DANH MỤC CÁC BẢNG hiệu 1 3.1 Tóm tắt kết quả thẩm định phương pháp định lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết quả cần tây 24 2 3.2 Kết quả khảo sát khả năng tạo hệ dung môi eut
TỔNG QUAN
Tổng quan về quả cần tây
Dược liệu là quả chín đã phơi hay sấy khô của cây cần tây (Apium graveolens L.), họ Cần (Apiaceae) [1]
Quả cần tây giàu các thành phần dinh dưỡng như flavonoid, tinh dầu, coumarin, chất béo và carotenoid Trong số đó, flavonoid, tinh dầu và coumarin là những hợp chất hóa học chủ yếu, được nghiên cứu và chú ý nhiều nhất hiện nay.
Quả cần tây chứa các hợp chất flavonoid chủ yếu là apigenin, luteolin cùng với các dẫn xuất glycosid của chúng Đây là những thành phần hóa học quan trọng, đồng thời là nhóm chất chuyển hóa thứ cấp chính, mang lại nhiều tác dụng sinh học như kháng khuẩn, chống viêm, chống oxy hóa, chống khối u và bảo vệ tim mạch.
Nhóm hợp chất flavonoid trong quả cần tây đã được chứng minh có khả năng hạ acid uric Cụ thể, apigenin và luteolin là hai flavonoid có tác dụng hạ acid uric và ức chế xanthin oxidase, điều này đã được xác nhận qua nhiều nghiên cứu.
[35] Cấu trúc hóa học của apigenin và luteolin được trình bày ở hình 1.1
Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của apigenin và luteolin
Quả cần tây chứa khoảng 2 - 3% tinh dầu, chủ yếu là các hợp chất terpen, phenolic và dẫn xuất của chúng Nghiên cứu của tác giả Lu Zhan-guo và cộng sự sử dụng phương pháp sắc ký khí kết hợp khối phổ (GC-MS) đã phát hiện 23 thành phần trong tinh dầu quả cần tây, trong đó 18 hợp chất đã được xác định, bao gồm limonen (31,15%), β-selinen (22,28%), p-cresyl iso-valerat (14,94%), α-2-propenyl benzen methanol (9,87%), β-myrcen (4,32%), α-selinen (4,32%) và một số hợp chất khác.
Theo thống kê, hiện có 20 hợp chất furanocoumarin đã được phát hiện trong quả cần tây [6], [7], [10], [31], điển hình trong số đó là: umbelliferon [41], psoralen [14],
1.1.2.1 Tác dụng hạ acid uric và ức chế xanthin oxidase
Cao chiết ethanol từ quả cần tây có khả năng ức chế enzym xanthin oxidase (XO) in vitro với hai nồng độ 50 µg/ml và 100 µg/ml Ngoài ra, các phân đoạn chloroform và ethyl acetate từ quả cần tây cũng cho thấy tác dụng ức chế XO in vitro rõ rệt.
3 nồng độ thớ nghiệm 10 àg/ml, 50 àg/ml và 100 àg/ml [4]
Nghiên cứu của Shaopeng Li và cộng sự đã chỉ ra rằng cao chiết nước và tinh dầu quả cần tây có khả năng hạ acid uric và ức chế xanthin oxidase trên mô hình chuột tăng acid uric máu Cụ thể, ở liều 75 mg/kg và 300 mg/kg, cao chiết nước từ quả cần tây đã giảm đáng kể nồng độ acid uric huyết thanh, với hiệu quả 41,9% trong việc ức chế hoạt tính xanthin oxidase trong huyết thanh và 11,3% trong gan chuột Tinh dầu quả cần tây cũng cho thấy tác dụng tương tự ở các liều 0,058 ml/kg và 0,233 ml/kg.
Nghiên cứu của tác giả Nguyễn Thu Hằng và cộng sự cho thấy, cao ethanol chiết từ quả cần tây có tác dụng giảm nồng độ acid uric huyết thanh trên chuột nhắt trắng, với các liều 250 mg/kg, 500 mg/kg và 1000 mg/kg lần lượt giảm 59,3%, 52,6% và 43,8% sau 5 ngày sử dụng Điều này chứng tỏ tiềm năng của cao chiết này trong việc hỗ trợ điều trị tình trạng tăng acid uric.
500 mg/kg làm giảm hoạt độ xanthin oxidase (XO) gan chuột thí nghiệm tương ứng 12,1% và 10,5% [44]
1.1.2.2 Tác dụng chống viêm Để đánh giá tác dụng chống viêm trên mô hình gây viêm cấp tính bằng natri urat, tác giả Shaopeng Li và cộng sự đã sử dụng cao chiết nước từ quả cần tây với các mức liều 50 mg/kg, 200 mg/kg và tinh dầu quả cần tây với các mức liều 0,039 ml/kg, 0,155 ml/kg Kết quả cho thấy, 2 loại mẫu thử trên đều thể hiện tác dụng giảm viêm khớp cấp tính so với lô chứng ở cả 2 mức liều Cụ thể, cao chiết nước từ quả cần tây liều cao làm giảm lần lượt 22,4% nồng độ IL-1β; 20,4% nồng độ IL-6; 17,2% nồng độ TNF-α và tăng 8,8% nồng độ IL-10 trong huyết thanh so với lô chứng Bên cạnh đó, tinh dầu quả
5 cần tây liều thấp cũng làm giảm 14,2% nồng độ TNF-α; 19,4% nồng độ IL-1β và tăng hơn 14,3% nồng độ IL-10 trong huyết thanh so với lô chứng [33]
Một nghiên cứu của Mina Ramezani và cộng sự cho thấy cao chiết nước và n-hexan từ quả cần tây có tác dụng chống viêm mạnh mẽ, đặc biệt là ở liều 200 mg/kg, tương đương với dexamethason 15 mg/kg, với tỷ lệ ức chế viêm lần lượt là 76,06% và 76,74% Các liều khác (100, 300, 400 và 500 mg/kg) cũng được thử nghiệm trên mô hình gây phù tai chuột bằng xylen.
Trong nghiên cứu sử dụng mô hình gây phù bàn chân chuột bằng carrageenan, cao ethanol chiết xuất từ quả cần tây đã cho thấy tác dụng chống viêm rõ rệt với các liều lượng 250 và 500 mg/kg Cụ thể, tỷ lệ ức chế phù tại liều 250 mg/kg đạt 37,6%, trong khi ở liều 500 mg/kg con số này là 60,6% sau 1 giờ điều trị.
Quả cần tây có hoạt tính chống viêm mạnh nhờ vào các hợp chất acid phenolic và flavonoid, đặc biệt là apigenin và apiin Nhiều nghiên cứu đã chứng minh apigenin có khả năng kháng histamin và ức chế sự hình thành hydroperoxid, trong khi apiin có tác dụng ức chế sản xuất NO và hoạt động của cyclooxygenase.
2 (COX-2) và từ đó ức chế quá trình viêm [51]
Nghiên cứu của Mina Ramezani và cộng sự cho thấy cao chiết nước và n-hexan từ quả cần tây tiêm phúc mạc với liều lượng 300, 400 và 500 mg/kg có hiệu quả giảm đau Hiệu quả này được đánh giá thông qua số lần và thời gian liếm của chuột trong mô hình gây đau bằng formalin.
Nghiên cứu chỉ ra rằng sau khi tiêm formalin, có hai giai đoạn đau: đau thần kinh và đau do viêm Hiệu quả giảm đau của các phương pháp điều trị được so sánh với nhóm chứng sử dụng morphin Kết quả cho thấy, trong giai đoạn đau thần kinh, cao chiết nước không có tác dụng giảm đau, trong khi cao chiết n-hexan với liều 300 cho thấy hiệu quả tích cực.
Liều lượng 400 và 500 mg/kg cho thấy hiệu quả giảm đáng kể thời gian liếm ở chuột, với tỷ lệ giảm so với nhóm chứng lần lượt là 50,7%; 62,7% và 55,2% Trong giai đoạn đau do viêm, cao chiết hexan với liều 500 mg/kg đã chứng minh khả năng giảm đau, làm giảm thời gian liếm ở chuột 7,5% so với nhóm chứng.
