol với cấu trúc flavan, thường xuất hiện trong nhiều loài thực vật Cấu trúc cơ bản của flavonoid đóng vai trò quan trọng trong các hoạt động sinh học và lợi ích sức khỏe.

Flavonoid là một nhóm hợp chất thực vật có cấu trúc gồm ba vòng phenolic, trong đó vòng A gắn liền với vòng C và vòng B có vị trí tương tự Chúng có sự khác biệt về mức độ oxy hóa và các nhóm thế trên vòng C, cũng như số lượng và loại nhóm thế ở hai vòng A, B Flavonoid được tổng hợp qua con đường phenylpropanoid từ phenylalanin, và tùy thuộc vào loài thực vật cùng các nhóm enzym khác nhau, sẽ tạo ra các flavonoid đa dạng Chúng được chia thành hai nhóm chính: 2-phenylchroman (bao gồm flavonol, flavon, flavanon, flavan-3-ol, anthocyanidin và tannin ngưng tụ) và 3-phenylchroman (isoflavonoid) Mặc dù chalcon có cấu trúc tương tự, nhưng không được xem là flavonoid thực sự Flavonoid nổi bật với khả năng chống oxy hóa mạnh mẽ, giúp loại bỏ các gốc tự do nhờ vào cấu trúc hóa học đặc biệt của chúng, và được biết đến với tác dụng tích cực trong việc phòng ngừa các bệnh như bệnh thoái hóa thần kinh và bệnh tim mạch.

Hình 1.4 Cấu trúc cơ bản của các flavonoid

Nhiều flavonoid đã được xác định trong lá Đu đủ thông qua phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép phổ khối (HPLC-ICP-MS) Các nghiên cứu của Afzan và cộng sự đã phát hiện bốn flavonoid chính, bao gồm quercetin 3-(2G-rhamnosylrutinosid), kaempferol 3-(2G-rhamnosylrutinosid), quercetin 3-rutinosid, và kaempferol 3-rutinosid Trong khi đó, Nguyen và cộng sự dự kiến xác định kaempferol β-D-glucopyranosid, luteolin β-D-glucopyranosid, myricetin 3-rhamnosid, quercetin và rutin Tan và cộng sự đã tìm thấy các flavonoid như apigenin, kaempferol, quercetin, myricetin, isorhamnetin, catechin, hesperitin và naringenin Sử dụng HPLC, Andarwulan và cộng sự đã phát hiện quercetin, kaempferol và apigenin.

Tác dụng dược lý của flavonoid:

Các mô hình gây giảm tiểu cầu đã biết

Hiện nay, nhiều mô hình đã được áp dụng để nghiên cứu cơ chế bệnh sinh của rối loạn giảm tiểu cầu trên động vật thí nghiệm Các phương pháp này bao gồm gây giảm tiểu cầu thông qua hóa trị liệu, sử dụng kháng thể kháng tiểu cầu, và nhiễm virus Dengue, cùng với một số mô hình khác.

1.3.1 Gây giảm tiểu cầu bằng hóa trị liệu

Các hợp chất hóa trị liệu thường ức chế tủy xương, dẫn đến giảm sản xuất các tế bào máu và tiểu cầu Mặc dù hiệu quả trong việc điều trị ung thư, nhưng hóa trị liệu cũng có thể gây ra các tác dụng phụ, bao gồm tình trạng giảm tiểu cầu.

Việc sử dụng 17 tiểu cầu kéo dài có thể tạo ra độc tính quá mức, dẫn đến nguy cơ tử vong cho động vật thí nghiệm Do đó, việc lựa chọn tác nhân hóa trị liệu và phương pháp điều trị phù hợp là rất quan trọng Dưới đây là một số tác nhân hóa trị liệu đã được áp dụng.

Mô hình gây giảm tiểu cầu bằng cyclophosphamid

Hiện nay, nhiều mô hình được áp dụng để mô phỏng cơ chế bệnh sinh của rối loạn giảm tiểu cầu trên động vật thí nghiệm Các phương pháp này bao gồm gây giảm tiểu cầu thông qua hóa trị liệu, sử dụng kháng thể kháng tiểu cầu, và nhiễm virus Dengue, cùng với một số mô hình khác.

Cyclophosphamid là một tác nhân alkyl hoá thuộc nhóm oxazaphosphorin, có tác dụng chống ung thư và ức chế miễn dịch Là một tiền chất, cyclophosphamid được chuyển hoá tại gan thành các chất chuyển hoá hoạt tính như aldophosphamid và phosphoramid, liên kết với ADN, ức chế sao chép ADN và khởi đầu quá trình chết tế bào Cyclophosphamid không phụ thuộc vào chu kỳ tế bào, hoạt động như một tác nhân alkyl hoá protein và ADN, thường được sử dụng trong hóa trị liệu kết hợp với các hoạt chất khác để điều trị các loại ung thư như u lympho ác tính, bệnh bạch cầu, và ung thư vú Tuy nhiên, cyclophosphamid cũng ức chế sự phân chia của các tế bào đang tăng sinh, đặc biệt là tế bào tủy xương, dẫn đến giảm bạch cầu, tiểu cầu và thiếu máu, với mức độ gây giảm tiểu cầu phụ thuộc vào liều lượng sử dụng.

Trong các thí nghiệm nghiên cứu giảm tiểu cầu trên chuột, cyclophosphamid thường được sử dụng làm tác nhân chính, thường qua đường tiêm với các liều lượng khác nhau Một nghiên cứu của NIE Hong và cộng sự (2009) cho thấy khi sử dụng cyclophosphamid với liều nạp 200 mg/kg trong 6 ngày, có tới 60% chuột chết Ngược lại, một nhóm nghiên cứu khác sử dụng liều 150 mg/kg trong 3 ngày không ghi nhận chuột chết, nhưng tiểu cầu giảm từ 33% xuống 11% vào ngày thứ 7 và thứ 11 Tương tự, Tansena Akhter (2014) cũng sử dụng cyclophosphamid với liều 100 mg/kg trong 3 ngày mà không ghi nhận chuột chết, và số lượng tiểu cầu bắt đầu giảm từ ngày thứ 4.

