Tổng quan về quercetin
Cấu trúc hóa học của quercetin
Hình 1.1: Công thức cấu tạo của quercetin
Tên IUPAC: 2-(3’,4’-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxychromen-4-on
Khối lượng phân tử: 302,23 g/mol
Tính chất vật lý của quercetin
quercetin thường kết tinh ở dạng quercetin dihydrat có màu vàng đậm hơn rutin quercetin mất nước ở 95-97°C và có nhiệt độ nóng chảy ở 309 - 314°C [14]
Quercetin có thể tan hoàn toàn trong 290 ml ethanol tuyệt đối và 23 ml ethanol sôi, dễ hòa tan trong dung dịch kiềm, tạo màu vàng, nhưng không tan trong nước Quang phổ hấp thụ của quercetin trong vùng tử ngoại ở độ dài sóng 258nm và 275nm khi sử dụng methanol.
Tính chất hóa học của quercetin
Quercetin bản chất là một flavonoid có các nhóm hydroxyl phenolic, nhóm carbonyl, vòng thơm benzen nên chúng có khả năng phản ứng rất lớn Tính chất
3 hóa học của nhóm phenolic còn phụ thuộc vào vị trí nhóm -OH, hệ nối đôi liên hợp và các nhóm thế
Phản ứng của nhóm hydroxy (-OH):
Dưới tác dụng của các chất oxy hóa như bạc nitrat, ferricyanid, persulfat và các gốc tự do, flavonoid sẽ bị oxy hóa thành các gốc ArO* Những gốc này có khả năng dimer hóa hoặc phản ứng với các gốc tự do khác, tạo ra các liên kết mới như C-C, C-O hoặc O-O Sự gia tăng nhóm hydroxy trong phân tử làm cho các chất phenol trở nên nhạy cảm hơn với quá trình oxy hóa và các phản ứng bẻ gãy vòng.
Trong môi trường acid pH = 2, quercetin bị oxy bởi H2O2 tạo quinon theo sơ đồ như trong hình 1.2 [19]
Hình 1.2: Phản ứng oxy hóa quercetin thành quinon
Các flavonoid có tính acid yếu, dễ phản ứng với dung dịch kiềm để tạo thành muối tan trong nước, cho màu sắc thay đổi khi đun nóng, từ vàng đến đỏ thắm tùy thuộc vào nồng độ và nhóm flavonoid Flavon và flavonol (như quercetin) trong dung dịch ammoniac tạo màu vàng sáng, trong khi chalcon và auron cho màu đỏ da cam Anthocyan trong dung dịch amoniac hoặc natri carbonat mang lại màu xanh hoặc tím.
Liên kết hydro hình thành khi không có trở ngại cấu trúc không gian, xảy ra giữa các nhóm OH tự do trong cùng một phân tử hoặc giữa các phân tử khác nhau Đặc điểm này có ảnh hưởng lớn đến tính chất của các chất.
4 tính chất lí hóa học như: điểm sôi, điểm nóng chảy, độ hòa tan, đặc tính phổ tử ngoại, cấu trúc phân tử và khả năng phản ứng
Khi đun nóng khung flavon với dung dịch KOH 30%, vòng γ-pyron sẽ bị mở ra, tạo thành O-hydroxydibenzoylmethan Chất này sau đó phân hủy thành các dẫn chất ceton và acid, như minh họa trong hình 1.3.
Hình 1.3: Phản ứng mở vòng γ-pyron
Dưới tác dụng của acid, O-hydroxyldibenzoylmethan lại được đóng vòng thành flavon (hiệu suất 77%)
Tương tự các isoflavon cũng bị thủy phân thành dẫn chất ceton, phenol hoặc acid:
Ether thiên nhiên của phenol thường gặp trong thực vật, đặc biệt những ether metylic Những nhóm -OH phenol dễ dàng tham gia phản ứng ether hóa
Phản ứng của vòng thơm:
+Phản ứng thế: Các flavonoid tham gia phản ứng thế dễ hơn so với benzen và chịu ảnh hưởng của nhóm khác
Phản ứng diazo và azo hóa được sử dụng để phát hiện flavonoid trên sắc ký đồ, với các thuốc thử thường là amin thơm như p-nitroanilin, benzidin và acid sulfanilic Màu sắc đặc trưng của phản ứng này có thể là đỏ, da cam hoặc nâu đỏ, tùy thuộc vào vị trí và số lượng nhóm –OH có trong cấu trúc flavonoid.
Phản ứng của nhóm carbonyl:
Phản ứng Shinoda, hay còn gọi là phản ứng cyanidin, là một quá trình khử quan trọng có sự tham gia của các kim loại như sắt, kẽm, magie và axit clohydric (HCl) Sản phẩm của phản ứng này thường có màu sắc đa dạng, bao gồm màu da cam, hồng, hoặc đỏ, tạo nên những ứng dụng thú vị trong hóa học và công nghiệp.
Phản ứng của flavonoid có nhóm carbonyl tại vị trí C4 và nối đôi giữa C2 đặc trưng cho flavonol, như quercetin Ngược lại, flavon thiếu nhóm -OH ở C3, dẫn đến phản ứng khó hơn và màu sắc nhạt, làm cho việc phát hiện trở nên khó khăn hơn.
Năm 1914, Willsaetter đã tiến hành phản ứng khử quercetin bằng kim loại magie trong môi trường HCl thành dẫn chất màu cyanidin chlorid [23]
Người ta dùng phản ứng này để định tính và định lượng quercetin bằng phương pháp so màu
Phản ứng tạo phức kim loại là một đặc tính quan trọng của flavonoid, liên quan đến hoạt tính sinh học của chúng Flavonoid có khả năng tạo chelat với kim loại nặng, đặc biệt là với molipden và sắt, tạo ra các phức màu xanh đen Các flavonoid chứa nhóm chức carbonyl ở vị trí C4 và hydroxyl ở vị trí C3 - C5 (flavonol) có khả năng tạo phức với kim loại dễ dàng, đặc biệt là nhôm, cho màu vàng hoặc vàng xanh phát quang tại bước sóng 365 nm.
Các flavonoid chứa nhóm -OH tự do ở vòng C (flavonol) khi được lắc kỹ với dung dịch chì acetat trong rượu sẽ tạo ra kết tủa màu vàng đỏ, trong khi anthocyan sẽ tạo kết tủa màu đỏ hoặc xanh.
+ Phản ứng Martini Bettolo (phản ứng với dung dịch SbCl 5 trong CCl 4 ):
Các chalcon tạo ra màu đỏ đến đỏ tím, trong khi flavon và flavonol mang lại màu vàng đến vàng cam Phản ứng này chủ yếu là do sự tạo phức của các flavonoid có nối đôi liên hợp giữa nhóm carbonyl và vòng B Nếu flavonoid không có sự liên hợp này, thì phản ứng đặc trưng sẽ không diễn ra.
Tính chất sinh học và ứng dụng trong điều trị của quercetin
Quercetin là một hợp chất có hoạt tính sinh học phong phú, đóng vai trò quan trọng trong nhiều sản phẩm thực phẩm chức năng bảo vệ sức khỏe hiện có cả trong nước và quốc tế.