Nghiên cứu của Powanda và cộng sự cho thấy cao chiết ethanol từ quả cần tây có khả năng giảm đau cấp và mạn tính trên chuột Cụ thể, trong mô hình gây đau cấp bằng carrageenan, liều 500 mg/kg cao chiết ethanol từ quả cần tây và liều 70 mg/kg cao chiết siêu tới hạn từ quả cần tây cho tác dụng giảm đau tương đương với ibuprofen.
Tổng quan về dung môi eutectic
Dung môi eutectic (DES - Deep Eutectic Solvent) là hỗn hợp của 2 hay nhiều thành phần, trong đó bao gồm: một chất cho liên kết hydro (HBD - Hydrogen Bond
Chất cho (HBD - Hydrogen Bond Donor) và chất nhận liên kết hydro (HBA - Hydrogen Bond Acceptor) có khả năng tương tác để tạo thành hỗn hợp eutectic với điểm nóng chảy thấp hơn điểm nóng chảy của từng thành phần Do đó, hỗn hợp này tồn tại ở trạng thái lỏng ở nhiệt độ phòng.
Các thành phần chính của DES bao gồm chất nhận liên kết hydro (HBA) và chất cho liên kết hydro (HBD) Giữa các thành phần này không xảy ra phản ứng hóa học và không tạo ra sản phẩm phụ.
Chất nhận liên kết hydro (HBA) thường là các muối amoni bậc 4, trong đó cholin clorid là một trong những HBA phổ biến nhất nhờ tính an toàn, khả năng phân hủy sinh học và chi phí thấp Ngoài cholin clorid, một số HBA khác như betain, prolin và acid lactic cũng được ứng dụng rộng rãi trong các hệ dung môi eutectic.
Chất cho liên kết hydro (HBD): Thường là các hợp chất tự nhiên chứa O, N như alcol, amin, acid carboxylic, ure…[34]
Trong các trường hợp cụ thể, các hợp chất có thể đóng vai trò vừa là chất cho liên kết hydro, vừa là chất nhận liên kết hydro Để giảm độ nhớt và tăng khả năng hòa tan, DES thường được pha loãng với nước Nhiều nghiên cứu cho thấy hầu hết các DES không tồn tại ở trạng thái lỏng ở nhiệt độ nhất định.
Hệ thống DES có thể duy trì trạng thái lỏng bền vững ở nhiệt độ phòng khi chứa một lượng nhỏ nước từ 5-10% Tuy nhiên, nếu hàm lượng nước vượt quá mức này, đặc biệt là khi đạt 50%, sẽ gây ảnh hưởng tiêu cực đến các đặc tính của hệ như độ nhớt, độ phân cực và độ tan Sự gia tăng nước có thể làm mất các liên kết hydro hiện có, dẫn đến sự đứt gãy và phá hủy cấu trúc của DES, đồng thời làm giảm tương tác giữa các phân tử HBA và HBD.
Hiện nay, DES có thể được phân loại dựa vào thành phần cấu tạo hoặc tác dụng sinh học của hệ dung môi
Cách 1: Dựa vào thành phần cấu tạo, DES được chia làm 4 loại như sau:
Loại I là hợp chất được hình thành từ muối amoni bậc 4, chẳng hạn như cholin clorid, kết hợp với muối halogen của kim loại, thường là muối clorid của các kim loại.
Zn, Sn, Fe, Al, Ga…) [34], [62]
Ví dụ: Cholin clorid + ZnCl2, cholin clorid+ AlCl3…
Muối amoni bậc 4, chẳng hạn như cholin clorid, kết hợp với muối halogen của các kim loại ngậm nước như Cr, Co, Cu, Ni và Fe, tạo thành loại II.
Ví dụ: Cholin clorid + MgCl2.6H2O, cholin clorid + CrCl3.6H2O…
Loại III được hình thành từ muối amoni bậc 4, chẳng hạn như cholin clorid, kết hợp với các hợp chất cho hydro như ure, glycerol, ethylen glycol, acid malonic và một số chất khác.
Ví dụ: Cholin clorid + ure, cholin clorid + glycerol…
Loại IV được hình thành từ sự kết hợp giữa muối halogen kim loại, thường là muối clorid của các kim loại lưỡng tính, với các chất cho hydro (HBD) như ure, glycerol, ethylen glycol, acid malonic và một số hợp chất khác.
Muối halogen của kim loại khan (loại I) ít được ứng dụng trong thực tế vì có nhiệt độ nóng chảy cao, khiến việc sử dụng làm dung môi ở điều kiện thường trở nên khó khăn Ngược lại, muối halogen của kim loại ngậm nước (loại II) được sử dụng phổ biến hơn nhờ vào nhiệt độ nóng chảy thấp, chi phí thấp và khả năng hút ẩm kém, do đã có sẵn nước trong thành phần, giúp dễ dàng ứng dụng trong nhiều quy trình.
DES loại III là dung môi được nghiên cứu nhiều nhất hiện nay nhờ vào các ưu điểm nổi bật như dễ chuẩn bị, không phản ứng với nước, khả năng phân hủy sinh học, chi phí sản xuất thấp và khả năng hòa tan nhiều kim loại chuyển tiếp, bao gồm muối clorid kim loại và oxit kim loại So với các loại DES khác như I, II, IV có thể gây độc do chứa muối kim loại, DES loại III tương đối an toàn hơn, có khả năng tương thích sinh học cao và ít gây độc cho con người.
Based on their biological effects, Deep Eutectic Solvents (DES) are categorized into two types: Therapeutic Deep Eutectic Solvents (THEDES) and Natural Deep Eutectic Solvents (NADES).
Hệ dung môi eutectic trị liệu THEDES chứa các hoạt chất quan trọng, trong đó một ví dụ điển hình là sự kết hợp giữa tinh dầu bạc hà và ibuprofen theo tỷ lệ 3:1.
NADES, hay hệ dung môi eutectic tự nhiên, bao gồm các hợp chất nguồn gốc tự nhiên có mặt trong tế bào và cơ thể sống, được công nhận là dung môi thân thiện với môi trường Hệ dung môi này được hình thành từ sự kết hợp giữa HBA, thường là cholin clorid, với các HBD như glucose, fructose, acid malic và acid aconitic.
DES được hình thành từ sự kết hợp của HBA và HBD dưới nhiệt độ và tỉ lệ mol nhất định Các phương pháp điều chế DES phổ biến bao gồm gia nhiệt, nghiền, bay hơi, đông khô và hỗ trợ vi sóng.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu, thiết bị
Quả cần tây được thu hái tại Hải Hậu, Nam Định là nguyên liệu nghiên cứu chính Sau khi thu hoạch, dược liệu này được phơi khô và bảo quản ở nơi khô ráo, thoáng mát để đảm bảo chất lượng.
2.1.2 Hóa chất, thiết bị và phần mềm
Hóa chất dùng cho nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích bao gồm:
- Các dung môi/hóa chất hữu cơ: Ethanol, methanol, ethyl acetat, lactose, glucose, propylen glycol, acid citric, acid acetic, glycerin, saccharose, cholin clorid, betain, acetonitril (HPLC)
- Hóa chất vô cơ: Acid phosphoric, than hoạt tính, nước cất 2 lần
- Chất chuẩn: Apigenin chuẩn (độ tinh khiết 98,03%), luteolin chuẩn (độ tinh khiết 99,55%) được cung cấp bởi công ty Biopurify Phytochemicals Ltd
- Cân phân tích Presica (Thụy Sĩ), độ chính xác 0,1 mg
- Cân kỹ thuật Sartorius (Đức), độ chính xác 0,01g
- Máy siêu âm Sonic vibra cell (Mỹ)
- Máy ly tâm Universad 320 (Đức)
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu CDD-10AVP; detector DAD; cột sắc ký Shim-pack GIS C18, kớch thước 250 4,6 mm, đường kớnh hạt 5 àm
- Máy đo hàm ẩm Presica XM60 (Thụy Sĩ)
- Thiết bị cách thủy Memmert (Đức)
- Máy lọc hút chân không (Trung Quốc)
- Các dụng cụ lấy mẫu: Pipet pasteur, pipet chính xác 0,5 ml, 1 ml, 2 ml, 5 ml, bình định mức 10 ml, quả bóp cao su, ống nghiệm
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Nội dung 1: Xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết quả cần tây
Phương pháp định lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết quả cần tây được thực hiện bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Phương pháp này đã được thẩm định đầy đủ, đảm bảo độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, đường chuẩn, sự phù hợp của hệ thống, độ lặp lại và độ đúng.