Trong một nghiên cứu của Nur Atik (2018), cyclophosphomid được sử dụng với liều thấp 25 mg/kg trong 3 ngày liên tiếp, và kết quả cho thấy số lượng tiểu cầu giảm từ ngày thứ 4 đến ngày thứ 11.

Một nghiên cứu tại Việt Nam đã khảo sát tác động của cyclophosphamid lên tình trạng giảm tiểu cầu với các liều lượng khác nhau, bao gồm 12,5 mg/kg và 25 mg/kg.

Nghiên cứu đã tiến hành tiêm dưới da các liều TT 50 mg/kg và 100 mg/kg trong 3 ngày liên tiếp để xác định liều lượng phù hợp cho việc đánh giá tác dụng của thuốc Kết quả cho thấy cả 4 mức liều CPA đều gây giảm tiểu cầu rõ rệt vào ngày thứ 7, với tỷ lệ giảm có xu hướng phụ thuộc vào liều lượng Việc thử nghiệm mô hình giảm tiểu cầu bằng cyclophosphamid với nhiều mức liều khác nhau giúp xác định liều tối ưu, giảm độc tính và tỷ lệ tử vong trên động vật thí nghiệm.

Gây giảm tiều cầu bằng busulfan

Busulfan là một tác nhân alkyl hóa, ngăn cản sự sao chép ADN và phiên mã ARN, gây rối loạn chức năng acid nucleic và ảnh hưởng đến các pha của chu kỳ phân chia tế bào Chất này có hai nhóm methansulfonat không bền, liên kết với mạch alkyl 4 carbon Khi tiếp xúc với nước, busulfan bị thủy phân, giải phóng các nhóm methansulfonat và sản sinh ion carbon hoạt động, có khả năng alkyl hóa ADN và gây độc tế bào Busulfan có hoạt tính ức chế miễn dịch yếu và tác động chọn lọc đến tủy xương, với liều thấp ức chế quá trình tạo bạch cầu hạt và một phần tạo tiểu cầu, trong khi ít ảnh hưởng đến tế bào lympho Tuy nhiên, ở liều cao hơn, thuốc có thể ức chế tủy xương mạnh mẽ và không hồi phục.

Trong các thí nghiệm, busulfan đã được sử dụng để giảm tiểu cầu ở cừu thông qua tiêm dưới da với liều 900 mg/m² hai lần mỗi ngày vào ngày đầu tiên và ngày thứ ba Cừu được lấy máu 2 đến 3 đơn vị mỗi ngày trong 2 đến 3 ngày và sau đó đã chết, tuy nhiên thời điểm chết không được xác định rõ Một thí nghiệm khác đã kiểm tra hiệu quả tăng tiểu cầu của capain từ lá đu đủ trên chuột, trong đó busulfan cũng được sử dụng với liều 5 mg/kg tiêm dưới da vào các ngày 1, 5, 10 và 15 Liều này được cho là an toàn vì không gây độc tính nghiêm trọng và làm giảm đáng kể lượng tiểu cầu, từ 623,30*10^9/L vào ngày 1 xuống còn 78*10^9/L vào ngày thứ 20 Thêm vào đó, một mô hình giảm tiểu cầu trên thỏ cũng sử dụng busulfan với nồng độ 25 mg/kg tiêm vào bụng.

19 ngày đầu tiên và ngày thứ 3 Sau đó không phát hiện các biến chứng nào trên thỏ [70]

1.3.2 Giảm tiểu cầu qua kháng thể kháng tiểu cầu

Mô hình giảm tiểu cầu qua kháng thể kháng tiểu cầu, hay mô hình giảm tiểu cầu miễn dịch thụ động, được thực hiện bằng cách tiêm huyết thanh kháng tiểu cầu hoặc các kháng thể đơn dòng đặc hiệu vào vật chủ, dẫn đến tình trạng giảm tiểu cầu Kể từ những năm 1950, mô hình này đã được sử dụng để nghiên cứu chức năng tiểu cầu, bệnh lý giảm tiểu cầu và các tương tác dược lý trên nhiều loài động vật như chuột, thỏ, lợn, cừu và ngựa Năm 1960, Rossolini đã kiểm tra hiệu quả của cortisone trong điều trị giảm tiểu cầu ở lợn thông qua mô hình này, mang lại nhiều kiến thức quan trọng về giảm tiểu cầu miễn dịch vẫn được ứng dụng trong y học ngày nay Đến những năm 1980, các kháng thể đơn dòng kháng tiểu cầu ở người đầu tiên được phát triển, tiếp theo là các kháng thể ở bò, chó và chuột, dẫn đến việc sử dụng kháng thể này trong các mô hình giảm tiểu cầu miễn dịch thụ động Một trong những kháng thể đơn dòng đầu tiên, MReg30, đã được sử dụng để gây giảm tiểu cầu miễn dịch thụ động ở chuột và sau đó được áp dụng rộng rãi trong nghiên cứu.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tƣợng nghiên cứu

Lá đu đủ được thu hái tại Cần Thơ và được định danh bởi Thạc sĩ Cao Ngọc Giang từ Trung tâm Sâm và Dược liệu Thành phố Hồ Chí Minh, Viện Dược liệu Mẫu nghiên cứu được lưu trữ tại Khoa Hóa Thực Vật, Viện Dược liệu, bao gồm các mẫu thử như cao chiết toàn phần, cao chiết phân đoạn, carpain đã tinh chế và cao giàu flavonoid từ lá đu đủ Các mẫu nghiên cứu đã được định lượng hàm lượng carpain và flavonoid, như thể hiện trong bảng 2.1.

