Hoàn thiện quy trình bào chế vi cầu leuprolid acetat

TỔNG QUAN

Tổng quan về leuprolid acetat

- Khối lượng phân tử: 1209,41 g/mol (dạng base)

- Tên khoa học: 5-oxo-L-prolyl-L-histidyl-L-trytophyl-L-seryl-L-tyrosy-D- leucyl-L-leucyl-L-arginyl-N-ethyl-L-prolinamid acetat

- Công thức viết tắt: pGu1-His2-Trp3-Ser4-Tyr5-Leu6-Leu7-Arg8-Pro9-

- Tên chung quốc tế: Leuprolid acetat

1.1.2 Tính chất vật lý, hóa học

- Hình thức: Bột kết tinh màu trắng hoặc hơi vàng nhạt, hút ẩm mạnh

- Độ tan: Tan rất tốt trong nước, DMSO, tan tự do trong methanol, ít tan trong ethanol [20]

- Leuprolid acetat (LA) là muối của acid acetic và nonapeptid leuprolid có pKa lần lượt là 6,0 – 10,0 – 13,0 Dung dịch leuprolid acetat 1% (kl/tt) có pH nằm trong khoảng từ 5,5 đến 7,5 [20]

- Trong môi trường kiềm mạnh hoặc acid mạnh, LA dễ dàng bị thủy phân

Hình 1.1 Cấu trúc phân tử leuprolid acetat [25]

Leuprolid acetat (LA) là một polypeptid gồm 9 acid amin, có cấu trúc phân tử dễ bị phân hủy do các liên kết peptid và nhóm chức Sự phân hủy này làm mất hoạt tính sinh học của LA, với bốn phản ứng chính gây thay đổi cấu trúc phân tử bao gồm thủy phân, tổng hợp, oxy hóa và đồng phân hóa.

1.1.4 Ứng dụng trong điều trị

Leuprolid acetat (LA) là một chất tương tự GnRH, có tác dụng làm tăng nồng độ hormon luteinizing (LH) và hormon kích thích nang trứng (FSH) khi tiêm liều duy nhất Tuy nhiên, khi sử dụng liên tục với liều điều trị, LA trở thành chất ức chế mạnh việc tiết gonadotropin, dẫn đến giảm nồng độ hormon sinh dục Do đó, LA được áp dụng trong điều trị ung thư để ức chế sự phát triển của các khối u phụ thuộc hormon và điều trị dậy thì sớm ở trẻ em.

- Dậy thì sớm phụ thuộc gonadotropin

- Ung thư tuyến tiền liệt giai đoạn muộn

- Ung thư vú giai đoạn muộn của phụ nữ đang và sau mãn kinh

- Bệnh lạc nội mạc tử cung, u cơ trơn tử cung

1.1.4.3 Một số chế phẩm trên thị trường hiện nay

Hiện nay, trên thị trường phổ biến một số dạng thuốc tiêm giải phóng kéo dài với dược chất leuprolid acetat được bao giữ trong vi cầu như bảng 1.1 [1]

Bảng 1.1 Các chế phẩm thuốc giải phóng kéo dài chứa leuprolid acetat

Chế phẩm và nhà sản xuất Thành phần

Bột đông khô pha tiêm Dung môi pha tiêm Lucrin Depot 3,75 mg

Tiêm bắp sâu 1 lần/tháng

NaCMC 5 mg D-Mannitol 50 mg Polysorbat 80 1 mg Nước cất pha tiêm vừa đủ 1,5 ml

Hình 1.2 Cấu trúc hóa học của a) acid lactic; b) acid glycolic; c) PLGA

Leuprolid acetat 11,25 mg Polylactic acid

Tween 80 Glacial acetic acid Nước cất pha tiêm

Tổng quan về polyme PLGA

Poly (lactic-co-glycolic) là một polymer sinh học được sử dụng phổ biến trong chẩn đoán và điều trị nhờ vào khả năng kiểm soát giải phóng dược chất và tính an toàn với cơ thể Nghiên cứu hiện nay đang tập trung vào việc kết hợp PLGA với các dược chất khác nhau để phát triển các hệ thống mang thuốc hiệu quả.

