Khảo sát một số điều kiện lên men nhằm tăng cường hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết cây bạc hà á ( mentha arvensis l )

TỔNG QUAN

Tổng quan về cây Bạc hà (Mentha arvensis L.)

1.1.1 Tên khoa học và phân loại khoa học

- Tên khoa học: Mentha arvensis L

Lớp Ngọc lan (Magnolyopsida) Phân lớp Hoa môi (Lamidae)

Họ Bạc hà (Lamiaceae) Chi Mentha

1.1.2 Đặc điểm thực vật và phân bố

M arvensis L là cây thân thảo sống lâu năm, cao từ 10 đến 60 – 70 cm, có thể cao tới 1 m Thân vuông mọc đứng hay hơi bò, trên thân có nhiều lông Lá đơn, mọc đối, cuống dài từ 2 – 10 mm, phiến lá hình trứng hay thuôn dài, rộng 2 – 3 cm, mép có răng cưa, mặt trên và mặt dưới của lá đều có lông che chở và lông bài tiết chứa nhiều tinh dầu Hoa mọc vòng ở kẽ lá, cánh hoa hình môi màu tím hay hồng nhạt có khi màu trắng

Bạc hà Á thường mọc hoang ở Việt Nam và được trồng tại một số vùng như Nghĩa Trai (Hưng Yên), Gia Lâm (Hà Nội), Sơn La, Tam Đảo (Vĩnh Phúc) và Đà Lạt với mục đích làm thuốc.

Hình 1.1 Mentha arvensis L (Nguồn: Wikipedia)

Tinh dầu là thành phần chính của lá bạc hà Ngoài ra trong cây bạc hà còn có các hợp chất flavonoid, coumarin, phenolic và các hợp chất khác

Tinh dầu trong lá bạc hà thường tập trung ở lông tiết, với tỷ lệ dao động từ 0,5% đến 1%, và có thể đạt tới 1,3% đến 1,5% Tinh dầu này thường ở dạng lỏng, không màu hoặc có màu vàng nhạt đến vàng xanh Thành phần chính của tinh dầu bạc hà bao gồm nhiều chất hữu ích khác nhau.

- Menthol (C10H19OH) có trong tinh dầu với tỷ lệ 40-50%, chủ yếu ở dạng tự do, một phần nhỏ ở dạng kết hợp với acid acetic

- Menthon (C10H18O) có hàm lượng từ 10 - 20% trong tinh dầu bạc hà

Ngoài ra, trong tinh dầu bạc hà còn chứa các hợp chất: limonen, cineol, eugenol, α- pinen …

Các hợp chất khác cũng được tìm thấy trên cây bạc hà gồm: các hợp chất flavonoid: luteolin, menthoside, rutin, hesperidin…; các hợp chất phenolic: acid caffeic, chlorogenic, rosmarinic…[2]

1.1.4 Các đặc tính dược lý

Năm 2014, Megha M Kumbalwar và cộng sự đã nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của dịch chiết nước và dịch chiết dung môi hữu cơ từ Mentha arvensis L trên các chủng vi khuẩn Gram (-) Kết quả cho thấy cả hai loại dịch chiết đều có khả năng kháng khuẩn, nhưng dịch chiết nước có hoạt tính thấp hơn so với các dịch chiết từ dung môi hữu cơ khác Nghiên cứu này chỉ ra rằng dịch chiết từ Mentha arvensis L có tiềm năng kháng khuẩn, mở ra cơ hội khám phá các chất kháng khuẩn tự nhiên mới.

Nhiều nghiên cứu khác cũng cho thấy khả năng kháng khuẩn trên nhiều chủng vi khuẩn gram (-) và (+) của dịch chiết ethanol và tinh dầu bạc hà [4], [26], [27]

- Hoạt tính chống oxi hóa

Cineol, eugenol và thymol có trong bạc hà được xác nhận là những chất chống oxy hóa hiệu quả, giúp ức chế quá trình peroxy hóa lipid Ngoài ra, flavonoid quercetin có trong bạc hà cũng đóng vai trò quan trọng trong việc loại bỏ các gốc tự do OH và superoxide, đồng thời ngăn chặn peroxy hóa lipid.