Quercetin có bromelain hỗ trợ điều trị gout và ưng thư
Minh nhãn khang hỗ trợ điều trị đục thủy tinh thể
Now foods quercetin giúp cải thiện hệ miễn dịch
Bên cạnh đó, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng quercetin còn có một số tác dụng sinh học như:
Tăng cường sức đề kháng và giảm tính thẩm thấu của mao mạch là những tác dụng quan trọng giúp phục hồi tính đàn hồi của mao mạch bị tổn thương Điều này không chỉ bảo vệ các mạch máu mà còn liên kết các mô trong cơ thể, từ đó giảm nguy cơ mắc các bệnh tim mạch và đột quỵ.
Quercetin có tác dụng chống viêm mạnh mẽ, được chứng minh qua các thí nghiệm trên chuột, khi nó ức chế tình trạng phù bàn chân do albumin, histamin và serotonin gây ra, cũng như làm giảm sưng khớp khuỷu do enzyme hyaluronidase.
Quercetin đã được chứng minh qua các thí nghiệm trên động vật có khả năng hạ huyết áp và giảm cholesterol trong máu, đồng thời hỗ trợ điều trị và phòng ngừa bệnh xơ vữa động mạch.
Quercetin có khả năng chống kết tập tiểu cầu bằng cách tăng cường hàm lượng cAMP trong tiểu cầu của con người và ức chế quá trình kết tập tiểu cầu do ADP gây ra.
Quercetin tác động đến chuyển hóa cAMP ở tiểu cầu bằng cách ức chế enzym phosphodiesterase, dẫn đến việc tăng hàm lượng cAMP Ngoài ra, quercetin cũng ức chế cả hai enzym cAMP và cGMP.
Quercetin có tác dụng tích cực đối với tim mạch bằng cách làm giãn mạch vành và cải thiện tuần hoàn Nghiên cứu cho thấy quercetin giảm thời gian xuất hiện rối loạn nhịp tim, hạ thấp hàm lượng MDA (malonil - dialdehyd) trong cơ tim và bảo vệ enzym SOD (superoxyd dismutase).
Quercetin có khả năng giảm trương lực cơ trên hệ cơ trơn của ruột và khí phế quản, với tác dụng giải co thắt cơ trơn mạnh mẽ hơn nhiều so với rutin.
+ Trên tế bào ung thư: Thí nghiệm trên chuột nhắt trắng đã được tiêm truyền tế bào u, quercetin có tác dụng kéo dài thời gian sống [29]
Quercetin đã được nghiên cứu và phát hiện có khả năng gây đột biến trong các thí nghiệm với Samionella typhimuricum Tuy nhiên, các thí nghiệm trên động vật cho thấy không có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa nhóm sử dụng quercetin và nhóm chứng Do đó, quercetin được xác nhận là không chứa tác nhân gây ung thư.
Mặt khác quercetin đã được chứng minh là có tác dụng ức chế khối u do 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetat (TPA) gây nên
Enzym Tyrosinase đóng vai trò quan trọng trong quá trình oxy hóa L-tyrosin thành dopaquinon, đây là giai đoạn quyết định trong việc tổng hợp melanin trên da Do đó, các chất ức chế hoạt động của enzym này được coi là những hợp chất quan trọng trong mỹ phẩm và dược phẩm, giúp điều trị các vấn đề về da và cải thiện vẻ đẹp làn da.
Quercetin có khả năng chống dị ứng hiệu quả nhờ vào việc ức chế sự giải phóng histamin từ các tế bào ưa kiềm Nó không chỉ có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm rộng rãi, mà còn đặc biệt mạnh với vi nấm và vi khuẩn gram dương, đồng thời ức chế virus HIV và bảo vệ cơ thể khỏi tác động của bức xạ Hơn nữa, quercetin còn sở hữu hoạt tính chống oxy hóa cao, tương đương với vitamin C.
Các phương pháp điều chế quercetin
Chiết xuất từ dược liệu
Quercetin là một hợp chất có mặt trong nhiều loại thực vật và thực phẩm, bao gồm hành tây, trà xanh, táo, quả mọng và Ginkgo biloba Đặc biệt, chiết xuất từ cây Sophora Japonica được biết đến là nguồn quercetin với độ tinh khiết cao nhất.
Có một số tác giả đã nghiên cứu việc chiết xuất trực tiếp từ dược liệu:
Yasushi Numata và Hiroyuki Tanaka đã thực hiện quy trình chiết xuất quercetin từ vỏ củ hành tây Đầu tiên, vỏ hành tây được rửa sạch cho đến khi nước rửa trong, sau đó được làm khô tự nhiên ở nhiệt độ phòng hoặc bằng phương pháp đông khô Cuối cùng, quá trình chiết xuất được thực hiện qua hai phương pháp khác nhau.
Chiết xuất ở nhiệt độ phòng: Vỏ củ hành khô được ngâm trong ethanol và methanol trong một tuần
Chiết xuất bằng dung môi đun nóng là phương pháp ngâm vỏ củ hành khô trong dung môi ở nhiệt độ 50°C với ethanol và 40°C với methanol trong ba giờ Phương pháp này tiết kiệm thời gian và chi phí, tuy nhiên, quercetin thu được có độ tinh khiết không cao, chỉ đạt 30-31% với phương pháp 1 và 69-70% với phương pháp 2.
Nhóm nghiên cứu tại Khoa công nghệ, Trường Đại Học Nis, Serbia đã phát triển một quy trình tối ưu hóa chiết xuất quercetin từ lá trà xanh (Camellia sinensis) Quy trình bao gồm việc cho 2 g bột trà xanh vào bình cầu 100 mL, thêm các thể tích ethanol khác nhau, sau đó thực hiện đun hồi lưu cách thủy và khuấy liên tục Dịch chiết thu được được lọc và làm bay hơi dưới áp suất giảm trên thiết bị cô quay, cuối cùng các mẫu được làm khô đến khối lượng không đổi trong bình hút ẩm.
Bán tổng hợp từ rutin
Nụ hòe là nguồn nguyên liệu giàu rutin, với hàm lượng tối thiểu theo Dược Điển Việt Nam V (tập 2) là 20% Đặc biệt, nụ hòe Việt Nam có thể đạt hiệu suất chiết lên đến 34%, vượt trội hơn so với nhiều nguyên liệu khác.
Mạch ba góc châu Âu 2-3% rutin trong khi Mạch ba góc ở Việt Nam có 5,8% rutin
Hoa đã nở chứa 8% rutin
Rutin có mặt ở nhiều bộ phận của cây, với tỷ lệ 4-11% ở vỏ quả, 0,5-2% ở hạt và 5-6% ở lá chét Hòe nếp chứa hàm lượng rutin cao hơn Hòe tẻ, lần lượt là 44% và 40,6% Qua quá trình chế biến, hàm lượng rutin có thể thay đổi, đạt 34,7% ở dạng sống, 28,9% ở dạng sao vàng và 18,5% ở dạng sao cháy.
