Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzym a-glucosidase và a-amylase của loài dây thìa canh - Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Sm. và dây thìa canh lá to - Gymnema latifolium Wall. ex Wight

MỞ ĐẦU Tiểu đường là một nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa cacbohydrat, mỡ và protein khi hormone insulin của tuyến tụy bị thiếu hay giảm tác động trong cơ thể, biểu hiện bằng mức đường trong máu luôn cao. Trong giai đoạn mới phát bệnh bệnh nhân thường đi tiểu nhiều, tiểu ban đêm và do đó làm khát nước, về lâu dài gây phá hủy các hệ thống trên cơ thể, đặc biệt là các mạch máu và dây thần kinh. Theo thời gian, bệnh tiểu đường có thể dẫn đến mù, suy thận và tổn thương thần kinh. Tiểu đường cũng là một trong những yếu tố quan trọng thúc đẩy quá trình hình thành xơ vữa động mạch, dẫn đến đột quỵ, bệnh tim mạch. Các biến chứng mãn tính xảy ra sớm hay muộn, nặng hay nhẹ rất khác biệt ở từng bệnh nhân. Nhưng nói chung, nếu kiểm soát tốt đường huyết, chúng ta có thể ngăn ngừa hoặc làm chậm hay nhẹ đi các biến chứng mãn tính của bệnh tiểu đường [1]. Xu hướng sử dụng nguồn dược liệu tự nhiên nói chung, đặc biệt là các hợp chất thiên nhiên có nguồn gốc từ thực vật để chữa trị một số bệnh nhiệt đới và những bệnh hiểm nghèo đã và đang là mối quan tâm không chỉ của ngành dược ở nước ta mà còn của các nước trong khu vực cũng như các nước trên thế giới. Nhiều cây thuốc bản địa đã được phát hiện có tác dụng làm hạ đường huyết. Đây là một lợi thế vì khả năng cung cấp nguyên liệu để điều trị cũng như ít tác dụng phụ. Theo thống kê, trên thế giới có khoảng 800 loài được cho là có khả năng điều trị bệnh tiểu đường [2]. Tiêu biểu trong số đó là các loài: dây thìa canh (G. sylvestre), mướp đắng (Momordica charantia), cải bẹ xanh (Brassica Juncea), bồ công anh (Elephantopus scaber), cỏ tóc tiên (Liriope spicata), thầu dầu (Ricinus communis), khoai sâm (Smallanthus sonchifolius), trạch lan (Vernonia anthelmintica), … Các loài thuộc chi Gymnema thuộc họ Trúc đào (Apocynaceae) đã nhận được rất nhiều quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Các loài thuộc chi Gymnema được coi như là nguồn cung cấp các hoạt chất và thể hiện các hoạt tính sinh học (hạ đường huyết, kháng tế bào ung thư, chống oxi hóa, kháng viêm, …). Đặc biệt, loài G. sylvestre được sử dụng rộng rãi như là một loại thảo dược chuyên trị bệnh tiểu đường từ trên 2000 năm ở Ấn Độ. Loài này còn được dùng để điều trị hen suyễn, đau mắt, viêm và rắn cắn. Bên cạnh đó, G. sylvestre có tính kháng khuẩn và bảo vệ tế bào gan. Tuy nhiên ở Việt Nam chỉ mới có một vài nghiên cứu về thành phần hóa học và dược học của loài Gymnema sp. Xuất phát từ điểm đó,2 chúng tôi đề xuất đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính ức chế enzym α-glucosidase và α-amylase của loài dây thìa canh - Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br. ex Sm. và dây thìa canh lá to - Gymnema latifolium Wall. ex Wight”. Mục tiêu của luận án: Mục tiêu của luận án là xác định được thành phần hóa học chủ yếu của thân và lá của hai loài Gymnema sylvestre và Gymnema latifolium ở Việt Nam và đánh giá được tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase và α-amylase in vitro của các hợp chất phân lập được. Nội dung luận án bao gồm: 1. Phân lập các hợp chất từ thân và lá loài G. sylvestre và G. latifolium ở Việt Nam. 2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được bằng các phương pháp vật lý, hóa học. 3. Đánh giá tác dụng ức chế enzyme α-glucosidase và α-amylase của các hợp chất phân lập được từ loài G. sylvestre và G. latifolium.

TỔNG QUAN

Giới thiệu về chi Gymnema

1.1.1.Đặc điểm thực vật của chi Gymnema

Chi Gymnema (chi Lõa ti) thuộc họ Trúc đào (Apocynaceae), là cây leo không có rễ phụ trên thân Lá của cây mọc đối, không nạc, và hoa thường có cụm xim, tán hoặc chùm với kích thước nhỏ Đài hoa có thùy nhỏ hình trứng, trong khi tràng hoa hình bánh xe với thùy không gập trong nụ Chỉ nhị dính nhau, bao phấn có hai ô với phần phụ ở đỉnh, hạt phấn dính thành khối và có lớp sáp bao bên ngoài Đầu nhụy phình lên hình trứng, trong khi cột nhị-nhụy có hình ống nhọn đầu.

Hình 1.1 Hình ảnh một số loài thuộc chi Gymnema

Theo thống kê của hiệp hội các nhà thực vật học thế giới

Thư viện trực tuyến "The Plant List" cung cấp danh mục các loài thực vật học toàn cầu, trong đó chi Gymnema hiện có 52 loài được công nhận.

Bảng 1.1 Danh sách và nơi phân bố các loài thuộc chi Gymnema

TT Tên khoa học Phân bố TT Tên khoa học Phân bố

1 G acuminatum Wall Nepal, Ấn Độ,

2 G albidum Decne Timor 28 G.lushaiense M.A.Rahm an & Wilcock

3 G albiflorum Costantin Việt Nam 29 G macrothyrsa Warb Sulawesi

4 G brevifolium Benth Úc 30 G maingayi Hook.f Malacca

5 G calycinum Schltr Luzon 31 G mariae Schltr Philippin

6 G chalmersii Schltr New Guinea 32 G micradenium Benth Queenland

7 G cumingii Schltr Philippin 33 G molle Wall ex Wight Myanmar

(Thunb.) Kuntze Ấn Độ, Sri Lanka

9 G decaisneasum Tamil Nadu 35 G montanum var beddo mei Hook.f

10 G dissitiflorum Ridl Malaysia 36 G muelleri Benth Úc

Betche) P.I.Forst Úc 37 G pachyglossum Schltr Luzon

Arn Tamil Nadu 38 G piperii Schltr Mindanao

15 G glabrum Wight Myanmar 41 G rotundatum Thwaites Sri Lanka

16 G griffithii Craib Thái Lan, Việt

17 G hainanense Tsiang Trung Quốc 43 G schlechterianum Warb Philippin

18 G hirtum Ridl Malaysia 44 G spirei Costantin Lào

Trung Quốc, Ấn Độ, Đông Nam Á

20 G javanicum Koord Java 46 G sylvestre (Retz).R.Br ex Sm

Việt Nam, Trung Quốc, Ấn Độ

22 G kollimalayanum A.Ram ach & M.B.Viswan Ấn Độ 48 G thorelii Costantin Lào

24 G lactiferum (L.) R.Br ex Schult Ân Độ, Siriranka

26 G littorale Blume Java 52 G yunnanense Tsiang Trung Quốc

Theo danh lục các loài thực vật Việt Nam [2], chi Gymnema tại Việt Nam hiện có

8 loài là G albiflorum Cost, G alternifolium (Lour.) Merr., G foetidum Tsiang,

G griffithii Craib, G inodorum (Lour.) Decne, G latifolium Wall ex Wight, G reticulatum (Moon) Alston và G sylvestre (Retz) R Br Ex Schult