PLGA là một copolyme được hình thành từ acid lactic và acid glycolic, với nhiều loại khác nhau dựa trên tỷ lệ của hai monome và khối lượng phân tử Ví dụ, PLGA 50:50 chứa 50% acid lactic và 50% acid glycolic Sản phẩm phân hủy của PLGA là hai acid, là chất nội sinh và được chuyển hóa qua chu trình Krebs, tạo ra carbonic và nước Acid glycolic cũng được thải qua thận, giảm độc tính cho cơ thể Vì lý do này, PLGA được FDA và EMA chấp thuận sử dụng cho người.

PLGA tan tốt trong các dung môi hữu cơ như dichloromethan, tetrahydrofuran, ethyl acetat, chloroform, hexafluoroisopropanol, aceton và benzyl alcohol

Do sự hiện diện của hai nguyên tử cacbon bất đối trong phân tử acid lactic, có ba dạng polyme khác nhau: poly (L-acid lactic), poly (D-acid lactic) và poly (D,L-acid lactic) Các dạng poly (L-acid lactic) tồn tại ở trạng thái bán tinh thể, trong khi các dạng còn lại ở trạng thái vô định hình, dẫn đến sự đa dạng trong các dạng polyme của PLGA.

Với nhiệt độ chuyển kính (Tg) của PLGA cao hơn nhiệt độ cơ thể (37 o C) và cấu trúc dẻo dai, PLGA có độ bền cơ học thích hợp cho việc thiết kế các hệ thống mang thuốc giải phóng kéo dài như vi cầu và vi nang Tg của PLGA chịu ảnh hưởng bởi tỷ lệ acid lactic/acid glycolic, trong đó tỷ lệ acid lactic cao làm tăng Tg, cũng như khối lượng phân tử của polyme và sự tương tác giữa dược chất và polyme Đặc tính thân nước hay sơ nước của PLGA phụ thuộc vào tỷ lệ acid lactic/acid glycolic, với tỷ lệ nhỏ hơn giúp polyme trở nên thân nước hơn Hơn nữa, các PLGA có nhiều nhóm carboxyl sẽ có tính thân nước tốt hơn và dễ bị thủy phân hơn so với các PLGA có nhóm chức este ở cuối mạch.

1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình phân hủy sinh học của polyme PLGA

Tỷ lệ acid lactic và acid glycolic ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phân hủy của PLGA, trong đó acid glycolic có tính chất thân nước hơn, làm tăng khả năng hấp thu nước và phân hủy PLGA, ngoại trừ PLGA 50:50 có tốc độ phân hủy nhanh nhất Đối với các loại PLGA có cùng tỷ lệ acid lactic/acid glycolic nhưng khác nhau về khối lượng phân tử (KLPT), loại có KLPT lớn thường có tốc độ phân hủy nhanh hơn Bên cạnh đó, bản chất của nhóm chức cuối mạch polymer cũng đóng vai trò quan trọng; PLGA có nhóm este ở cuối mạch sẽ có thời gian phân hủy lâu hơn so với loại có nhóm acid ở cuối mạch.

Quá trình phân hủy PLGA chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như phương pháp bào chế, pH môi trường, sự có mặt của oxy, nhiệt độ, loại và hàm lượng dược chất Phân hủy của polyme diễn ra thông qua việc cắt các liên kết este, chủ yếu qua hai hình thức: ăn mòn bề mặt và ăn mòn toàn bộ, trong đó ăn mòn toàn bộ là con đường chính Quá trình này bao gồm ba giai đoạn: đầu tiên, khối lượng phân tử polyme giảm đáng kể mà chưa tạo ra sản phẩm monome tan; sau đó, khối lượng phân tử giảm nhanh và tạo thành các oligome và monome tan; cuối cùng, các monome được hình thành từ các mảnh oligome và polyme bị phân hủy hoàn toàn.

Các tiểu phân nano và micro PLGA thường gặp hiện tượng giải phóng dược chất ồ ạt (burst release) trong giai đoạn đầu, kéo dài từ vài ngày đến một tuần Đây là một nhược điểm quan trọng cần được cải thiện khi thiết kế các thuốc giải phóng kéo dài sử dụng PLGA.