- Hoạt tính chống viêm và chống dị ứng

Histamine, được sản xuất bởi tế bào mast, đóng vai trò quan trọng trong phản ứng viêm và dị ứng Nghiên cứu cho thấy hoạt động chống viêm và chống dị ứng của dịch chiết ethanol và dịch chiết nước từ lá, thân và rễ của M arvensis L được xác định qua phản ứng phù chân do histamine gây ra ở chuột và thử nghiệm ức chế giải phóng histamine.

M arvensis L (đặc biệt là lá) là nguồn giàu phytoconstituents thứ cấp, có tác dụng điều trị chống lại các bệnh dị ứng và viêm nhiễm Kết quả chống dị ứng cho thấy chiết xuất ethanol của lá và rễ có hoạt tính ức chế rõ rệt được biểu thị bằng tỷ lệ phần trăm ức chế, tương ứng là 57% và 53%

Khả năng chống viêm của các bộ phận thực vật được thể hiện qua chiết xuất ethanol, trong đó lá có hiệu quả cao nhất (68,3%), tiếp theo là rễ (48,8%) và thân (10,7%) So với thuốc đối chiếu Natri diclofenac, có khả năng ức chế phù nề đạt 77,87%, các chiết xuất thực vật cho thấy tiềm năng đáng kể trong việc chống viêm.

Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng bạc hà có tác dụng quan trọng, bao gồm việc ảnh hưởng đến phản ứng phản vệ, sản xuất yếu tố hoại tử khối u TNF-α, chống vô sinh và mang lại lợi ích cho một số bệnh tim mạch.

1.1.5 Công dụng của bạc hà

Bạc hà Á, hay còn gọi là Mentha arvensis, được trồng chủ yếu để chiết xuất tinh dầu phục vụ sản xuất methol tự nhiên Ngoài ra, loại bạc hà này còn được sử dụng rộng rãi như một gia vị trong ẩm thực.

L được mô tả có nhiều đặc tính y học trong đó bao gồm đặc tính kháng khuẩn [26] Bạc hà Á được sử dụng như một phương thuốc dân gian tại nhiều đất nước Phần lá được dùng để chữa các rối loạn tiêu hóa như tiêu chảy, kiết lỵ, đầy hơi, viêm ruột Ngoài ra nó còn có tác dụng an thần, hạ sốt, giảm cảm giác buồn nôn, kháng khuẩn và kháng nấm [4] Ngày nay, bạc hà sau khi thu hái được chế biến để đạt độ ẩm thích hợp (thường là sấy nhiệt hoặc sấy lạnh) và được sử dụng như một thức trà dùng hàng ngày.

Phương pháp lên men

1.2.1 Tổng quan về phương pháp lên men

Lên men là một phương pháp bảo quản thực phẩm lâu đời, chi phí thấp nhưng hiệu quả trong việc kéo dài tuổi thọ và đảm bảo an toàn cho thực phẩm Louis Pasteur, vào những năm 1850 - 1860, đã trở thành nhà khoa học đầu tiên nghiên cứu quá trình lên men và xác định rằng nó được thực hiện nhờ các tế bào sống Tuy nhiên, thực tế cho thấy quá trình này đã được con người sử dụng từ hàng nghìn năm trước để sản xuất thực phẩm, đồ uống và thuốc ở nhiều khu vực trên thế giới.

Lên men là quá trình phân hủy hoặc biến đổi kị khí các hợp chất hữu cơ nhờ vào vi sinh vật, dẫn đến sự thay đổi hóa học của cơ chất Quá trình này có thể diễn ra trong điều kiện kị khí hoặc hiếu khí, hoặc thông qua enzyme chiết tách từ vi sinh vật, nhằm tạo ra các sản phẩm hữu ích.

Các sản phẩm lên men thường bắt nguồn từ những phát hiện tình cờ, chẳng hạn như nước ép nho lên men trong quá trình bảo quản Những khám phá này đã dẫn đến các thử nghiệm nhằm tạo ra những thay đổi tương tự trong các loại thực phẩm khác Hệ vi sinh vật (VSV) được sử dụng trong quá trình lên men rất đa dạng, nhờ vào đặc tính hô hấp và khả năng chuyển hóa của chúng Nấm men, ví dụ, được ứng dụng trong sản xuất rượu và bia nhờ khả năng tạo ra ethanol.