Hòe được trồng tương đối tập trung ở Thái Bình (Thái Thụy), Nghệ An (Quỳnh Lưu) và Hà Nam, ngoài ra còn được trồng phân tán ở hầu hết các tỉnh
Rutin trong nước còn được xuất khẩu nhiều thị trường, kể cả những thị trường khó tính: Trung Quốc, Nhật Bản, Ấn Độ, Australia, Mỹ, Nam Phi
Rutin là nguồn nguyên liệu phong phú, dễ dàng chiết xuất và tinh chế, vì vậy nhiều nhà khoa học và công ty đã sử dụng rutin để sản xuất quercetin, mang lại giá trị sinh học và thương mại vượt trội.
Về hóa học, rutin là một flavonoid dễ bị thủy phân bởi acid và enzym
Nguyên tắc: Trong môi trường acid, rutin sẽ bị thủy phân thành quercetin, glucose, rhamnose theo sơ đồ sau [7], [28]:
Nguyên tắc: quercetin được tạo ra dưới tác động của enzym
Một số ví dụ về việc sử dụng enzym trong phản ứng tạo quercetin
Phản ứng xảy ra nhờ enzym Aspergillus Niger trong methanol với các thông số sau:
Hình 1.4: Thủy phân rutin dưới tác động của enzym
Quercetin được sản xuất thông qua quá trình thủy phân rutin từ cây Mạch Đắng (fagopyrum tataricum) bằng enzym trong môi trường ethanol và nước, diễn ra trong 15 phút ở nhiệt độ 37 °C Phương pháp này có ưu điểm là thời gian thủy phân ngắn và có thể thực hiện ở nhiệt độ phòng.
Nhược điểm: chi phí nuôi dưỡng và phân lập enzym lớn Hiệu suất của phản ứng khó dự đoán, sản phẩm có thể bị nhiễm vi sinh vật
Phương pháp khác
Quercetin có thể được sản xuất không chỉ qua phương pháp thủy phân từ rutin hoặc chiết xuất trực tiếp từ dược liệu, mà còn thông qua con đường tổng hợp hóa học do một số tác giả thực hiện.
Ví dụ một phương pháp tổng hợp quercetin của Kostanceki
Hình 1.5: Tổng hợp hóa học quercetin bởi Kostanceki
NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ
Nguyên liệu, thiết bị
Nguyên liệu ban đầu được sử dụng là bột rutin thô chiết xuất từ hoa Hòe tại bộ môn Công nghiệp Dược – Trường Đại Học Dược Hà Nội
Các hóa chất khác đã sử dụng trong khóa luận được trình bày trong bảng 2.1
Bảng 2.1: Danh mục các nguyên vật liệu sử dụng
STT Nguyên vật liệu Hàm lượng % Xuất xứ
3 Nước RO Đạt Việt Nam
Bảng 2.2: Danh mục các nguyên vật liệu sử dụng
STT Thiết bị, dụng cụ Xuất xứ
1 Bản mỏng silicagel GF254 Đức
2 Bếp khuấy từ gia nhiệt Hàn Quốc
3 Bộ lọc hút chân không Buchner Trung Quốc
4 Cân kỹ thuật Sartorius BP 2001S Thụy Sĩ
5 Đèn soi UV sắc ký CN6 Đức
6 Máy đo nhiệt độ nóng chảy EZ – Melt Mỹ
7 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân(1H - NMR) Bruker
8 Máy đo phổ hồng ngoại Jasco 6700 Mỹ
9 Máy đo phổ khối lượng LC - MS/MS Agilent 1290/6460 Mỹ
10 Máy khuấy từ có bộ phận gia nhiệt IKA Đức
11 Đèn sấy hồng ngoại Đức
13 Máy đo nhiễu xạ tia X Mỹ
14 Máy đo phổ phân tích nhiệt vi sai DSC Mỹ
15 Bình cầu 1 cổ 100 mL, 250 mL, 500 mL Đức
16 Cốc có mỏ 50 mL, 100 mL, 250 mL, 500 mL, 1000 mL Đức
Nội dung nghiên cứu
Điều chế quercetin từ rutin dựa theo phương pháp của tác giả Phạm Công
Khảo sát một số điều kiện phản ứng thủy phân rutin thành quercetin ở quy mô 2g/mẻ,
+Ảnh hưởng của dung môi
+Ảnh hưởng của xúc tác
Khảo sát một số điều kiện tinh chế tạo quercetin tinh khiết
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm.
Phương pháp nghiên cứu
Tổng hợp hóa học
Sử dụng phương pháp thủy phân cơ bản trong hóa học hữu cơ để bán tổng hợp quercetin từ rutin
Theo dõi tiến trình phản ứng bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng (SKLM) sử dụng bản mỏng silica gel 60 F254 Merck với kích thước hạt 70 - 230 Mesh Hệ dung môi khai triển được sử dụng là hỗn hợp ethyl acetat và methanol theo tỷ lệ 4:1.
Quan sát sắc ký đồ dưới bước sóng 254 nm của đèn tử ngoại
Phương pháp kết tinh để tinh chế sản phẩm
Kiểm tra độ tinh khiết và xác định cấu trúc của quercetin tổng hợp được
Sử dụng phương pháp SKLM với các điều kiện như đã trình bày ở mục 2.3.1
Dựa vào đặc điểm hình thức của sắc ký đồ để sơ bộ đánh giá độ tinh khiết của sản phẩm
Phổ khối lượng (MS) được thực hiện tại Phòng đo Phổ thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng máy LC-MS/MS Agilent 1290/6460 (Mỹ) với chế độ đo ESI.
Phổ hồng ngoại (IR) được ghi nhận tại Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng kỹ thuật viên nén KBr trong khoảng sóng 4000-400 cm-1 Các mẫu rắn được phân tán trong KBr đã được sấy khô với tỷ lệ khoảng 1:200, sau đó được ép thành film mỏng dưới áp lực cao và trong môi trường chân không để loại bỏ hơi ẩm.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR và 13C-NMR) được ghi nhận tại Phòng đo Phổ thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, sử dụng máy Bruker 500 MHz Ascend.
Phổ nhiễu xạ tia X (XRPD) được ghi tại Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội
Phân tích nhiệt quét vi sai (DSC) được thực hiện trên máy Setaram DSC131 tại Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Hà Nội Mẫu được quét trong khoảng nhiệt độ từ 30 đến 300 °C với tốc độ gia nhiệt 10 °C/phút.
Kiểm tra hàm lượng của quercetin điều chế được bằng sắc ký lớp mỏng hiệu nặng cao HPLC
THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ, BÀN LUẬN
Xây dựng quy trình tạo và tinh chế quercetin
Bán tổng hợp quercetin từ rutin với quy mô 2g/mẻ
Tiến hành tạo quercetin từ rutin quy mô 2g/mẻ theo quy trình sau:
Hình 3.1: Sơ đồ bán tổng hợp quercetin bằng phản ứng thủy phân rutin trong môi trường acid Cách tiến hành:
Để tiến hành thủy phân rutin, cho 2g rutin vào bình cầu 250ml và thêm 70ml acid hydrochloric 5% Lắp sinh hàn và đun cách thủy ở nhiệt độ 80-90°C, đồng thời khuấy liên tục Sử dụng SKLM để theo dõi quá trình thủy phân, so sánh với quercetin chuẩn Khi quá trình thủy phân hoàn tất (khoảng 2,5 giờ), dừng phản ứng.