TT Mẫu nghiên cứu Hàm lƣợng carpain

Hàm lƣợng flavonoid (Q+K sau thủy phân

Bảng 2 1 Thành phần carpain và flavonoid của một số mẫu nghiên cứu

Cách chuẩn bị các cao chiết này nhƣ sau:

100,0 g dược liệu lá Đu đủ kích thước 0,5 - 1 cm chiết hồi lưu bằng ethanol 70

Quá trình chiết xuất được thực hiện 3 lần với thời gian chiết lần lượt là 2,5 giờ, 2 giờ và 1,5 giờ, cùng với tỷ lệ dung môi/dược liệu là 10:1, 8:1 và 8:1 (10/8/8) Sau khi lọc, dịch chiết được gộp lại và tiến hành cất dung môi dưới áp suất giảm, thu được 27,5 g cao với hiệu suất 27,5% Cao chiết có độ ẩm 4,7%, hàm lượng flavonoid tổng số sau thủy phân tính theo quercetin và kaempferol đạt 0,38%, và hàm lượng carpain là 0,17%.

Ba kilogram lá đu đủ kích thước từ 0,5 đến 1 cm được chiết xuất hồi lưu bằng ethanol 70% Quá trình chiết diễn ra ba lần với thời gian lần lượt là 2,5 giờ, 2 giờ và 1,5 giờ, cùng với tỷ lệ dung môi so với dược liệu được tối ưu hóa.

Dịch chiết được thực hiện với tỷ lệ 21 tích/khối lượng (ml/g) theo các tỷ lệ 10:1, 8:1, 8:1 Sau ba lần lọc, dịch chiết được gộp chung và tiến hành cất loại dung môi dưới áp suất giảm, sau đó cô cạn ở 50 oC cho đến khi còn 3 lít dịch Dịch chiết cô đặc được đưa vào phễu chiết lỏng với các dung môi có độ phân cực tăng dần: dichloromethan (DCM), n-butanol và nước Sau khi cô cạn dung môi, thu được cao dichloromethan (62 g, hiệu suất 2,1%) và cao n-BuOH (56 g, 1,87%) Cao chiết dichloromethan có độ ẩm 5% và hàm lượng carpain 3,3%, trong khi cao chiết n-BuOH có độ ẩm 4,3%, hàm lượng carparin 1,12% và hàm lượng flavonoid tổng số sau thủy phân tính theo quercetin và kaempferol là 2,28%.

Cao giàu flavonoid từ cao phân đoạn n-butanol

Cao chiết n-BuOH được thu từ quá trình chiết phân đoạn cao chiết ethanol 70% từ lá Đu đủ, sau đó tinh chế để thu phân đoạn giàu flavonoid Quá trình tinh chế bắt đầu bằng cách phân tán 30 g cao chiết n-BuOH trong 100 ml nước, lọc để loại bỏ phần không tan Dịch lọc được đưa lên cột D101 và rửa giải lần lượt với H2O, ethanol 10%, 30% và 50%, thu các phân đoạn vào bình nón 50 ml Kiểm tra bằng TLC với hệ dung môi Ethylacetat: H2O: acid formic: acid acetic = 100:26:11:11 cho thấy flavonoid tập trung chủ yếu ở phân đoạn ethanol 30% Các phân đoạn này được gộp lại, cô cạn, sấy khô thu được 7,3 g Phân đoạn giàu flavonoid từ cột D101 được hòa tan trong MeOH và đưa lên cột sephadex LH 20, rửa giải với MeOH, thu các ống nghiệm 10 ml Kiểm tra bằng TLC và HPLC để thu các ống chứa flavonoid, gộp lại thu được 1,8 g phân đoạn giàu flavonoid từ lá Đu đủ, với hàm lượng flavonoid tổng số sau thủy phân tính theo quercetin và kaempferol là 11,79%.

Carpain đƣợc tinh chế từ cao phân đoạn DCM:

Carpain đã tinh chế từ lá Đu đủ: carpain đƣợc tinh chế bởi khoa Hóa Thực Vật, Viện Dƣợc liệu, có độ tinh khiết > 95 %

Pha dung dịch thử bằng cách phân tán cao trong nước cất đến nồng độ phù hợp cho động vật uống Liều dùng được xác định theo khối lượng cao khô tuyệt đối Đối với carpain tinh khiết ở dạng tinh thể, do khó phân tán trong nước, cần thêm 1-2 giọt tween trong quá trình pha chế.

Chuột cống trắng cả hai giống đực và cái chủng Wistar, khỏe mạnh, cân nặng từ

Học viện Quân Y cung cấp chuột có trọng lượng từ 180 - 250 g, được nuôi bằng thức ăn chuẩn từ Viện Vệ sinh Dịch tễ trung ương và uống nước lọc Trước khi tiến hành thí nghiệm, chuột được nuôi trong một thời gian để thích nghi với điều kiện phòng thí nghiệm, đảm bảo chọn lọc những con chuột khỏe mạnh.

2.1.3 Hóa chất thuốc thử, thiết bị nghiên cứu

- Cyclophosphamid: cyclophosphamide monohydrat 5 gam, đạt tiêu chuẩn phân tích, số lô sản xuất: A0412722

- Bơm kim tiêm, lam kính, bông

- Máy xét nghiệm huyết học tự động

Phương pháp nghiên cứu

Hình 2.1 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu

Nghiên cứu này triển khai mô hình giảm tiểu cầu trên chuột bằng cách sử dụng CPA Mục tiêu là đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết toàn phần lá đu đủ trên mô hình chuột đã được gây giảm tiểu cầu.

Nghiên cứu này đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của các cao chiết phân đoạn lá đu đủ, bao gồm carpain tinh khiết và cao giàu flavonoid, trên mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA Các kết quả cho thấy khả năng cải thiện số lượng tiểu cầu, mở ra tiềm năng ứng dụng của lá đu đủ trong điều trị các rối loạn liên quan đến tiểu cầu.