1.3 Tổng quan về vi cầu PLGA-LA

Vi cầu PLGA-LA

Vi cầu là các hạt nhỏ hình cầu có kích thước từ 1 đến 1000 µm, thường từ 1 - 800 µm, được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực Vi cầu PLGA là hệ thống phân phối thuốc sử dụng PLGA làm polymer bao giữ dược chất, đã được FDA chấp thuận cho điều trị lâm sàng Tính đến năm 2019, thị trường có 12 dòng sản phẩm vi cầu PLGA với tác dụng kéo dài, như Lupron Depot® và Lupaneta PackTM Đối với các dược chất kém ổn định và liều dùng hàng ngày thấp, việc bào chế dưới dạng vi cầu từ polymer phân hủy sinh học là hướng nghiên cứu phù hợp Các phương pháp sản xuất vi cầu hiện nay bao gồm nhũ hóa kép kết hợp bốc hơi dung môi, phun sấy và phân tách đồng pha, trong đó phương pháp nhũ hóa kép nước/dầu/nước (W/O/W) kết hợp bốc hơi dung môi là chủ yếu được sử dụng để sản xuất vi cầu PLGA-LA.

Phương pháp bào chế vi cầu bằng nhũ hóa kép kết hợp bốc hơi dung môi 6 1.3.3 Các yếu tố quy trình ảnh hưởng đến đặc tính của vi cầu PLGA

Phương pháp nhũ hóa kép nước/dầu/nước (W/O/W) kết hợp với bốc hơi dung môi là kỹ thuật phổ biến trong thiết kế vi cầu PLGA để giữ dược chất Đầu tiên, dược chất được hòa tan trong pha nước nội (W1), có thể là nước, dung dịch đệm hoặc gelatin PLGA được hòa tan trong các dung môi hữu cơ như dicloromethan (DCM) để tạo pha dầu (O) Hai pha này được kết hợp và nhũ hóa để tạo nhũ tương sơ cấp W/O (NT1) Nhũ tương W/O sau đó được kết hợp với pha nước ngoại (W2) có chứa chất diện hoạt như polyvinyl alcol (PVA) và nhũ hóa để tạo nhũ tương thứ cấp W/O/W (NT2) Dung môi hữu cơ được loại bỏ qua quá trình bốc hơi, và vi cầu thu được thông qua lọc hoặc ly tâm, rửa sạch để loại bỏ chất diện hoạt và dược chất tự do, cuối cùng được đông khô để bảo quản.

Hình 1.3 Phương pháp nhũ hóa kép kết hợp bốc hơi dung môi

Phương pháp tạo vi cầu bằng cách bốc hơi dung môi từ nhũ tương kép W/O/W có nhiều ưu điểm, đặc biệt là phù hợp với các dược chất dễ tan trong nước như leuprolid acetat Tuy nhiên, phương pháp này cũng gặp phải một số nhược điểm, bao gồm kích thước vi cầu không đồng đều, nhũ tương kép kém bền, và quy trình phức tạp với nhiều bước, đòi hỏi phải kiểm soát chặt chẽ các thông số Ngoài ra, dược chất dễ tan trong nước dễ bị thất thoát ra ngoài pha nước ngoại, gây khó khăn trong việc nâng quy mô sản xuất.

1.3.3 Các yếu tố quy trình ảnh hưởng đến đặc tính của vi cầu PLGA

Các yếu tố quy trình như thể tích pha nước nội và ngoại, nhiệt độ, tốc độ nhũ hóa, tốc độ rắn hóa vi cầu, và phương pháp làm khô ảnh hưởng đáng kể đến các đặc tính của vi cầu, bao gồm hàm lượng dược chất, hiệu suất vi cầu hóa, phân bố kích thước, tỷ lệ xốp và khả năng giải phóng dược chất.

1.3.3.1 Tốc độ loại dung môi hữu cơ

Quá trình hình thành vi cầu PLGA bắt đầu bằng việc chiết dung môi hữu cơ từ nhũ tương kép W/O/W, dẫn đến sự tủa và kết tụ của các phân tử PLGA hòa tan để tạo thành lớp màng vi cầu sơ cấp Khi dung môi hữu cơ tiếp tục được chiết ra pha nước ngoại, các vi cầu sơ cấp này co rút lại, hình thành vi cầu PLGA - LA đặc chắc hơn Động học tách chiết dung môi hữu cơ đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra lớp màng ổn định cho vi cầu sơ khai, và quá trình này phụ thuộc vào loại dung môi, loại PLGA và nhiệt độ trong quy trình bào chế.

