TỔNG QUAN
Vị trí phân loại và đặc điểm thực vật của chi Commelina
Theo hệ thống phân loại Cronquist (hệ thống phân loại thực vật có hoa do Arthur Cronquist phát triển), [16] chi Commelina thuộc:
Chi Commelina L là chi lớn nhất trong họ Commelinaceae, với khoảng 205 đến 215 loài Đây là một trong sáu chi có sự phân bố rộng rãi toàn cầu và phức tạp nhất trong việc phân loại của họ này Chi Commelina L chủ yếu phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới.
Chi Commelina bao gồm nhiều loài nổi bật, trong đó có C benghalensis, phân bố ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của châu Á và châu Phi Một loài khác, Commelina erecta, thường gặp ở châu Mỹ, bao gồm cả khu vực ôn đới và nhiệt đới, cũng như tiểu vùng Sahara ở châu Phi và phía Nam bán đảo Ả Rập.
Commeline dielsii là loài thực vật độc nhất vô nhị, chỉ tồn tại tại một địa điểm duy nhất trên toàn cầu Loài này lần đầu tiên được phát hiện vào năm 1940 và cho đến nay vẫn chưa được tìm thấy ở bất kỳ nơi nào khác.
2 thấy ở Concepción del Uruguay, tỉnh Entre Ríos, vùng đông bắc Argentina. [21]
Các loài thuộc chi Commelina L là cây sống lâu năm hoặc hàng năm.
Rễ cây thường có hình dạng sợi, ít khi xuất hiện dưới dạng củ hoặc thân rễ Lá cây thường sắp xếp theo hai hàng hoặc theo kiểu xoắn ốc, có thể không có cuống hoặc có một cuống lá.
Cụm hoa mọc ở ngọn thân, mọc tại nách lá, trên cùng một mấu với lá.
Cụm hoa bao gồm một hoặc hai xim hoa hình đuôi bọ cạp, trong đó mỗi hoa mọc trên một trục hoa đơn lẻ Các trục hoa sắp xếp so le, tạo thành hình dạng giống như đuôi bọ cạp dọc theo trục chính của chùy hoa Xim hoa được bao bọc bởi một bao mo, là một chiếc lá biến đổi chứa đầy dịch nhầy.
Hoa có cấu trúc đối xứng hai bên (zygomorphic) và thường không có lá bắc, mặc dù đôi khi có thể thấy lá bắc nằm dưới cuống hoa Chi này bao gồm hoa lưỡng tính hoặc hoa đực, với ba lá đài không đồng đều, có thể mọc tự do hoặc hợp nhất Các cánh hoa cũng không đồng đều, với hai cánh hoa bên trên to hơn và quắp vào, trong khi cánh hoa bên dưới thường nhỏ hơn và có màu sắc khác biệt Hoa thường có màu xanh lam, nhưng cũng có thể xuất hiện với các màu sắc như tím nhạt, vàng, hoặc trắng.
Hoa có cấu trúc gồm ba nhị hữu thụ và ba nhị bất thụ, trong đó nhị bất thụ thường nằm phía sau và có bốn hoặc sáu thùy Nhị hữu thụ dài hơn và nằm ở phía trước, trong khi nhị hoa ở giữa có kích cỡ và hình dạng khác biệt Bầu nhụy của hoa có hai hoặc ba ô, mỗi ô chứa một hoặc hai noãn.
Quả nang thường có hai hoặc ba ô, và hiếm khi chỉ có một ô Chúng có hai hoặc ba mảnh vỏ, với mỗi ô chứa một hoặc hai hạt, hoặc thậm chí không có hạt nào Các hạt thường được xếp thành hàng với rốn hạt thẳng.
Theo y học cổ truyền, nhiều loài thuộc chi Commelina L có công dụng chữa bệnh, như viêm họng, cảm cúm và cảm lạnh C benghalensis được sử dụng để trị đau, táo bón, nhức đầu và bệnh phong, đồng thời còn hỗ trợ điều trị vô sinh ở phụ nữ tại nhiều vùng nhiệt đới châu Á Tại Ấn Độ, loài này được biết đến với khả năng giảm béo, nhuận tràng, làm mềm da, chống viêm và chống trầm cảm.
C coelestis được sử dụng để chữa tiêu chảy ở Mexico [28]
Tại Việt Nam, nhiều loài trong chi Commelina L được sử dụng làm thuốc chữa bệnh C benghalensis có tác dụng làm thuốc xổ, bảo vệ màng nhầy, hoạt nhuận và làm mát cơ thể Trong khi đó, C communis L được dùng làm thuốc lợi tiểu, điều trị phù thũng do suy tim, huyết áp cao, sốt, đau mắt và bệnh lậu.