Nấm men không chỉ tạo ra khí CO2 mà còn được ứng dụng trong quá trình lên men để sản xuất bánh mì Bên cạnh đó, nhiều loại vi khuẩn được sử dụng để sản xuất pho-mát, dưa chua và sữa chua Đặc biệt, một số loại nấm mốc cũng đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra các loại pho-mát khác.

Lên men đóng vai trò quan trọng trong việc tạo ra sự đa dạng và hương vị độc đáo cho thực phẩm Quá trình này phụ thuộc vào loại nguyên liệu, hệ vi sinh vật và điều kiện lên men, dẫn đến các sản phẩm khác nhau với hương vị phong phú.

Trước đây, sản phẩm lên men chủ yếu chỉ giới hạn trong thực phẩm, nhưng hiện nay, nhiều ngành công nghiệp đã phát triển dựa trên quá trình này để sản xuất nguyên vật liệu thiết yếu cho cuộc sống Ngành công nghiệp lên men hiện nay không chỉ được áp dụng trong sản xuất thực phẩm như sữa chua và pho-mát, mà còn trong thực phẩm chức năng như vitamin, sản phẩm nông nghiệp như thuốc trừ sâu vi sinh, dược phẩm như vaccine và enzyme, hóa chất công nghiệp như acetone và acid citric, cũng như nhiên liệu sinh học.

1.2.2 Ứng dụng phương pháp lên men trong việc nâng cao giá trị của dược liệu 1.2.2.1 Nguyên tắc cơ bản

Thảo dược và dược liệu đã được sử dụng như những phương thuốc truyền thống trong hàng nghìn năm Các sản phẩm từ dược liệu, bao gồm cả dược liệu thô và những sản phẩm chế biến, chứa các thành phần hoạt tính có giá trị chữa bệnh cho con người.

Theo ước tính của WHO, ngày càng nhiều quốc gia đang phát triển sử dụng thuốc thảo dược như một phương pháp chăm sóc sức khỏe ban đầu Nghiên cứu của Luqman và cộng sự vào năm 2014 đã chỉ ra rằng có những bằng chứng quan trọng chứng minh sự hiệu quả của thảo dược trong việc điều trị và giảm nhẹ các rối loạn cũng như bệnh tật.

Nhiều loại thảo dược cần trải qua sự biến đổi sinh học từ vi sinh vật trong hệ tiêu hóa để phát huy hoạt tính, điều này nhấn mạnh vai trò quan trọng của quá trình lên men trong việc ứng dụng điều trị của thuốc thảo dược.

Quá trình lên men vi sinh vật và biến đổi của thuốc thảo dược truyền thống tuân theo một số nguyên tắc cơ bản, bao gồm các đặc điểm quan trọng như sau: sự phát triển của vi sinh vật, ảnh hưởng của điều kiện môi trường, và quá trình chuyển hóa các hợp chất trong thảo dược Những yếu tố này đóng vai trò quyết định trong việc cải thiện chất lượng và hiệu quả của thuốc thảo dược.

VSV trong giai đoạn phát triển có khả năng sản sinh nhiều phân tử sinh học hoạt tính như enzyme protease, amylase, cellulase, esterase và amidase Những enzyme này đóng vai trò quan trọng trong việc tổng hợp và phân hủy các hợp chất Trong quá trình lên men thảo dược và dược liệu, các enzyme này hỗ trợ phân hủy và chuyển đổi nguyên liệu thành các thành phần mới, góp phần nâng cao hiệu quả của quá trình này.

Nhiều vi sinh vật (VSV) có khả năng sử dụng các thành phần hoạt tính từ thảo dược làm cơ chất để tổng hợp các hợp chất mới Đồng thời, các chất chuyển hóa của VSV và thuốc thảo dược có thể tương tác với nhau, tạo ra những hợp chất mới và giảm độc tính của thuốc thảo dược.

Một số thành phần trong thuốc thảo dược có khả năng điều chỉnh con đường trao đổi chất của vi sinh vật, dẫn đến việc hình thành các hợp chất mới và tăng cường hoạt tính sinh học của các chất chuyển hóa thứ cấp.