2.2.2 Nội dung 2: Khảo sát và lựa chọn hệ dung môi eutectic
Khảo sát khả năng tạo thành hệ dung môi eutectic từ các cặp chất HBA và HBD tương ứng theo tỉ lệ mol và điều kiện xác định
Chiết xuất quả cần tây bằng các hệ dung môi eutectic đã được nghiên cứu, cho ra các mẫu dịch chiết Qua việc so sánh hàm lượng hai hợp chất trong các mẫu dịch chiết, chúng tôi đã xác định được hệ dung môi có khả năng chiết xuất hiệu quả nhất.
2.2.3 Nội dung 3: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc giàu apigenin và luteolin từ quả cần tây
Trong nghiên cứu này, chúng tôi lựa chọn phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT) để khảo sát các yếu tố đầu vào trong quá trình chiết xuất Các yếu tố được xem xét bao gồm thời gian chiết xuất (phút), nhiệt độ chiết xuất (°C), và hàm lượng nước trong dung môi (%) Mục tiêu đánh giá là xác định hàm lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết từ quả cần tây.
2.2.4 Nội dung 4: Khảo sát và lựa chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết xuất cao đặc giàu apigenin và luteolin từ quả cần tây
Khảo sát và lựa chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết xuất nhằm đạt được hàm lượng apigenin và luteolin cao nhất trong dịch chiết.
2.2.5 Nội dung 5: Khảo sát và lựa chọn phương pháp điều chế cao đặc giàu apigenin và luteolin từ dịch chiết quả cần tây trong DES
Khảo sát các phương pháp điều chế cao đặc từ dịch chiết quả cần tây trong DES
Để xây dựng quy trình chiết xuất hoàn chỉnh, cần so sánh và lựa chọn phương pháp phù hợp nhất Các thông số đánh giá quan trọng bao gồm tỷ lệ phần trăm khối lượng cao thu được, hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin trong cao đặc.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Quy trình chiết xuất dự kiến
Quả cần tây được xay nhỏ và rây qua rây có kích thước mắt rây 0,25 mm, lấy phần bột lọt qua rây để chiết xuất
Cân chính xác khoảng 0,2000 g dược liệu cho vào ống nghiệm Thêm chính xác
Để tiến hành chiết xuất, sử dụng 4 ml dung môi và thực hiện quá trình chiết trong 20 phút Sau đó, ly tâm dịch chiết ở tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút để thu hồi dịch Cuối cùng, dịch chiết được gạn và điều chế thành cao đặc bằng phương pháp thích hợp.
Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất cao cần tây được trình bày như trên hình 2.1
Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt quy trình chiết xuất cao cần tây
2.3.2 Phương pháp định lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết quả cần tây
Xác định hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin trong dịch chiết quả cần tây bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) [25]
- Cột sắc ký: Shim-pack GIS C18 (250 4,6 mm; 5 m)
- Pha động: Acetonitril - Acid phosphoric 0,1% tỉ lệ 40:60
- Bước sóng phát hiện: 335 nm
- Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút
- Thể tớch tiờm mẫu: 20 àl
Dịch chiết trước khi tiến hành sắc ký được lọc qua màng lọc 0,45 àm Hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin trong dịch chiết được tính từ đường chuẩn
2.3.2.2 Thẩm định phương pháp định lượng
Dược liệu đã được rây
Cao đặc Điều chế cao đặc
Phương pháp định lượng đã được đánh giá về độ đặc hiệu, khoảng tuyến tính, đường chuẩn, sự phù hợp của hệ thống, độ lặp lại và độ đúng, dựa trên các điều kiện sắc ký đã được lựa chọn.
2.3.3 Phương pháp khảo sát và lựa chọn hệ dung môi eutectic
Chuẩn bị 34 hệ dung môi bằng cách phối hợp các cặp chất HBA và HBD trong điều kiện xác định Sau đó, loại bỏ các hệ không tạo thành dung môi đồng nhất ở điều kiện thường Các hệ còn lại được lựa chọn để khảo sát khả năng chiết xuất apigenin và luteolin từ quả cần tây.
Tiến hành chiết xuất dịch chiết theo các bước đã mô tả, sử dụng các dung môi đồng nhất đã được lựa chọn trong bước khảo sát Các dung môi đối chiếu bao gồm nước, methanol và ethanol 70% Xác định hàm lượng apigenin và luteolin trong các mẫu dịch chiết, đồng thời so sánh khả năng chiết xuất giữa các hệ DES, nước, methanol và ethanol 70% Dựa trên kết quả này, lựa chọn dung môi chiết xuất cho các bước khảo sát tiếp theo.
2.3.4 Phương pháp khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất 2.3.4.1 Lựa chọn yếu tố khảo sát và thông số đánh giá
- Thời gian chiết xuất: 5 phút, 10 phút, 20 phút, 40 phút, 60 phút
- Hàm lượng nước trong hệ dung môi: 10%, 20%, 30%, 40% và 50% (kl/kl)
Hàm lượng apigenin (hoặc hàm lượng luteolin) trong dịch chiết được xác định bằng HPLC và được tính theo công thức:
Trong đó: X: hàm lượng apigenin hoặc hàm lượng luteolin trong dịch chiết (mg/g)
S: diện tớch pic (àAU.s) b: hệ số chặn của đường chuẩn V: thể tích dịch chiết (ml) a: hệ số góc đường chuẩn m1: khối lượng dược liệu (g) A%: độ ẩm dược liệu, được xác định bằng phương pháp mất khối lượng do làm khô [1], (A% = 10,45%)
Phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT)
Thời gian chiết xuất, nhiệt độ chiết xuất và hàm lượng nước trong hệ dung môi được khảo sát bằng cách thay đổi các mức giá trị khác nhau của từng yếu tố, trong khi các yếu tố còn lại được giữ cố định Dựa trên kết quả khảo sát, điều kiện tối ưu cho hàm lượng apigenin và luteolin cao nhất được lựa chọn và cố định để thực hiện các bước khảo sát tiếp theo.
2.3.5 Phương pháp khảo sát các yếu tố ảnh hưởng và lựa chọn các điều kiện tối ưu cho quá trình chiết xuất
Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM)
Lựa chọn khoảng khảo sát các biến đầu vào
Ba biến đầu vào được lựa chọn là: Thời gian chiết xuất (X 1 ), nhiệt độ chiết xuất (X 2 ), hàm lượng nước trong hệ dung môi (X 3 ) với khoảng khảo sát như sau:
- Thời gian chiết xuất (X 1 ): 10 phút - 40 phút
- Hàm lượng nước trong hệ dung môi (X 3 ): 20% - 40% (kl/kl)
Các biến đầu vào được mã hóa thành các giá trị nằm trong khoảng [-1;1] và được tính toán từ giá trị thực tế theo công thức:
- Thời gian chiết xuất: X 1 = Giá trị thực - 25
- Nhiệt độ chiết xuất: X 2 = Giá trị thực - 60
- Hàm lượng nước trong hệ dung môi: X 3 = Giá trị thực - 30
Trong nghiên cứu này, các điều kiện biến đầu vào đã được khảo sát để xác định hàm lượng apigenin (Y1) và hàm lượng luteolin (Y2) trong dịch chiết quả cần tây.