Hình 1.4 Sơ đồ các yếu tố quy trình ảnh hưởng đến đặc tính vi cầu PLGA-LA

Hình 1.5 Các bước hình thành lớp vỏ vi cầu PLGA [27]

Quá trình loại bỏ dung môi nhanh chóng dẫn đến sự phân bố không đồng đều của các thành phần trong pha phân tán, khiến vi cầu dễ dàng đạt đến điểm gel hóa ở vùng ngoại vi Kết quả là vi cầu có lỗ xốp lớn hơn, bề mặt đặc chắc hơn, diện tích bề mặt nhỏ hơn và lượng dung môi tồn dư cao, làm giảm khả năng giải phóng Ngược lại, tốc độ loại bỏ dung môi chậm giúp vi cầu có thành phần phân bố đồng nhất hơn nhờ vào quá trình rắn hóa từ từ của PLGA Các yếu tố quy trình như nhiệt độ, tỉ lệ thể tích pha nước nội và ngoại, cũng như thể tích pha loãng đều ảnh hưởng đến thời gian rắn hóa của vi cầu.

Để kiểm soát hiệu quả quá trình tách chiết và rắn hóa vi cầu, việc lựa chọn dung môi, thể tích pha loãng, nhiệt độ và nồng độ PLGA là rất quan trọng Những yếu tố này ảnh hưởng trực tiếp đến kích thước, đặc tính lỗ xốp và khả năng nạp dược chất của vi cầu, giúp đạt được các đặc tính mong muốn.

1.3.3.2 Phương pháp tạo nhũ tương sơ cấp W/O

Có 2 phương pháp thông thường được sử dụng để tạo nhũ tương là siêu âm và đồng nhất hóa Sự khác nhau về phương pháp bào chế này sẽ tạo ra các vi cầu với các tính chất giải phóng khác nhau Trong nghiên cứu của Feng Q và các cộng sự, khi sử dụng siêu âm để tạo nhũ tương W/O, hiệu suất vi cầu hóa cao hơn, nhưng khả năng giải phóng in vitro lại chậm Điều này được giải thích là do sóng siêu âm sẽ tạo ra một cấu trúc vi cầu quá đặc chắc làm ngăn cản dược chất thoát ra ngoài Dẫn đến vi cầu tạo thành có pha lag kéo dài sau giai đoạn giải phóng nhanh (burst release) Sóng siêu âm có lực phân cắt cực cao, sẽ tạo các giọt nước nội rất nhỏ bên trong vi cầu, tính thấm của dược chất qua lớp màng polyme bị giới hạn Trong khi đó, phương pháp đồng nhất hóa có lực phân cắt nhỏ hơn, sẽ tạo ra các giọt nước nội lớn hơn và cho phép dược chất có thể khuếch tán thuận lợi hơn qua màng polyme Do đó, sử dụng thiết bị đồng nhất hóa để tạo nhũ tương W/O sẽ cho vi cầu không có giai đoạn pha lag kéo dài và tính chất giải

Việc sử dụng phóng kéo dài của vi cầu sẽ mang lại hiệu quả tốt hơn Hơn nữa, việc áp dụng siêu âm có thể tạo ra các điểm quá nhiệt, dẫn đến biến đổi polyme và làm thay đổi đặc tính của vi cầu.

