TỔNG QUAN
Tổng quan về Cốt khí củ
Cốt khí củ, scientifically known as Polygonum cuspidatum Sieb et Zucc., belongs to the Polygonaceae family It is also referred to by several synonyms, including Reynoutria japonica Houtt., Polygonum reynoutria Mak., and Reynoutria elata Nak.
Cốt khí củ, còn được biết đến với nhiều tên gọi khác nhau tại Việt Nam như điền thất, hổ trượng căn, phù linh, nam hoàng cầm, co hớ hườn (Thái), mèng kẻng (Tày), và hồng lìu (Dao).
Theo phân loại thực vật học [31] Cốt khí củ thuộc
Cây nhỏ, sống lâu năm với rễ phình thành củ cứng, mọc bò nghiêng dưới đất Vỏ ngoài có màu nâu đen, trong khi ruột có màu vàng Thân cây hình trụ, nhẵn, cao từ 0,5 đến 1m, thường xuất hiện những đốm màu tím hồng Lá mọc so le, cuống ngắn, có hình trứng với đầu tù, hơi nhọn, kích thước dài từ 5 đến 12cm và rộng từ 3,5 đến 8cm, mặt trên có màu lục sẫm hoặc đôi khi nâu đen.
Cụm hoa ngắn hơn lá, mọc thành chùm ở kẽ lá với hoa nhỏ màu trắng, bao gồm hoa đực và hoa cái riêng biệt Bao hoa có 5 phiến, hoa đực có 8 nhị, trong khi hoa cái có bầu ba góc Quả của cây có hình 3 cạnh và màu nâu đỏ.
Nhiều cây cũng mang tên “cốt khí” như cốt khí muồng hay cốt khí hạt (Cassia occidentalis L.) thuộc họ Vang (Caesalpiniaceae), cốt khí thân tím (T purpurea
Pers.), cốt khí thân trắng (Tephrosia candida DC.) họ Đậu (Fabaceae) và cốt khí dây (Sabia olacifolia Stapf )họ Thanh phong (Sabiaceae)
Cốt khí củ, một loại cây có nguồn gốc từ Đông Nam Á, đã lan rộng ra các khu vực cận nhiệt đới và nhiệt đới, bao gồm Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Việt Nam, Lào và nhiều nơi khác Tại Việt Nam, cây thường mọc hoang dại ở các vùng núi cao từ 1000 đến 1600 m và được trồng rải rác trong cộng đồng dân cư ở các vùng trung du và đồng bằng Bắc.
Cốt khí củ là loại cây ưa sáng và ẩm, thường mọc thành khóm tại các thung lũng gần nguồn nước như ở Sa Pa Cây này rụng lá vào mùa đông và hàng năm ra hoa quả nhiều, có khả năng mọc chồi từ thân rễ Do sự hiếm gặp trong tự nhiên, cốt khí củ đã được đưa vào Sách Đỏ Việt Nam năm 1996 để nhấn mạnh tầm quan trọng của việc bảo vệ loài cây này.
Cốt khí củ thường được trồng ở vườn, bờ ao hoặc quanh nhà tại vùng trung du và đồng bằng Loài cây này ưa đất ẩm nhưng cần thoát nước tốt, vì nếu bị ngập úng sẽ dễ bị thối củ.
Cốt khí củ được nhân giống từ đoạn rễ mang mầm, sau khi thu hoạch, rễ bên được tách ra và giâm trong cát ẩm Vào mùa xuân, cây con được trồng trên đất đã được chuẩn bị kỹ, làm sạch cỏ, với luống cao từ 25 – 30 cm và rộng 60 – 70 cm Khoảng cách trồng cây con là 20 – 30 cm, phủ một lớp đất sâu từ 2 – 3 cm.
Rễ cây ăn nông, vì vậy phải thường xuyên vun gốc, kết hợp làm cỏ
Cây phát triển mạnh từ mùa xuân đến mùa thu, với thời gian thu hoạch củ bắt đầu từ tháng 9 Nên thu hoạch vào những ngày nắng ráo trong mùa đông khi thân lá héo Sau khi cắt bỏ thân lá, sử dụng cuốc hoặc xẻng để đào rễ củ, rửa sạch, thái lát và phơi khô Ngoài ra, có thể thu hoạch vào đầu mùa xuân trước khi cây tái sinh, vừa thuận tiện cho việc thu hoạch vừa dễ dàng bảo quản giống.
Rễ cốt khí củ được thu hái quanh năm, nhưng thời điểm tốt nhất là vào mùa thu – đông Sau khi thu hoạch, rễ cần được rửa sạch đất cát, cắt bỏ rễ con, và thái thành những miếng nhỏ dày khoảng 1 – 2cm trước khi phơi hoặc sấy khô Dược liệu này có bề mặt màu nâu xám, sần sùi và nhăn nheo theo chiều dọc, với các mấu đốt rõ rệt.
4 gióng, mặt cắt ngang màu vàng bẩn, lõi gần như rỗng, phần không rỗng có màu nâu sẫm Chất nhẹ, hơi cứng, mùi không rõ, vị hơi đắng
Y học cổ truyền dùng cốt khí củ thay hoàng cầm với tên hoàng cầm nam
Cốt khí củ đã được nghiên cứu từ những năm 1950, khi các quinon và các dẫn xuất của chúng được phân lập và xác định cấu trúc hóa học Trong rễ Cốt khí củ, các quinon chủ yếu bao gồm nhóm anthraquinon với hàm lượng lớn và nhóm naphthoquinon Các anthraquinon trong rễ này có cấu trúc khung emodin, bao gồm các hợp chất như physcion, emodin, chrysaphanol, rhein, falacinol, citreorosein, questin, questinol, và anthraglycosid A – B, cùng với các anthraquinones polyganin.