Lọc và rửa tủa bằng nước cho đến khi nước rửa đạt pH trung tính và cho phản ứng âm tính với thuốc thử Fehling Sau đó, sấy khô tủa để thu được quercetin thô.
Cảm quan: Sản phẩm có dạng bột mịn, màu vàng sáng
Nhiệt độ nóng chảy: 310-314°C (Theo tài liệu tham khảo [14] là 309- 314°C)
Chúng tôi tiến hành kiểm tra độ tinh khiết của chất điều chế bằng phương pháp SKLM trên bản mỏng Silicagel Chất được hòa tan trong MeOH, và hệ dung môi cùng thuốc thử đã được phát hiện.
Chất hấp thụ: Silicagel GF254 (Merck)
Hệ dung môi: ethyl acetat: methanol = 8: 2
Thuốc thử: để khô, soi dưới UV254
Tiến hành với 3 mẫu: rutin nguyên liệu, quercetin sản phẩm, quercetin chuẩn Kết quả được ghi ở bảng 3.1:
Bảng 3.1: Kết quả sắc ký lớp mỏng
Chất phân tích Giá trị Rf rutin quercetin sản phẩm quercetin chuẩn Ethyl acetat: methanol 0,52 0,80 0,80
Sắc ký lớp mỏng cho thấy dung dịch thử chỉ xuất hiện một vết duy nhất, với giá trị Rf trùng khớp với Rf của quercetin chuẩn và tương tự với các tài liệu tham khảo [4], [11].
Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân tạo quercetin
Để đạt được hiệu suất tối ưu trong việc nâng cấp quy mô, cần khảo sát một số yếu tố quan trọng như nồng độ acid hydroclorid, phương pháp gia nhiệt, tỷ lệ dung môi phản ứng, loại xúc tác, dung môi sử dụng và tỷ lệ dung môi tinh chế.
Trước khi tiến hành khảo sát, các thông số được thiết lập bao gồm khối lượng rutin là 2g, nhiệt độ phản ứng dao động từ 80 đến 90°C, dung môi phản ứng sử dụng là nước, với xúc tác HCl và tổng thể tích dung môi là 70ml.
3.1.2.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid hydroclorid
Theo nghiên cứu của TLTK [9], tác giả Phạm Công Hiếu đã áp dụng nồng độ HCl 2% trong khảo sát Tuy nhiên, tỷ lệ này không mang lại hiệu suất như mong đợi, do đó cần thực hiện thêm khảo sát về tỷ lệ dung môi trong tổng thể tích 70ml Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nồng độ acid HCl tới phản ứng trong dung môi nước
1 2% >4h X x x x Phản ứng chưa xảy ra hoàn toàn
2 5% 2h 0,90g 90,9 307,4-311,3 3,9 Tủa có màu vàng nhạt
3 10% 1,5h 0,91g 91,9 307,6-311,0 3,4 Tủa có màu vàng nhạt
4 15% 1h 0,87g 87,9 308,5-311,8 3,3 Tủa màu vàng đậm hơn
5 20% 0,5h 0,93g 93,9 308,0-311,1 3,1 Tủa có màu vàng cam
Nồng độ acid hydrochloric ảnh hưởng rõ rệt đến thời gian phản ứng, với thời gian phản ứng giảm khi nồng độ tăng từ 2% đến 20%, trong khi nhiệt độ nóng chảy hầu như không thay đổi Tuy nhiên, khi nồng độ acid HCl đạt 25%, tủa màu đen, sẫm xuất hiện và thời gian phản ứng không giảm, cho thấy sản phẩm đã bị phân hủy Do đó, nồng độ acid hydrochloric tối ưu cho phản ứng là 20%.
3.1.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của cách thức gia nhiệt
Các tài liệu tham khảo [9] và [12] chưa cung cấp kết quả đánh giá về ảnh hưởng của phương pháp gia nhiệt đến hiệu suất bán tổng hợp quercetin Do đó, cần tiến hành thêm khảo sát để xác định tác động của yếu tố này, nhằm tối ưu hóa năng lượng sử dụng trong phản ứng bán tổng hợp quercetin từ rutin.
Tiến hành khảo sát với các điều kiện sau: Điều kiện 1: Lắp sinh hàn, đun cách thủy ở 80-90°C và khuấy liên tục
Để thực hiện quy trình lắp sinh hàn, có một số điều kiện cần tuân thủ Điều kiện 2 yêu cầu lắp sinh hàn và ủ trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng, đồng thời khuấy liên tục Điều kiện 3 cũng tương tự nhưng thêm bước đun nóng cách thủy trong 30 phút ở nhiệt độ 80-90°C sau khi ủ Điều kiện 4 và 5 đều yêu cầu làm nóng dụng cụ và đun sôi nước trước khi lắp sinh hàn, sau đó ủ trong 12 giờ với việc khuấy liên tục, và điều kiện 5 cũng bao gồm bước đun nóng cách thủy như điều kiện 3.
Kết quả được thể hiện ở bảng 3.3 (xem trang sau)
Bảng 3.3: Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của cách gia nhiệt tới phản ứng
Nhiệt độ Thời gian m (g) H% T nc
1 Đun nóng + khuấy Đun cách thủy ở 80- 90°C
12h x x x x Phản ứng không xảy ra
Chỉ đun cách thủy ở 80-90°C sau ủ
3,4 Tủa màu vàng sau đun
H2O sôi, bình được làm nóng
12h x x x x SKLM phản ứng xảy ra 1 ít, không đáng kể
Sử dụng nước sôi, bình được làm nóng, sau đó đun cách thủy sau ủ ở 80-90°C
2,3 Tủa màu vàng sau đun
Nhận xét: Từ bảng 3.3 ta thấy, cách thức gia nhiệt có ảnh hưởng đến phản ứng thủy phân tạo quercetin
Khi ủ hỗn hợp ở nhiệt độ phòng hoặc với nhiệt độ giảm dần, phản ứng không diễn ra Phản ứng chỉ xảy ra khi hỗn hợp được đun nóng liên tục trong suốt quá trình.
Vì vậy, lựa chọn duy trì nhiệt độ đun cách thủy khi lắp thiết bị sinh hàn ở 80-90°C trong suốt quá trình phản ứng cho khảo sát tiếp theo
3.1.2.3 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi: acid
Trong tài liệu tham khảo [9], chưa có đánh giá về ảnh hưởng của việc thay đổi dung môi đến hiệu suất phản ứng Tài liệu [28] đã sử dụng ethanol 96% làm dung môi phản ứng, nhưng không có báo cáo nào về hiệu suất của quá trình Do đó, cần tiến hành khảo sát thêm về tỷ lệ dung môi tham gia phản ứng với tổng thể tích 70ml.