1.3.3.3 Thể tích pha nước nội/pha dầu

Thể tích pha nước nội và pha dầu có ảnh hưởng lớn đến cấu trúc nhũ tương kép và đặc điểm lỗ xốp của vi cầu sau khi rắn hóa, từ đó tác động đến khả năng nạp và giải phóng dược chất Nghiên cứu của Shirui Mao cho thấy, khi tăng thể tích pha nước nội, hiệu suất vi cầu hóa giảm, tạo ra lỗ xốp lớn và tăng cường giải phóng ban đầu Điều này xảy ra do việc tăng thể tích pha nước nội làm gia tăng lỗ xốp, tạo điều kiện thuận lợi cho khuếch tán Ngược lại, thể tích pha nước nội thấp dẫn đến lớp dung môi hữu cơ dày hơn bao quanh các giọt nước, làm giảm khả năng khuếch tán dược chất trong giai đoạn đầu của quá trình rắn hóa và tăng hiệu suất vi cầu hóa Ngoài ra, nghiên cứu của Yang chỉ ra rằng tỷ lệ thể tích pha dầu trên pha nước nội ảnh hưởng đáng kể đến bề mặt vi cầu Khi tỷ lệ này giảm từ 40:1 xuống 12:1, vi cầu không chỉ nhẹ hơn mà còn có kích thước lớn hơn, đồng thời tăng cường pha giải phóng ban đầu và thay đổi dữ liệu giải phóng Việc sử dụng lượng DCM (pha dầu) cao làm chậm quá trình loại bỏ dung môi và ngăn cản sự hình thành lỗ xốp, dẫn đến vi cầu ít lỗ xốp hơn và khả năng giải phóng bị chậm lại.

1.3.3.4 Thể tích pha nước ngoại

Nghiên cứu của Shirui Mao và các cộng sự không chỉ tập trung vào ảnh hưởng của pha nước nội mà còn xem xét thể tích pha nước ngoại, đặc biệt khi thể tích này tăng từ 100 đến một mức nhất định.

Khi thể tích pha nước ngoại tăng lên trên 400 ml, hiệu suất vi cầu hóa giảm mạnh từ 90% xuống 73% Sự gia tăng này dẫn đến thất thoát dược chất và thay đổi phân bố của chúng trên bề mặt vi cầu trong giai đoạn rắn hóa, với sự tập trung gần bề mặt Nguyên nhân chính là do chênh lệch gradient nồng độ giữa pha nước nội và ngoại tăng lên Ngoài khả năng nạp dược chất, bề mặt vi cầu cũng bị ảnh hưởng, khi thể tích pha nước ngoại lớn hơn tạo ra bề mặt với nhiều lỗ xốp hơn, trong khi độ xốp bên trong vi cầu lại giảm Sự gia tăng lỗ xốp bề mặt và phân bố dược chất gần bề mặt vi cầu đã dẫn đến hiện tượng giải phóng dược chất.

10 ban đầu tăng [41] Báo cáo này cũng tương đồng với báo cáo của Yang và các cộng sự

1.3.3.5 Thể tích và tốc độ pha loãng

Loại bỏ dung môi và rắn hóa vi cầu là giai đoạn quan trọng quyết định hình thái và khả năng giải phóng dược chất Quá trình pha loãng giúp tách chiết dung môi và rắn hóa PLGA hiệu quả hơn Kỹ thuật này tạo ra các vi cầu có cấu trúc tổ ong đồng nhất, với kích thước lỗ xốp phụ thuộc vào mức độ pha loãng nước ngoại Khi tăng mức độ pha loãng, các vi cầu sẽ có lỗ xốp lớn hơn, do thể tích pha loãng lớn thúc đẩy quá trình loại bỏ dung môi và làm polyme rắn hóa nhanh chóng.

Tốc độ pha loãng ảnh hưởng lớn đến đặc điểm hình thái của vi cầu, với tốc độ thấp (1,5 ml/phút) tạo ra vi cầu có tỷ trọng nhỏ và mật độ lỗ xốp cao, trong khi tốc độ pha loãng nhanh hơn giúp tăng tốc độ rắn hóa bề mặt vi cầu và cải thiện hiệu suất vi cầu hóa Tuy nhiên, nếu tốc độ pha loãng quá cao, hiệu suất vi cầu hóa sẽ giảm do dược chất dễ dàng thất thoát ra ngoài Mối quan hệ giữa tốc độ pha loãng và đặc tính giải phóng cũng rất phức tạp; tốc độ thấp tạo ra vi cầu với lỗ xốp nhỏ và đồng đều, trong khi tốc độ cao gây ra sự xáo trộn mạnh, dẫn đến bề mặt lỗ xốp lớn hơn Điều này cho thấy rằng tốc độ pha loãng không chỉ ảnh hưởng đến cấu trúc vi cầu mà còn đến hiệu suất giải phóng dược chất.