Bảng 1.2 Danh sách các loài thuộc chi Gymnema ở Việt Nam

TT Tên khoa học Tên thường dùng Phân bố

1 G albiflorum Cost Lõa ti hoa trắng Hà Tây

Lõa ti xen Ninh Thuận

3 G foetidum Tsiang Lõa ti thối Đắc Lắc, các tỉnh phía bắc

Decne Rau mỏ Bắc Kạn, Thái Nguyên,

Thìa canh lá to Hòa Bình, Ninh Bình,

Alston Lõa ti mạng, Dây thìa canh gân mạng

8 G sylvestre (Retz) R Br ex Sm Lõa ti rừng, Dây thìa canh, Dây muôi

Bắc Giang, Hải Phòng, Hải Dương, Ninh Bình, Thanh Hóa, Kon Tum 1.1.2 Giới thiệu về loài Gymnema sylvestre và Gymnema latifolium

Tên khoa học: Gymnema sylvestre (Retz) R Br ex Sm

Tên thường gọi: Dây thìa canh, Dây muôi

G sylvestre, hay còn gọi là Dây thìa canh hoặc Dây muôi, là một loại dây leo cao từ 6 đến 10 mét, có nhựa mủ màu vàng và thân có lông dài từ 8 đến 12 cm, đường kính khoảng 3 mm với lỗ bì thưa Lá của cây có hình bầu dục thon ngược, dài từ 6 đến 7 cm và rộng từ 2.5 đến 5 cm, đầu lá nhọn và có mũi, với 4-6 đôi gân bên rõ rệt ở mặt dưới và thường nhăn lại khi khô, cuống lá dài từ 5 đến 8 mm Hoa của G sylvestre nhỏ, màu vàng, xếp thành xim dạng tán ở nách lá, có kích thước cao 8 mm và rộng từ 12 đến 15 mm, với đài có lông mịn và rìa lông, trong khi tràng không có lông ở mặt ngoài và có 5 răng ở tràng phụ Quả của cây có chiều dài 5.5 cm, rộng ở nửa dưới, với hạt dẹt và lông mào dài 3 cm.

Sinh thái : mọc leo lên các bờ bụi, hàng rào

Cây thuốc này có công dụng trong y học cổ truyền, bao gồm việc điều trị tiểu đường và các vết thương do rắn cắn Ngoài ra, phần trên mặt đất của cây còn được sử dụng để chữa phong thấp, tê bại, cùng với các vết thương do dao và đạn Cây phân bố chủ yếu tại các tỉnh Bắc Giang, Hải Phòng, Hải Dương, Ninh Bình, Thanh Hóa và Kon Tum.

Tên khoa học: G latifolium Wall ex Wight

Tên thường gọi: Lõa ty lá rộng, Thìa canh lá to

G latifolium, hay còn gọi là Lõa ti lá rộng hoặc Thìa canh lá to, là một loài cây thân leo có chiều dài lên tới 6 m Thân cây có lỗ vỏ và nhánh phủ đầy lông tơ Cuống lá dài từ 1.5-4 cm, với lông dày đặc, gốc tròn và ngọn nhọn, có từ 6-7 cặp gân bên Cụm hoa xim dạng đầu thường xuất hiện thành từng đôi ở mấu, mang nhiều hoa thơm, với cuống cụm hoa dài từ 1-1.5 cm và cuống hoa từ 3-8 mm Đài hoa hình trứng, phủ lông măng, trong khi tràng hoa màu vàng, hình chuông, nhẵn ở mặt ngoài Ống hoa có 5 cặp gờ mang lông ở họng tràng, các thùy hình trứng, phủ lông dày đặc và ngắn hơn so với ống tràng.

Phân bố: Hòa Bình, Ninh Bình, Kon Tum

1.1.3.Tình hình nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Gymnema

Các loài thuộc chi Gymnema, đặc biệt là G sylvestre, đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới Các loài khác như G tingens, G griffithii, G montanum, G inodorum và G alternifolium vẫn chưa được nghiên cứu nhiều về hóa học Nghiên cứu cho thấy các hợp chất hóa học trong Gymnema bao gồm steroid, terpenoid, phenolic và flavonoid, với các hoạt tính nổi bật như hạ đường huyết, chống béo phì, kháng khuẩn, bảo vệ gan và chống oxy hóa.

Steroids are a distinctive group of compounds found in the Gymnema genus, primarily characterized by a pregnane framework These steroid compounds feature various sugar-like side chains, including cymarose (cym), 6-deoxy-3-oxymethylallopyranose (all), D-thevetopyranose (thv), oleandropyranose (ole), canaropyranose (can), and digitoxose (dig).

Bảng 1.3 Các hợp chất pregnane glycoside từ chi Gymnema

TT Tên chất Bộ phận Loài TLTK

Hình 1.2 Cấu trúc các hợp chất pregnane glycoside từ chi Gymnema

Triterpennoid là nhóm hợp chất chủ yếu và chiếm tỷ lệ lớn nhất trong chi Gymnema, bao gồm oleane saponin, cùng với các dẫn xuất từ khung damarane và lupane.

Các oleanane được phân lập từ chi Gymnema chủ yếu có nối đôi tại vị trí C-12, ngoại trừ hợp chất đặc biệt 3β,16β,23,28-tetrahydroxyolean-13(18)-ene Đặc biệt, các oleanane này chủ yếu được chiết xuất từ loài G sylvestre với 46 hợp chất và G alterifolium với 21 hợp chất.

Bảng 1.4 Các hợp chất triterpennoid khung oleanane từ chi Gymnema

TT Tên chất Bộ phận Loài TL

34 3β,16β,21β,28-Tetrahydroxyolean-12-ene Thân lá G sylvestre [9]

35 3β,16β,22α,28-Tetrahydroxyolean-12-ene Thân lá G sylvestre [9]

36 3β,23,28-Trihydroxyolean-12-ene Thân lá G sylvestre [9]

37 3β,16β,21β,23-Tetrahydroxyolean-12-ene Thân lá G sylvestre [9]

39 3β,16β,21α,23,28-Pentahydroxy olean-12- ene Thân lá G sylvestre [9]

40 3β,16β,23,28-Tetrahydroxy olean-13 (18)- ene Thân lá G sylvestre [9]

41 16β,23,28-Trihydroxyolean-12-en-3-one Thân lá G sylvestre [9]

12-en-3-one Thân lá G sylvestre [9]

45 3β,16β,23,28-Tetrahydroxyolean-12-ene Thân lá G sylvestre [11]

46 3β,16β,23,28-Tetraacetateolean-12-ene Thân lá G sylvestre [11]

47 3β,16β,21β,22α-Pentahydroxyolean-12- en-21-yl 2S-2-methylbutanoate Thân lá G sylvestre [11]

48 3β,16β,21β,22α-28-Acetyloxy-3,16,22,23- tetrahydroxyolean-12-en-21-yl-(2S)-2- methylbutanoate