Các sản phẩm từ dược liệu có thể được cô đặc thông qua hệ vi sinh vật (VSV) tiêu thụ các thành phần không có hoạt tính như protein, đường và các chất khác Quá trình này giúp tăng nồng độ các chất có hoạt tính trong sản phẩm, nâng cao hiệu quả sử dụng.

Quá trình lên men thảo dược không chỉ dẫn đến các thay đổi sinh hóa mà còn làm thay đổi tỷ lệ thành phần dinh dưỡng của thực vật, từ đó ảnh hưởng đến đặc tính sinh học của sản phẩm Việc lên men cải thiện các đặc tính dược lý của thuốc thảo dược thông qua việc thay đổi các phân tử tự nhiên như isoflavone, saponin, phytosterol và phenol, những chất này đóng vai trò quan trọng trong việc nâng cao giá trị dược liệu Nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng chúng có tác dụng tích cực trong việc tăng cường sức khỏe và ngăn ngừa bệnh tật cho con người.

1.2.2.2 Các phương pháp lên men thảo dược, dược liệu

Một số phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn

Trong những năm gần đây, nghiên cứu và phát triển các hợp chất kháng vi sinh vật từ thực vật ngày càng được quan tâm Điều này đi kèm với việc chú trọng đến các phương pháp sàng lọc và đánh giá hiệu quả hoạt tính kháng khuẩn Tuy nhiên, không phải tất cả các phương pháp in vitro đều phù hợp để đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ thực vật một cách tối ưu Dưới đây là một số phương pháp đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật có thể áp dụng cho các dịch chiết nguồn gốc thực vật.

1.3.1 Phương pháp khuếch tán đĩa thạch ( Agar disk-diffusion method)

Phương pháp đánh giá mức độ nhạy cảm của vi sinh vật, được phát triển vào năm 1940, hiện là tiêu chuẩn trong nhiều phòng thí nghiệm Nguyên tắc của phương pháp này bao gồm việc cấy các đĩa thạch petri với chủng vi sinh vật đã chuẩn hóa về nồng độ tế bào Sau đó, các đĩa giấy lọc chứa hợp chất thử ở nồng độ mong muốn được đặt trên bề mặt thạch Các đĩa thạch được ủ trong điều kiện thích hợp, cho phép các chất từ đĩa giấy lọc khuếch tán vào thạch và ức chế sự phát triển của vi sinh vật nếu chúng có hoạt tính kháng Đường kính vòng vô khuẩn được đo để đánh giá khả năng kháng vi sinh vật của hợp chất thử nghiệm.

1.3.2 Phương pháp khuếch tán giếng thạch ( Agar well diffusion method) Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi để đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật của các dịch chiết từ thực vật hay vi sinh vật khác Tương tự như phương pháp khuếch tán đĩa thạch, một lượng vi sinh vật thử nghiệm được trải đều lên bề mặt đĩa thạch Sau đó các giếng có đường kính từ 6 – 8 mm được đục bằng dụng cụ vô khuẩn Khoảng 20 – 100 àL tỏc nhõn chống vi sinh vật hoặc dịch chiết đem thử được đưa vào giếng Cỏc đĩa được ủ ở điều kiện thích hợp Các chất trong giếng sẽ khuếch tán vào thạch và ức chế sự phát triển của vi sinh vật thử nghiệm [5]

1.3.3 Phương pháp pha loãng thạch (Agar dilution method) Đây là một trong những phương pháp để xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của tác nhân kháng vi sinh vật nhờ vào khả năng ước tính nồng độ chất kháng khuẩn được sử dụng trong thạch Các chất kháng khuẩn với nồng độ mong muốn được trộn chung vào thạch khi còn đang chảy lỏng Sau khi thạch đông lại, chủng vi sinh vật thử nghiệm sẽ được đưa lên bề mặt đĩa thạch MIC được ghi nhận là nồng độ chất kháng khuẩn thấp nhất ức chế hoàn toàn sự phát triển trong điều kiện ủ thích hợp [5]

1.3.4 Phương pháp pha loãng môi trường trên đĩa 96 giếng (Broth microdilution method) Đây cũng là một phương pháp cơ bản để xác định MIC của tác nhân kháng vi sinh vật Quá trình thực hiện liên quan tới việc pha loãng dần nồng độ của tác nhân trên đĩa