Các nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng độc tính và mức độ giảm tiểu cầu ở chuột do CPA gây ra phụ thuộc vào liều lượng và thời gian sử dụng Nghiên cứu của Nur Atik đã làm rõ mối liên hệ này.

Nghiên cứu năm 2018 cho thấy liều CPA 25 mg/kg TT trong ba ngày dẫn đến giảm tiểu cầu đáng kể từ ngày 4 đến ngày 11 mà không có trường hợp chuột chết Phạm Đức Vịnh và cộng sự (2018) đã khảo sát đáp ứng giảm tiểu cầu với các liều 12,5 mg/kg TT, 25 mg/kg TT, 50 mg/kg TT và 100 mg/kg TT, tiêm dưới da trong ba ngày liên tiếp, cho thấy số lượng tiểu cầu giảm trên 90% ở liều 50 và 100 mg/kg TT, khoảng 86% ở liều 25 mg/kg TT, và gần 50% ở liều 12,5 mg/kg TT Tuy nhiên, liều 50 mg/kg TT và 100 mg/kg TT gây độc tính đáng kể trên chuột Do đó, chúng tôi chọn liều CPA 30 mg/kg TT, tiêm dưới da trong hai ngày liên tiếp, nhằm đạt được mức giảm tiểu cầu khoảng 80%, phù hợp với mức giảm tiểu cầu bệnh lý cho các thí nghiệm tiếp theo.

Nghiên cứu này được thực hiện qua bốn đợt thí nghiệm nhằm đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết toàn phần và các cao chiết phân đoạn từ lá Đu đủ, cũng như carpain và cao giàu flavonoid từ lá Đu đủ trên mô hình chuột gây giảm tiểu cầu bằng CPA.

Đợt 1 của nghiên cứu đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết toàn phần lá Đu đủ, sử dụng hai mức liều là 400 mg/kg và 800 mg/kg trên chuột bị gây giảm tiểu cầu bằng CPA.

Đợt 2 của nghiên cứu tập trung vào việc đánh giá hiệu quả chống giảm tiểu cầu của các chiết xuất từ lá đu đủ, bao gồm phân đoạn nước, n-butanol và DCM, trên chuột bị gây giảm tiểu cầu bằng CPA.

Đợt 3 của nghiên cứu tập trung vào việc đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của carpain, được chiết xuất từ cao phân đoạn DCM, trên chuột đã được gây giảm tiểu cầu bằng CPA.

Đợt 4 nghiên cứu tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết flavonoid từ n-butanol trên chuột bị giảm tiểu cầu bằng CPA Đợt 1 đánh giá tác dụng của cao chiết toàn phần lá Đu đủ với hai liều 400 mg/kg và 800 mg/kg trên chuột cũng bị giảm tiểu cầu bằng CPA Mặc dù các nghiên cứu hiện đại đã chỉ ra rằng lá Đu đủ có tác dụng chống giảm tiểu cầu trên một số động vật, nhưng các dung môi chiết khác nhau, như cao chiết nước trong nghiên cứu của Swati Patil năm 2013, vẫn cần được xem xét thêm.

24 Đu đủ trong nghiên cứu của Tansena Akhter năm 2015 [14], của Sinhalagoda năm

Nghiên cứu năm 2013 đã xác định tác dụng chống giảm tiểu cầu của lá Đu đủ thu hái tại Việt Nam Để đánh giá hiệu quả này, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA, sử dụng cao chiết cồn toàn phần từ lá Đu đủ Dung môi chiết sử dụng là ethanol 70%, một loại dung môi phổ biến trong việc chiết xuất các hợp chất từ thực vật.

Chuột cống trắng được chia thành 4 lô, mỗi lô gồm 8 con cả đực và cái, bao gồm lô sinh lý, bệnh lý, cao chiết ethanol 400 mg/kg TT và ethanol 800 mg/kg TT Các lô bệnh lý và cao chiết ethanol được tiêm dưới da CPA liều 30 mg/kg TT vào ngày thứ nhất và thứ hai, trong khi lô sinh lý được tiêm nước muối sinh lý tương đương Chuột trong hai lô cao chiết ethanol được cho uống cao chiết toàn phần từ đầu đến cuối thí nghiệm với liều lượng khác nhau Trong suốt thí nghiệm, chuột được cung cấp thức ăn đầy đủ, nước cất và vệ sinh sạch sẽ để tránh nhiễm khuẩn Máu được lấy từ tĩnh mạch đùi vào các ngày 0, 4, 6 và 8 để phân tích số lượng hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu Vào ngày 8, thời gian máu chảy được xác định Đợt 2 của thí nghiệm đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của các phân đoạn cao chiết lá Đu đủ trên chuột bị giảm tiểu cầu do CPA, nhằm xác định các nhóm hóa thực vật chính có tác dụng trong cao chiết toàn phần.

Chuột cống trắng được chia thành 5 lô, mỗi lô gồm 8 con cả đực và cái Lô 1 là bệnh lý, lô 2 là phân đoạn nước, lô 3 là phân đoạn butanol, lô 4 là phân đoạn DCM, và lô 5 là sinh lý Chuột trong lô bệnh lý và lô các cao chiết phân đoạn được tiêm dưới da CPA với liều 30 mg/kg vào ngày thứ nhất và ngày thứ hai, trong khi chuột lô sinh lý được tiêm nước muối sinh lý với thể tích tương đương Ngoài ra, chuột lô 2 được cho uống cao chiết nước với liều 800 mg/kg/ngày, lô 3 được uống cao chiết phân đoạn butanol với liều 400 mg/kg/ngày.

Trong nghiên cứu, bốn nhóm đối tượng được uống cao chiết phân đoạn DCM với liều lượng 400 mg/kg thể trọng mỗi ngày, bắt đầu từ ngày đầu cho đến khi kết thúc nghiên cứu Đồng thời, lô 1 và lô 5 được cung cấp nước cất với thể tích tương đương.