Phương pháp nhũ hóa kép bốc hơi dung môi bao gồm hai giai đoạn nhũ hóa để tạo ra NT1 (W/O) và NT2 (W/O/W) Tốc độ nhũ hóa lần thứ nhất có ảnh hưởng lớn đến sự đồng nhất và độ bền của kích thước giọt NT1 Nghiên cứu của tác giả Huajuan Jin và các cộng sự đã chỉ ra rằng

Độ nhũ hóa lần 1 có ảnh hưởng lớn đến hiệu suất và hình thái của vi cầu PLGA chứa lipopeptid amphipathic (LP-98) Tăng tốc độ nhũ hóa tạo ra vi cầu với lỗ xốp nhỏ hơn, cấu trúc đặc chắc và nâng cao hiệu suất vi cầu hóa dược chất Điều này xảy ra do tốc độ đồng nhất hóa cao giúp phá vỡ pha nước nội thành các giọt nhỏ hơn, tạo ra nhũ tương ổn định và các hạt đặc chắc hơn, từ đó giảm khả năng dược chất thoát ra khỏi pha nước ngoại.

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu, thiết bị sử dụng

Bảng 2.1 Nguyên liệu sử dụng trong nghiên cứu

STT Tên nguyên liệu Xuất xứ Tiêu chuẩn

1 Leuprolid acetat Trung Quốc EP 8

5 Alcol polyvinyl (PVA-124) Trung Quốc NSX

6 Natri clorid Việt Nam DĐVN V

13 Acid hydrocloric Trung Quốc TKHH

14 Nước vô khuẩn để tiêm Việt Nam DĐVN V

Bảng 2.2 Thiết bị sử dụng trong nghiên cứu

STT Thiết bị Xuất xứ Thông số kỹ thuật

Hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC

2 Máy đo kích thước tiểu phân

3 Máy đồng nhất hóa Unidrive X1000

Homogenizer Drive Đức 4000 - 18000 vòng/phút

4 Máy khuấy từ gia nhiệt IKA – WERKE Hàn

5 Máy ly tâm lạnh tốc độ cao Hanil Supra R2 Hàn

6 Cân phân tích Satorius BP121S Đức 30,0 mg – 120 g

7 Cân phân tích Metller Toledo XPE105 Thụy Sĩ 1,00 mg – 31 g

8 Máy đo pH Euteh Instruments pH 510 Nhật Bản pH 1,00 - 14,00

9 Máy đông khô Christ Alpha 1-LD Đức Nhiệt độ -50°C, áp suất 0,100 mbar

10 Máy đông khô Labconco Freezone Triad

740030 Mỹ Nhiệt độ -50°C, áp suất 0,03 mmbar

11 Máy huỳnh quang Cary Eclipse

13 Màng thẩm tích 12 kDa -14 kDa Mỹ

14 Kính hiển vi điện tử quét phát xạ điện trường FESEM: Hitachi S-4800 FESEM Nhật Độ phóng đại 30 –

15 Máy quét nhiệt vi sai Mettler – Toledo Thụy Sĩ 0 - 250 o C

16 Máy chuẩn độ METTLER TOLEDO

DL31/DL38 Thụy sĩ 1 ppm- 5% hàm ẩm

17 Dụng cụ thủy tinh, khuấy từ, tủ lạnh… Việt Nam Bộ môn Bào chế

Nội dung nghiên cứu

Khảo sát các thông số kỹ thuật trong quy trình bào chế vi cầu bằng phương pháp nhũ hóa kép kết hợp bốc hơi dung môi ở quy mô phòng thí nghiệm là rất quan trọng Nghiên cứu này giúp tối ưu hóa quy trình sản xuất, nâng cao hiệu quả và chất lượng sản phẩm Việc điều chỉnh các thông số như tỷ lệ chất nhũ hóa, tốc độ khuấy và nhiệt độ sẽ ảnh hưởng trực tiếp đến kích thước và tính chất của vi cầu Các kết quả thu được từ thí nghiệm sẽ cung cấp những thông tin quý giá cho việc phát triển sản phẩm mới trong ngành dược phẩm.