Các thí nghiệm được tiến hành ngẫu nhiên theo mô hình phức hợp trung tâm kiểu hướng mặt, sử dụng phần mềm Design Expert 11
Tối ưu hóa quá trình chiết xuất
Quá trình chiết xuất được tối ưu hóa thông qua các bước:
Bước đầu tiên trong quá trình phân tích là xây dựng mô hình hồi quy tuyến tính đa biến (MLR) để thể hiện mối quan hệ phụ thuộc giữa các biến đầu ra (Y1, Y2) và các biến đầu vào (X1, X2, X3).
22 sử dụng phần mềm Design Expert 11 Phương trình được thiết lập với các biến đầu vào mang giá trị thực và giá trị đã được mã hóa
Dựa trên các mô hình đã xây dựng, chúng tôi tiến hành đánh giá độ chính xác, độ tuyến tính, khả năng dự đoán và sự phù hợp của mô hình với số liệu thực nghiệm thông qua các chỉ số như giá trị p-value, hệ số xác định R², hệ số xác định hiệu chỉnh R² hiệu chỉnh và R² dự đoán.
Bước 2: Dựa trên kết quả xây dựng mô hình, lựa chọn các điều kiện tối ưu cho các biến đầu vào nhằm đạt được hàm lượng apigenin và luteolin tối đa Sau khi xác định điều kiện tối ưu, tiến hành kiểm định mô hình thông qua thực nghiệm.
3 lần nhằm đánh giá độ lặp lại, độ chính xác và sự phù hợp giữa mô hình so với giá trị thực nghiệm
2.3.6 Lựa chọn phương pháp điều chế cao đặc quả cần tây từ dịch chiết DES
Sau khi thu được dịch chiết quả cần tây bằng hệ dung môi eutectic và tối ưu hóa các điều kiện, cao đặc quả cần tây có thể được điều chế thông qua một trong các phương pháp sau.
Phương pháp 1: Sử dụng than hoạt
Thêm 10% than hoạt vào dịch chiết và ngâm khoảng 15 phút, khuấy trộn để hoạt chất hấp phụ hoàn toàn lên bề mặt than Sau đó, lọc lấy than hoạt bằng thiết bị lọc chân không Tiến hành giải hấp phụ than hoạt bằng ethanol 96%, lọc lấy dịch và cô đặc dung môi cho đến khi thu được cao đặc.
Phương pháp 2: Sử dụng phản dung môi
Phương pháp nghiên cứu này dựa trên nguyên tắc thêm một lượng lớn nước để phá vỡ liên kết giữa HBA và HBD, dẫn đến việc mất đặc tính của hệ DES Hai hợp chất apigenin và luteolin không tan trong nước, do đó sẽ tạo thành tủa Trong nghiên cứu, dịch chiết được bổ sung nước với tỷ lệ 1:20 và được kết tinh trong khoảng 1 giờ ở nhiệt độ 0°C Sau đó, mẫu được ly tâm trong 10 phút với tốc độ 3000 vòng/phút để thu hồi tủa, và tủa này được sấy khô đến khi đạt được thể chất mong muốn.
Để tối ưu hóa quy trình chiết xuất, trước tiên cần cô loại dung môi của dịch chiết, sau đó thêm nước để kết tủa các hợp chất Tiếp theo, tiến hành ly tâm để thu hồi tủa, lọc sạch tủa và sấy khô cho đến khi đạt được thể chất mong muốn.
2.3.6.2 Các thông số đánh giá
Dựa trên các phương pháp điều chế cao đặc từ dịch chiết quả cần tây trong DES, chúng tôi đã lựa chọn phương pháp hiệu quả nhất dựa trên các thông số đánh giá cụ thể.
- Tỉ lệ % khối lượng cao thu được (A1%) được tính theo công thức:
- Hàm lượng apigenin trong cao đặc (A2) và hàm lượng luteolin trong cao đặc (A3):
Trong đó: A2: hàm lượng apigenin trong cao đặc (mg/g)
A3: hàm lượng luteolin trong cao đặc (mg/g)
S: diện tớch pic (àAU.s) b: hệ số chặn của đường chuẩn V: thể tích dịch chiết (ml) a: hệ số góc đường chuẩn m2: khối lượng cao (g)
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả xây dựng và thẩm định phương pháp định lượng apigenin và
3.1.1 Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc
Cân chính xác 5,0 mg chất chuẩn apigenin và cho vào bình định mức 10 ml Tiếp theo, cân 5,0 mg chất chuẩn luteolin vào bình định mức 10 ml thứ hai Hòa tan và định mức bằng methanol đến vạch, sau đó lọc qua màng lọc 0,45 µm để thu được dung dịch chuẩn gốc apigenin và luteolin, mỗi dung dịch có nồng độ 500 µg/ml.
3.1.2 Chuẩn bị dung dịch thử
Cân chính xác 0,2000 g quả cần tây và cho vào ống nghiệm, sau đó thêm 4 ml dung môi methanol Tiến hành chiết siêu âm trong 10 phút, tiếp theo là ly tâm dịch chiết với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút Gạn thu lấy phần dịch và lọc qua màng lọc 0,45 để thu được dung dịch thử.
3.1.3 Thẩm định phương pháp định lượng
Kết quả thẩm định các tiêu chuẩn như độ đặc hiệu, sự phù hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng đã được trình bày chi tiết trong phụ lục 1 và tóm tắt trong bảng 3.1.
Bảng 3.1 Tóm tắt kết quả thẩm định phương pháp định lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết quả cần tây
Apigenin Luteolin Độ đặc hiệu - Pic apigenin và luteolin cân xứng, 2 pic tách nhau hoàn toàn
- Pic ở mẫu chuẩn, mẫu thử và mẫu thử thêm chuẩn có tR giống nhau
- Mẫu thử thêm chuẩn có Spic lớn hơn mẫu chuẩn
Sự phù hợp hệ thống tR: RSD = 0,06%
Spic: RSD = 1,68% Độ tuyến tính y = 116907,3427x + 104787,6691 R² = 0,9998 y = 68121,9382x + 41266,6025 R² = 0,9998 Độ lặp lại RSD = 2,06% RSD =3,37% Độ đúng Độ thu hồi trung bình = 99,82% Độ thu hồi trung bình = 102,73%
Kết quả thẩm định cho thấy phương pháp định lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết quả cần tây đạt yêu cầu về độ đặc hiệu, sự phù hợp hệ thống, độ tuyến tính, độ lặp lại và độ đúng Do đó, phương pháp này có thể được áp dụng hiệu quả để định lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết từ quả cần tây.
Kết quả khảo sát và lựa chọn hệ dung môi eutectic
Tiến hành chuẩn bị 34 hệ dung môi eutectic theo phương pháp ghi trong tài liệu
Để tạo ra các hệ DES, cần phối hợp các cặp chất HBA và HBD theo tỉ lệ mol xác định, sau đó thêm nước với tỉ lệ 30% khối lượng/khối lượng Quá trình tiếp theo là đun cách thủy ở nhiệt độ 80°C kết hợp khuấy trộn cho đến khi đạt được chất lỏng đồng nhất và trong suốt Thông tin chi tiết về 34 hệ DES cùng kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2 Kết quả khảo sát khả năng tạo hệ dung môi eutectic
Chú thích: (+): Hệ tạo thành dung môi đồng nhất
(-): Hệ không tạo thành dung môi đồng nhất
Trong 34 hệ được khảo sát, 23 hệ tạo thành dung môi đồng nhất, ổn định và trong suốt ở nhiệt độ phòng Tuy nhiên, một số hệ không đồng nhất hoàn toàn như hệ 1’c, 2’c, 4’c, 5’a, 5’b, 6’a, 6’b, 7’a, 7’b Một số hệ khác như hệ 1b và 3’c lại xuất hiện hiện tượng kết tinh khi nhiệt độ giảm xuống mức nhiệt độ phòng.
Trong nghiên cứu này, 23 hệ DES đồng nhất đã được lựa chọn để khảo sát khả năng chiết xuất, so sánh với nước, methanol và ethanol 70% Mẫu dược liệu được cân chính xác 0,2000 g và thêm 4 ml dung môi, sau đó chiết xuất ở nhiệt độ 60°C trong 20 phút Hàm lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết được xác định bằng phương pháp HPLC Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 3.3.