(acetyloxy)olean-12-en-21-yl-(2S)-2- methylbutanoate

Pentahydroxyolean-12-en-21-yl-(2E)-2- methylbut-2-enoate

53 Gymnemic acid II Lá G sylvestre [13]

54 Gymnemic acid III Lá G sylvestre [13]

55 Gymnemic acid IV Lá G sylvestre [13]

57 Gymnemic acid VI Lá G sylvestre [14]

58 Gymnemic acid VII Lá G sylvestre [14]

59 Gymnemic acid VIII Lá G sylvestre [15]

60 Gymnemic acid XIX Lá G sylvestre [15]

62 Gymnemic acid XI Lá G sylvestre [15]

63 Gymnemic acid XII Lá G sylvestre [15]

64 Gymnemic acid XV Lá G sylvestre [16]

65 Gymnemic acid XVI Lá G sylvestre [16]

66 Gymnemic acid XVII Lá G sylvestre [16]

67 Gymnemic acid XVIII Lá G sylvestre [16]

Trihydroxy-olean-12-ene 3-O-β- D - xylopyranosyl-(1→6)-β-D- glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucuronic acid

81 Longispinogenin-3-O-β-D-glucuronic acid Lá G sylvestre [22]

83 3-O-β -D -glucopyranosyl-(1→6)-β -D - glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D- glucuropyranosyl ester

85 3-O-β -D -Xylopyranosyl-(1→6)-β -D - glucopyranosyl-(1→6)-β-D- glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β -D - glucopyranosyl ester

86 3-O-β-D-Glucopyranosyl-(1→6)-β-D- glucopyranosyl oleanolic acid 28-β -D - glucopyranosyl-(1→6)-β-D- glucopyranosyl ester

88 Muối kali của Longispinogenin-3-O-β-D- glucopyranosyl-(1→3)-β-D-glucuronic acid

89 Muối kali của 29- hydroxylongispinogenin-3-O-β -D - glucopyranosyl (1→3)-β-D-glucuronic acid

90 Muối natri của alternoside II Lá G sylvestre [23]

117 2α,3β-Dihydroxyolean-12-ene-23,28-dioic acid-3-O-β -D -glucopyranoside

23,28-dioic acid-3-O-β-D-glucopyranoside Lá G inodorum [27]

Hình 1.3 Cấu trúc các hợp chất khung oleanane từ chi Gymnema

Triterpennoid khung dammarane và lupane

Ngoài oleanane saponin, nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Gymnema còn phát hiện sự hiện diện của một số triterpenoid dạng dammarane saponin và lupane Các hợp chất này được tìm thấy chủ yếu ở loài G sylvestre.

Bảng 1.5 Các hợp chất khung dammarane và lupane từ chi Gymnema

TT Tên chất Bộ phận Loài TLTK

134 3β,16β,23,28-Tetrahydroxylup-20-ene Thân lá G sylvestre [9]

135 3β,16β,29-Trihydroxylup-20 (30)-ene Thân lá G sylvestre [9]

Hình 1.4 Cấu trúc các hợp chất khung dammarane và lupane từ chi Gymnema

(Các ký hiệu Glc, S 1 - S 7 như Hình 1.3) 1.1.3.3 Phenolic và các hợp chất khác

Chi Gymnema không chỉ chứa triterpenoid và steroid mà còn có một số hợp chất khác như phenolic, flavonoid, lignan và các hợp chất khác.

Bảng 1.6 Phenolic và một số hợp chất khác từ chi Gymnema

TT Tên chất Bộ phận

148 Dihydroxy gymnemic triacetat Lá G sylvestre [31]

152 (7′S,8S,8′R)-4,4′-Dihydroxy-3,3′,5,5- tetramethoxy-7′,9-epoxylignan-9′′-ol-7-one Thân G tingens [33]

Hình 1.5 Cấu trúc các phenolic và một số hợp chất khác từ chi Gymnema 1.1.4.Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học của chi Gymnema

1.1.4.1 Hoạt tính trị bệnh tiểu đường

Dịch chiết saponin từ loài G sylvestre, bao gồm các triterpene saponin gymnemic acid I-IV và gymnemasaponin V, đã được chứng minh có tác dụng hạ đường huyết Cụ thể, gymnemic acid IV (3,4/13,4 mg/kg) có khả năng giảm đường huyết từ 14-60% trong 6 giờ so với glibenclamide Hơn nữa, hợp chất này cũng làm tăng nồng độ insulin ở chuột bị tiểu đường khi sử dụng với liều 13,4 mg/kg.

Nghiên cứu về tác dụng hạ đường huyết của lá G sylvestre trên chuột Wistar với liều 200 mg/kg cho thấy dịch chiết từ loài này có khả năng giảm đáng kể mức đường huyết và lipid trong máu, được thể hiện qua các chỉ số cholesterol VLDL và LDL.

Hợp chất dihydroxy gymnemic triacetat (148), được phân lập từ lá loài G sylvestre, đã cho thấy tác động tích cực lên các thông số sinh hóa ở chuột mắc bệnh tiểu đường khi sử dụng liều 20 mg/kgP qua đường uống trong 45 ngày Các thông số được đánh giá bao gồm đường huyết, insulin, hemoglobin glycated (HbA1c), mô glycogen và các chỉ số lipid như triglycerid.

The study examined total cholesterol, LDL-cholesterol, HDL-cholesterol, and liver enzyme activities, including aspartate aminotransferase (AST), alanine aminotransferase (ALT), alkaline phosphatase (ALP), and acid phosphatase (ACP) Additionally, gymnemic acid derived from the leaves of G sylvestre significantly enhanced the regeneration of β-cells in the pancreas of diabetic mice.

Khái quát về bệnh tiểu đường

Tiểu đường là một nhóm bệnh rối loạn chuyển hóa carbohydrate, mỡ và protein do sự thiếu hụt hoặc giảm tác động của hormone insulin từ tuyến tụy, dẫn đến mức đường trong máu cao Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), vào năm 2019, bệnh tiểu đường được phân loại thành ba loại chính.

Tiểu đường tuýp 1, hay còn gọi là tiểu đường phụ thuộc insulin, là tình trạng mà cơ thể không sản xuất insulin Bệnh thường xuất hiện ở trẻ em và thanh thiếu niên Để duy trì sự sống, bệnh nhân tiểu đường tuýp 1 cần phải điều trị bằng insulin hàng ngày.

Tiểu đường tuýp 2 là một bệnh mạn tính phổ biến, chiếm hơn 90% số ca mắc bệnh, xảy ra khi tuyến tụy không sản xuất đủ insulin hoặc cơ thể không sử dụng insulin hiệu quả Bệnh thường gặp ở người trên 40 tuổi và có thể dẫn đến nhiều biến chứng nghiêm trọng như tăng huyết áp, đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim và đục thủy tinh thể, làm giảm tuổi thọ của người bệnh.

Tiểu đường thai kỳ là tình trạng rối loạn dung nạp glucose trong thời gian mang thai, dẫn đến tăng đường huyết ở thai nhi Tình trạng này có thể gây ra những nguy cơ nghiêm trọng như sảy thai, thai lưu và dị tật bẩm sinh.

Ngoài những loại tiểu đường phổ biến, còn tồn tại một số thể hiếm gặp như tiểu đường do gen đơn (MODY), tiểu đường do bệnh tụy ngoại tiết, rối loạn nội tiết, cũng như tiểu đường do thuốc hoặc hóa chất Bên cạnh đó, tiểu đường cũng có thể xuất phát từ các tình trạng tự miễn và liên quan đến các hội chứng di truyền.