Bảng 3.4: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi: acid tới phản ứng
Kết quả từ bảng 3.4 cho thấy rằng với tỷ lệ 3:0:1, khi nồng độ HCl giảm từ 36,5% xuống 2%, thời gian phản ứng tăng lên Mặc dù hiệu suất phản ứng và nhiệt độ nóng chảy gần như ổn định, nồng độ HCl 36,5% có thể gây độc hại cho người sử dụng.
Vì thế, lựa chọn tỷ lệ dung môi ethanol 96%: acid = 3:1, nồng độ acid sử dụng là HCl 20% để thực hiện khảo sát phản ứng tiếp theo
3.1.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của xúc tác
Nhựa Dowex/H + đã được sử dụng hiệu quả làm xúc tác cho các phản ứng tạo ester, như tổng hợp monomethyl acid malic ester và acid citric dimetyl ester, với hiệu suất cao và tiết kiệm năng lượng Xúc tác này không chỉ mang lại năng suất tốt mà còn không độc hại và có khả năng tái sử dụng Do đó, cần nghiên cứu thêm về ảnh hưởng của nhựa Dowex/H + đến phản ứng thủy phân rutin để tạo ra quercetin.
Tiến hành khảo sát với các điều kiện sau:
Điều kiện 2: 1g nhựa Dowex/H + + 2ml HCl 20%
Bảng 3.5: Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của nhựa Dowex tới phản ứng
STT Xúc tác Dung môi
Phản ứng chưa xảy ra
+HCl EtOH 3h 0,71 71,7 308,6-312,7 3,9 Tủa vàng nhạt
3 HCl EtOH 3h 0,70g 70,7 308,0-312,0 4,0 Tủa vàng nhạt
Nhận xét: Từ bảng 3.5 ta thấy rằng
Khi sử dụng duy nhất nhựa Dowex đã được hoạt hóa H + trong dung môi EtOH thì phản ứng cũng không xảy ra
Khi sử dụng 2ml HCl, thời gian phản ứng của phản ứng có nhựa Dowex đã hoạt hóa H+ tương đương với thời gian phản ứng chỉ sử dụng HCl.
=> Kết luận: Nhựa Dowex đã hoạt hóa H + chưa cho thấy vai trò xúc tác của mình trong phản ứng thủy phân rutin tạo quercetin
3.1.2.5 Đánh giá hiệu quả việc tái sử dụng nước cái
Việc tái sử dụng nước cái trong quy trình công nghiệp đã được áp dụng, nhưng chưa có tài liệu nào đánh giá hiệu suất của phản ứng thủy phân rutin thành quercetin khi sử dụng nước cái Do đó, cần tiến hành khảo sát để đánh giá hiệu suất của quá trình này.
Để tiến hành phản ứng, cho 2g rutin vào bình cầu 250ml, thêm 45ml ethanol 96% và 15ml acid HCl 20%, sau đó đun cách thủy ở nhiệt độ 80-90°C và khuấy liên tục Khi phản ứng hoàn tất, thêm nước để tủa quercetin, lọc và rửa tủa đến khi nước rửa đạt độ trung tính Gộp phần nước cái và nước rửa đầu, sau đó bổ sung acid hydrochloric để đạt tỷ lệ dung môi với dung dịch acid HCl 20% là 3:1 Cuối cùng, tiến hành phản ứng lần 2 với 4g rutin, sử dụng 120ml dung môi cho lần này.
Bảng 3.6: Kết quả của việc tái sử dụng nước cái cho phản ứng phản ứng
STT Thời gian (h) m quercetin thô (g)
Lần 1 0,5h 0,88 88,9 307,0-310,8 3,8 Tủa màu vàng Lần 2 1h 1,92 96,9 307-310,5 3,5 Tủa màu vàng HCl
2h 0,90g 90,9 307,4-311,3 3,9 Tủa thu được màu vàng nhạt Nhận xét: Từ bảng 3.6 ta thấy, việc tái sử dụng nước cái là hiệu quả
Nước cái từ mẻ 1 được tái sử dụng cho mẻ 2, mặc dù thời gian có tăng do bổ sung nước, nhưng hiệu suất đạt 95% cao hơn so với 87% của mẻ 1, và nhiệt độ nóng chảy tương tự Việc này còn giúp giảm thời gian so với việc sử dụng HCl 5% với nồng độ tương đương, cho thấy rằng việc thu hồi nước cái để tái sử dụng là rất có ý nghĩa.
Tái sử dụng nước cái là một giải pháp hiệu quả, giúp tối ưu hóa chi phí trong sản xuất mà vẫn đảm bảo đạt được hiệu suất cao.
Khảo sát phương pháp tinh chế quercetin ở quy mô 2g/ mẻ
3.1.3.1 Khảo sát tỷ lệ dung môi
Trong tài liệu tham khảo [9], [12] đã mô tả quá trình tinh chế sử dụng dung môi EtOH, nhưng chưa có nghiên cứu nào về ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi - nước đến hiệu suất tinh chế Do đó, cần tiến hành khảo sát thêm để đánh giá tác động của tỷ lệ dung môi - nước đối với hiệu suất của quá trình này.
Để tiến hành, hòa tan 2g quercetin thô vào 60ml ethanol 96% trong bình cầu 100ml Đun nóng cho đến khi quercetin hoàn toàn tan Sau đó, lọc nóng để thu được dịch trong Tiếp theo, bổ sung nước và làm lạnh dịch lọc ở nhiệt độ -5°C trong 24 giờ.
Tủa xuất hiện được lọc, sấy khô ở 60°C trong 3h Đánh giá cảm quan, khối lượng, T°nc Kết quả được ghi trong bảng 3.7
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát quá trình tinh chế quercetin bằng EtOH-nước
STT EtOH- nước Cảm quan m
Tủa màu vàng giảm so với TC1
Tủa màu vàng giảm so với TC2
Tủa màu vàng giảm so với TC3
Tủa có màu vàng như TC4
Nhận xét: Từ bảng kết quả 3.7 ta thấy, khi giảm dần tỷ lệ dung môi: nước có ảnh hưởng đến quá trình tinh chế
Khi giảm tỷ lệ dung môi: nước, hiệu suất tinh chế tăng lên đáng kể Cụ thể, ở phương pháp 1, khi không bổ sung nước, lượng tủa thu được ít và hiệu suất chỉ đạt 14% Trong khi đó, ở phương pháp 2 với tỷ lệ dung môi: nước là 2,5:1, hiệu suất tăng gấp 4 lần, đạt 65%, mặc dù khoảng nóng chảy chỉ tăng không đáng kể Tuy nhiên, khi tỷ lệ dung môi: nước giảm xuống 0,5:1, hiệu suất chỉ tăng nhẹ lên 92,5% so với tỷ lệ 1:1 là 91%.
=> Lựa chọn tỷ lệ dung môi: nước – 1:1 để tiến hành khảo sát tinh chế tiếp theo
3.1.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến quá trình tinh chế
Trong nghiên cứu, quercetin đã được tinh chế bằng methanol và ethanol Tuy nhiên, do methanol là một dung môi độc hại, nên việc khảo sát sử dụng isopropanol (IPA) làm dung môi thay thế được tiến hành.