Bảng 3.3 Kết quả khảo sát khả năng chiết xuất của các dung môi
STT Mẫu Khối lượng dược liệu (g)
Diện tích pic apigenin (àAU.s)
Diện tích pic luteolin (àAU.s)
Chú thích: (*) : Không phát hiện pic apigenin trên sắc ký đồ
Kết quả so sánh khả năng chiết xuất cao đặc giàu apigenin và luteolin từ quả cần tây của các dung môi được trình bày ở hình 3.1
Hình 3.1 Hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin trong các mẫu dịch chiết
Trong ba dung môi nước, methanol và ethanol 70%, nước có khả năng chiết xuất apigenin và luteolin kém nhất Ethanol 70% là dung môi tối ưu, với hàm lượng apigenin đạt 0,0850 mg/g và hàm lượng luteolin đạt 0,3715 mg/g trong dịch chiết.
- Hầu hết các hệ DES đều có khả năng chiết xuất apigenin và luteolin tốt hơn nước, methanol và ethanol 70%
Hệ 2’b, 3’b và 8a cho hiệu suất chiết xuất cao, trong đó hệ 2’b đạt hiệu suất chiết xuất apigenin cao nhất, còn hệ 8a tối ưu cho luteolin Tuy nhiên, khi xem xét tổng thể hiệu suất chiết xuất cả apigenin và luteolin, hệ 2’b (betain - propylene glycol tỷ lệ 1:8) cho thấy khả năng chiết xuất tốt nhất và được chọn làm dung môi trong các thí nghiệm tiếp theo.
Kết quả khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất
Tiến hành chiết xuất quả cần tây bằng hệ dung môi eutectic theo quy trình đã trình bày, khảo sát ba yếu tố quan trọng: thời gian chiết xuất, nhiệt độ chiết xuất và hàm lượng nước của hệ dung môi Phương pháp OFAT được sử dụng để đánh giá hiệu quả chiết xuất thông qua hàm lượng apigenin và luteolin thu được.
Khảo sát thời gian chiết xuất được thực hiện với các giá trị 5, 10, 20, 40 và 60 phút, trong khi các thông số khác được giữ cố định, bao gồm nhiệt độ chiết xuất ở mức 60°C và hàm lượng nước là 30% (kl/kl) Kết quả của khảo sát này được thể hiện rõ ràng trong hình.
Hàm lượng apigenin (mg/g) Hàm lượng luteolin (mg/g)
Hình 3.2 Kết quả khảo sát thời gian chiết xuất
Biểu đồ hình 3.5 cho thấy, trong khoảng thời gian từ 5 đến 20 phút, hàm lượng apigenin và luteolin tăng lên khi thời gian chiết xuất kéo dài Cả hai hợp chất này đạt giá trị tối đa sau 20 phút, với hàm lượng apigenin là 0,1287 mg/g và luteolin là 0,7536 mg/g Tuy nhiên, khi thời gian chiết xuất tiếp tục tăng, hàm lượng không còn tăng thêm.
Sau 20 phút, hàm lượng hoạt chất trong dịch chiết giảm dần do cần thời gian để khuếch tán từ dược liệu ra môi trường Khi đạt đến điểm cân bằng, quá trình khuếch tán dừng lại và nồng độ hoạt chất đạt giá trị lớn nhất Nếu tiếp tục chiết xuất, nước trong hệ có thể bay hơi, làm tăng độ nhớt của dung môi và gây khó khăn trong việc chiết và lọc sản phẩm, từ đó giảm hiệu suất chiết Thời gian chiết xuất kéo dài cũng có thể dẫn đến phân hủy hoạt chất, và chiết ở nhiệt độ cao trong thời gian dài có thể phá vỡ cấu trúc hệ, làm giảm hiệu suất chiết.
Thời gian chiết xuất là yếu tố quan trọng trong việc thu nhận hoạt chất từ dược liệu; nếu quá ngắn, không thể chiết hết hoạt chất, trong khi nếu quá dài, lượng hoạt chất có thể giảm và tạp chất tăng lên.
Dựa trên kết quả thu được, khoảng thời gian từ 10 đến 40 phút đã được chọn làm khoảng khảo sát để phát triển mô hình bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) trong bước tối ưu hóa tiếp theo.
5 phút 10 phút 20 phút 40 phút 60 phút
Hàm lượng apigenin (mg/g) Hàm lượng luteolin (mg/g)
Khảo sát nhiệt độ chiết xuất được thực hiện với các mức 45°C, 60°C, 75°C và 90°C, trong khi các thông số khác như thời gian chiết xuất (20 phút) và hàm lượng nước (30% kl/kl) được giữ cố định Kết quả của khảo sát này được thể hiện trong hình 3.3.
Hình 3.3 Kết quả khảo sát nhiệt độ chiết xuất
Hàm lượng luteolin trong dịch chiết tăng cao nhất ở 75°C, trong khi hàm lượng apigenin đạt tối đa ở 60°C Sau nhiệt độ này, cả hai hoạt chất đều giảm Sự tăng nhiệt độ làm tăng hệ số khuếch tán, giảm độ nhớt và sức căng bề mặt của dung môi, từ đó cải thiện tính thấm vào dược liệu Ngoài ra, nhiệt độ cao cũng làm tăng độ tan của hoạt chất, nâng cao hiệu suất chiết Do đó, nhiệt độ tăng cường cả tốc độ và hiệu suất chiết.
Khi nhiệt độ chiết tăng quá cao, lượng hoạt chất thu được sẽ giảm do sự không ổn định của các hoạt chất trước nhiệt độ, dẫn đến phân hủy Nhiệt độ cao cũng làm tăng độ nhớt của hệ thống chiết, gây khó khăn trong quá trình lọc và giảm hiệu suất chiết Hệ chiết quá nhớt không chỉ làm giảm độ tan của hoạt chất mà còn làm tăng lượng tạp chất, ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng dịch chiết.
Hàm lượng apigenin (mg/g) Hàm lượng luteolin (mg/g)
Để tối ưu hóa quá trình chiết xuất apigenin và luteolin, khoảng nhiệt độ từ 45°C đến 75°C được lựa chọn làm phạm vi khảo sát cho việc xây dựng mô hình bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM).
3.3.3 Hàm lượng nước trong hệ dung môi
Khảo sát hàm lượng nước trong hệ dung môi được thực hiện với các giá trị 10%, 20%, 30%, 40% và 50% (kl/kl), trong khi các thông số khác như thời gian chiết xuất là 20 phút và nhiệt độ chiết xuất là 60°C được giữ cố định Kết quả của nghiên cứu về hàm lượng nước trong hệ dung môi được thể hiện trong hình 3.4.
Hình 3.4 Kết quả khảo sát hàm lượng nước trong hệ dung môi
Khi hàm lượng nước trong hệ tăng từ 10% đến 30%, hàm lượng cả hai hoạt chất trong dịch chiết đều tăng và đạt giá trị tối đa tại 30% Sự gia tăng tỉ lệ nước làm giảm độ nhớt và sức căng bề mặt của dung môi, từ đó tăng cường tính thấm của dung môi vào dược liệu.
Khi tỉ lệ nước trong dung môi tăng quá cao, hiệu suất chiết của hoạt chất giảm do nước ảnh hưởng đến các đặc tính của hệ như độ nhớt, độ phân cực và độ tan Sự gia tăng lượng nước có thể làm mất các liên kết hydro hiện có, dẫn đến phá vỡ cấu trúc của hệ.
Lượng nước từ 20% đến 40% được chọn làm khoảng khảo sát để xây dựng mô hình bằng phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) trong các bước tối ưu hóa tiếp theo.
Hàm lượng nước trong hệ dung môi (%)
Hàm lượng apigenin (mg/g) Hàm lượng luteolin (mg/g)
Từ các kết quả khảo sát trên, biến đầu vào được lựa chọn để xây dựng mô hình với khoảng khảo sát tương ứng là:
- Thời gian chiết xuất: Từ 10 phút đến 40 phút
- Nhiệt độ chiết xuất: Từ 45°C đến 75°C
- Hàm lượng nước trong hệ: Từ 20% đến 40% (kl/kl).