Trong suốt quá trình thí nghiệm, chuột được cung cấp thức ăn đầy đủ và nước cất, đồng thời lồng chuột được vệ sinh và thay trấu sạch hằng ngày để ngăn ngừa nhiễm khuẩn Mẫu máu được lấy từ tĩnh mạch đùi của chuột vào các ngày 0, 4, 6 và 8 để phân tích số lượng hồng cầu, tiểu cầu và bạch cầu Vào ngày thứ 8, thời gian máu chảy của chuột được xác định Đợt thí nghiệm thứ ba nhằm đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của carpain chiết xuất từ lá đu đủ trên chuột đã được gây giảm tiểu cầu bằng CPA.

Chuột cống trắng được chia thành 4 lô, mỗi lô gồm 8 con chuột cả đực và cái Lô 1 tập trung vào bệnh lý, lô 2 sử dụng liều carpain 2 mg/kg, lô 3 sử dụng liều carpain 6 mg/kg, và lô 4 nghiên cứu sinh lý.

3 được tiêm dưới da CPA liều 30 mg/kg TT vào ngày thứ nhất và ngày thứ 2 Chuột lô

Phương pháp xử lý số liệu

Dữ liệu được lưu trữ và phân tích bằng phần mềm SPSS 20.0

Vì cỡ mẫu nhỏ hơn 50, dùng phép kiểm định Shapiro-Wilk để kiểm định tính chuẩn của mẫu

Trong phân tích dữ liệu với các mẫu phân bố chuẩn, giá trị được thể hiện dưới dạng X SE, trong đó X là giá trị trung bình và SE là sai số chuẩn Để so sánh sự khác biệt giữa các lô, người ta sử dụng kiểm định ANOVA kết hợp với hậu kiểm LSD hoặc Dunnett's T3.

Khi làm việc với các mẫu không tuân theo phân phối chuẩn, dữ liệu thường được trình bày dưới dạng trung vị và khoảng tứ phân vị Để so sánh sự khác biệt giữa các lô, chúng ta sử dụng kiểm định Kruskal Wallis kết hợp với các hậu kiểm tương ứng.

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

Kết quả nghiên cứu

3.1.1 Kết quả đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết toàn phần lá Đu đủ

3.1.1.1 Ảnh hưởng của cao chiết toàn phần đến số lượng tiểu cầu

Số lượng tiểu cầu đo được qua các ngày được trình bày ở hình dưới đây:

Hình 3.1 Ảnh hưởng của cao chiết toàn phần lá Đu đủ đến số lượng tiểu cầu

Ghi chú: Các nhóm chuột được chia thành ba lô: lô chuột sinh lý, lô chuột bệnh lý, và lô chuột được uống cao chiết ethanol toàn phần từ lá Đu đủ với liều 400 mg/kg TT, cùng với lô chuột uống cao chiết ethanol liều 800 mg/kg TT Kết quả nghiên cứu được trình bày dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn, với các mức ý nghĩa thống kê được chỉ định là *p < 0,05; **p < 0,01; và ***p.

< 0,001 khi so sánh với lô chứng bệnh lý

Kết quả nghiên cứu vào ngày thứ 4 cho thấy, chuột trong lô bệnh lý có số lượng tiểu cầu giảm đáng kể (476,875 ± 27,839) so với lô sinh lý (673,250 ± 40,240), với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,01) Ở lô chuột được điều trị bằng cao toàn phần lá Đu đủ với liều 400 mg/kg TT, không ghi nhận sự khác biệt có ý nghĩa so với lô bệnh lý (p > 0,05) Tương tự, lô chuột sử dụng cao toàn phần lá Đu đủ với liều 800 mg/kg TT cũng không cho thấy tác dụng làm tăng số lượng tiểu cầu so với lô bệnh lý (p > 0,05) vào ngày thứ 4.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, vào ngày 6, chuột lô bệnh lý có số lượng tiểu cầu giảm rõ rệt so với lô sinh lý (249,25 ± 33,328 so với 740,25 ± 43,38; p < 0,001) Lô chuột được uống cao toàn phần lá Đu đủ 400 mg/kg TT không có sự khác biệt có ý nghĩa về số lượng tiểu cầu so với lô bệnh lý (p > 0,05) Tuy nhiên, lô chuột uống cao toàn phần lá Đu đủ 800 mg/kg TT đã làm tăng số lượng tiểu cầu gấp 1,6 lần so với lô bệnh lý (389,375 ± 29,490 so với 249,25 ± 33,328; p < 0,05) Đến ngày 8, chuột lô bệnh lý tiếp tục giảm tiểu cầu so với lô sinh lý (387,5 ± 62,7 so với 727,2 ± 49,1; p < 0,01) Lô cao toàn phần lá Đu đủ 400 mg/kg TT vẫn không cho thấy tác dụng làm tăng số lượng tiểu cầu so với lô bệnh lý (p > 0,05), và số lượng tiểu cầu của lô cao toàn phần 800 mg/kg TT cũng không khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý (p > 0,05).

3.1.1.2 Ảnh hưởng của cao chiết toàn phần đến các tế bào máu khác Ảnh hưởng của cao chiết toàn phần lá Đu đủ đến số lượng bạch cầu:

Số lượng bạch cầu qua các ngày được thể hiện trên hình dưới đây:

Hình 3.2 Ảnh hưởng của cao chiết toàn phần lá Đu đủ đến số lượng bạch cầu

Nghiên cứu này sử dụng ba nhóm chuột: nhóm sinh lý, nhóm bệnh lý và hai nhóm chuột được điều trị bằng cao chiết ethanol từ lá đu đủ với liều lượng 400 mg/kg và 800 mg/kg Kết quả được trình bày dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn, với mức ý nghĩa thống kê **p < 0,01 và ***p < 0,001 khi so sánh với nhóm chứng bệnh lý.