Trong nghiên cứu này, 96 giếng được pha loãng mỗi 2 lần, sau đó mỗi giếng được cấy thêm một lượng vi sinh vật được hoạt hóa và pha loãng đến khoảng 0,5 McFarland Sau thời gian ủ, MIC được xác định là nồng độ chất kháng khuẩn thấp nhất có khả năng ức chế hoàn toàn sự phát triển của vi sinh vật, điều này có thể quan sát bằng mắt thường Phương pháp này không chỉ thực hiện nhanh chóng mà còn tiết kiệm thuốc thử và không gian lưu trữ.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nguyên vật liệu, thiết bị

- Dược liệu bạc hà Á được cung cấp từ vùng Nghĩa Trai (Hưng Yên), và được Bộ môn Thực vật - Đại học Dược Hà Nội giám định tên khoa học

- Các chủng nấm men ký hiệu HC5, TX2, TX5, VC3 do bộ môn Vi sinh & Sinh học, Đại học Dược Hà Nội cung cấp

- Chủng VSV kiểm định Staphylococcus aureus ATCC 6538 do Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương cung cấp

- Đường saccarose: sử dụng đường saccarose được cung cấp từ hãng hóa chất Xilong (Trung Quốc)

- Môi trường dinh dưỡng nuôi cấy vi sinh vật:

+ Môi trường Luria Bertani (LB):

Agar (nếu pha môi trường thạch) 16 – 18 g/L + Môi trường Sabouraud:

Agar (nếu pha môi trường thạch) 16 – 18 g/L Các môi trường sau khi pha xong được hấp tiệt trùng ở 121 o C trong 20 phút

- Dung môi, hóa chất khác: NaCl 0.9%, EtOH 70 o , nước cất, glucose, peptone, cao nấm men, NaCl…

Các dụng cụ, thiết bị sử dụng trong quá trình làm thực nghiệm được liệt kê dưới đây:

- Tủ an toàn sinh học cấp II Streamline

- Tủ ấm vi sinh WiseCube

- Tủ lạnh Samsung Freezer & Refrigerator SR-269

- Nồi hấp tiệt trùng Hirayama HVE 25

Trong quá trình thí nghiệm, các dụng cụ cần thiết bao gồm côn phun tách, micropipet với các thể tích 10 – 100 µL và 100 – 1000 µL, bình nuôi, cốc có mỏ để đo thể tích, ống Eppendorf 1,5 mL, ống nghiệm, đèn cồn, que cấy, bông không thấm nước, tăm bông vô khuẩn và thước kẹp Panme Những dụng cụ này hỗ trợ hiệu quả cho các quy trình nghiên cứu và thí nghiệm trong phòng lab.

Nội dung nghiên cứu

Đề tài của chúng tôi tiến hành trên các nội dung:

- Lên men dịch chiết cây bạc hà M arvensis L.theo các điều kiện khảo sát: thay đổi nồng độ saccarose; hàm lượng bạc hà; nồng độ nấm men

- Thử hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết bạc hà sau lên men bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch

Đọc kết quả và xử lý số liệu bằng phương pháp thống kê để phân tích xu hướng ảnh hưởng của các yếu tố khảo sát đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết từ cây bạc hà.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Lên men dịch chiết bạc hà trong các điều kiện khác nhau

Các thí nghiệm lên men dịch chiết bạc hà được thực hiện theo quy trình chung như sau (hình 2.1):

- Bạc hà khô được ngâm với nước cất trong thời gian 30 – 45 phút, nhiệt độ nước được kiểm soát trong khoảng từ 70 – 80 o C

Sau khi loại bỏ phần bã dược liệu, đường saccarose được thêm vào và khuấy đều cho tan hoàn toàn Dung dịch chiết xuất dược liệu kết hợp với đường được để nguội đến nhiệt độ phòng trước khi chuyển vào các bình chứa để tiến hành quá trình lên men.

Nấm men sau khi được hoạt hóa trong 18 – 24 giờ ở nhiệt độ 28°C trong môi trường Sabouraud lỏng sẽ được pha loãng đến khi đạt độ đục khoảng 1,0 McFarland Sau đó, một lượng nấm men này sẽ được thêm vào các bình dịch chiết đã có đường và được ủ trong tủ ấm ở điều kiện thích hợp.