Vi cầu PLGA-LA có nhiều đặc tính quan trọng như hình thức và hình thái đa dạng, kích thước đồng đều, tính chất nhiệt ổn định, cùng khả năng nạp và giải phóng dược chất hiệu quả Những đặc điểm này góp phần làm tăng khả năng ứng dụng của vi cầu PLGA-LA trong lĩnh vực dược phẩm và công nghệ sinh học.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương pháp bào chế vi cầu PLGA- LA

Bảng 2.3 Thành phần và lượng tá dược sử dụng trong bào chế vi cầu PLGA-LA

Thành phần Khối lượng/thể tích

Pha nước nội Đệm phosphat 7,4 Khảo sát

Pha nước ngoại Dung dịch PVA 1,5%,

Dung dịch pha loãng Dung dịch PVA 1,5%,

Tá dược đông khô Dung dịch mannitol 10%

Bào chế vi cầu leuprolid acetat sử dụng phương pháp nhũ hóa tạo nhũ tương kép kết hợp với bốc hơi dung môi, với thành phần và liều lượng tá dược được trình bày trong bảng 2.3, cùng với các bước thực hiện như mô tả trong hình 2.1.

Trong giai đoạn đầu tiên của quy trình bào chế, tất cả dụng cụ và thiết bị cần được tiệt khuẩn bằng phương pháp phù hợp Tủ isolator được tiệt khuẩn bằng tia UV, đảm bảo môi trường sạch sẽ Bao bì vô khuẩn, bao gồm lọ thủy tinh, nút cao su và nắp nhôm, được bảo quản trong túi riêng biệt và chỉ được mở ra khi sử dụng Các công đoạn pha chế được thực hiện trong tủ isolator để đảm bảo an toàn và hiệu quả.

 Giai đoạn 2: Bào chế hỗn dịch

Pha nước nội là một dung dịch chứa phosphat với pH 7,4, bao gồm dược chất (LA) và gelatin được hòa tan ở nhiệt độ 60 °C Sau đó, dung dịch này được duy trì ở nhiệt độ này để thực hiện quá trình lọc vô khuẩn qua màng CA 0,2 µm.

- DCM được lọc lạnh (dưới 10 °C) qua màng PTFE 0,2 àm Sau đú hũa tan PLGA vào DCM

Để thu được nhũ tương W/O, cần phối hợp pha dầu vào pha nước dưới tác dụng của máy đồng nhất hóa với tốc độ và thời gian thích hợp, đồng thời duy trì nhiệt độ dưới 10 °C.

- Pha nước ngoại là dung dịch PVA, NaCl được lọc qua màng lọc CA 0,2 àm

Pha nước nội: 0,6 ml đệm phosphat 7.4 chứa gelatin và LA

Rắn hóa vi cầu Đông khô vi cầu

Pha nước ngoại: 10 ml dung dịch PVA 1%,

Pha loãng: 20 ml dung dịch PVA 1%, NaCl

Máy đồng nhất hóa: tốc độ

Máy đồng nhất hóa: tốc độ

Sục khí nitơ (N 2 ) tốc độ 20 ml/phút trong thời gian 30 phút

Hình 2.1 Sơ đồ bào chế vi cầu PLGA-LA

Phối hợp nhũ tương W/O vào pha nước ngoại bằng máy đồng nhất với tốc độ 4000 vòng/phút trong 40 giây và ở nhiệt độ dưới 10°C để thu được nhũ tương kép W/O/W.

 Pha loãng và tinh chế vi cầu:

Nhũ tương kép này cần được pha loãng với một lượng nước thích hợp đã được lọc qua màng lọc CA 0,2 µm Sau đó, quá trình sục khí nitơ (N2) sẽ được thực hiện để rắn hóa vi cầu với tốc độ và thời gian phù hợp.

- Vi cầu đã rắn hóa hoàn toàn được ly tâm lạnh với tốc độ, nhiệt độ và thời gian thích hợp để thu vi cầu

Rửa vi cầu bằng nước vô khuẩn ở nhiệt độ 10 °C để loại bỏ PVA, sau đó phân tán lại vi cầu bằng nước vô khuẩn để tiêm nhằm tạo thành hỗn dịch đồng nhất Hỗn dịch này được lọc qua màng 125 µm để loại bỏ các vi cầu có kích thước lớn Tiến hành hút một lượng thể tích hỗn dịch để xác định lượng leuprolid acetat (LA) bằng phương pháp HPLC, từ đó tính toán thể tích hỗn dịch tương ứng với 3,75 mg LA.