Bệnh tiểu đường có thể gây ra nhiều biến chứng nguy hiểm, bao gồm hôn mê do tăng đường huyết, hạ đường huyết và tăng keto-axit máu Các biến chứng lâu dài như tổn thương thần kinh, tim mạch, thị giác và nguy cơ nhiễm trùng thường xảy ra do lượng đường trong máu cao kéo dài, dẫn đến tổn thương mạch máu nhỏ, gây mù mắt và suy thận, đồng thời làm tăng nguy cơ xơ vữa động mạch, dẫn đến tai biến mạch máu não và nhồi máu cơ tim Bệnh tiểu đường cũng ảnh hưởng xấu đến dây thần kinh, cơ tim, da, chân và răng lợi, với mức độ và thời gian xuất hiện biến chứng khác nhau ở từng bệnh nhân Để kiểm soát đường huyết và các biến chứng, bệnh nhân tiểu đường thường kết hợp chế độ ăn uống hợp lý với việc sử dụng thuốc, bao gồm thuốc tiêm và thuốc viên uống.

- Nhóm thuốc tiêm gồm insulin và amyrin [56]

Nhóm thuốc dùng đường uống bao gồm các dẫn xuất biguanide, sulfamide, ức chế enzyme α-glucosidase, meglitinide và thiazolidinedione Trong đó, thuốc ức chế enzyme α-glucosidase và α-amylase như acarbose và miglitol hoạt động bằng cách liên kết với các enzyme này, làm chậm quá trình thủy phân tinh bột và glycogen, từ đó giảm sự gia tăng glucose sau bữa ăn.

Tinh bột Sucrose Đường huyết tăng

Glucose Fructose Glucose Galactose α-amylase α-amylase α-glucosidase

Rối loạn tiết insulin Tăng tiết glucagon Đề kháng insulin ở các cơ quan

Tăng ly giải mô mỡ Giảm hiệu ứng incretin

Cơ thể ngưng/sản xuất ít insulin Ức chế

Hình 1.6 Ý nghĩa của việc ức chế enzyme α-glucosidase và enzyme α-amylase trong giảm đường huyết

Khái quát về vai trò của enzyme α-glucosidase và enzyme α-amylase

Trong cơ thể sống, quá trình trao đổi chất diễn ra liên tục và là yếu tố sống còn, vì khi ngừng lại, sự sống sẽ không còn Quá trình này bao gồm nhiều phản ứng hóa học phức tạp, có mối liên hệ chặt chẽ và điều chỉnh lẫn nhau Enzyme, một loại protein, đóng vai trò là chất xúc tác cho các phản ứng hóa học này, giúp chúng diễn ra một cách đặc hiệu và nhịp nhàng Enzyme có mặt trong hầu hết các tế bào của cơ thể sống và được gọi là chất xúc tác sinh học để phân biệt với các chất xúc tác hóa học.

Enzyme amylase, được biết đến với tên gọi hệ thống 1,4-α-D-glucan glucanohydrolase, là một loại enzyme phổ biến trong sinh vật Thuộc nhóm enzyme thủy phân, amylase xúc tác quá trình phân giải các liên kết nội phân tử trong polysaccharide thông qua sự tham gia của nước.

Amylase là enzyme quan trọng trong quá trình thủy phân tinh bột, glycogen và dextrin thành glucose, maltose và dextrin phân tử lượng thấp Enzyme này có mặt trong nước bọt (được gọi là ptyalin), dịch tiêu hóa của người và động vật, cũng như trong hạt nẩy mầm, nấm sợi, xạ khuẩn, nấm men và vi khuẩn Quá trình thủy phân tinh bột bắt đầu từ miệng nhờ ptyalin và được hoàn tất ở ruột non nhờ amylase từ tuyến tụy.

Có 6 loại enzyme được chia vào 2 nhóm: Endoamylase (enzyme nội bào) và exoamylase (enzyme ngoại bào)

+ Endoamylase gồm: α-amylase, pullulanase (hay α-dextrin 6-glucosidase), transglucosilase (hay oligo-1,6-glucosidase), amylo-1,6-glucosidase Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaacharide

+ Exoamylase gồm: β -amylase và γ-amylase Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide

Enzyme α-amylase là một enzyme nội bào có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside trong tinh bột và glycogen một cách ngẫu nhiên Nó còn được biết đến với các tên đồng nghĩa như glycogenase, endeamylase, clarase, và maxamyl Ngoài việc phân hủy hồ tinh bột, α-amylase cũng có thể phân hủy các hạt tinh bột nguyên vẹn, tuy nhiên với tốc độ chậm hơn.

Quá trình thủy phân tinh bột bởi enzyme α-amylase là quá trình đa giai đoạn:

+ Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin)

Trong giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa), các dextrin phân tử thấp tiếp tục bị thủy phân tạo ra tetra-trimaltose không màu với iode Chúng bị thủy phân chậm bởi α-amylase cho đến khi chuyển thành disaccharide và monosaccharide Dưới tác động của α-amylase, amylose phân giải nhanh chóng thành oligosaccharide với 6-7 gốc glucose.

+ Sau đó, các polyglucose này bị phân cách tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose colagen cứ ngắn dần và bị phân giải tới maltotetrose, maltotriose và maltose

Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose và dextrin phân tử thấp

Enzyme α-glucosidase, còn được gọi là maltase, transglucosidase, glucoinvertase, nitrophenyl α-D-glucosidase, glucosidosucrase, α-glucopyranosidase, α-D-glucosidase, α-glucosidase hydrolase và α-1,4-glucosidase, thuộc nhóm hydrolase, là những enzyme xúc tác cho các phản ứng thủy phân.

Enzyme α-glucosidase hoạt động theo cơ chế exohydrolysis, xúc tác phản ứng thủy phân liên kết α-1,4-glycoside để giải phóng các phân tử α-D-glucose Chất nền đặc trưng của enzyme này bao gồm disaccharide, oligosaccharide, cùng với các aryl- và akyl-α-glucopyranoside khác.

Enzyme α-glucosidase là một thành viên của lớp glycoside hydrolase, có khả năng phân tách các liên kết glycoside giữa các phân tử carbohydrate, một trong những liên kết mạnh nhất trong polymer tự nhiên Enzyme này có khả năng bẻ gãy liên kết glycoside nhanh hơn 10^17 lần so với phản ứng không có enzyme Khi thức ăn được hấp thụ, carbohydrate trong thức ăn sẽ được thủy phân thành các phân tử đường nhỏ hơn nhờ vào enzyme ở ruột non Quá trình này yêu cầu tụy tiết ra enzyme α-amylase để phá vỡ các phân tử carbohydrate lớn thành oligosaccharid, và enzyme α-glucosidase tại màng ruột non sẽ tiếp tục phân hóa oligosaccharid thành các phân tử đường nhỏ hơn để thẩm thấu vào máu.

THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

Đối tượng nghiên cứu

2.1.1.Loài Gymnema sylvestre (Retz.) R.Br ex Sm

Thân và lá của loài dây thìa canh (Gymnema sylvestre (Retz) R Br ex Sm.) được thu hái tại xã Hải Lộc, huyện Hải Hậu, Nam Định, Việt Nam vào tháng 11 năm 2015 Việc giám định tên khoa học được thực hiện bởi TS Nguyễn Thế Cường, thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật Mẫu tiêu bản NCCT-P20 hiện đang được lưu giữ tại Phòng Nghiên cứu cấu trúc, Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Hình 2.1 Dây thìa canh (G sylvestre)

2.1.2.Loài Gymnema latifolium Wall ex Wight

Thân và lá của loài lõa ty lá rộng, hay còn gọi là dây thìa canh lá to (G latifolium Wall ex Wight.), được thu hái tại Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc.