Hình 2.1 Sơ đồ tổng quát quy trình lên men từ dịch chiết bạc hà Á

Thành phần và điều kiện lên men đối chứng:

- Lượng dược liệu khô sử dụng: 4% (40 g/L)

- Lượng nấm men đưa vào: 10%

- Thời gian lên men: 3 ngày

Hàm lượng dược liệu, đường saccarose, lượng dịch nấm men được thay đổi trong các thí nghiệm khảo sát, các điều kiện khác được giữ nguyên

2.3.2 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch

Các bước chính của quy trình tiến hành thử hoạt tính kháng khuẩn bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch được thực hiện như sau (hình 2.2):

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình thử hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết bạc hà Á sau lên men bằng phương pháp khuếch tán giếng thạch

- Chuẩn bị môi trường thạch:

Môi trường thạch LB được chuẩn bị theo công thức đã trình bày trong Phần 2.1 về nguyên vật liệu Sau khi chuẩn bị, môi trường được chuyển vào các bình nón và tiến hành hấp tiệt khuẩn ở nhiệt độ 121°C trong 20 phút.

Sau khi hấp, môi trường thạch được làm nguội đến khoảng 50 oC Sau đó, 20 – 25 mL môi trường thạch lỏng được đổ vào từng đĩa Petri đã được tiệt khuẩn và để khô, đảm bảo độ dày của thạch khoảng 4 mm Các đĩa này được để nguội trên bề mặt phẳng và tĩnh để thạch đông lại.

Để kiểm định chủng vi sinh vật (VSV), lấy mẫu từ ống thạch nghiêng, sử dụng một vòng que cấy và chuyển vào ống nghiệm chứa 2 – 3 mL môi trường LB lỏng Sau đó, ống nghiệm được ủ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37 độ C trong khoảng thời gian 18 – 24 giờ.

Sau thời gian hoạt hóa trên, ống VSV được pha loãng và đồng nhất độ đục tương đương 1,0 McFarland

Sau khi pha loãng các vi sinh vật (VSV), chúng được đưa lên các đĩa thạch LB bằng phương pháp Kirby Bauer Cụ thể, sử dụng que tăm bông vô khuẩn để nhúng vào các ống VSV và sau đó phết đều lên toàn bộ bề mặt đĩa thạch.

- Đục các giếng đường kính 7 mm bằng dụng cụ vô khuẩn

- Đưa 100 àL dịch chiết bạc hà sau lờn men vào mỗi giếng

- Chuyển các đĩa này vào tủ ấm 37 o C, để 18 – 24 h

Để đọc kết quả, cần quan sát sự xuất hiện của các vòng vô khuẩn hoặc vòng kìm khuẩn xung quanh mỗi giếng Nếu phát hiện có vòng vô khuẩn hay kìm khuẩn, hãy sử dụng thước kẹp Panme để đo đường kính của các vòng này và ghi lại số liệu một cách chính xác.

- Số liệu sau đó sẽ được tập hợp và xử lý thống kê để thấy được xu hướng ảnh hưởng khi sự thay đổi các yếu tố khảo sát

2.3.3 Xử lý kết quả sau thực nghiệm Đường kính vòng vô khuẩn được tính theo công thức: Đường kính vòng vô khuẩn = Đường kính tổng – Đường kính giếng (7 mm) Các kết quả được phân tích ANOVA để xác định ý nghĩa thống kê ở ngưỡng 0,05 và xây dựng đường hồi quy tuyến tính Các xử lý được thực hiện trên phần mềm MS Excel và SPSS

THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

3.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ saccarose a) Ảnh hưởng của nồng độ saccarose lên hoạt tính kháng khuẩn của các chủng nấm men khác nhau

Chúng tôi thực hiện quá trình lên men theo quy trình đã mô tả trong phần 2.3 Phương pháp nghiên cứu, với các nồng độ saccarose khảo sát là 20%, 10%, 5% và 2,5% (g/mL) Kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết bạc hà Á lên men với các điều kiện thay đổi lượng đường được trình bày trong bảng 3.1 và hình 3.1.