Vào các ngày 4, 6 và 8, số lượng bạch cầu trong lô bệnh lý giảm rõ rệt với các giá trị lần lượt là 1,69 ± 0,39; 2,28 ± 0,20; và 6,75 ± 0,20, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001 cho ngày 4 và 6, p < 0,01 cho ngày 8) Trong khi đó, lô sử dụng cao toàn phần liều 400 mg/kg TT không cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý (p > 0,05) Tương tự, số lượng bạch cầu ở lô cao toàn phần lá Đu đủ liều 800 mg/kg TT cũng không khác biệt có ý nghĩa so với lô bệnh lý (p > 0,05).

Số lượng hồng cầu qua các ngày được thể hiện trên hình dưới đây:

Hình 3.3 Ảnh hưởng của cao chiết toàn phần lá Đu đủ đến số lượng hồng cầu

Nghiên cứu này sử dụng ba lô chuột: lô sinh lý, lô bệnh lý và lô chuột được uống cao chiết ethanol toàn phần từ lá Đu đủ với liều 400 mg/kg TT, cùng với lô chuột uống cao chiết liều 800 mg/kg TT Kết quả được trình bày dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn, nhằm đánh giá hiệu quả của cao chiết ethanol từ lá Đu đủ trên các nhóm chuột khác nhau.

Số lượng hồng cầu trong các lô bệnh lý không khác biệt đáng kể so với lô sinh lý (p > 0,05) Cả chuột uống cao ethanol 400 mg/kg TT và cao ethanol 800 mg/kg TT đều cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa về số lượng hồng cầu so với lô sinh lý (p > 0,05).

3.1.1.3 Ảnh hưởng của cao chiết toàn phần lá Đu đủ đến thời gian chảy máu

Kết quả đánh giá thời gian chảy máu đƣợc thực hiện vào ngày thứ 8 thể hiện trên hình dưới đây:

Hình 3.4 Ảnh hưởng của cao chiết toàn phần lá Đu đủ đến thời gian chảy máu trên chuột

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng ba nhóm chuột: nhóm sinh lý, nhóm bệnh lý và hai nhóm chuột được điều trị bằng cao chiết ethanol từ lá đu đủ với liều 400 mg/kg và 800 mg/kg Kết quả được trình bày dưới dạng trung vị và các tứ phân vị 25% và 75%, với mức ý nghĩa thống kê **p < 0,01 khi so sánh với nhóm chứng bệnh lý.

Thời gian chảy máu của động vật thí nghiệm lô bệnh lý kéo dài đáng kể so với lô sinh lý, với kết quả là 701,3 ± 89,3 so với 231,6 ± 63,1 (p < 0,01) Tuy nhiên, thời gian chảy máu của chuột trong lô cao ethanol 400 mg/kg không cho thấy sự khác biệt so với lô bệnh lý (p > 0,05).

> 0,05) Ngƣợc lại, chuột đƣợc uống cao ethanol 800 mg/kg TT làm giảm thời gian chảy máu 60 % so với chuột lô bệnh lý ( 293,4 ± 89,1 so với 701,3 ± 89,3; p < 0,01)

Thời gian chảy máu (giây)

Sinh lý Bệnh lý ETOH 400 ETOH 800

3.1.2 Kết quả đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của các phân đoạn cao chiết lá Đu đủ khác nhau

3.1.2.1 Ảnh hưởng của các phân đoạn cao chiết lá Đu đủ đến số lượng tiểu cầu

Số lượng tiểu cầu đo được qua các ngày được trình bày ở hình dưới đây

Hình 3.5 Ảnh hưởng của các phân đoạn cao chiết lá Đu đủ đến số lượng tiểu cầu

Ghi chú: Các ký hiệu trong nghiên cứu bao gồm sinh lý (DCM), bệnh lý (BuOH), lô chuột uống cao chiết DCM 400 mg/kg TT, lô chuột uống cao chiết n-butanol 400 mg/kg TT, và lô chuột uống cao chiết nước 800 mg/kg TT Kết quả được trình bày dưới dạng trung bình ± sai số chuẩn, với các mức độ ý nghĩa thống kê được xác định là *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 khi so sánh với lô chuột bệnh lý.

Vào ngày thứ 4, số lượng tiểu cầu trong lô bệnh lý giảm đáng kể so với lô sinh lý (453,125 ± 31,303 so với 729,167 ± 36,070), với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,001) Lô sử dụng cao DCM 400 mg/kg TT có số lượng tiểu cầu thấp hơn so với lô bệnh lý (332,06 ± 40,36 so với 453,125 ± 31,303; p < 0,05) Trong khi đó, số lượng tiểu cầu của lô sử dụng cao n-butanol 400 mg/kg TT và cao chiết nước 800 mg/kg TT cao hơn lô sinh lý, nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê (p > 0,05) Đến ngày thứ 6, số lượng tiểu cầu trong lô bệnh lý tiếp tục giảm mạnh so với lô sinh lý (284,63 ± 27,84 so với 707,00 ± 41,35), với sự sụt giảm có ý nghĩa thống kê (p < 0,001).

Trong khi đó số lượng tiểu cầu hai lô dùng cao DCM 400 mg/kg TT và cao chiết nước

Nghiên cứu cho thấy rằng liều 800 mg/kg TT không tạo ra sự khác biệt đáng kể so với nhóm bệnh lý (p > 0,05) Tuy nhiên, chuột được điều trị bằng cao chiết n-butanol với liều 400 mg/kg TT đã ghi nhận số lượng tiểu cầu là 406,5 ± 41,7, tăng đáng kể so với nhóm bệnh lý có số lượng tiểu cầu là 284,63 ± 27,84 (p < 0,05).