Các nghiên cứu hiện đại cũng đã chứng minh được tác dụng của một số loài thuộc chi Commelina L Các chất chiết xuất ethanol từ rễ của loài
C.benghalensi cho thấy tác dụng giảm đau rất tốt với cơ chế tương tự cơ chế hoạt động của các NSAID khác Ngoài ra, loài này còn cho thấy khả năng chống viêm, kháng khuẩn, chống oxi hóa,… [33] C coelestis cho thấy hoạt tính chống tiêu chảy [28] Còn loài C appendiculata có tiềm năng giảm đau tốt [32]
Tổng quan về cây Thài lài trắng
Tên khoa học: Commelina diffusa Burm.F.
Synonyms: Commelina agraria Kunth (1843), Commelina aquatica J.K.Morton, Commelina longicaulis Jacq,…[42]
Tên tiếng Việt thường gọi: Thài lài trắng, Rau trai [9]
Commelina diffusa được mô tả lần đầu tiên vào năm 1768 bởi Burman.f.
C diffusa phân bố rộng rãi ở các vùng nhiệt đới của châu Mỹ, châu Phi, châu Á và Thái Bình Dương, cũng như tại các khu vực cận nhiệt đới phía nam của Hoa Kỳ, Nam Mỹ, Úc và các đảo Nam Á.
C diffusa là một loài cỏ dại ở vùng nhiệt đới và cả cận nhiệt đới, xuất hiện chủ yếu ở các môi trường sống thoáng và ẩm như các cánh đồng lúa Cây thường mọc ở các vùng đất canh tác, ven đồng ruộng, đồng cỏ ẩm ướt, ven đường và các khu vườn C.diffusa có thể chống chịu được những đợt lũ lụt tạm thời [22]
Tại Việt Nam, loài cây này thường phát triển ở những khu vực ẩm ướt như ven đồi, ven đường và đất ẩm Nó xuất hiện ở nhiều tỉnh thành trên cả nước, bao gồm Tam Đảo, Quảng Trị và Long An.
Hình 1.1: Hình ảnh về loài Thài lài trắng 1.2.2 Đặc điểm loài
Commeline diffusa là cây hàng năm ở vùng ôn đới nhưng trở thành cây lâu năm ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới Cây có thân bò lan rộng, phân nhánh và mọc rễ tại các mắt cây, với chiều dài có thể lên tới một mét Phiến lá có hình dạng đa dạng từ hình mác đến hình trứng, kích thước từ 3-12 cm x 0,8-3 cm, bề mặt lá có thể nhẵn hoặc có lông Lá không có cuống và bẹ lá có sọc màu đỏ, được phủ bởi các sợi lông tơ.
Hoa thường mọc thành xim hoa hình đuôi bọ cạp, với mỗi hoa phát triển trên một trục hoa đơn lẻ Các trục hoa này sắp xếp so le, tạo thành cụm giống như đuôi bọ cạp dọc theo trục chính của chùy hoa.
Xim hoa của cây có hai phần, với xim hoa thấp hơn mang từ hai đến bốn bông hoa, trong khi xim hoa phía trên có ít nhất một bông hoa Phần xim hoa trên chỉ chứa một bông hoa đực với cuống dài hơn so với xim hoa dưới có hoa lưỡng tính Mỗi cuống hoa chỉ phát triển một bông hoa, và quả của cây có kích thước từ 3 đến 5 mm.
Các lá đài mỏng manh, khó nhận thấy, dài từ 3-4 mm Cánh hoa chủ yếu có màu xanh, nhưng đôi khi xuất hiện màu tím nhạt Hai cánh hoa phía trên có kích thước từ 4,2-6 mm Phần liên kết giữa hai nửa bao phấn của nhị hoa trung tâm có dải ngang màu tím Bao mo thường mọc đơn độc trên cuống, có hình dáng từ lưỡi liềm đến hình trái tim hoặc đáy tròn, đỉnh nhọn Chúng có thể mịn hoặc có vân nhỏ, dài từ 0,8-2,5 cm, với chiều rộng thường là 0,4x1,2 cm, có thể lên đến 1,4 cm Cuống bao mo dài từ 0,5-2 cm, hiếm khi đạt 2,9 cm Thời gian ra hoa từ tháng 5 đến tháng 11.