 Giai đoạn 3: Bào chế vi cầu đông khô

 Tá dược manitol được hòa tan trong nước vô khuẩn để tiêm để tạo dung dịch có nồng độ 10% (kl/tt) Sau đú lọc qua màng CA 0,2 àm

Hút 1 thể tích hỗn dịch tương ứng với 3,75 mg LA và 2 ml dung dịch manitol 10% vào lọ đông khô, sau đó đậy hờ bằng nút cao su có xẻ rãnh ở phần dưới.

Chuyển các lọ vào thiết bị đông khô Labconco với các thông số: đông lạnh ở -50°C trong 8 giờ, sấy sơ cấp ở -15°C trong 20 giờ, tốc độ gia nhiệt 0,25°C, áp suất 0,03 mmbar, và sấy thứ cấp ở 25°C trong 8 giờ Hoặc tiến hành tiền đông ở tủ -70°C và sau đó đông khô trên thiết bị Christ Alpha 1-LD trong 24 giờ tại áp suất 0,1 mmbar.

 Lấy sản phẩm ra khỏi buồng đông khô và siết nắp nhôm

2.3.2 Thẩm định một số chỉ tiêu định lượng LA trong vi cầu PLGA-LA bằng HPLC

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) được phát triển nhằm định lượng dược chất trong mẫu vi cầu Dựa trên tài liệu tham khảo và điều kiện thực tiễn, các điều kiện sắc ký đã được lựa chọn phù hợp.

- Pha động: Đệm NH4H2PO4 0,03M pH 4,0 : ACN = 75 : 25 (tt/tt)

- Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút

- Thể tớch tiờm mẫu: 50 àl

- Detector UV, phát hiện ở bước sóng 280 nm

- Dung dịch pha mẫu: Đệm NH4H2PO4 0,03M pH 4,0

2.3.2.1 Tính thích hợp của hệ thống sắc ký

Cân chính xác 5,00 mg leuprolid acetat và hòa tan trong dung dịch đệm amoni dihydrophosphat pH 4,0, sau đó định mức đủ 10,0 ml để tạo dung dịch chuẩn gốc Tiếp theo, lấy 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc và pha loãng với dung dịch đệm amoni dihydrophosphat pH 4,0 đến 10,0 ml, lắc đều để thu được dung dịch chuẩn với nồng độ khoảng 50 μg/ml.

Tiến hành tiêm mẫu dung dịch chuẩn 6 lần theo điều kiện mục 2.3.2 Hệ thống sắc ký được xác định là phù hợp để định lượng leuprolid acetat khi %RSD của thời gian lưu (tR) và diện tích pic (Spic) của dược chất nhỏ hơn 2%.

-Mẫu trắng: Dung dịch đệm amoni phosphat 0,03M pH 4,0

Cân chính xác 5,00 mg leuprolid acetat và hòa tan trong dung dịch đệm amoni dihydrophosphat pH 4,0, sau đó định mức tới 10,0 ml để tạo dung dịch chuẩn gốc Tiếp theo, lấy 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc và pha loãng với dung dịch đệm amoni dihydrophosphat pH 4,0 tới 10,0 ml, lắc đều để thu được dung dịch chuẩn có nồng độ khoảng 50 μg/ml.

Để chuẩn bị mẫu placebo, cần cân chính xác một lượng mẫu vi cầu trắng không chứa dược chất, được bào chế theo phương pháp đã mô tả Sau đó, tiến hành hòa tan mẫu bằng DMSO và định mức đủ 10,0 ml.

-Mẫu thử: Cân chính xác khoảng 10,00 mg mẫu vi cầu (bào chế theo phương pháp mô tả mục 2.3.1) được hòa tan bằng DMSO, định mức vừa đủ 10,0 ml

Tất cả các mẫu đã được lọc qua màng nylon 0,45 μm trước khi phân tích bằng hệ thống HPLC Kết quả sắc ký đồ được ghi lại, với các đáp ứng pic tại các vị trí tương ứng với thời gian lưu của mẫu chuẩn leuprolid acetat.

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