Vào tháng 4 năm 2017, TS Nguyễn Thế Cường từ Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật đã tiến hành giám định tên khoa học của mẫu tiêu bản NCCT-P76 Hiện tại, mẫu này được lưu trữ tại Phòng Nghiên cứu cấu trúc thuộc Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.

Hình 2.2 Dây thìa canh lá to (G latifolium)

Phương pháp nghiên cứu

2.2.1.Phương pháp phân lập các hợp chất

2.2.1.1 Sắc ký lớp mỏng (TLC)

Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60

F254 (0,25 mm, Merck) và RP-18 F254s (0,25 mm, Merck) được sử dụng để phát hiện chất bằng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm Thuốc thử sử dụng là dung dịch acid sulfuric 10%, được phun đều lên bản mỏng, sau đó sấy khô và hơ nóng từ từ cho đến khi xuất hiện màu.

Sắc ký cột sử dụng chất hấp phụ Silica gel với kích thước hạt từ 0,040 đến 0,063 mm (230 - 400 mesh) và pha đảo là RP-18 (30 - 50 µm, Fuji Silysia Chemical Ltd.) cùng với Diaion HP-20 (Mitsubishi Chemical Industries Co., Ltd.).

2.2.1.3 Sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Sắc ký lỏng hiệu năng cao được thực hiện trên máy AGILENT 1200, khoa Dược, trường đại học Yonsei, Hàn Quốc

2.2.2.Phương pháp xác định cấu trúc

Cấu trúc hóa học của các hợp chất được xác định thông qua việc sử dụng các phép đo thông số vật lý và phương pháp đo phổ hiện đại, kết hợp với phân tích và tra cứu tài liệu tham khảo Các phương pháp đo này đóng vai trò quan trọng trong việc nghiên cứu và hiểu biết về cấu trúc hóa học.

2.2.2.1 Phổ khối lượng phun mù điện tử phân giải cao (HR-ESI-MS)

Phổ khối lượng phun mù điện tử phân giải cao HR-ESI-MS đo trên máy Agilent 6530 Accurate-Mass Q-TOF LC/MS tại trường Đại học Yonsei, Hàn Quốc

2.2.2.2 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ NMR được thực hiện trên máy Varian 400 MHz tại Khoa Dược, Trường Đại học Yonsei, Hàn Quốc, với chất nội chuẩn TMS (Tetramethyl Silan) Các kỹ thuật phổ cộng hưởng từ hạt nhân được áp dụng trong nghiên cứu này bao gồm nhiều phương pháp khác nhau.

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều: 1 H NMR, 13 C NMR và DEPT

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân hai chiều: HSQC, HMBC, COSY và ROESY

Dung môi sử dụng trong quá trình này là CD3OD Lựa chọn dung môi phù hợp phụ thuộc vào đặc tính của từng mẫu, đảm bảo rằng dung môi phải có khả năng hòa tan hoàn toàn mẫu thử.

2.2.2.3 Độ quay cực Độ quay cực ([α]D) được đo trên máy JASCO P-2000 polarimeter của Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam

2.2.2.4 Phương pháp xác định đường

Thành phần hóa học chính của chi Gymnema chủ yếu là các saponin, với chuỗi đường từ 2-6 đơn vị monosaccarit Bên cạnh các đường quen thuộc như D-glucose và D-xylose, chi này còn chứa một lượng lớn các đơn vị giả đường, trong đó một số nhóm hydroxyl đã được chuyển hóa thành CH2 hoặc methyl hóa.

Việc xác định loại đường, chuỗi đường, cấu hình đường và vị trí gắn là rất quan trọng trong việc xây dựng cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập Trình tự xác định đường cần được thực hiện một cách chính xác để đảm bảo tính chính xác trong nghiên cứu.

 Nhận dạng loại đường bằng phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR

Nhận dạng đường đơn có thể thực hiện thông qua việc phân tích giá trị độ chuyển dịch hóa học của carbon và proton Đặc biệt, việc xác định cấu hình α/β của nhóm OH-hemiacetal được dựa vào hằng số tương tác của proton anome (J1-2) Hơn nữa, lập thể các vị trí trong từng phân tử đường cũng được xác định qua dạng tín hiệu và hằng số tương tác J của các proton trong từng phân tử.

- So sánh độ chuyển dịch hóa học δC của các đường thu được với các tài liệu tham khảo về chi và loài

Kiểm tra cấu trúc hóa học của từng phân tử đường đơn được thực hiện bằng phương pháp phổ HSQC kết hợp với phổ 1H-1H COSY, giúp nối mạch cacbon và gán chính xác các giá trị độ dịch chuyển hóa học của từng vị trí Phổ HMBC cũng đóng vai trò hỗ trợ trong quá trình này, cho phép xác định chuỗi đường và vị trí gắn thông qua phổ tương tác 2 chiều HMBC.

Tuy nhiên, với việc sử dụng phổ NMR, chúng ta chưa khẳng định được cấu hình D/L của từng phân tử đường

Để xác định cấu hình D và L của đường, trước tiên cần thủy phân và cắt đứt mạch đường thành các đường đơn Sau đó, các đường đơn được tinh chế bằng các phương pháp sắc ký kết hợp Tiến hành đo độ quay cực của từng đường đơn và so sánh kết quả với dữ liệu đã công bố để xác định cấu hình D/L.

Các hợp chất GS1-GS8 và GL1-GL5 (3,0 mg mỗi loại) được hòa tan trong 1 mL HCl 1,0 N (dioxane-H2O, 1:1, v/v) và được đun nóng ở 80°C trong 3 giờ Sau đó, hỗn hợp phản ứng được chiết xuất bằng CHCl3, và lớp nước còn lại được thổi khô bằng khí N2 để thu được cặn chiết nước (A).

A được tách bằng cột sắc ký silica gel, sử dụng dung môi CH2Cl2–MeOH (10:1, v/v), sau đó tiếp tục qua cột pha đảo với dung môi MeOH–H2O theo tỷ lệ phân cực tăng dần (6:4, 7:3 và 8:2, v/v) Kết quả thu được các đường đơn, sau đó đo độ quay cực riêng và so sánh với các giá trị chuẩn đã công bố.

Hợp chất GS1, GS3: D-cymarose, D-oleandrose, D-thevetose

Hợp chất GS2, GS4, GS7: D-cymarose, D-oleandrose, 6-deoxy-3-O-methyl-

Hợp chất GS5, GL1, GL2, GL3, GL4: D-cymarose, D-oleandrose, D- thevetose, D-glucose

Hợp chất GS6, GS8, GL5: D -cymarose, D- oleandrose, 6-deoxy-3-O-methyl-

Bảng 2.1 Giá trị độ quay cực riêng của các đường đơn sau thủy phân Đường đơn [α]D thực nghiệm [α]D tham khảo

2.2.3.Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học

2.2.3.1 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α -glucosidase

Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase được xác định thông qua phản ứng thủy phân 4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside (pNPG) thành glucose và p-nitrophenol, một hợp chất màu vàng, dưới tác động của enzyme α-glucosidase Khi mẫu thử có khả năng ức chế enzyme này, sự hình thành p-nitrophenol sẽ giảm, dẫn đến mật độ quang (OD) của p-nitrophenol so với mẫu đối chứng không bị ức chế cũng giảm theo Mật độ quang của p-nitrophenol sau phản ứng được đo ở bước sóng 405 nm, từ đó đánh giá được hoạt động ức chế enzyme của mẫu thử.