Ngày 8, số lƣợng tiểu cầu lô bệnh lý vẫn thấp hơn có ý nghĩa thống kê so với lô sinh lý (382,3 ± 35,00 so với 742,25 ± 38,80; p < 0,001) Lô cao chiết phân đoạn DCM

Nghiên cứu cho thấy rằng liều 400 mg/kg TT và phân đoạn nước 800 mg/kg TT không làm thay đổi số lượng tiểu cầu so với lô bệnh lý (p > 0,05) Trong khi đó, cao chiết n-butanol 400 mg/kg TT cho thấy tác dụng chống giảm tiểu cầu rõ rệt ở chuột, với số lượng tiểu cầu đạt 548,6 ± 34,3, cao hơn có ý nghĩa so với lô bệnh lý là 382,3 ± 35,00 (p < 0,01).

3.1.2.2 Ảnh hưởng của các phân đoạn cao chiết lá Đu đủ đến thời gian chảy máu

Hình 3.6 Ảnh hưởng của các cao chiết phân đoạn lá Đu đủ đến thời gian chảy máu trên chuột

Trong nghiên cứu này, các lô chuột được phân loại như sau: lô chuột sinh lý, lô chuột bệnh lý, lô chuột uống cao chiết DCM với liều 400 mg/kg TT, lô chuột uống cao chiết n-butanol với liều 400 mg/kg TT, và lô chuột uống cao chiết nước với liều 800 mg/kg TT Kết quả được trình bày dưới dạng trung vị cùng với các tứ phân vị 25% và 75% Sự khác biệt giữa các nhóm được đánh giá với mức ý nghĩa thống kê *p < 0,05 và **p < 0,01 khi so sánh với lô chuột bệnh lý.

Bệnh lý PĐ nước PĐ n-butanol PĐ DCM Sinh lý

Lô bệnh lý có thời gian chảy máu trung bình là 743,9 ± 80,2 giây, kéo dài hơn so với lô sinh lý với thời gian 267,9 ± 84,7 giây Sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê với p < 0,01, cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa hai lô phân đoạn nước.

Bàn luận

3.2.1 Về đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết toàn phần lá Đu đủ

Nghiên cứu của Mrinal Saraf và cộng sự năm 2017 cho thấy cao chiết cồn lá đu đủ không có tác dụng kích thích sinh tiểu cầu ở liều 100 mg/kg TT và 200 mg/kg TT Tuy nhiên, khi nâng liều lên 400 mg/kg TT, cao chiết cồn đã thể hiện tác dụng rõ rệt, với lượng tiểu cầu tăng gấp 2,7 lần so với nhóm chuột bệnh lý Do đó, chúng tôi quyết định sử dụng hai mức liều 400 mg/kg TT và 800 mg/kg TT cao chiết ethanol toàn phần lá đu đủ để đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu trên mô hình chuột gây giảm tiểu cầu bằng CPA.

Nghiên cứu cho thấy, chuột được uống cao ethanol 800mg/kg TT có số lượng tiểu cầu gấp đôi so với lô bệnh lý (p < 0,05), nhưng đến ngày thứ 8, sự khác biệt này không còn ý nghĩa, mặc dù tiểu cầu của lô bệnh lý vẫn giảm đáng kể so với lô sinh lý Cao chiết toàn phần lá Đu đủ liều 800 mg/kg TT có tác dụng chống giảm tiểu cầu ở chuột bị giảm tiểu cầu do CPA, nhưng hiệu quả chỉ duy trì khi tiểu cầu ở mức thấp (ngày 6) và không kéo dài khi tiểu cầu hồi phục vào ngày thứ 8 Trong khi đó, cao chiết cồn 400 mg/kg TT không cho thấy tác dụng chống giảm tiểu cầu, có thể do hàm lượng hoạt chất chưa đủ Các nghiên cứu của Swati Patil (2013) và Tansena Akhter cho thấy cả hai liều 400 mg/kg TT và 800 mg/kg TT đều có tác dụng tăng tiểu cầu, tương tự như nghiên cứu của Sinhalagoda (2013) với liều cao hơn 2g/động vật thí nghiệm (xấp xỉ 1600 mg/kg TT) Sự khác biệt về hiệu quả giữa các liều có thể do chất lượng dược liệu và quy trình chiết xuất khác nhau, ảnh hưởng đến hàm lượng hoạt chất.

Việc sản xuất tiểu cầu có thể khác nhau do 38 yếu tố khác nhau, bao gồm thao tác và mô hình thí nghiệm Đặc biệt, cách lấy máu và sử dụng chất chống đông rất quan trọng; nếu máu không được lấy đúng cách hoặc không chống đông hiệu quả, tiểu cầu sẽ nhanh chóng đông lại, dẫn đến số lượng tiểu cầu đo được không chính xác so với thực tế.

CPA có khả năng giảm tới 80% số lượng tế bào bạch cầu trong các dòng tế bào bạch cầu ở lô bệnh lý Đặc biệt, liều cao toàn phần ethanol 400 mg/kg và ethanol 800 mg/kg cũng cho thấy hiệu quả trong việc tác động đến số lượng tế bào bạch cầu.

Nghiên cứu cho thấy TT không có tác dụng kích thích dòng bạch cầu, điều này cũng được xác nhận bởi Sinhalagoda (2013) và một nghiên cứu trước đó tại Việt Nam Ngược lại, nghiên cứu của Achini Gammulle cho thấy dịch ép tinh khiết lá Đu đủ có khả năng tăng số lượng tế bào bạch cầu đáng kể lên 30,51% Đối với tế bào hồng cầu, mô hình gây giảm tiểu cầu bằng CPA không làm giảm số lượng hồng cầu, kết quả này tương đồng với các nghiên cứu trước đó.

Nghiên cứu của Achini Gammulle (2012) và Sinhalagoda (2013) cho thấy rằng dịch chiết từ lá Đu đủ có khả năng tăng cường số lượng hồng cầu, điều này được xác nhận trong các nghiên cứu về tác dụng kích thích tạo tiểu cầu của lá Đu đủ.