Bảng 3.8: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của dung môi đến quá trình tinh chế
STT Dung môi Cảm quan m (g) H
Theo bảng 3.8, việc sử dụng dung môi EtOH trong quá trình tinh chế mang lại hiệu suất cao 91%, vượt trội hơn so với dung môi IPA.
Vì vậy, lựa chọn dung môi EtOH làm dung môi cho quá trình tinh chế quercetin.
Quy trình bán tổng hợp và tinh chế quercetin từ rutin với quy mô 2g/mẻ
Dựa trên kết quả khảo sát, chúng tôi đề xuất quy trình bán tổng hợp và tinh chế quercetin với quy mô 2g/mẻ, sử dụng khối lượng rutin 2g và thể tích dung môi 70ml Tỷ lệ dung môi phản ứng được thiết lập là EtOH: acid = 3:1, cùng với xúc tác acid HCl 20%.
25 cách gia nhiệt: đun cách thủy ở 80-90°C và khuấy liên tục, tỷ lệ dung môi tinh chế: EtOH: nước – 1:1
Quy trình điều chế quercetin từ rutin theo sơ đồ sau:
Rutin thô Đun cách thủy
Dung dịch quercetin thô trong ethanol
EtOH: HCl 20% 3:1 Để nguội, rửa bằng nước đến hết acid
Nước cái tái sử dụng mẻ 2
Hòa tan trong ethanol Đun nóng, lọc nóng
Thêm nước (1:1) Để kết tinh qua đêm, lọc
Hình 3.2: Sơ đồ đề xuất điều chế quercetin từ rutin
Sơ đồ được miêu tả như sau:
Để thực hiện bán tổng hợp, cho 2g rutin vào bình cầu có dung tích 250ml Tiếp theo, thêm 70ml hỗn hợp ethanol và dung dịch acid HCl 20% theo tỷ lệ 3:1 Đun cách thủy ở nhiệt độ 80-90°C và khuấy liên tục trong 20 phút.
Lọc tủa và rửa bằng nước cho đến khi nước rửa có pH trung tính và phản ứng âm tính với thuốc thử Fehling Sau đó, sấy khô tủa để thu được quercetin thô.
Để tinh chế quercetin, cho quercetin thô vào bình cầu chứa ethanol 96% theo tỷ lệ 1:30 và đun nóng cho đến khi quercetin tan hoàn toàn Sau đó, lọc nóng để thu dịch trong và thêm đồng lượng nước để kết tinh qua đêm Cuối cùng, lọc tủa và sấy ở nhiệt độ 60°C trong 3 giờ để thu được quercetin tinh khiết.
Tiến hành quy trình trên với quy mô 3 mẻ chúng tôi thu được kết quả như sau:
Bảng 3.9: Kết quả khảo sát quy trình điều chế quercetin từ rutin
Khối lượng quercetin sau tinh chế (g)
Hiệu suất toàn quy trình (%)
Nhận xét: Quy trình cho hiệu suất cao và ổn định Sản phẩm có nhiệt độ nóng chảy đúng với tài liệu tham khảo [14].
Xác định cấu trúc và đánh giá một số đặc trưng của sản phẩm
Phổ hồng ngoại
Kết quả đo phổ khối lượng của sản phẩm được thể hiện ở phụ lục 1 và bảng 3.10
Bảng 3.10: Kết quả phân tích phổ IR của quercetin
Công thức cấu tạo Nhóm max (cm -1 )
Phân tích phổ đồ sản phẩm giúp xác định các dải hấp thụ đặc trưng của các nhóm chức, bao gồm nhóm –OH phenol, nhóm C=O, nhóm C=C trong nhân thơm, và nhóm C-O, phù hợp với công thức của sản phẩm.
Phổ khối lượng
Kết quả đo phổ khối lượng của sản phẩm được thể hiện ở phụ lục 2, phụ lục 3 và bảng 3.11 Chất phân tích được hòa tan trong dung môi là methanol
Bảng 3.11: Số liệu phân tích phổ khối lượng của quercetin
Công thức cấu tạo CTPT M m/z lý thuyết m/z thực tế
Nhận xét: Dựa vào số liệu phổ MS, sản phẩm cho thấy pic phân tử có khối lượng tương ứng với khối lượng phân tử dự kiến.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân ( 1 H-NMR)
Tiến hành ghi phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton Dung môi được sử dụng: DMSO Kết quả được thể hiện ở phụ lục 4, phụ lục 5 và bảng 3.12
Bảng 3.12: Kết quả phân tích phổ 1 H-NMR của quercetin
Công thức cấu tạo sản phẩm δ (ppm)
12,48 (1H, s, HO-C5) 10,76 (1H, s, HO-C7) 9,57 (1H, s, HO-C4’) 9,33 (1H, s, HO-C3) 9,28 (1H, s, HO-C3’) 7,68 (1H, d, J=1,8 Hz, H-2’) 7,54 (1H, dd, J 1 =2,4 Hz, J 2=8,4
Hz, H-6’) 6,88 (1H, d, J=8,4 Hz, H-5’) 6,41 (1H, d, J= 2,4 Hz, H-8) 6,19 (1H, d, J=1,8 Hz, H-6) Nhận xét: Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton cho thấy sản phẩm có cấu trúc như dự kiến.
Phổ cộng hưởng từ carbon ( 13 C-NMR)
Tiến hành ghi phổ cộng hưởng từ carbon 13 Dung môi được sử dụng là DMSO Kết quả được thể hiện ở phụ lục 6, phụ lục 7 và bảng 3.13 (xem trang sau)
Bảng 3.13: Kết quả phân tích phổ 13 C-NMR của quercetin
Công thức cấu tạo sản phẩm δ (ppm)
Nhận xét: Kết quả phân tích phổ 13 C-NMR cho thấy sản phẩm có cấu trúc đúng như dự kiến.
Phổ nhiễu xạ tia X
Tiến hành ghi phổ nhiễu xạ tia X Kết quả được thể hiện ở phụ lục 8 và bảng 3.14 sau:
Bảng 3.14: Kết quả phân tích phổ nhiễu xạ tia X của quercetin
Nhận xét: Trên phổ nhiễu xạ tia X xuất hiện các pic tương tự với tài liệu
Quét nhiệt lượng vi sai (DSC)
Tiến hành ghi phân tích quét nhiệt vi sai Kết quả được thể hiện ở phụ lục
9 Các đỉnh nhiệt nội cực đại ở 330°C tương tự với các pic trên tài liệu [38].
Xác định hàm lượng bằng HPLC
Hàm lượng quercetin trong mẫu được xác định bằng phương pháp HPLC theo tiêu chuẩn dược điển Mỹ, đạt 98,9% Kết quả phân tích không phát hiện rutin Thông tin chi tiết được trình bày ở phụ lục 10.