Cách tiến hành: Sử dụng phiến 96-giếng, trong mỗi giếng chứa mẫu nghiên cứu (20

L mẫu hòa tan trong DMSO), sau đó thêm enzyme α-glucosidase (40 L) và 120

L đệm phosphate buffe Sau 5 phút thêm 40 L 4-nitrophenyl-α- D -glucopyranoside

5 mM rồi ủ trong 30 phút ở 37 o C Đo độ hấp thụ quang OD ở bước sóng 405 nm

Kết quả được tính theo công thức sau:

ODc+: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng dương (không có mẫu thử, có α- glucosidase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 0%)

ODc-: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng âm (không có mẫu thử và α- glucosidase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 100%)

ODs: Mật độ quang trung bình của mẫu thử

ODb: Mật độ quang trung bình mẫu trắng (có mẫu thử, không có α-glucosidase) Nồng độ ức chế 50%, IC50 được xây dựng trên 5 nồng độ thử nghiệm

Giá trị IC50 được xác định theo phương pháp hồi quy tuyến tính trên phần mềm Graphpad Prism 8.0

2.2.3.2 Phương pháp đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α -amylase

Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase được xác định thông qua phản ứng thủy phân tinh bột khoai tây trong nước với sự có mặt của enzyme này Dung dịch tinh bột hòa tan, dưới tác động của enzyme α-amylase, sẽ tạo ra hỗn hợp phản ứng cho màu xanh khi tiếp xúc với i-ốt Để đánh giá hoạt tính ức chế enzyme, độ giảm màu được đo ở bước sóng 650 nm trong mẫu nghiên cứu.

Cách tiến hành: Đun sôi 100 mg tinh bột khoai tây trong 5 mL đệm phosphate trong

Sau khi làm nguội mẫu thử về nhiệt độ phòng trong 5 phút, trộn 20 µL mẫu thử với 50 µL tinh bột và 30 µL đệm phosphate 0,1 M Sau 5 phút, thêm 20 µL dung dịch α-amylase 5 mg/mL và ủ hỗn hợp ở 37°C trong 15 phút Kết thúc phản ứng bằng cách thêm 50 µL HCl 1 M và 50 µL dung dịch iốt Cuối cùng, đo độ hấp thụ quang của dung dịch ở bước sóng 650 nm và tính % ức chế.

- Kết quả được tính theo công thức sau:

ODc+: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng dương (không có mẫu thử, có α- amylase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 0%);

ODc-: Mật độ quang trung bình của mẫu chứng âm (không có mẫu thử và α-amylase; trường hợp này coi như giá trị ức chế 100%);

ODs: Mật độ quang trung bình của mẫu thử

ODb: Mật độ quang trung bình mẫu trắng (có mẫu thử, không có α-amylase)

Nồng độ ức chế 50%, IC50 được xây dựng trên 5 nồng độ thử nghiệm

Giá trị IC50 được xác định theo phương pháp hồi quy tuyến tính trên phần mềm Graphpad Prism 8.0

Phân lập các hợp chất

2.3.1.Các hợp chất phân lập từ loài G sylvestre

Thân và lá của loài Gymnema sylvestre được chế biến thành bột khô qua quá trình thái nhỏ, phơi khô và nghiền mịn, thu được 4,0 kg bột Bột này được ngâm chiết với methanol qua ba lần, mỗi lần 10 lít, bằng thiết bị chiết siêu âm trong 3 giờ Sau khi lọc và cất thu hồi dung môi, thu được 450,0 g cặn chiết methanol Cặn này được hòa vào 2 lít nước cất và chiết phân bố với n-hexane, dichloromethane và ethyl acetate, từ đó thu được các phân đoạn GSL1 (47,0 g), GSL2 (60,0 g), GSL3 (87 g) và GSL4 Phân đoạn GSL2 được sắc ký trên cột silica gel với dung môi n-hexane:acetone, tạo ra bảy phân đoạn GS2A-GS2G Tiếp theo, GS2F được sắc ký trên cột silica gel pha thường với CHCl3:MeOH, cho bốn phân đoạn nhỏ hơn GS2F1-GS2F4, trong đó GS2F1 được sắc ký trên cột RP-18 với dung môi MeOH:H2O, tạo ra năm phân đoạn GS2F1A-GS2F1E.

(17,0 mg, tR 38,5 phút), GS2 (9,0 mg, tR 42,1 phút) và GS7 (14,0 mg, tR 41,1 phút) thu được từ phần GS2F1B sử dụng hệ thống sắc lý lỏng hiệu năng cao (HPLC): cột

Hợp chất GS3 (5,0 mg, tR 44,7 phút) và GS4 (5,0 mg, tR 49,4 phút) được thu được từ phần GS2F1D trên cột J-sphere H-80 (150 × 20 mm) với dung môi acetonitrile 40% Phân đoạn GS2F1E được phân tách trên cột J-sphere H-80 (150 × 20 mm) sử dụng acetonitrile 35%, cho các hợp chất GS10 (5,0 mg, tR 37,8 phút) và GS12 (12,0 mg, tR 35,7 phút) Hợp chất GS11 (72,0 mg, tR 34,3 phút) được tinh chế từ phân đoạn GS2F1C bằng hệ thống HPLC trên cột J-sphere H-80 (150 × 20 mm) với dung môi acetonitrile 35% Phân đoạn GS2G được sắc ký trên cột RP-18 bằng hệ dung môi MeOH: H2O (4:1, v:v), tạo ra bốn phân đoạn nhỏ hơn, GS2G1-GS2G4 GS2G3 được tinh chế trên cột J-sphere H-80 (150 × 20 mm) với acetonitrile 35%, thu được hợp chất GS5 (14,0 mg, tR 39,7 phút) và GS9 (20,0 mg, tR 44,7 phút) Phân đoạn GS2G4 cũng được tinh chế trên cột J-sphere H-80 (150 × 20 mm) với acetonitrile 35%, cho hợp chất GS6 (30,0 mg, tR).

Lớp nước GSL4 được xử lý qua cột Diaion-HP20 với dung môi methanol và nước (25%, 50%, 100%) để thu được ba phân đoạn GS4A, GS4B và GS4C Phân đoạn GS4C tiếp tục được sắc ký trên cột silica gel với hệ dung môi CHCl3:MeOH, tạo ra bốn phân đoạn nhỏ hơn là GS4C1, GS4C2, GS4C3 và GS4C4 Tiếp theo, GS4C4 được sắc ký trên cột RP-18 với dung môi methanol:nước (2:1) cho năm phân đoạn GS4C4A, GS4C4B, GS4C4C, GS4C4D và GS4C4E Các hợp chất GS14 (5,0 g) và GS16 (40,0 mg) được thu nhận từ phân đoạn GS4C4B bằng hệ dung môi acetone:nước (0,8:1), trong khi GS13 (100,0 mg) và GS15 (5,0 mg) được tinh chế từ GS4C4E trên cột RP-18 với dung môi acetone:nước (1:1).