A – B Ba naphthoquinon là 2-methoxy-6-acetyl-7-methyljuglon, cuspidatumin A và 7-acetyl-2-methoxy-6-methyl-8-hydroxyl-4-naphthoquinon cũng đã được phân lập từ rễ Cốt khí củ
Hình 1.1 Công thức một số anthraquinon và naphthoquinon trong rễ
Stilben là một nhóm hợp chất có cấu trúc cacbon C6-C2-C6, thuộc nhóm phenylpropanoids Một số stilbenoid, như piceatannol trong rễ cây vân sam Na Uy và pinosylvin - một độc tố nấm giúp bảo vệ gỗ khỏi nhiễm nấm, đã được phát hiện trong thực vật và khẳng định hoạt tính đặc trưng của chúng.
Nghiên cứu về rễ cây Cốt khí củ đã chỉ ra sự hiện diện của nhóm stilben, với hai stilben chính được xác định.
Vào năm 1963, resveratrol và dẫn xuất của nó là polydatin đã được phân lập và xác định cấu trúc Đến năm 2004, hai stilben khác là resveratrol 4-O-D-(2’-galloyl)-glucopyranoside và resveratrol 4-O-D-(6’-galloyl)-glucopyranoside đã được phát hiện từ dịch chiết methanol 70% của rễ Cốt khí củ.
Hình 1.2 Công thức cấu tạo một số stilben trong rễ Cốt khí củ
Trong rễ Cốt khí củ có chứa các flavonoid thuộc nhóm flavonol như: quercetin, dẫn chất của quercetin và dạng glycosid, catechin và dạng glycosid của nó [1],
In addition, the roots of Cốt khí củ contain various compounds, including coumarins such as 7-hydroxy-4-methoxy-5-methylcoumarin, lignans like sodium (-)-lyoniresinol-2a-sulfate and sodium (+)-isolaricireinol-2a-sulfate, as well as other compounds such as gallic acid, tryptophan, and β-sitosterol.
Tổng quan về emodin, physcion
1.2.1.1 Tính chất vật lý và hóa học
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của emodin
- Tên đầy đủ: 1,3,8-trihydroxy-6-methylanthracene-9,10-dion
- Khối lượng phân tử: 270,24 g/mol
- Các đỉnh hấp thụ đặc trưng trên phổ UV – Vis: 223, 254, 267, 290, 440 (nm)
Emodin, dưới điều kiện nhiệt độ phòng, xuất hiện dưới dạng bột kết tinh hoặc tinh thể hình kim màu vàng cam, với nhiệt độ nóng chảy khoảng 256 – 257 độ C Chất này hòa tan tốt trong các dung môi hữu cơ như ether, dầu hỏa, chloroform và methanol, nhưng lại không tan trong nước.
1.2.1.2 Tác dụng dược lý a Tác dụng chống ung thư
Jin và cộng sự đã chứng minh rằng emodin có khả năng ức chế sự di căn của tế bào ung thư vú bằng cách ngăn chặn sự hồi phục của các đại thực bào M2 trong phổi Hơn nữa, một nghiên cứu khác cho thấy sự kết hợp giữa emodin và curcumin có tác dụng ức chế sự gia tăng và xâm lấn của tế bào ung thư vú thông qua việc tăng cường sự hiện diện của miR-34a.
Way và cộng sự đã chứng minh rằng emodin có khả năng ức chế đáng kể sự di chuyển và xâm lấn của tế bào TWIST thông qua việc ức chế các con đường tổng hợp β-catechin và Akt Ngoài ra, emodin cũng thể hiện tác dụng chống viêm hiệu quả.
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng emodin có khả năng chống viêm hiệu quả trên chuột bị hoại tử, thông qua việc tăng sinh tế bào mCD14 và ức chế các cytokine viêm như TNF-α, IL-6, và IL-1β trong huyết thanh.
Nghiên cứu của Gao và cộng sự đã chỉ ra rằng thuốc bôi sẹo trị liệu Jiashitang chứa các thành phần hoạt tính kháng viêm như saffiomin, emodin, salvianolic acid, tanshinone và các dẫn xuất saponin triterpenoid Trong số đó, emodin có khả năng ức chế NF-κB thông qua các con đường MAPK, PI3K/AKT và NIK – IKK, góp phần vào tác dụng kháng khuẩn của sản phẩm.
Emodin cho thấy khả năng kháng khuẩn mạnh mẽ đối với các vi khuẩn Gram dương, đặc biệt là Bacillus subtilis và Staphylococcus aureus, với giá trị nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) lần lượt là 28,9 và 14,4 µg/ml Tuy nhiên, emodin không có hiệu quả đối với hai vi khuẩn Gram âm như Klebsiella.
8 pneumoniae và Escherichia coli) ở nồng độ cao nhất (1851,9 àm) đó được thử nghiệm d Các tác dụng khác
Emodin được ghi nhận với nhiều tác dụng tích cực, bao gồm giảm đau, kháng virus, ức chế miễn dịch, bảo vệ thần kinh, chống tiểu đường và bảo vệ tế bào gan.
1.2.2.1 Tính chất vật lý và hóa học
Hình 1.4 Công thức cấu tạo của physcion
- Tên đầy đủ: 1,8-dihydroxy-3-methoxy-6-methylanthracen-9,10-dion
- Khối lượng phân tử: 284,26 g/mol
- Các đỉnh hấp thụ đặc trưng trên phổ UV – Vis: 226, 255, 267, 288, 440 (nm)
At room temperature, Physcion appears as yellow needle-shaped crystals with a melting point of 203–207 °C It is soluble in boiling ethanol, benzene, chloroform, ether, acetone, and acetic acid, but is insoluble in water and has limited solubility in cold ethanol and very little solubility in kerosene ether.