Bàn luận
Về quy trình điều chế quercetin từ rutin
3.3.1.1 Về phản ứng điều chế quercetin từ rutin Đề tài đã sử dụng phương pháp điều chế quercetin dựa trên cơ chế của phản ứng thủy phân trong môi trường acid, đi từ nguyên liệu là rutin, là một glycosid có phần aglycon là quercetin liên kết với nhóm –OH bán acetal của Glucose bằng liên kết O-Glycosid Sơ đồ phản ứng tổng quát [8]:
Phản ứng diễn ra theo cơ chế thế ái nhân đơn phân tử SN 1 Dựa trên tài liệu tham khảo [8] và [39], chúng tôi đã đề xuất cơ chế cho phản ứng này.
Hình 3.3: Cơ chế đề xuất của phản ứng thủy phân
Trong giai đoạn đầu, xúc tác H tấn công vào oxy ngoại vòng của liên kết glycosid, tạo ra acid liên hợp và nhanh chóng đạt trạng thái cân bằng Sau đó, acid liên hợp sẽ tách ra, thu được phần aglycon và carbocation.
Giai đoạn 2: H2O là tác nhân nucleophin yếu, cặp electron sẽ tấn công vào carbocation để tách H + ra, thu được phần đường
Nhiều yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng hóa học, bao gồm nồng độ acid thủy phân, loại dung môi, loại xúc tác và nhiệt độ Ngoài ra, việc tái sử dụng nước cái cũng có tác động đáng kể Do đó, nhóm nghiên cứu đã tiến hành khảo sát các yếu tố này nhằm xác định thông số tối ưu cho phản ứng.
Nồng độ acid HCl có ảnh hưởng lớn đến thời gian phản ứng và độ tinh khiết của sản phẩm Phản ứng diễn ra hiệu quả nhất ở các nồng độ HCl từ 5% đến 20% Nếu nồng độ thấp hơn, phản ứng sẽ chậm lại, trong khi nồng độ cao hơn có thể dẫn đến sự phân hủy của rutin và quercetin, ảnh hưởng tiêu cực đến chất lượng sản phẩm Sự gia tăng nồng độ H+ làm tăng tốc độ phản ứng, nhưng đến một mức độ nhất định, tốc độ này không còn tăng nữa do H+ làm giảm khả năng thế ái nhân.
Trong nghiên cứu, HCl 2% được chọn để thủy phân quercetin từ rutin, nhưng hiệu suất không đạt yêu cầu Do đó, chúng tôi đã quyết định sử dụng nồng độ HCl 20% để cải thiện phản ứng thủy phân.
Trong quá trình khảo sát ta nhận thấy rằng:
Khi không sử dụng nhiệt phản ứng không xảy ra
Khi ủ hỗn hợp phản ứng trong 12 giờ ở nhiệt độ phòng hoặc sử dụng dung môi và dụng cụ được làm nóng, phản ứng hầu như không diễn ra.
Khi đun cách thủy ở 80-90°C thì phản ứng mới xảy ra
Ủ bằng nước và sử dụng dụng cụ nóng, tủa thu được có ∆T hẹp
Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong việc tăng cường va chạm giữa các phân tử, từ đó thúc đẩy tốc độ phản ứng Ngoài ra, nhiệt độ còn cung cấp năng lượng cần thiết để hoạt hóa rutin thành carbocation Vì vậy, nếu không có nhiệt độ, phản ứng sẽ không diễn ra.
Trong quá trình phản ứng, rutin không hòa tan trong nước, ngay cả khi đun nóng Do đó, nghiên cứu đã chuyển sang sử dụng ethanol 96% làm dung môi chính Kết quả cho thấy tỷ lệ EtOH: acid = 3: 1 mang lại thời gian phản ứng ngắn nhất, giảm đáng kể so với việc chỉ sử dụng nước Khi giảm tỷ lệ ethanol, thời gian phản ứng cũng giảm theo.
Rutin có tính chất ít tan trong nước lạnh và nước sôi (1g/200ml), do đó, trong môi trường nước, rutin không tan ngay cả khi được đun nóng Điều này dẫn đến việc xúc tác H+ chỉ có thể phản ứng trên bề mặt ngoài của rutin Ngược lại, quercetin cũng không tan trong dung môi nước nóng và có khả năng tạo thành tủa bao quanh tinh thể rutin, làm cản trở quá trình tiếp xúc của rutin với xúc tác H+.
Việc sử dụng ethanol 96% làm dung môi trong quá trình phản ứng không chỉ tăng cường độ hòa tan của nguyên liệu rutin mà còn ngăn chặn hiện tượng tủa bao quanh nguyên liệu, từ đó hỗ trợ hiệu quả cho quá trình thủy phân.
Khảo sát cho thấy nồng độ acid HCl 5% trong ethanol 96% mang lại hiệu suất thô cao hơn so với acid HCl 5% trong nước Đây là một cải tiến quan trọng, giúp nâng cao hiệu suất và rút ngắn thời gian phản ứng trong quá trình thủy phân.
Trong ngành công nghiệp, tiết kiệm chi phí và đảm bảo an toàn trong các phản ứng quy mô lớn là rất quan trọng Nghiên cứu đã thử nghiệm sử dụng nhựa Dowex/H + làm xúc tác nhằm giảm chi phí và giảm tác động tiêu cực của acid hydrochloric đến con người và môi trường Tuy nhiên, hiệu suất khi sử dụng nhựa Dowex/H + kết hợp với HCl không khác biệt so với việc chỉ sử dụng HCl Do đó, nhựa Dowex không được lựa chọn cho phản ứng bán tổng hợp quercetin từ rutin.
Việc sử dụng nước cái từ mẻ 1 làm dung môi cho phản ứng ở mẻ 2 đã dẫn đến sự gia tăng hiệu suất từ 88,9% lên 96,9% Nguyên nhân chính là do nước cái đã bão hòa quercetin, giúp tránh mất sản phẩm trong quá trình bão hòa dung môi khi tái sử dụng Do đó, hiệu suất phản ứng ở mẻ 2 cao hơn so với mẻ 1.
3.3.1.2 Về kết tinh và tinh chế sản phẩm
Quercetin là một sản phẩm có khả năng tan kém trong nước nhưng tan tốt trong ethanol và isopropanol khi được đun nóng Do đó, phương pháp kết tinh quercetin trở nên đơn giản hơn bằng cách thêm nước và làm lạnh Tỷ lệ dung môi nước rất quan trọng trong quá trình này.
Về xác định một số đặc trưng của sản phẩm
Phân tích phổ hồng ngoại giúp xác định các dải hấp phụ đặc trưng liên quan đến dao động hóa trị và dao động biến dạng của các nhóm chức, cũng như các liên kết điển hình trong cấu trúc phân tử của chất được phân tích.
Phổ hồng ngoại của chất phân tích không hiển thị dải hấp thụ đặc trưng của nhóm C-O-C, mà chỉ ghi nhận dải hấp thụ với số sóng cực đại 3369 cm^-1, đặc trưng cho các nhóm –OH phenol, chứng minh rằng phản ứng đã diễn ra.