Gymnema sylvestre (thân và lá, 4,0 kg)

Chiết với methanol (3 lần, mỗi lần 10L trong 3h) Cặn methanol (450,0 g )

Bổ sung 2L nước và chiết phân lớp với các dung môi theo tỉ lệ 1:1

CH 2 Cl 2 n-hexane EtOAc Nước

GS4C4A GS4C4B GS4C4C GS4C4D GS4C4E

Silica gel c.c : sắc ký cột pha thường M : methanol

: săc ký lỏng hiệu năng cao

: săc ký cột pha đảo

: water : thời gian lưu (phút) t R 44,7 t R 31,5 t R 33,4

Hình 2.3 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài G sylvestre

2.3.2.Các hợp chất phân lập từ loài G latifolium

Thân và lá của loài G latifolium được thái nhỏ, phơi khô và nghiền mịn, thu được 4,0 kg bột khô Bột này được ngâm chiết bằng methanol (3 lần x 8 L) qua thiết bị chiết siêu âm ở 50 o C trong 3 giờ mỗi lần Sau khi gom các dịch chiết, chúng được lọc qua giấy lọc và cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, thu được 400 g cặn chiết methanol Cặn chiết này được hòa vào 2 lít nước cất và tiến hành chiết phân bố lần lượt với n-hexane, dichloromethane và ethyl acetate, sau đó loại bỏ dung môi bằng máy cô quay dưới áp suất giảm, thu được các phân đoạn n-hexane (GLL1, 50,0 g), CH2Cl2 (GLL2, 52,0 g), ethyl acetate (GLL3, 30,0 g) và lớp nước (GLL4).

Cặn chiết GLL2 được thực hiện qua quá trình sắc ký trên cột silica gel với dung môi gradient n-hexan:acetone (40:1, 20:1, 10:1, 5:1, 1:1 và 0:1, v:v), tạo ra sáu phân đoạn được ký hiệu từ GL2A đến GL2F Phân đoạn GL2D sau đó được sắc ký trên cột silica gel với dung môi chloroform:MeOH (11:1, v:v), cho ra bốn phân đoạn GL2D1-GL2D4 Tiếp theo, GL2D1 được sắc ký trên cột RP-18 với hệ dung môi methanol:nước (3:1, v:v), dẫn đến bốn phân đoạn nhỏ hơn, ký hiệu từ GL2D1A đến GL2D1D Hợp chất GL1 có trọng lượng 15,0 mg và thời gian lưu tR.

Trong nghiên cứu, các hợp chất được tách chiết bằng hệ thống sắc ký HPLC với cột J-sphere H-80 (150 x 20 mm) và dung môi 48% acetonitrile Phân đoạn GL2D1B cho ra kết quả tR 34,2 phút Hai hợp chất GL3 (13,3 mg, tR 39,1 phút) và GL5 (14,2 mg, tR 41,9 phút) được thu nhận từ GL2D1C cũng sử dụng dung môi 48% acetonitrile Phân đoạn GL2D3 được tách trên cột pha đảo với dung môi MeOH:H2O (4:1, v:v), tạo ra các phân đoạn GL2D3A, GL2D3B và GL2D3C Hợp chất GL4 (16,0 mg, tR 42,2 phút) được chiết xuất từ GL2D3A với điều kiện dung môi 48% acetonitrile Cuối cùng, phân đoạn GL2E được sắc ký trên cột RP-18 với dung môi MeOH.

H2O (3:1, v:v) được sử dụng cho bốn phân đoạn GL2E1 - GL2E4 Phân đoạn GL2E1 được phân tích bằng HPLC với điều kiện dung môi 48% acetonitrile cho hợp chất GL2 (17,0 mg, tR 53,6 phút) và GL6 (11,6 mg, tR 32,6 phút) Lớp nước GLL4 được xử lý qua cột Diaion-HP20, sử dụng hệ dung môi MeOH:H2O với tỷ lệ 25%, 50%, 75% và 100%, tạo ra bốn phân đoạn GL4A, GL4B, GL4C và GL4D Phân đoạn GL4C tiếp tục được sắc ký trên cột silica gel với dung môi gradient dichloromethane:methanol (20:1, 10:1, 5:1 và 0:1, v:v), cho ra bốn phân đoạn được ký hiệu từ GL4C1 đến GL4C4 Cuối cùng, phân đoạn GL4C4 được xử lý trên cột silica gel với dung môi chloroform:methanol:nước (4:1:0,1, v:v:v), cho ba phân đoạn GL4C4A, GL4C4B và GL4C4C.

GL4C4C được phân tách trên cột RP-18 bằng hệ dung môi acetone:nước (0,8:1, v:v), tạo ra ba phân đoạn GL4C4C1, GL4C4C2 và GL4C4C3 Hợp chất GL8 (20,3 mg, tR 54,0 phút) được tinh chế từ phân đoạn GL4C4C1 qua hệ thống HPLC: J-sphere, cột H-80 (150x20 mm) với dung môi 30% acetonitrile Hợp chất GL7 (12,5 mg, tR 39,1 phút) được tinh chế từ phân đoạn GL4C4C3 cũng qua hệ thống HPLC: J-sphere, cột H-80 (150x20 mm) với dung môi 35% acetonitrile.

Gymnema latifolium (thân và lá, 4,0 kg)

Chiết siêu âm với methanol (3 lần, mỗi lần 8L trong 3h) Cặn chiết methanol GLL, (400 g )

Bổ sung 2L nước và chiết phân lớp với các dung môi theo tỉ lệ 1:1

GL2A n-hexane dichloromethane ethyl acetate cặn nước t R 39,1 t R 41,9 t R 34,2 t R 42,2 t R 53,6 t R 32,8

Silica gel c,c : sắc ký cột pha thường M : methanol

: săc ký lỏng hiệu năng cao

: săc ký cột pha đảo

: water : thời gian lưu (phút) t R 54,0 t R 39,1 GL2E4

Hình 2.4 Sơ đồ phân lập các hợp chất từ loài G.latifolium

Thông số vật lý và dữ liệu phổ của các hợp chất đã phân lập được

2.4.1.Các thông số vật lí của các hợp chất phân lập được từ loài G sylvestre

2.4.1.1 Hợp chất GS1: gymsyloside A (hợp chất mới)

Chất bột vô định hình màu trắng Độ quay cực [  ] 2 5 D - 20,0 o (c 0,1, MeOH)

HR-ESI-MS: m/z 935,4986 [M+Na] + (tính toán lý thuyết [C47H76O17Na] + : 935,4975) Công thức phân tử: C47H76O17; M = 912

Số liệu phổ 1 H và 13 C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.1

2.4.1.2 Hợp chất GS2: gymsyloside B (hợp chất mới)

Chất bột vô định hình màu trắng Độ quay cực [  ] 2 5 D + 35,0 o (c 0,1, MeOH)

HR-ESI-MS tại m/z 935,4996 [M+Na] + , (tính toán lý thuyết [C47H76O17Na] + : 935,4975)

2.4.1.3 Hợp chất GS3: gymsyloside C (hợp chất mới)

HR-ESI-MS tại m/z 1079,5769 [M+Na] + , (tính toán lý thuyết [C54H88O20Na] + : 1079,5767)

2.4.1.4 Hợp chất GS4: gymsyloside D (hợp chất mới)

HR-ESI-MS tại m/z 1079,5778 [M+Na] + , tính toán lý thuyết [C54H88O20Na] + : 1079,5769)