1.2.2.2 Tác dụng dược lý a Tác dụng chống ung thư
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng physcion có khả năng kích thích các tế bào apoptotic đã chết để tiêu diệt các tế bào ung thư khác nhau Cụ thể, physcion hiệu quả trong việc gây tự chết cho các tế bào bệnh bạch cầu nguyên bào lympho cấp tính ở người bằng cách giảm biểu hiện của HOXA5 Đồng thời, nó cũng thể hiện tác dụng gây apoptosis thông qua việc tăng cường biểu hiện của poly(adenosine diphosphate-ribose) polymerase (PARP) và caspases.
3/8/9 bị phân cắt, và giảm dần biểu hiện của Bcl-2 và Bid trong tế bào ung thư vú
[17], làm tăng đáng kể tỷ lệ apoptosis của tế bào ung thư đại trực tràng ở người
Physcion đã chứng minh khả năng chống ung thư bằng cách can thiệp vào chu kỳ tế bào của khối u Nghiên cứu của Gao F và cộng sự cho thấy physcion có hiệu quả trong việc gây ra sự bắt giữ chu kỳ tế bào ở pha G1 bằng cách ức chế biểu hiện của gen HOXA5 Ngoài ra, nó cũng làm ngưng trệ pha G1 của tế bào CNE2 thông qua việc điều chỉnh tăng các tín hiệu p21 và p27, đồng thời giảm biểu hiện của cyclin D1 và E.
Physcion có khả năng giảm di căn của tế bào ung thư cổ tử cung bằng cách kích hoạt AMPK và ức chế hoạt động của RhoA và Rac1 Đồng thời, nó cũng tăng cường sự nhạy cảm của tế bào khối u với hóa trị liệu thông qua nhiều cơ chế khác nhau Cụ thể, Physcion làm tăng độ nhạy của các tế bào bệnh bạch cầu nguyên bào tủy mãn tính với adriamycin bằng cách kích thích quá trình apoptosis thông qua việc điều hòa tín hiệu miR-146a Hơn nữa, Physcion còn tăng cường hiệu quả chống tăng sinh và tạo tế bào gốc của các thuốc như paclitaxel, doxorubicin và cisplatin đối với tế bào HCC bằng cách ức chế chuyển hóa NADPH và oxy hóa thông qua con đường AMPK.
Physcion được phát hiện lần đầu tiên là chất ức chế đặc hiệu của enzyme glucose-6-phosphate dehydrogenase (G6PD) bởi Ruiting Lin và cộng sự Nghiên cứu của họ đã chỉ ra rằng physcion có khả năng ngăn chặn sự tăng trưởng và giảm khả năng sống sót của các tế bào khối u, bao gồm các dòng tế bào K562, H1299, A549, 212LN, MDA-MB-231 và tế bào bạch cầu nguyên phát ở người.
Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng physcion thể hiện hoạt động diệt nấm đáng kể
It effectively inhibits the viability of Rhyzoctonia solani, Botrytis cinerea, and Candida albicans with minimum inhibitory concentrations (MIC) of 31.3 μg/mL, 62.5 μg/mL, and 62.5 μg/mL, respectively Additionally, it demonstrates strong to moderate antifungal activity against Phytophthora infestans, Botrytis cinerea, Rhyzoctonia solani, and Erysiphe graminis at doses of 0.25, 0.5, and 1 g/L.
Physcion exhibits significant antibacterial activity against S aureus, S epidermidis, and P aeruginosa It can inhibit biofilm production in S aureus and E faecalis, while also enhancing the sensitivity of extended-spectrum beta-lactamase E coli strains and vancomycin-resistant E faecalis to cefotaxime and vancomycin Additionally, Physcion demonstrates anti-inflammatory effects.
Physcion có khả năng làm giảm đáng kể sản xuất NO trên các tế bào MH-S khi bị xử lý bằng lipopolysaccharide (LPS), dẫn đến giảm tổng hợp NO và PGE2 thông qua iNOS và COX-2 Nó cũng ức chế bài tiết TNF-α bằng cách can thiệp vào protein hoạt hóa mitogen kinase (MAPK) và kích hoạt NF-κB Hơn nữa, Physcion có thể làm giảm quá trình điều hòa hóa học qua trung gian CXCR4 của tế bào Jurkat E6.1 bằng cách ức chế con đường MEK/ERK, đồng thời làm giảm sự di chuyển của tế bào HSC-T6.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu
- Nguyên liệu Cốt khí củ được mua tại Cơ sở kinh doanh và chế biến dược liệu An Bình, xã Nghĩa Trai, huyện Văn Lâm, tỉnh Hưng Yên
Hình 2.1 Hình ảnh dược liệu Cốt khí củ
2.1.2 Thiết bị và hóa chất
Thiết bị máy móc và dụng cụ thí nghiệm
- Máy cất cô chân không IKA RV8
- Máy đo quang phổ HITACHI 1800
Hệ thống máy sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao bao gồm các thiết bị chính như: máy phun mẫu bán tự động CAMAG LINOMAT 5, bình triển khai sắc ký CAMAG, máy chụp ảnh bản mỏng CAMAG TLC VISUALIZER và phần mềm winCATS.