Quả nang có cấu trúc gồm 3 ô và hai mảnh vỏ, chứa 5 hạt đen với vỏ hạt có mạng Kích thước quả dài từ 4-6,3 mm và rộng 3-4 mm, có thể hẹp đến 2,1 mm Hạt có chiều dài từ 2-2,8 mm, hiếm khi đạt đến 3,2 mm và rộng từ 1,4-1,8 mm.
Nghiên cứu bằng phương pháp sắc kí lớp mỏng cho thấy loài C diffusa chứa nhiều thành phần hóa học quan trọng như alcaloid, flavonoid, saponin, tanin, glycosid tim, anthraquinon, steroid và terpenoid Bên cạnh đó, thài lài cũng cung cấp hàm lượng dinh dưỡng cao với các vitamin như vitamin C, vitamin B3 và vitamin B2.
Năm 2014, Lê Xuân Đắc và cộng sự phát hiện khoảng 0,006% 20-hydroxyecdysone trong toàn thân loài C diffusa, mẫu thu hái tại khu vực dân cư thị trấn Tam Đảo và các xã vùng đệm của vườn quốc gia Tam Đảo Hàm lượng 20-hydroxyecdysone được xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) trên hệ thống Agilent 1200.
(Mĩ), cột Zorbax Eclipse XDB-C18 (5 μm, 4,6x150 mm), thành phần pha động: nước/axetonitrin là 80/20, tốc độ dòng là 1 ml/phút, bước sóng l = 242 nm, nhiệt độ cột 30°C [6]
Năm 2018, Ekeke và các cộng sự đã nghiên cứu mẫu cây C diffusa từ vườn thực vật đại học Port Harcourt, Nigeria, và phát hiện 38 flavonoid, 38 alcaloid, 40 phenolic acid và 18 glycosid thông qua phương pháp sắc kí lớp mỏng hiệu suất cao Trong số flavonoid, flavanon và flavon chiếm ưu thế, với rhoifolin có hàm lượng cao nhất (4,44g/100g) Các alcaloid chủ yếu là isoquinoline, trong đó psychotrin có hàm lượng cao nhất (6,97g/100g) Astringin acid là phenolic acid chiếm tỉ lệ cao nhất (8,023g/100g), trong khi captopril acid là glycosid được tìm thấy nhiều nhất (15,705g/100g).
Năm 2019, Samir M Hamad và các cộng sự đã phát hiện ra 7-hydroxy-4´-methoxy-isoflavon (2) từ dịch chiết lá cây C diffusa Dịch chiết flavonoid được xác định thông qua các phương pháp quang phổ UV-Vis, H NMR và các kỹ thuật C NMR.
Vào năm 2019, các nhà khoa học đã phát hiện ra nhiều hợp chất quan trọng trong loài C diffusa, bao gồm alcaloid, phenolic, tannin, steroid, flavonoid, protein và phyosteriod Từ chồi cây, họ đã xác định được 21 hợp chất, trong đó những hợp chất có tác dụng sinh học nổi bật.
- 2-Methoxy-4-vinylphenol (3): kháng khuẩn, chống oxy hóa và viêm
- 3,7,11,15-Tetramethyl-2 hexadecen-1-ol (4): kháng khuẩn, chống viêm
- Phytol (5): Chống viêm, chống oxi hóa, lợi tiểu
- Methyl stearate (6): chống tiêu chảy, gây độc tế bào và chống tăng sinh
- 9,12,15- Octadecatrienoic acid, methyl ester, (Z,Z,Z)- (7): Chống viêm, giảm cholesterol máu, hỗ trợ điều trị ung thư
- Octadecanoic acid (8): Sử dụng trong mĩ phẩm, điều hương [29]
Năm 2019, các nhà khoa học đã tiến hành nghiên cứu để chứng minh giá trị thực phẩm của cây C diffusa, qua đó phát hiện chiết xuất từ loài cây này chứa 6,32% carbohydrat.
Vitamin C (44,80 mg/100g ), Vitamin B3 (63,18mg/100g) và Vitamin B2 7
(8,30 mg/100g) Hàm lượng chất khoáng từ chiết xuất lá gồm Na (69,32mg/100g), Ca (232,00mg/100g) và Mg (84,28mg/100g) [27]
Hình 1.2: Cấu trúc hóa học một số chất được tìm thấy ở loài C diffusa 1.2.4 Tác dụng sinh học
Nghiên cứu cho thấy chiết xuất từ loài Commelina diffusa có khả năng kháng khuẩn và kháng nấm hiệu quả Bên cạnh đó, loài cây này còn được chứng minh có tác dụng chống oxi hóa, ức chế thần kinh, bảo vệ gan và giúp ổn định đường huyết.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Thài lài trắng được thu hái vào tháng 12 năm 2020 tại phường Tây Mỗ, quận Nam Từ Liêm, Hà Nội Mẫu cây tươi này đã được làm tiêu bản đầy đủ bộ phận sinh sản và được bảo quản, lưu giữ tại Trường Đại học Y Dược, Đại học quốc gia Hà Nội với số hiệu tiêu bản UMP-092021.