2.4.1.5 Hợp chất GS5:gymsyloside E (hợp chất mới)

Chất bột vô định hình màu trắng Độ quay cực [  ] 2 5 D +54,0 o (c 0,1, MeOH)

HR-ESI-MS tại m/z 1097,5530 [M+Na] + (tính toán lý thuyết [C54H88O20Na] + : 1097,5503)

Số liệu phổ 1 H- và 13 C NMR (CD3OD): xem Bảng 3.5

2.4.1.6 Hợp chất GS6: gymnepregoside R (hợp chất mới)

2.4.1.7 Hợp chất GS7: gymnepregoside T (hợp chất mới)

HR-ESI-MS tại m/z 1037,5299 [M+Na] + , (tính toán lý thuyết cho công thức [C51H82O20Na] + : 1037,5292)

Chất bột vô định hình, màu trắng Độ quay cực [  ] 2 5 D + 30,5 (c 0,1, MeOH)

HR-ESI-MS tại m/z 997,5318[M+Na] + (tính toán lý thuyết cho công thức [C49H82O19Na] + : 997,5343)

HR-ESI-MS tại m/z 1127,5771[M+Na] + (tính toán lý thuyết [C58H88O20Na] + 1127,5761)

2.4.1.13 Hợp chất GS13:3β-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester

Chất bột vô định hình màu trắng Độ quay cực [  ] 2 5 D -8.0 o (c 0,1, MeOH)

HR-ESI-MS tại m/z 965,5094 [M+H] + (tính toán lý thuyết [C48H78O18H] + : 965,5080) Công thức phân tử: C48H78O18; M = 942

Số liệu phổ 1 H và 13 H NMR (CD3OD): xem Bảng 3.13

HR-ESI-MS tại m/z 967,5236 [M+Na] + , (tính toán lý thuyết cho công thức [C48H80O18Na] + : 967,5237)

2.4.1.15 Hợp chất GS15: 3β-O-β-D-xylopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl- (1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β-D-glucopyranosyl ester

HR-ESI-MS tại m/z 1097,5521 [M+H] + (tính toán lý thuyết [C53H86O22Na] + : 1097,5503)

2.4.1.16 Hợp chất GS16: alternoside XIX

2.4.2.Các thông số vật lí của các hợp chất phân lập được từ loài G latifolium

2.4.2.1 Hợp chất GL1: gymlatifoside A (hợp chất mới)

HR-ESI-MS tại m/z 1262,5528 [M + 35 Cl] - (tính toán lý thuyết [C63H89NO23 35Cl] - : 1262,5514)

Công thức phân tử: C63H89NO23; M = 1227

2.4.2.2 Hợp chất GL2: gymlatifoside B (hợp chất mới)

HR-ESI-MS tại m/z 1424,6061 [M + 35 Cl], 1426,6067 [M + 37 Cl] - , (tính toán lý thuyết [C69H99NO28 35Cl] - : 1424,6042, [C69H99NO28 37Cl] - : 1426,6013)

Công thức phân tử: C69H99NO28; M = 1389

2.4.2.3 Hợp chất GL3: gymlatifoside C (hợp chất mới)

Chất bột vô định hình màu trắng Độ quay cực [  ] 2 5 D 46,5 o (c 0,1, MeOH)

HR-ESI-MS tại m/z 1253,6050 [M + 35 Cl] - và 1255,5982 [M + 37 Cl] - (tính toán lý thuyết [C60H98O25 35Cl] - : 1253,6086, [C60H98O25 37Cl] - : 1255,6056)

2.4.2.4 Hợp chất GL4: gymlatifoside D (hợp chất mới)

HR-ESI-MS tại m/z 1171,5676 [M + 35 Cl] - và 1173,5676 [M + 37 Cl] - (tính toán lý thuyết [C55H92O24 35Cl] - : 1171,5667, [C55H92O24 37Cl] - : 1173,5638)

Chất bột vô định hình màu trắng Độ quay cực [  ] 2 5 D 22,0 o (c 0,1, MeOH)

Chất bột vô định hình màu trắng Độ quay cực [  ] 2 5 D -7,5° (c 0,1, MeOH)

2.4.2.7 Hợp chất GL7: 3-O-β-D- glucopyranosyl (1→6)-β-D- glucopyranosyl oleanolic acid 28-O-β- D -glucopyranosyl ester (xem hợp chất GS13)

2.4.2.8 Hợp chất GL8: 3-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl oleanolic acid-28-O-β-D-glucopyranosyl (1→6)-β-D-glucopyranosyl ester

Kết quả thử hoạt tính sinh học của các hợp chất phân lập được

2.5.1.Hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của các hợp chất

Tất cả các hợp chất phân lập được từ loài G sylvestre và G latifolium đã được thử hoạt tính in vitro ức chế enzyme α-glucosidase (

Acarbose, một loại thuốc điều trị tiểu đường phổ biến, đã được sử dụng làm chất đối chứng dương trong nghiên cứu này Kết quả đánh giá hoạt tính ức chế enzyme α-glucosidase của 23 hợp chất (GS1-GS16 và GL1-GL8) được trình bày trong bảng dưới đây Các chất sạch được thử nghiệm ở nồng độ 200 µM, trong khi cặn chiết và chất đối chứng acarbose được thử nghiệm ở nồng độ 500 µg/ml.

Các chất có khả năng ức chế trên 50% sẽ được tiếp tục thử nghiệm để xác định giá trị IC50 Hợp chất GS8 có giá trị IC50 là 173,8 ± 0,7 àM, trong khi đó, đối chứng dương acarbose có IC50 là 580,3 ± 0,5 àM.

Bảng 2.2 Hoạt tính ức chế α-glucosidase của các hợp chất từ G.sylvestre

Hợp chất % Ức chế Hợp chất % Ức chế

Bảng 2.3 Hoạt tính ức chế α-glucosidase của các hợp chất từ G latifolium

2.5.2.Hoạt tính ức chế enzyme α-amylase của các hợp chất

Tất cả các hợp chất được phân lập từ loài G sylvestre và G latifolium đã được thử nghiệm hoạt tính ức chế enzyme α-amylase in vitro Kết quả cho thấy 23 hợp chất ở nồng độ 200 µM có khả năng ức chế enzyme này, với acarbose được sử dụng làm chất đối chứng dương ở nồng độ 100 µg/ml Bảng 2.4 trình bày hoạt tính ức chế α-amylase của các hợp chất phân lập từ G sylvestre.

GS8 46,22 ± 0,75 Cặn MeOH 34,93 ± 2,44 GS9 5,44 ± 3,94 Acarbose 91,24 ±1,31

Các chất GS2, GS3 và GS4 với tỷ lệ ức chế trên 50% đã được tiến hành thử nghiệm để xác định giá trị IC50 Kết quả cho thấy giá trị IC50 của các hợp chất này lần lượt là 175,8 ± 2,3 μM, 162,2 ± 2,7 μM và 113,0 ± 0,7 μM, trong khi acarbose có giá trị IC50 là 72,4 ± 0,8 μM.

Bảng 2.5 Hoạt tính ức chế α-amylase của các hợp chất từ loài G latifolium

GL3 1,59 ± 1,46 Cặn MeOH 17,65 ± 0,21 GL4 21,32 ± 1,25 Acarbose 91,24 ±1,31

THẢO LUẬN KẾT QUẢ

D -glucopyranosyl ester

Định dạng
Số trang	240
Dung lượng	10,1 MB