- Bản mỏng HPTLC Silica gel 60 F254 (Merk) TLC
- Cân kỹ thuật, độ chính xác 0,01g
- Cân phân tích, độ chính xác 0,0001g
- Các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác (bình nón, bình định mức, ống nghiệm, cốc có mỏ, ống đong, pipet…)
Ethanol tuyệt đối, Methanol, Ethyl Acetat, Toluen, Acid Acetic băng, Aceton, Acid Fomic và n-Hexan (Trung Quốc) đều đạt tiêu chuẩn tinh khiết phân tích (PA) Ngoài ra, Ethanol 96% và nước cất cũng đáp ứng tiêu chuẩn DĐVN V.
- Chất đối chiếu: Emodin, Physcion (Trung Quốc, phòng thí nghiệm).
Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát một số phương pháp chiết xuất anthranoid từ Cốt khí củ
- Phân lập emodin và physcion
- Định tính, định lượng emodin và physcion bằng TLC-UV
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phân lập emodin và physcion bằng sắc ký lớp mỏng điều chế
Phương pháp chiết cao toàn phần từ dược liệu cốt khí củ bắt đầu bằng việc cân 50g bột dược liệu và cho vào bình cầu, sau đó thêm 250-300ml cồn 70° và thực hiện chiết hồi lưu trong 90 phút, lặp lại quá trình này 3 lần Các dịch chiết sau đó được gộp lại và cô loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cất quay chân không đến cắn Cắn thu được được hòa tan trong EtOH hoặc MeOH với tỷ lệ thích hợp, siêu âm trong 60 phút, sau đó ly tâm và gạn lấy dịch trong để tiến hành sắc ký lớp mỏng.
Bản mỏng Silicagel GF254 (Merck) kích thước 20x10cm hoạt hóa ở 110 o C trong
Sau 1 giờ, chấm dịch chiết cao toàn phần lên bản mỏng thành một băng dài và khai triển sắc kí với hệ dung môi Toluen: EtOH: Acid acetic (8: 2: 0.5) Sau khi để khô tự nhiên hoặc sấy khô, quan sát dưới ánh sáng trắng, 366nm và 254nm để xác định và khoanh vùng các vết emodin và physcion Cạo riêng biệt các vùng có vết đã đánh dấu và gộp bột silicagel đã cạo vào một bình nón, lặp lại nhiều lần cho đến khi thu được khoảng 10g bột silicagel có chất đã hấp phụ.
Quá trình chiết xuất được thực hiện bằng cách sử dụng 200ml CHCl3 và áp dụng siêu âm trong 30 phút, lặp lại ba lần Sau khi gộp các dịch chiết, dung môi được cô đặc dưới áp suất giảm bằng máy cất quay chân không cho đến khi còn lại cặn Cuối cùng, cặn thu được chứa emodin và physcion tinh khiết.
2.3.2 Phân lập emodin và physcion bằng sắc kí cột
2.3.2.1 Chiết hỗn hợp anthranoid từ Cốt khí củ
Tiến hành chiết xuất hỗn hợp anthranoid từ bột dược liệu cốt khí củ theo 2 phương pháp sau:
Để chiết xuất từ bột cốt khí củ, cân 100g bột vào bình nón và thêm 700-800ml EtOH 96%, sau đó siêu âm trong 60 phút và lặp lại quá trình chiết 3 lần Gộp các dịch chiết và cô đặc dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cất quay chân không cho đến khi còn cắn Tiếp theo, chuyển cắn vào bình nón với 700-800ml HCl 20% và chiết hồi lưu cách thủy trong 5 giờ Lọc lấy cắn và sấy khô, sau đó tiếp tục chiết cắn này với 700-800ml EtOAc Lọc lấy bã dược liệu, rửa bằng nước cất và sấy khô ở 60°C Cuối cùng, bã này được chiết với 700-800ml EtOAc, siêu âm trong 60 phút, lọc lấy dịch và cô đặc dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cất quay chân không cho đến khi còn cắn (Cắn 1).
Để thực hiện phương pháp chiết xuất, cân 100g bột cốt khí củ cho vào bình nón, sau đó thêm 700-800ml HCl 20% Tiến hành chiết hồi lưu cách thủy trong 5 giờ Sau khi chiết xong, lọc lấy bã dược liệu và rửa bằng nước cất, rồi sấy khô ở nhiệt độ 60°C Bã dược liệu này tiếp tục được chiết với 700-800ml EtOAc, siêu âm trong 60 phút, sau đó lọc lấy dịch và cô loại dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cất quay chân không.
2.3.2.2 Phân lập emodin và physcion từ hỗn hợp
Sử dụng cắn EtOAc thu được từ 2 phương pháp trên rễ để tiến hành phân lập bằng sắc kí cột
Để chuẩn bị cột chạy sắc ký, sử dụng cột thủy tinh có khóa với đường kính 3.5cm và chiều dài 45cm Rửa sạch và sấy khô cột, sau đó cố định trên giá theo chiều thẳng đứng Chất nhồi cột là 30g silicagel (Merck, cỡ hạt 60µm), được hoạt hóa ở 110°C trong 1 giờ Tiến hành nhồi cột bằng phương pháp nhồi cột ướt.
Dung môi rửa giải: Toluen : EtOH (8:2)
Nhồi cột là quá trình bắt đầu bằng việc cho một lượng vừa đủ dung môi rửa giải vào silicagel đã hoạt hóa Sau đó, cần phân tán đều silicagel trong bình nón và loại bỏ bọt khí Tiếp theo, đổ dung môi vào cột một cách từ từ và gõ nhẹ để đảm bảo silicagel được trải đều Cuối cùng, rửa thành cột bằng dung môi rửa giải để hoàn thiện quá trình.