Bảng 3.1 Kích thước vòng vô khuẩn của dịch chiết bạc hà Á lên men với các nồng độ saccarose và chủng nấm men khác nhau

Kích thước vòng vô khuẩn (mm)

Chú thích: HC5, TX2, TX5, VC3: chủng nấm men HC5, TX2, TX5, VC3

(-): kết quả không rõ ràng

Hình 3.1 trình bày kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết bạc hà Á lên men, sử dụng các nồng độ saccarose và chủng nấm men khác nhau, được thực hiện theo phương pháp khuếch tán giếng thạch.

Chú thích: 1 HC5, 2 TX2, 3 TX5, 4 VC3 S20%, S10%, S5%, S2,5%: Nồng độ saccarose 20%, 10%, 5%, 2,5%

Chúng tôi tiến hành phân tích phương sai ANOVA, kết quả được thể hiện trong hình 3.2

Hình 3.2 Kết quả phân tích ANOVA kích thước vòng vô khuẩn của các mẫu bạc hà Á lên men ở nồng độ saccarose và chủng nấm men khác nhau

Giá trị p trong ANOVA thấp hơn 0,05, cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê trong hoạt tính kháng khuẩn khi thay đổi nồng độ saccarose và các loại nấm men khác nhau.

Chúng tôi thực hiện phân tích hồi quy tuyến tính nhằm xác định mối quan hệ giữa nồng độ saccarose và hoạt tính kháng khuẩn Dữ liệu từ mẫu HC5 cho thấy có nhiều giá trị đáng chú ý.

0 dẫn đến khó xác định đường hồi quy nên chúng tôi chỉ phân tích các mẫu TX2, TX5, VC3 Kết quả được thể hiện trong hình 3.3

Hình 3.3 Phân tích hồi quy tuyến tính giữa kích thước vòng vô khuẩn và nồng độ saccarose của dịch lên men bằng các chủng nấm men khác nhau

Phương trình các đường hồi quy thu được:

TX2: y = 0,2655x + 1,5941, R² = 0,3711 TX5: y = 0,0892x + 3,3388, R² = 0,1274 VC3: y = 0,2005x + 2,6409, R² = 0,2681 Trong đó x là nồng độ saccarose, y là kích thước vòng vô khuẩn

Nồng độ saccarose có ảnh hưởng khác nhau đến hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết bạc hà lên men bằng các loại nấm men khác nhau Hệ số góc của các đường hồi quy lớn hơn 0 cho thấy hoạt tính kháng khuẩn tăng theo nồng độ saccarose, mặc dù các giá trị R² thấp (TX2: R² = 0,3711; TX5: R² = 0,1271; VC3: R² = 0,2681) cho thấy mức độ tuyến tính không cao.

HC5 TX2 TX5 VC3 Linear (TX2) Linear (TX5) Linear (VC3)

Hệ số góc đường hồi quy cho thấy nồng độ saccarose ảnh hưởng mạnh nhất đến nấm men TX2 (0,2655) và VC3 (0,2005), trong khi TX5 chỉ đạt 0,0892 Điều này cho thấy nấm men TX2 và VC3 nhạy cảm hơn với nồng độ saccarose so với TX5 Để phân tích mối tương quan giữa nồng độ saccarose và hoạt tính kháng khuẩn, chúng tôi đã tổng hợp kết quả thí nghiệm của các chủng nấm men, được trình bày trong bảng 3.2.

Bảng 3.2 Kích thước vòng vô khuẩn của dịch lên men khi thay đổi nồng độ saccarose

Kích thước vòng vô khuẩn (mm)

Hình 3.4 Kết quả phân tích ANOVA kích thước vòng vô khuẩn của các mẫu bạc hà Á lên men ở nồng độ saccarose khác nhau

Phân tích ANOVA cho thấy giá trị p = 0,008, thấp hơn ngưỡng 0,05 (hình 3.4), chứng tỏ có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về đường kính vòng vô khuẩn giữa các mẫu với nồng độ đường khác nhau.

Sau khi phân tích ANOVA cho thấy sự khác biệt có ý nghĩa thống kê, chúng tôi đã xây dựng đường hồi quy với phương trình y = 0,1701x + 2,7045 (R² = 0,2386) Trong đó, x đại diện cho nồng độ saccarose và y là kích thước vòng vô khuẩn.