Kết quả khảo sát và lựa chọn các điều kiện tối ưu
3.4.1 Thiết kế thí nghiệm và kết quả thực nghiệm
Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) được áp dụng để tối ưu hóa quá trình chiết xuất thông qua các thí nghiệm thiết kế theo mô hình phức hợp trung tâm (CCD) kiểu hướng mặt (α = 1) Mục tiêu là xác định điều kiện chiết xuất tối ưu cho ba yếu tố: thời gian chiết xuất (X1), nhiệt độ chiết xuất (X2) và hàm lượng nước trong dung môi (X3) Các biến phụ thuộc được đo lường là hàm lượng apigenin (Y1) và luteolin (Y2) trong dịch chiết Tổng số thí nghiệm được xác định bằng công thức N = 2n + 2n + C0, với n là số biến đầu vào, dẫn đến 20 thí nghiệm, bao gồm 6 thí nghiệm tại tâm để đảm bảo tính lặp lại và ổn định Phần mềm Design Expert 11 được sử dụng để thiết kế, phân tích dữ liệu và xây dựng mô hình cho các thí nghiệm này Kết quả được trình bày trong bảng 3.4.
Bảng 3.4 Thiết kế thí nghiệm và kết quả thực nghiệm Thí nghiệm
Biến đầu vào mang giá trị thực
Biến đầu vào mang giá trị mã hóa
3.4.2 Kết quả tối ưu hóa quá trình chiết xuất
3.4.2.1 Kết quả xây dựng và đánh giá mô hình
Các mô hình M1, M2, M3 và M4 được xây dựng thông qua phương pháp hồi quy tuyến tính đa biến, nhằm thể hiện mối quan hệ giữa hàm lượng apigenin trong dịch chiết (Y1) và hàm lượng luteolin trong dịch chiết (Y2) với các biến đầu vào như thời gian chiết xuất (X1), nhiệt độ chiết xuất (X2) và hàm lượng nước (X3) Các hệ số của phương trình được xác định bằng phần mềm Design Expert 11, sử dụng cả giá trị thực và giá trị đã mã hóa cho các biến đầu vào Kết quả của quá trình này được trình bày dưới dạng các phương trình cụ thể.
Phương trình với biến đầu vào đã được mã hóa:
Phương trình với biến đầu vào mang giá trị thực:
Biểu đồ trong hình 3.5 thể hiện mối quan hệ giữa hàm lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết, dựa trên các biến đầu vào đã được phân tích.
Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa hàm lượng apigenin trong dịch chiết và hàm lượng luteolin trong dịch chiết với các biến đầu vào
Đồ thị A1, A2, A3 thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng apigenin trong dịch chiết với các yếu tố: thời gian chiết xuất và nhiệt độ chiết xuất, thời gian chiết xuất và hàm lượng nước trong dung môi, cùng với nhiệt độ chiết xuất và hàm lượng nước trong dung môi Tương tự, đồ thị B1, B2, B3 minh họa mối quan hệ giữa hàm lượng luteolin trong dịch chiết với thời gian chiết xuất và nhiệt độ chiết xuất, thời gian chiết xuất và hàm lượng nước trong dung môi, cũng như nhiệt độ chiết xuất và hàm lượng nước trong dung môi.
Kết quả phân tích phương sai ANOVA của các mô hình được trình bày ở bảng
Bảng 3.5 Kết quả phân tích phương sai ANOVA của mô hình biểu thị mối tương quan giữa hàm lượng apigenin trong dịch chiết với các biến đầu vào
Hàm lượng apigenin trong dịch chiết (mg/g)
Biến số Tổng bình phương
Bảng 3.6 Kết quả phân tích phương sai ANOVA của mô hình biểu thị mối tương quan giữa hàm lượng luteolin trong dịch chiết với các biến đầu vào
Hàm lượng luteolin trong dịch chiết (mg/g) Biến số Tổng bình phương
Giá trị p-value của cả hai mô hình M1 và M2 đều nhỏ hơn 0,0001, trong khi giá trị p-value trong kiểm định sự không phù hợp của hai mô hình đều lớn hơn 0,05, cho thấy rằng sự không phù hợp không có ý nghĩa thống kê Do đó, hai mô hình M1 và M2 có thể được sử dụng để dự đoán điều kiện chiết xuất apigenin và luteolin tối ưu từ quả cần tây bằng dung môi DES.
Hệ số xác định R² cho hai mô hình M1 và M2 lần lượt là 0,9723 và 0,9614, cho thấy khoảng 97% lượng apigenin chiết được và 96% lượng luteolin trong dịch chiết phụ thuộc vào các biến đầu vào, trong khi chỉ khoảng 3% và 4% kết quả không được giải thích bởi mô hình Giá trị R² cao chứng tỏ cả hai mô hình đều có độ tuyến tính cao.
Hệ số xác định R² và hệ số xác định hiệu chỉnh của hai mô hình cho thấy độ chính xác cao và sự phù hợp tốt với dữ liệu thực nghiệm Sự chênh lệch giữa R² hiệu chỉnh và R² dự đoán của cả hai mô hình đều ở mức thấp, khẳng định tính hiệu quả của các mô hình này.
0,2 thể hiện tính bền vững và khả năng dự đoán cao của mô hình
3.4.2.2 Kết quả lựa chọn điều kiện tối ưu của các biến đầu vào
Mục đích của việc tối ưu hóa chiết xuất là xác định các điều kiện tối ưu cho các biến đầu vào nhằm đạt được hàm lượng apigenin và luteolin tối đa trong dịch chiết Phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) đã được áp dụng để xác định các điều kiện chiết xuất tối ưu.
Thời gian chiết xuất: 18,6228 phút
Hàm lượng nước trong dung môi: 40% (kl/kl)
Dưới các điều kiện tối ưu, hàm lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết lần lượt đạt 0,1542 mg/g và 0,7317 mg/g Mô hình đã được kiểm định thực nghiệm lại ba lần để xác nhận hiệu quả của các điều kiện này.
Thời gian chiết xuất: 19 phút
Hàm lượng nước trong hệ dung môi: 40% (kl/kl)
Kết quả kiểm định mô hình bằng thực nghiệm được trình bày ở bảng 3.7
Bảng 3.7 Kết quả kiểm định mô hình bằng thực nghiệm
Giá trị dự đoán Giá trị thực nghiệm Độ chính xác
Hàm lượng apigenin trong dịch chiết (mg/g) 0,1542 0,1532 ± 0,0004 99,38% Hàm lượng luteolin trong dịch chiết (mg/g) 0,7317 0,7237 ± 0,0076 98,91%
Độ chính xác của mô hình trong việc dự đoán hàm lượng apigenin và luteolin trong dịch chiết lần lượt đạt 99,38% và 98,91% Điều này cho thấy sự phù hợp cao giữa mô hình và giá trị thực nghiệm, khẳng định chất lượng tốt và độ chính xác cao của mô hình.
Kết quả khảo sát và lựa chọn phương pháp điều chế cao đặc từ dịch chiết quả cần tây trong DES
Tiến hành chiết xuất quả cần tây bằng hệ dung môi eutectic theo quy trình đã nêu ở mục 3.2 để thu được dịch chiết Dịch chiết này có thể được xử lý bằng hai phương pháp: sử dụng phản dung môi hoặc sử dụng than hoạt.
3.5.1.1 Phương pháp 1: Sử dụng phản dung môi
Phản dung môi được lựa chọn là nước với 2 cách tiến hành điều chế cao như sau:
Cách 1: Dịch chiết thu được đem đun nóng ở nhiệt độ cao đến khi thu được cắn
Thêm khoảng 3ml nước vào cắn để hòa tan hoàn toàn betain, apigenin và luteolin Sau khi hòa tan, các chất không tan trong nước sẽ tủa lại Hỗn hợp này được ly tâm trong 10 phút với tốc độ 3000 vòng/phút để thu lấy tủa Cuối cùng, tủa được sấy ở 60°C trong 15 phút để thu được sản phẩm.