Để ổn định cột, mở khóa cho dung môi chảy cho đến khi lượng silicagel trên cột đạt mức ổn định Tiếp tục cho dung dịch chảy đến khi cách bề mặt silicagel khoảng 3mm, sau đó khóa cột và nhồi cắn.
Để đưa cắn lên cột, hòa tan cắn EtOAc bằng một lượng tối thiểu dung môi rửa giải và thêm một ít silicagel đã được hoạt hóa Trộn đều và bốc hơi dung môi cho đến khi bột cắn khô mịn và tơi Sau đó, nhồi cắn lên cột và chèn thêm một lớp bông ở trên để bảo vệ cắn khỏi bị xáo trộn khi cho dung môi vào.
Dung dịch rửa giải được thu vào các bình 50ml và được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng, sử dụng bản mỏng silicagel GF254 với hệ dung môi Toluen: EtOH: Acid acetic Các dịch rửa giải có sắc ký đồ tương tự được gộp lại và cô đặc đến cắn.
Sau khi thu được các sản phẩm từ cột thứ nhất, tiến hành lấy cắn phân đoạn Toluen, trong đó có 2 vết tương ứng với emodin và physcion (Cắn 3), để tiếp tục chạy ở cột thứ hai.
Để chuẩn bị cột chạy sắc ký, sử dụng cột thủy tinh có khóa với đường kính 2.5cm và chiều dài 85cm Cột cần được rửa sạch và sấy khô trước khi cố định trên giá theo chiều thẳng đứng Chất nhồi cột là 30g silicagel (Merck, cỡ hạt 60àm), được hoạt hóa ở 110 o C trong 1 giờ, và thực hiện phương pháp nhồi cột ướt để đảm bảo hiệu quả tối ưu.
Dung môi rửa giải: N-hexan : EtOAc (98:2)
Nhồi cột là quá trình bắt đầu bằng việc cho một lượng dung môi rửa giải vừa đủ vào silicagel đã hoạt hóa, sau đó phân tán đều silicagel trong bình nón và loại bỏ bọt khí Tiếp theo, đổ dung môi từ từ vào thành cột, gõ nhẹ để đảm bảo silicagel được lấp đầy đều Rửa thành cột bằng dung môi rửa giải và ổn định cột bằng cách mở khóa cho dung môi chảy cho đến khi lượng silicagel trên cột nén xuống mức ổn định Cuối cùng, cho dung dịch chảy đến khi cách bề mặt silicagel khoảng 3mm, sau đó khóa cột và nhồi cắn.
Để đưa cắn lên cột, hòa tan cắn Toluen bằng lượng dung môi rửa giải tối thiểu, sau đó thêm một ít silicagel đã được hoạt hóa và trộn đều Cuối cùng, bốc hơi hết dung môi cho đến khi hoàn tất.
Khi bột đã cắn đều, khô mịn và tơi, hãy nhồi bột lên cột và chèn thêm một lớp bông lên trên Điều này giúp đảm bảo rằng bột không bị xáo trộn khi thêm dung môi.
KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN
Phân lập emodin và physcion bằng sắc ký lớp mỏng điều chế
Tiến hành điều chế cao toàn phần từ bột cốt khí củ như mục 2.3.1, làm 3 lần, kết quả được thể hiện trong Bảng 3.1
Bảng 3.1 Khối lượng cao toàn phần thu được từ dịch chiết bột cốt khí củ
Khối lượng cao sau cô đặc (g)
Tỷ lệ % cao chiết thu được (%)
Để chọn phương pháp chấm sắc ký phù hợp cho việc phân lập emodin và physcion bằng sắc ký lớp mỏng, cần khảo sát các tỷ lệ giữa cao và dung môi như đã trình bày trong bảng.
3.2 bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi Toluen: EtOHtđ: Acid aceticbăng
Kết quả nghiên cứu cho thấy tỉ lệ 1:10 (1g cao: 10ml EtOH) mang lại sắc kí đồ với các vết tách rõ nét nhất và dịch chiết có chất lượng tốt (Hình 3.1) Do đó, tỉ lệ này được lựa chọn để chuẩn bị dịch chiết cho quá trình sắc ký lớp mỏng.
Bảng 3.2 Khảo sát tỉ lệ khối lượng cao chiết và dung môi
Hình 3.1 Sắc kí đồ khảo sát tỉ lệ cao:dung môi
Để lựa chọn dung môi phù hợp, chúng tôi đã tiến hành chuẩn bị dịch chiết với tỉ lệ 1:10 cho hai loại dung môi EtOH và MeOH (1g cao hòa tan trong 10ml EtOH và 1g cao hòa tan trong 10ml MeOH) Sau đó, chúng tôi thực hiện sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi Toluen: EtOHtđ:: Acid aceticbăng (8:2:0.5) Kết quả cho thấy dịch chiết EtOH có màu sắc trong hơn, độ nhớt thấp hơn MeOH và sắc ký đồ rõ nét hơn Do đó, EtOH được lựa chọn là dung môi hòa tan cắn để tiến hành sắc ký lớp mỏng nhằm điều chế emodin và physcion.