Chúng tôi đã tiến hành đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao chiết toàn phần lá Đu đủ thông qua thời gian chảy máu Kết quả cho thấy, liều cao lá Đu đủ ethanol 800 mg/kg đã làm giảm thời gian chảy máu một cách có ý nghĩa so với nhóm bệnh lý, trong khi liều 400 mg/kg không đạt được kết quả tương tự.

Cao toàn phần lá Đu đủ có khả năng rút ngắn thời gian chảy máu trên chuột, nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê so với lô bệnh lý Thời gian chảy máu không chỉ phụ thuộc vào số lượng tiểu cầu mà còn chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố khác như chức năng của tiểu cầu, yếu tố Von Willebrand, fibrinogen và chức năng thành mạch Nghiên cứu cho thấy có mối tương quan giữa số lượng tiểu cầu và thời gian chảy máu; khi số lượng tiểu cầu giảm, thời gian chảy máu sẽ kéo dài đáng kể, phù hợp với chức năng cầm máu của tiểu cầu Tuy nhiên, nghiên cứu trước đó của Phạm Đức Vịnh (2018) không ghi nhận tác dụng rút ngắn thời gian chảy máu từ cao chiết nước lá Đu đủ.

Một hạn chế trong thí nghiệm của chúng tôi là thời gian chảy máu không được xác định chính xác tại thời điểm số lượng tiểu cầu giảm thấp nhất, điều này dẫn đến ảnh hưởng không đáng kể đến kết quả.

Nghiên cứu cho thấy cao chiết cồn toàn phần lá Đu đủ có tác dụng tích cực đến thời gian chảy máu, mặc dù thời gian này không phải là chỉ số đặc hiệu cho số lượng và chất lượng tiểu cầu Kết quả này củng cố thêm hiệu quả chống giảm tiểu cầu của cao chiết ở liều 800 mg/kg.

Giống như các thí nghiệm trước đó, chúng tôi không tìm được tác nhân để làm nhóm đối chứng dương cho mô hình Trong bối cảnh điều trị giảm tiểu cầu hiện nay, hydrocodtisol và các thuốc kích thích tiểu cầu thế hệ mới được áp dụng cho bệnh nhân Tuy nhiên, prednisone và methyl prednisolon thường được dùng trong trường hợp giảm tiểu cầu do cơ chế miễn dịch, trong khi CPA gây giảm tiểu cầu do ức chế tủy xương Các giả thuyết đều cho rằng lá Đu đủ có tác dụng chống giảm tiểu cầu thông qua cơ chế kích thích sản xuất tiểu cầu và ngăn chặn sự phá hủy tiểu cầu ở ngoại vi Hiện tại, các thuốc kích thích sản xuất tiểu cầu thế hệ mới chưa có sẵn tại Việt Nam và có giá thành rất cao, do đó chúng tôi không thể có nhóm chứng dương trong mô hình thí nghiệm này.

Lá Đu đủ cho thấy tác dụng chống giảm tiểu cầu trên chuột khi sử dụng liều cao ethanol 800 mg/kg, trong khi liều 400 mg/kg không có hiệu quả Nhiều nghiên cứu đã xác nhận kết quả tương tự, mở ra hướng tìm kiếm các hợp chất trong lá Đu đủ có vai trò chính trong tác dụng này Lá Đu đủ chứa nhiều thành phần như tanin, alcaloid, flavonoid, acid phenolic và saponins, do đó, cần tiến hành thêm nghiên cứu để xác định các hoạt chất có khả năng kích thích sản sinh tiểu cầu.

3.2.2 Về tác dụng chống giảm tiểu cầu của các cao chiết phân đoạn lá đu đủ

Nghiên cứu trước đây của chúng tôi đã chỉ ra rằng cao chiết toàn phần từ lá Đu đủ có tác dụng chống giảm tiểu cầu ở liều 800 mg/kg Mục tiêu của việc phân lập các chất chống giảm tiểu cầu từ lá Đu đủ thông qua quá trình chiết phân đoạn là xác định các nhóm hóa thực vật chính chịu trách nhiệm cho tác dụng này Lá Đu đủ chứa nhiều thành phần như alcaloid, flavonoid, acid phenolic và saponins, mỗi nhóm hoạt chất này có độ tan khác nhau trong các dung môi có độ phân cực khác nhau Các hợp chất phenolic và saponin với nhiều nhóm phân cực dễ hòa tan trong các dung môi phân cực mạnh như nước và metanol, trong khi flavonoid cũng có đặc tính tan tương tự.

Các glycosid dễ tan trong dung môi phân cực, flavonoid aglycon dễ tan trong dung môi kém phân cực, và alcaloid không tan trong nước nhưng dễ tan trong dung môi kém phân cực Do đó, chúng tôi chia thành ba nhóm cao chiết tương ứng với ba dung môi có độ phân cực tăng dần là DCM, n-butanol và nước, nhằm thu được các nhóm hoạt chất khác nhau và đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của chúng Kết quả cho thấy cao chiết DCM liều 400 mg/kg không có tác dụng chống giảm tiểu cầu, trong khi cao chiết nước liều 800 mg/kg cũng không hiệu quả Ngược lại, cao chiết n-butanol ở liều 400 mg/kg cho thấy tác dụng kích thích tăng số lượng tiểu cầu mạnh mẽ nhất vào ngày thứ 8 Điều này cho thấy dung môi có độ phân cực vừa phải như n-butanol có khả năng chiết xuất hoạt chất có tác dụng dược lý tốt hơn.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, cao chiết phân đoạn n-butanol từ lá Đu đủ có nồng độ cao hoạt chất với tác dụng chống giảm tiểu cầu Trong quá trình phân lập, đã phát hiện một lượng đáng kể flavonoid (2,28%) có trong cao chiết này Do đó, chúng tôi tiến hành đánh giá tác dụng chống giảm tiểu cầu của cao giàu flavonoid được tinh chế từ phân đoạn n-butanol.