Các dải hấp thụ đặc trưng còn lại của quercetin đều xuất hiện trên phổ đồ:
1667 cm -1 (C=O), 1618 cm -1 ,1559 cm -1 ,1513 cm -1 (C=C nhân thơm) và 1243 cm -1 ,
1210 cm -1 , 1162 cm -1 , 1092 cm -1 (C-O) phù hợp với cấu trúc phân tử dự kiến của quercetin
Dữ liệu phổ khối (MS) giúp xác định khối lượng phân tử của các chất tổng hợp và số khối của các mảnh ion phân mảnh từ công thức cấu tạo Kết quả đo phổ cho thấy các đỉnh chính trên phổ thể hiện giá trị m/z gần giống với khối lượng phân tử của các chất cần phân tích.
Kết quả phân tích phổ khối lượng cho thấy pic phân tử có số khối phù hợp là m/z thực tế = 300,8 [M-H] - và 303,8 [M+H] +
Kết quả này phù hợp với khối lượng phân tử của quercetin (M02,24 đvC) ứng với công thức phân tử là C15H10O7
3.3.2.3 Về phổ cộng hưởng từ 1 H- NMR và 13 C- NMR
Dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) dùng để khẳng định chắc chắn cấu trúc của các chất
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR) cho phép xác định các dạng proton và số lượng proton của từng hợp chất Phương pháp này cung cấp thông tin quan trọng về cấu trúc hóa học của các chất, giúp nhận diện và phân tích các thành phần trong mẫu.
13C cho phép nhận biết các dạng carbon và số lượng carbon trong chất tạo thành
Trên phổ cộng hường từ hạt nhân của quercetin xuất hiện các tín hiệu đặc trưng cho các proton trong phân tử:
Tín hiệu doublet doublet với độ chuyển dịch hóa học từ 7,53 đến 7,55 ppm biểu thị cho một proton tại vị trí carbon 6’ Sự xuất hiện của tín hiệu này là do tương tác spin-spin ortho giữa H-6’ và H-5’, cùng với tương tác meta giữa H-6’ và H-2’, dẫn đến hình dạng tín hiệu dd.
Tín hiệu doublet có độ chuyển dịch hóa học là 7,68 ppm là tín hiệu thuộc 1 proton ở vị trí carbon 2’do tương tác meta giữa H-6’ và H-2’
Tín hiệu doublet ở 6,88 ppm là tín hiệu thuộc 1 proton ở vị trí carbon 5’ do tương tác ortho giữa H-6’ và H-5’
Tín hiệu doublet tại 6,41 ppm đại diện cho một proton ở vị trí carbon 8, trong khi tín hiệu doublet ở 6,19 ppm phản ánh một proton ở vị trí carbon 6 Sự xuất hiện của các tín hiệu này là do tương tác meta giữa H-6 và H-8.
Nhận thấy có tín hiệu s ở 9,33 ppm thuộc về 1 proton ở vị trí carbon số 3 tương ứng với vị trí H-3 trong TLTK, chứng tỏ phản ứng đã xảy ra
Phổ 13 C- NMR cho thấy 15 tín hiệu tương ứng với 15 carbon trong phân tử phù hợp với khung carbon của quercetin
Kết quả so sánh với TLTK [16] được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 3.15: Bảng so sánh kết quả 1 H- NMR và 13 C- NMR với TLTK
Thực tế TLTK Thực tế TLTK
7,57 (1H, dd, J2,23/ 6,28) 119,91 120,6 Phổ 1 H- NMR và 13 C- NMR cho các tín hiệu đặc trưng tương tự so với tài liệu [10], [16]
3.3.2.5 Về phổ nhiễu xạ tia X
Nhiễu xạ tia X xảy ra khi các chùm tia X tương tác với các mặt tinh thể của chất rắn, tạo ra các cực đại và cực tiểu do cấu trúc tinh thể có tính tuần hoàn Hiện tượng này là cơ sở quan trọng trong nghiên cứu cấu trúc vật liệu.
38 nhiễu xạ Phổ nhiễu xạ tia X cho phép nhận biết các đặc trưng của cấu trúc tinh thể
Phổ nhiễu xạ tia X cho thấy có các đỉnh cực đã nhiễu xạ tại vị trí 2theta bằng 9, 11, 12, 21, 26 tương tự như tài liệu [21], [38]
3.3.2.6 Về phân tích nhiệt quét vi sai DSC
Phân tích nhiệt quét vi sai giúp xác định các tính chất chuyển pha nhiệt của mẫu bằng cách đo dòng nhiệt tỏa ra hoặc thu vào từ mẫu khi được đốt nóng Quá trình này diễn ra trong dòng nhiệt với các tốc độ quét khác nhau, cho phép thu thập dữ liệu chi tiết về hành vi nhiệt của mẫu.
Kết quả phân tích nhiệt vi sai cho thấy các đỉnh nội nhiệt cực đại xuất hiện ở 330°C, tương đồng với tài liệu [38], khẳng định rằng chất được phân tích là quercetin.
Trên phổ, một đỉnh nội nhiệt cực đại ở 266°C cho thấy sự hiện diện của tạp chất rutin, được hình thành từ quá trình thủy phân một mạch đường Tuy nhiên, lượng tạp chất này là nhỏ, cho thấy phần lớn rutin đã được chuyển hóa thành quercetin.
Bàn luận chung
Quy trình của tác giả Phạm Công Hiếu có những ưu điểm nổi bật như sử dụng dung môi xanh là nước và nồng độ acid thấp, phù hợp cho quy mô pilot với độ tinh khiết đạt 98,5% Tuy nhiên, quy trình này còn tồn tại một số hạn chế, bao gồm hiệu suất thu được không cao (chỉ 33g quercetin tinh khiết từ 100g rutin thô), thời gian phản ứng kéo dài, và chưa được đánh giá đầy đủ về các chỉ tiêu khác như phổ DSC và PXRD, cũng như độ ổn định của quy trình.
Sau khi thực hiện các khảo sát, quy trình điều chế quercetin từ rutin đã được thiết lập với quy mô 2g/mẻ, đạt hiệu suất tinh chế 78,3%, cao hơn đáng kể so với tài liệu trước đó là 33% Quá trình này có khoảng nóng chảy tương đối hẹp, đồng thời thao tác và thiết bị sử dụng cũng khá đơn giản, với điều kiện phản ứng nhẹ nhàng và dễ kiểm soát.
Sản phẩm cuối cùng đã được xác nhận cấu trúc thông qua các phương pháp phân tích như phổ hồng ngoại (IR), phổ khối (MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR), phổ nhiễu xạ tia X (XRD) và phân tích quét nhiệt vi sai (DSC) Việc xác định cấu trúc này chủ yếu nhằm chứng minh các phản ứng hóa học đã diễn ra, trong đó mẫu được phân tích là quercetin.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT
Đề xuất
Khảo sát thêm một vài yếu tố ảnh hưởng đến thời gian và hiệu suất phản ứng như: nhiệt độ phản ứng và một vài xúc tác khác
Một số dẫn chất alkyl của quercetin cho thấy nhiều giá trị điều trị đáng chú ý Việc nghiên cứu sâu hơn về các dẫn chất này là cần thiết để tối ưu hóa lượng quercetin tổng hợp.