Tiến hành sắc ký lớp mỏng với dịch chiết ethanol tuyệt đối của cao toàn phần cốt khí củ tỉ lệ 1:10 như đã trình bày ở mục 2.3.1 (Hình 3.2)
Hình 3.2 Sắc kí đồ của cao toàn phần cốt khí củ (366nm)
Sau khi triển khai sắc kí, cạo vết, phản hấp phụ, cô loại dung môi thu được emodin và physcion, tiến hành quét phổ UV để kiểm tra
Hình 3.3 Phổ hấp thụ UV của emodin phân lập từ cốt khí củ bằng sắc ký lớp mỏng
Hình 3.4 Phổ hấp thụ UV của physcion phân lập từ cốt khí củ bằng sắc ký lớp mỏng
Hình 3.5 Sơ đồ quy trình phân lập emodin và physcion từ cốt khí củ bằng sắc ký lớp mỏng
Chiết xuất Emodin và Physcion bằng sắc kí cột
3.2.1 Chiết hỗn hợp anthranoid từ cốt khí củ
Với 100g bột cốt khí củ ban đầu, quá trình chiết xuất hỗn hợp anthranoid theo phương pháp 1 cho kết quả 2.4785g cắn (Cắn 1), trong khi phương pháp 2 thu được 14.3170g cắn (Cắn 2).
Có thể thấy phương pháp 2 cho lượng cắn thu được lớn hơn nhiều so với phương pháp 1, thời gian điều chế cắn lại ngắn hơn nhiều
3.2.2 Phân lập emodin và physcion bằng sắc kí cột
- Cột thứ nhất: điều chế cắn phân đoạn Toluen (Cắn 3)
Dưới điều kiện chạy sắc ký đã nêu, từ 0,3g cắn EtOAc ban đầu, chúng tôi đã thu được 24 phân đoạn, mỗi phân đoạn khoảng 50ml Kết quả được kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi Toluen: EtOHtđ: Acid acetic.
(8:2:0.5) (Hình 3.6) chúng tôi gộp các phân đoạn giống nhau lại và cô loại dung môi đến cắn thu được 4 phần (Bảng 3.3)
Bảng 3.3 Các phân đoạn thu được từ sắc kí cột thứ nhất
Chú thích: Hàm lượng của phân đoạn trong cắn = mphân đoạn/Ʃmphân đoạn*100
Hình 3.6 Sắc kí đồ (366nm) kiểm tra các phân đoạn từ sắc kí cột thứ nhất
(Chú thích: T-hỗn hợp emodin và phyyscion, 1-24: các phân đoạn từ 1-24)
Bài nghiên cứu đã thu được bốn phần, bao gồm: phần 1 chứa hỗn hợp hai vết emodin và physcion; phần 2-16 là hỗn hợp ba vết không có physcion; phần 17-18 là hỗn hợp hai vết không có physcion; và phần 19-26 có các vết rất mờ, gần như không thể quan sát Kết quả cho thấy rằng cột sắc ký với hệ dung môi Toluen:EtOH (8:2) không thể tách riêng biệt emodin và physcion, nhưng phần 1 lại chứa hỗn hợp hai chất emodin và physcion với tỷ lệ cao trong cắn EtOAc, có chất lượng tốt sau khi cô cạn Do đó, chúng tôi đã lấy cắn từ phân đoạn này (Cắn 3) để tiếp tục thực hiện cột sắc ký thứ hai với hệ dung môi N-hexan:EtOAc (98:2).
Cột sắc ký thứ hai, theo các điều kiện đã trình bày ở mục 2.3.2.2, từ 0,3g mẫu, chúng tôi thu được 18 phân đoạn Toluen chỉ chứa emodin và physcion, với khoảng 125ml mỗi bình hứng Qua kiểm tra bằng sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi Toluen: EtOHtđ: Acid aceticbăng (8:2:0.5), chúng tôi đã gộp các phân đoạn giống nhau lại và cô đặc dung môi, cuối cùng thu được 4 phần.
Bảng 3.4 Các phân đoạn thu được từ sắc kí cột thứ hai Phân đoạn 1-3 4,10-11 5-9, 12, 15-18 13-14
Chú thích: Hàm lượng của phân đoạn trong cắn = mphân đoạn/Ʃmphân đoạn*100
Bài viết cho thấy rằng quá trình sắc ký đã thu được bốn phần với các thành phần khác nhau: phần 1-3 chỉ chứa một vết physcion; phần 4, 10-11 là hỗn hợp gồm hai vết emodin và physcion; phần 5-9, 12, 15-18 chứa emodin chưa tinh khiết; và phần 13-14 chỉ có một vết emodin Điều này chứng tỏ rằng cột sắc ký thứ hai sử dụng hệ dung môi N-hexan:EtOAc (98:2) đã tách riêng emodin và physcion từ phân đoạn toluen, mặc dù chưa hoàn toàn tách biệt.
Hình 3.7 Sắc kí đồ (366nm) kiểm tra các phân đoạn từ sắc kí cột thứ hai
Physcion được chiết xuất từ phân đoạn 1-3 và emodin từ phân đoạn 13-14, sau đó được kiểm tra độ tinh khiết bằng phương pháp HPLC như đã mô tả ở mục 2.3.2.3 Kết quả cho thấy physcion và emodin có độ tinh khiết cao, lần lượt đạt 98.17% và 98.25%.
Hình 3.8 Sắc kí đồ (HPLC) của emodin phân lập từ Cốt khí củ
Bảng 3.5 Peak hấp thụ của emodin phân lập từ Cốt khí củ
Peak Thời gian lưu Diện tích pic Chiều cao Tỷ lệ (%)
Hình 3.9 Sắc kí đồ (HPLC) của physcion phân lập từ Cốt khí củ
Bảng 3.6 Peak hấp thụ của physcion phân lập từ Cốt khí củ
Peak Thời gian lưu Diện tích pic Chiều cao Tỷ lệ (%)
Hình 3.10 Sơ đồ quy trình chiết xuất emodin và physcion từ Cốt khí củ bằng sắc kí cột theo hai phương pháp
Định lượng emodin và physcion trong các cắn EtOAc và cắn phân đoạn Toluen
3.3.1 Xây dựng phương pháp a) Khảo sát khoảng tuyến tính của emodin:
Triển khai sắc ký lớp mỏng theo mục 2.3.3.1 đối với dung dịch chất đối chiếu emodin với nồng độ C₀ 3.93 µg/µl Kết quả của quá trình sắc ký được thể hiện trong Hình 3.11.