Để thực hiện cách 2, pha loãng dịch chiết với nước theo tỷ lệ 1:20 và để kết tinh trong 1 giờ ở 0 độ C Do apigenin và luteolin không tan trong nước, chúng sẽ tạo thành tủa Hỗn hợp dịch và tủa sau đó được ly tâm trong 10 phút với tốc độ 3000 vòng/phút để thu được tủa Cuối cùng, tủa được sấy ở 60 độ C trong 15 phút để hoàn thành quá trình và thu được sản phẩm.
3.5.1.2 Phương pháp 2: Sử dụng than hoạt
Thêm 0,4 g than hoạt tính vào dịch chiết và ngâm trong 15 phút, đồng thời khuấy trộn để đảm bảo hoạt chất được hấp phụ hoàn toàn lên bề mặt than Sau đó, tiến hành lọc than hoạt tính bằng thiết bị lọc chân không để thu được sản phẩm.
Để giải hấp phụ lượng than hoạt, sử dụng 20 ml ethanol 96% và tiến hành đun nóng kết hợp khuấy trộn trong khoảng 15 phút Sau đó, lọc lấy dịch và cô đặc dịch lọc cho đến khi thu được cao đặc.
Cao đặc được hòa tan trong 4 ml methanol tuyệt đối và lọc qua màng lọc 0,45 μm Sau đó, dịch lọc được dùng để xác định hàm lượng apigenin và luteolin bằng phương pháp HPLC, như đã trình bày ở mục 3.1 Kết quả sẽ được so sánh với hàm lượng các chất tương ứng trong cao đặc chiết bằng dung môi ethanol 96% dưới cùng điều kiện, và được trình bày trong bảng 3.8.
Bảng 3.8 Kết quả định lượng apigenin và luteolin trong cao cần tây
Phương pháp Hợp chất Hàm lượng tính theo mg/g dược liệu
Hàm lượng tính theo mg/g cao
Tỉ lệ cao chiết được (%)
Sử dụng phản dung môi (cách 1)
Sử dụng phản dung môi (cách 2)
Sử dụng than hoạt Apigenin - (*) - (*)
Chú thích: (*) : Không phát hiện pic apigenin trên sắc ký đồ
Cả 3 phương pháp điều chế trên đều loại bỏ được các thành phần của hệ dung môi eutectic Trong đó, hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin trong cao đặc quả cần tây đạt giá trị cao nhất khi xử lý bằng phản dung môi (cách 1) với các giá trị lần lượt là 11,4008 mg/g và 46,3477 mg/g, thấp nhất khi sử dụng than hoạt
Phương pháp sử dụng than hoạt có tỉ lệ chiết xuất cao nhưng hàm lượng hoạt chất trong cao lại thấp Nguyên nhân là do apigenin và luteolin trong dịch chiết ít hấp phụ lên bề mặt than hoạt Thêm vào đó, lượng than hoạt không được loại bỏ hoàn toàn trong quá trình lọc, dẫn đến khối lượng cao thu được lớn Đây là phương pháp kém hiệu quả nhất trong ba phương pháp đã được thực hiện.
Từ kết quả khảo sát trên, phương pháp sử dụng phản dung môi được lựa chọn để điều chế cao đặc từ dịch chiết quả cần tây trong DES
Quy trình chiết xuất cao đặc giàu apigenin và luteolin từ quả cần tây bao gồm các bước tối ưu như sau: Đầu tiên, cân chính xác 0,2000 g dược liệu vào ống nghiệm và thêm 4 ml dung môi betain - propylen glycol với tỷ lệ 1:8 (hàm lượng nước 40%) Tiến hành chiết xuất ở nhiệt độ 75°C trong 19 phút, sau đó ly tâm dịch chiết với tốc độ 3000 vòng/phút trong 10 phút để thu gạn phần dịch Dịch chiết thu được được đun nóng đến khi tạo thành cắn, sau đó thêm 3 ml nước và ly tâm trong 10 phút với tốc độ 3000 vòng/phút để lọc thu lấy tủa Cuối cùng, sấy tủa ở 60°C trong 15 phút để thu được sản phẩm cuối cùng.
Bàn luận
Trong các nghiên cứu trước đây, các dung môi hữu cơ như ethanol, hexan và methanol thường được sử dụng để chiết xuất flavonoid từ quả cần tây, nhưng chúng có nhiều nhược điểm như dễ cháy nổ và tác động xấu đến môi trường và sức khỏe Do đó, nghiên cứu này đã áp dụng hệ dung môi eutectic để khắc phục những hạn chế của dung môi hữu cơ truyền thống Cụ thể, DES với thành phần betain và propylen glycol theo tỷ lệ 1:8 đã được sử dụng để chiết xuất cao đặc giàu apigenin và luteolin từ quả cần tây Các điều kiện chiết xuất đã được tối ưu hóa thông qua các phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT) và bề mặt đáp ứng (RSM), giúp xác định điều kiện tối ưu một cách nhanh chóng và tiết kiệm chi phí.
Nghiên cứu đã khảo sát các phương pháp loại bỏ dung môi DES khỏi dịch chiết và đề xuất một quy trình hoàn chỉnh sử dụng dung môi eutectic để chiết xuất cao đặc giàu apigenin và luteolin từ quả cần tây.
Việc sử dụng hệ dung môi eutectic đã giúp tăng đáng kể hàm lượng apigenin và luteolin trong cao quả cần tây so với các dung môi truyền thống như nước hay các dung môi hữu cơ khác như ethanol và methanol trong các nghiên cứu trước đây.
Việc lựa chọn thành phần và tỷ lệ của chúng trong hệ dung môi eutectic đóng vai trò quan trọng trong khả năng chiết xuất của DES Nghiên cứu này đã chứng minh rằng DES tạo thành từ betain và propylen glycol với tỷ lệ 1:8 mang lại hiệu suất chiết xuất apigenin và luteolin cao nhất Sự kết hợp này cũng mang lại các ưu điểm như chi phí thấp, không độc hại, dễ dàng tạo thành hệ đồng nhất, trong suốt và ổn định ở điều kiện thông thường Kết quả định lượng đã khẳng định DES là dung môi phù hợp để chiết xuất cao đặc giàu apigenin và luteolin từ quả cần tây.
Hệ dung môi eutectic gặp khó khăn trong quá trình điều chế cao do độ bay hơi thấp, nhưng nghiên cứu này đã đưa ra giải pháp hiệu quả để thu được hàm lượng hoạt chất cao Đây là nghiên cứu đầu tiên ứng dụng hệ dung môi eutectic trong chiết xuất apigenin và luteolin từ quả cần tây, mở ra cơ hội phát triển sản phẩm điều trị bệnh gút Quy trình chiết xuất không chỉ an toàn và không gây độc cho con người mà còn thân thiện với môi trường.
3.6.2 Triển vọng ứng dụng của hệ DES trong chiết xuất
DES, một dung môi thân thiện với môi trường, đang ngày càng thu hút sự chú ý với sự gia tăng đáng kể số lượng và ứng dụng đa dạng trong nhiều lĩnh vực Trong ngành chiết xuất, việc áp dụng DES đang mở rộng nhanh chóng, với các tính chất vật lý khác nhau dẫn đến triển vọng ứng dụng khác nhau Chẳng hạn, DES có sức căng bề mặt thấp thích hợp cho việc thấm ẩm dược liệu, trong khi DES có độ nhớt thấp thuận tiện cho việc hòa tan hoạt chất Hiện nay, các hệ dung môi DES ưa nước đang được nghiên cứu phổ biến nhất, mặc dù dung môi kỵ nước cũng đang nhận được sự quan tâm, nhưng số lượng vẫn còn hạn chế Thêm vào đó, DES chưa có sẵn trên thị trường, gây khó khăn cho việc sử dụng trong quy mô công nghiệp Tuy nhiên, trong tương lai gần, DES hứa hẹn sẽ trở thành dung môi phổ biến và sẵn có hơn trong ngành chiết xuất.