Hình 3.5 Phân tích hồi quy tuyến tính giữa kích thước vòng vô khuẩn và nồng độ saccarose dùng để len men

Nghiên cứu cho thấy rằng việc tăng nồng độ saccarose từ 2,5% lên 20% có thể làm tăng gấp đôi hoạt tính kháng khuẩn của dịch lên men Ở nồng độ saccarose 20%, kích thước vùng tác dụng có phương sai cao hơn so với các nồng độ khác, cho thấy nồng độ đường cao có ảnh hưởng khác nhau lên các chủng nấm men Tuy nhiên, phương trình hồi quy cho thấy mức độ tuyến tính không cao đối với dữ liệu thực nghiệm, với R² chỉ đạt 0,24.

3.2 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng bạc hà a) Ảnh hưởng của lượng bạc hà lên hoạt tính kháng khuẩn của các chủng nấm men khác nhau

Chúng tôi thực hiện quá trình lên men theo quy trình đã mô tả ở phần 2.3, với các hàm lượng bạc hà khảo sát là 8%, 4%, 2% và 1% (g/mL) Kết quả về hoạt tính kháng khuẩn của các dịch chiết bạc hà lên men, với điều kiện thay đổi lượng dược liệu sử dụng, được thể hiện trong bảng 3.3 và hình 3.6.

Bảng 3.3 Kích thước vòng vô khuẩn của dịch chiết bạc hà Á lên men với các nồng độ bạc hà và chủng nấm men khác nhau

Kích thước vòng vô khuẩn (mm)

Thí nghiệm BH8% BH4% BH2% BH1%

Chú thích: HC5, TX2, TX5, VC3: chủng nấm men HC5, TX2, TX5, VC3

BH8%, BH4%, BH2%, BH1%: hàm lượng bạc hà 8%, 4%, 2%, 1%

(-): kết quả không rõ ràng

Hình 3.6 trình bày kết quả thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của dịch chiết bạc hà Á đã được lên men, với các hàm lượng bạc hà và chủng nấm men khác nhau, thông qua phương pháp khuếch tán giếng thạch.

Chú thích: 1 HC5, 2 TX2, 3 TX5, 4 VC3 BH8%, BH4%, BH2%, BH1%: hàm lượng bạc hà 8%, 4%, 2%, 1%

Kết quả phân tích ANOVA cho thấy hoạt tính kháng khuẩn giữa các nhóm mẫu với hàm lượng bạc hà và nấm men khác nhau có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05), như thể hiện trong hình 3.7.

Hình 3.7 Kết quả phân tích ANOVA kích thước vòng vô khuẩn của các mẫu bạc hà Á lên men ở nồng độ bạc hà và chủng nấm men khác nhau

Sau khi thực hiện phân tích ANOVA và xác định sự khác biệt có ý nghĩa thống kê về hoạt tính kháng khuẩn giữa các hàm lượng bạc hà khác nhau, chúng tôi tiến hành phân tích hồi quy tuyến tính Kết quả của phân tích này được trình bày trong hình 3.8.

Phân tích hồi quy tuyến tính giữa kích thước vòng vô khuẩn và hàm lượng bạc hà trong dịch lên men với các chủng nấm men khác nhau đã cho ra các phương trình hồi quy cụ thể.

HC5: y = 0,1248x + 3,9784, R² = 0,1603 TX2: y = 0,5799x – 0,7234, R² = 0,8233 TX5: y = 0,2739x + 1,6839, R² = 0,2245 VC3: y = 0,6797x + 0,6594, R² = 0.,6963 Trong đó x là nồng độ bạc hà, y là đường kính vòng vô khuẩn

Các đường hồi quy với hệ số góc lớn hơn 0 cho thấy hoạt tính kháng khuẩn tăng theo hàm lượng bạc hà lên men Hệ số góc của TX2 và VC3 cao hơn HC5 và TX5, cho thấy khả năng chuyển hóa cơ chất của các chủng nấm men TX2 và VC3 vượt trội Hệ số R² của TX2 và VC3 cũng lớn hơn nhiều so với HC5 và TX5, phản ánh mối liên hệ tuyến tính cao hơn giữa hàm lượng bạc hà và hoạt tính kháng khuẩn trong quá trình lên men dịch chiết bạc hà.

HC5 TX2 TX5 VC3 Linear (HC5)

Linear (HC5) Linear (TX2) Linear (TX5) Linear (VC3) Linear (VC3)