Hình 3.11 Sắc kí đồ khảo sát khoảng tuyến tính của Emodin
Trên sắc kí đồ, dưới ánh sáng 366nm các vết emodin cho màu vàng đậm, các vết gọn, rõ nét, không có vết lạ, Rf tương đương nhau
Tiếp tục tiến hành cạo vết, đo quang ở bước sóng 250nm để xây dựng đường tuyến tính cho kết quả như Bảng 3.7
Bảng 3.7 Kết quả đo độ hấp thụ quang khảo sát khoảng tuyến tính emodin
Chỳ thớch: Vch: Thể tớch chấm (àl)
Cđ: Nồng độ đo quang, Cđ= 𝐶₀∗𝑉𝑐ℎ
5∗3 (àg/ml) A: Độ hấp thụ quang
Từ kết quả trên xây dựng được đường tuyến tính (Hình 3.12) với:
Phương trình đường tuyến tính: y=0.0294x+0.0551
Trong đó: y: độ hấp thụ x: nồng độ emodin
Đồ thị sự phụ thuộc độ hấp thụ quang theo nồng độ emodin cho thấy đường tuyến tính với hệ số tương quan R=0.998, cho phép thực hiện định lượng emodin trong khoảng nồng độ từ 3.93 đến 26.20 (µg/ml) Phương trình đường thẳng được xác định là y = 0.0294x + 0.0551, với R² = 0.9965, đảm bảo độ chính xác cao trong phân tích.
Nồng độ C (àg/ml) Đường tuyến tính của Emodin
29 b) Thẩm định tính phù hợp của hệ thống - emodin
Tiến hành sắc ký lớp mỏng đối với dung dịch chất đối chiếu emodin với nồng độ C₀ 3.93 µg/µl như đã mô tả ở mục 2.3.3.1 Kết quả sắc ký đồ được trình bày trong Hình 3.10, cho thấy dưới ánh sáng 366 nm, các vết emodin xuất hiện với màu vàng đậm, rõ nét và gọn gàng, không có vết lạ, với Rf tương đương nhau.
Tiếp tục tiến hành cạo vết, đo quang ở bước sóng 250nm để khảo sát độ lặp lại cho kết quả như Bảng 3.8
Bảng 3.8 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống - emodin
Băng V ch (àl) C đ (àg/ml) A
Chỳ thớch: Vch: Thể tớch chấm (àl)
Cđ: Nồng độ đo quang, Cđ= 𝐶₀∗𝑉𝑐ℎ
5∗3 (àg/ml) A: Độ hấp thụ quang
Kết quả cho thấy, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của phép đo nhỏ hơn 5,0%, phương pháp này phù hợp, có thể áp dụng để định lượng emodin
Hình 3.13 Sắc kí đồ khảo sát tính phù hợp của hệ thống – emodin
31 c) Khảo sát khoảng tuyến tính của physcion:
Tiến hành triển khai sắc ký lớp mỏng như ở mục 2.3.3.1 đối với dung dịch chất đối chiếu physcion nồng độ C₀ 0.98àg/àl thu được kết quả như Hỡnh 3.14
Hình 3.14 Sắc kí đồ khảo sát khoảng tuyến tính của Physcion
Trên sắc kí đồ, dưới ánh sáng 366nm, các vết physcion hiển thị màu vàng nhạt với hình dạng gọn gàng và rõ nét, có giá trị Rf tương đương nhau Mặc dù có một số vết lạ, nhưng chúng rất nhạt và tách biệt hoàn toàn với vết physicon.
Tiếp tục tiến hành cạo vết, đo quang ở bước sóng 250nm để xây dựng đường tuyến tính cho kết quả như Bảng 3.9:
Bảng 3.9 Kết quả đo quang khảo sát khoảng tuyến tính Physcion
Chỳ thớch: Vch: Thể tớch chấm (àl)
Cđ: Nồng độ đo quang, Cđ= 𝐶₀∗𝑉𝑐ℎ
5 (àg/ml) A: Độ hấp thụ quang
Dựa trên kết quả thu được, đường tuyến tính được xây dựng với hệ số tương quan R=0.970, phương trình y=0.0183x+0.2032, trong đó y đại diện cho độ hấp thụ và x là nồng độ physcion Phép định lượng physcion có thể được thực hiện trong khoảng nồng độ từ 2.94 đến 19.62 (µg/ml).
Hình 3.15 Đồ thị sự phụ thuộc độ hấp thụ quang theo nồng độ physcion d) Thẩm định tính phù hợp của hệ thống - Physcion y = 0.0183x + 0.2032 R² = 0.9424
Nồng độ C (àg/ml) Đường tuyến tính của Physcion
Triển khai sắc ký lớp mỏng cho dung dịch chất đối chiếu Physcion với nồng độ C₀ 0.98 µg/µl đã cho kết quả như thể hiện trong Hình 3.13.