DES được coi là dung môi hiệu quả trong việc chiết xuất polyphenol Để tối ưu hóa quá trình chiết xuất, các phương pháp như siêu âm và vi sóng có thể được áp dụng, giúp giảm thời gian và lượng dung môi cần thiết so với phương pháp truyền thống, đặc biệt cho các hợp chất nhạy cảm với nhiệt Mặc dù đã có nhiều nghiên cứu về các dung môi eutectic, nhưng lĩnh vực này vẫn còn mới mẻ và cần thêm nghiên cứu để nâng cao ứng dụng của DES trong thực tiễn.
Trong lĩnh vực phân tích và xử lý mẫu, DES đang thu hút sự chú ý nhờ vào tính chọn lọc cao đối với các chất phân tích và khả năng hiệu quả trong việc loại bỏ tạp chất.
Sự hiện diện của 42 gây nhiễu trong mẫu, đặc biệt là trong các mẫu có nền phức tạp như nước thải và mẫu sinh học, là một vấn đề quan trọng Với tính linh hoạt của dung môi DES, ứng dụng của nó trong phân tích sẽ tiếp tục phát triển và có khả năng thay thế dung môi hữu cơ trong nhiều ứng dụng trong tương lai.
DES không ngừng cải tiến và đáp ứng các tiêu chuẩn xanh trong hóa học phân tích, mở rộng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như chuẩn bị vật liệu mới (gel từ tính, hạt nano) để loại bỏ chất vi lượng hữu cơ và ion kim loại từ nước, lưu giữ CO2, tạo môi trường điện phân cho pin mặt trời, và chiết xuất hợp chất có hoạt tính sinh học.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN
Sau thời gian thực hiện, đề tài đã hoàn thành các mục tiêu đề ra và thu được các kết quả như sau:
1 Đã tiến hành khảo sát 34 hệ dung môi eutectic, kết quả cho thấy hệ betain - propylen glycol tỉ lệ 1:8 có khả năng chiết xuất tốt nhất và được lựa chọn làm dung môi để chiết xuất cao đặc giàu apigenin và luteolin từ quả cần tây
2 Đã tiến hành khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết xuất cao đặc giàu apigenin và luteolin từ quả cần tây bao gồm: thời gian chiết xuất, nhiệt độ chiết xuất, hàm lượng nước bằng phương pháp thay đổi một yếu tố (OFAT) kết hợp với phương pháp bề mặt đáp ứng (RSM) Từ đó lựa chọn được điều kiện chiết xuất tối ưu như sau:
Thời gian chiết xuất: 19 phút Nhiệt độ chiết xuất: 75 o C
Hàm lượng nước trong DES: 40 % (kl/kl)
3 Dựa trên điều kiện chiết xuất tối ưu, đã tiến hành khảo sát phương pháp điều chế cao cần tây từ dịch chiết quả cần tây trong DES Kết quả đã lựa chọn được phương pháp sử dụng phản dung môi cho hiệu quả tốt nhất với tỉ lệ cao chiết được là 6,22%; hàm lượng apigenin và hàm lượng luteolin trong cao lần lượt là 11,40 mg/g và 46,35 mg/g
Nghiên cứu nâng cấp quy trình chiết xuất ở quy mô pilot và quy mô công nghiệp
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1 Bộ Y Tế (2017), "Dược điển Việt Nam V, tập 2", Nhà xuất bản Y học
2 Nguyễn Thùy Dương, Nguyễn Thu Hằng (2016), "Đánh giá tác dụng chống viêm và giảm đau của hạt cần tây trên động vật thực nghiệm", Tạp chí Dược học,
3 Nguyễn Thu Hằng và cộng sự (2014), "Định lượng flavonoid trong hạt cần tây bằng phương pháp đo quang", Tạp chí Nghiên cứu Dược và Thông tin thuốc,
4 Nguyễn Thu Hằng, Nguyễn Thùy Dương, Nguyễn Thanh Tùng (2014), "Nghiên cứu tác dụng ức chế enzym xanthin oxidase in vitro của cây cần tây (Apium graveolens L.)", Tạp chí Dược học, 54(4), tr 67-71
5 Nguyễn Văn Hân (2017), "Kỹ thuật chiết xuất dược liệu", Nhà xuất bản Y học
6 Viện Dược Liệu (2004), "Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, tập 2", tr 566
7 Ahluwalia Vinod K, Boyd Derek R, et al (1988), "Furanocoumarin glucosides from the seeds of Apium graveolens", Phytochemistry, 27(4), pp 1181-1183
8 Aroso Ivo M, Craveiro Rita, et al (2015), "Design of controlled release systems for THEDES-Therapeutic deep eutectic solvents, using supercritical fluid technology", International journal of pharmaceutics, 492(1-2), pp 73-79
9 Association of Official Analytical Chemists (2016), Guidelines for Standard
10 Barnes, J., et al (2007), "Herbal medicines., 3rd Edition", Pharmaceutical Press
11 Beier RC, Ivie GW, et al (1983), "HPLC analysis of linear furocoumarins
(psoralens) in healthy celery (Apium graveolens)", Food and Chemical Toxicology, 21(2), pp 163-165
12 Cao Jun, Wang Huimin, et al (2018), "Tailor-made deep eutectic solvents for simultaneous extraction of five aromatic acids from Ginkgo biloba leaves", Molecules, 23(12), pp 3214
13 Chemat Farid, Abert Vian Maryline, et al (2019), "Review of alternative solvents for green extraction of food and natural products: Panorama, principles, applications and prospects", Molecules, 24(16), pp 3007
14 Cherng Jaw-Ming, Chiang Wen, et al (2008), "Immunomodulatory activities of common vegetables and spices of Umbelliferae and its related coumarins and flavonoids", Food chemistry, 106(3), pp 944-950
15 Choi Young Hae, van Spronsen Jaap, et al (2011), "Are natural deep eutectic solvents the missing link in understanding cellular metabolism and physiology?",
16 Cunha Sara C, Fernandes José O (2018), "Extraction techniques with deep eutectic solvents", TrAC Trends in Analytical Chemistry, 105, pp 225-239
17 Dai Yuntao, van Spronsen Jaap, et al (2013), "Natural deep eutectic solvents as new potential media for green technology", Analytica chimica acta, 766, pp 61-
18 de Souza Maíra Ribeiro, de Paula Carmen Aparecida, et al (2012),
"Pharmacological basis for use of Lychnophora trichocarpha in gouty arthritis: anti-hyperuricemic and anti-inflammatory effects of its extract, fraction and constituents", Journal of ethnopharmacology, 142(3), pp 845-850
19 Dolati Karim, Rakhshandeh Hassan, et al (2018), "Inhibitory effects of Apium graveolens on xanthine oxidase activity and serum uric acid levels in hyperuricemic mice", Preventive nutrition and food science, 23(2), pp 127
20 E Durand, J Lecomte, et al (2013), "Deep eutectic solvents: Synthesis, application, and focus on lipase-catalyzed reactions", European Journal of Lipid
21 El-Tantawy Walid Hamdy (2021), "Natural products for the management of hyperuricaemia and gout: a review", Archives of physiology and biochemistry,
22 Fazal Syed Sufiyan, Singla Rajeev K (2012), "Review on the pharmacognostical
& pharmacological characterization of Apium graveolens Linn", Indo Global Journal of Pharmaceutical Sciences, 2(1), pp 36-42
23 Fourmentin Sophie (2020), Deep Eutectic Solvents for Medicine, Gas
Solubilization and Extraction of Natural Substances, Springer, pp
24 Gudzenko Andriy (2013), "Development and Validation of a RP-HPLC Method for The Simultaneous Determination of Luteolin and Apigenin in Herb of Achillea millefolium L", The Pharma Innovation, 2(7), pp
25 Han Dandan, Row Kyung Ho (2011), "Determination of luteolin and apigenin in celery using ultrasonic‐assisted extraction based on aqueous solution of ionic liquid coupled with HPLC quantification", Journal of the Science of Food and Agriculture, 91(15), pp 2888-2892