Trên sắc kí đồ, dưới ánh sáng 366nm các vết physcion cho màu vàng nhạt, các vết gọn, rõ nét, Rf tương đương nhau
Tiếp tục tiến hành cạo vết, đo quang ở bước sóng 250nm để khảo sát độ lặp lại cho kết quả như Bảng 3.10
Bảng 3.10 Kết quả khảo sát tính phù hợp của hệ thống - physcion
Băng V ch (àl) C đ (àg/ml) A
Chỳ thớch: Vch: Thể tớch chấm (àl)
Cđ: Nồng độ đo quang, Cđ= 𝐶₀∗𝑉𝑐ℎ
5 (àg/ml) A: Độ hấp thụ qung
Kết quả cho thấy, độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của phép đo nhỏ hơn 5,0%, phương pháp này phù hợp, có thể áp dụng để định lượng physcion
Hình 3.16 Sắc kí đồ khảo sát tính phù hợp của hệ thống – physcion
3.3.2 Định lượng emodin và physcion trong các mẫu cắn Áp dụng phương pháp đã xây dựng ở trên, tiến hành sắc ký lớp mỏng như ở mục 2.3.3.2, để đánh giá hàm lượng emodin và physcion trong các mẫu cắn thu được, kết quả được thể hiện trong Hình 3.17, Bảng 3.11 và Bảng 3.12
Bảng 3.11 Kết quả định lượng emodin trong các mẫu cắn
Bảng 3.12 Kết quả định lượng physcion trong các mẫu cắn
Chỳ thớch: Cₒ: nồng độ tương ứng với lượng cắn ban đầu trong mẫu (àg/àl)
Vch: thể tớch chấm (àl)
Cđ: nồng độ đo quang Cđ= 𝐶₀∗𝑉𝑐ℎ
5 (àg/ml) A: độ hấp thụ quang
CPh: nồng độ emodin trong mẫu đo quang CPh= 𝐴−0.2032
HLPh: hàm lượng emodin trong cắn HLPh= (CPh/Cđ)*100 (%)
CEm: nồng độ emodin trong mẫu đo quang CEm= 𝐴−0.0294
HLEm: hàm lượng emodin trong cắn HLEm= (CEm/Cđ)*100 (%)
Kết quả phân tích sắc ký cho thấy, trên các cắn 1, 2, 3 chỉ có hai vết chính là emodin và physcion, trong khi một số vết khác xuất hiện rất nhạt Các vết emodin và physcion được tách biệt rõ ràng Đặc biệt, cắn 1 cho thấy hiện tượng kéo vết nhiều hơn so với cắn 2.
3 hoàn toàn không kéo vết Hàm lượng emodin và physcion trong 3 mẫu cắn khá cao, sự chênh lệch hàm lượng trong cắn 1 và cắn 2 không khác nhau nhiều Cắn
Quá trình thủy phân dược liệu bằng HCl 20% và chiết bằng EtOAc cho thấy hàm lượng emodin cao rõ rệt, trong khi hàm lượng physcion lại thấp hơn Phương pháp 2 mang lại lượng cắn nhiều hơn và ít tạp hơn Sau khi thực hiện sắc ký cột lần thứ nhất, cắn phân đoạn Toluen thu được khá sạch, chủ yếu là hỗn hợp emodin và physcion, với tỉ lệ emodin rất cao và physcion thấp hơn nhiều Sự thay đổi tỉ lệ này so với cắn EtOAc ban đầu có thể do physcion bị thất thoát ở các phân đoạn khác.
Hình 3.17 Sắc kí đồ định lượng emodin và physcion trong các mẫu cắn
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
1 KẾT LUẬN Đã chiết xuất, phân lập hỗn hợp emodin và physcion từ cốt khí củ bằng sắc kí lớp mỏng điều chế và sắc kí cột, emodin và physcion phân lập được có độ tinh khiết cao, có thể dùng để làm chất đối chiếu trong kiểm nghiệm dược liệu
Cả hai phương pháp điều chế cắn đều mang lại sản phẩm giàu hàm lượng emodin và physcion, với ít tạp chất Tuy nhiên, phương pháp thủy phân trực tiếp bằng HCl 20% từ bột dược liệu cho thấy hiệu suất thu được cắn cao hơn, giúp tối ưu hóa lượng chất chiết xuất từ dược liệu.
Quá trình sắc kí cột phải trải qua hai giai đoạn với hai hệ dung môi khác nhau
Hệ Toluen:EtOH (8:2) không thể tách riêng emodin và physcion, nhưng tạo ra một phân đoạn hỗn hợp tinh khiết của hai hợp chất này Khi tiếp tục sử dụng cột sắc ký thứ hai với hệ dung môi N-hexan:EtOAc, emodin và physcion đã được tách riêng thành công.
Chúng tôi đã phát triển phương pháp định lượng emodin và physcion, áp dụng để xác định hàm lượng của hai chất này trong các mẫu thu được từ quá trình làm giàu anthranoid từ bột dược liệu và các mẫu phân đoạn Toluen chứa hỗn hợp emodin và physcion Phương pháp này có khả năng được áp dụng để định lượng emodin và physcion trong các mẫu dược liệu khác.
Qua việc quan sát kết quả từ nghiên cứu trên, chúng tôi đưa ra một vài đề xuất như sau:
Tiếp tục nghiên cứu quy trình chiết xuất và phân lập emodin cùng physcion từ Cốt khí củ bằng phương pháp sắc kí cột nhằm tối ưu hóa quy trình, rút ngắn thời gian và tìm ra phương pháp tách riêng emodin và physcion chỉ trong một lần chạy cột.
- Áp dụng qui trình đã xây dựng để chiết xuất và phân lập emodin, physcion từ các nguồn dược liệu khác giàu anthranoid
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1 Lê Ngọc Duy (2017), Xây dựng phương pháp định lượng polydatin trong rễ cây Cốt khí củ bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao, Khóa luận tốt nghiệp, Trường Đại học Dược Hà Nội
2 Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, NXB Y Học,