2.1.2 Hóa chất, trang thiết bị
- Hóa chất dùng trong tẩy nhuộm vi phẫu: javen, acid acetic, xanh methylen, glycerin, nước cất
- Các dung môi dùng để chiết xuất và phân lập: ethanol (EtOH), ethyl acetat (EtOAc), aceton (Ac), cloroform (CHCl3), benzen, n-hexan, methanol (MeOH), dicloromethan (DCM),
- Các hóa chất dùng để định tính: FeCl3, dung dịch NaOH, H2SO4, HCl, phenonphtalein, fehling …
- Pha tĩnh dùng trong sắc ký cột là silicagel pha thường cỡ hạt
0,063 - 0,200 mm (Merck), (0,040 - 0,063 mm, Merck) Bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) (silicagel, 0,25 mm) và bản mỏng pha đảo
Các hóa chất đạt tiêu chuẩn phân tích.
- Kính hiển vi có gắn camera tại Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
- Sắc ký cột: sắc ký cột sử dụng silicagel cỡ hạt 0,063 - 0,200 mm (Merck) và cỡ hạt 0,040 - 0,063 mm (Merck) với các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân: NMR được ghi trên máy Bruker Avance
500 MHz tại Viện Hóa học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
- Phổ khối ESI-MS: đo trên máy AGILENT 1260 Series LC-MS ion Trap (Agilent Technologies, Hoa Kỳ).
- Nhiệt độ nóng chảy: đo trên máy SMP10 BioCote, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
- Góc quay cực riêng: đo trên máy PLR-4, MRC scientific instruments, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội.
- Dụng cụ thí nghiệm: Pipet, ống nghiệm, bình nón, bình chiết…
Nội dung nghiên cứu
2.2.1 Nghiên cứu đặc điểm thực vật
Mẫu cây Thài lài trắng được thu hái và xử lý sơ bộ, sau đó tiến hành phân tích để mô tả các đặc điểm hình thái đặc trưng của loài Đồng thời, việc giám định tên khoa học cũng được thực hiện để xác định chính xác danh tính của cây.
- Nghiên cứu, mô tả đặc điểm bột và vi phẫu thân, lá của cây Thài lài trắng.
2.2.2 Nghiên cứu thành phần hóa học
- Định tính các nhóm chất trong cây Thài lài trắng bằng các phản ứng hóa học.
- Chiết xuất, phân lập và nhận dạng cấu trúc hợp chất có trong cây Thài lài trắng.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Xử lí và bảo quản mẫu
Mẫu dược liệu gồm dược liệu tươi và dược liệu đã phơi khô sau khi thu hái Dược liệu được bảo quản như sau:
Mẫu dược liệu cắt làm vi phẫu cần phải là mẫu tươi và được tiến hành ngay sau khi lấy Nếu không thể thực hiện ngay, cần bảo quản mẫu trong hỗn hợp cồn và nước theo tỷ lệ 1:1.
Mẫu dược liệu dùng để soi bột được sấy khô, nghiền thành bột, bảo quản trong lọ có nút kín, có ghi nhãn và để nơi khô ráo.
Mẫu dược liệu cần được sấy ở nhiệt độ dưới 50 độ C trong tủ sấy, sau đó bảo quản trong túi ni lông kín, đặt ở nơi khô ráo và tránh ánh sáng mặt trời để đảm bảo chất lượng cho các quá trình định tính, chiết xuất, phân lập và nhận dạng cấu trúc hóa học.
2.3.2 Nghiên cứu đặc điểm hình thái
- Phân tích hình thái thực vật: mô tả đặc điểm hình thái theo phương pháp mô tả phân tích.
- Làm tiêu bản mẫu khô theo phương pháp làm tiêu bản cây khô.
Giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu được thực hiện bằng cách đối chiếu các đặc điểm mô tả với những thông tin thực vật đã được công bố trong tài liệu về loài Commelina diffusa Burm.F.
2.3.3 Nghiên cứu đặc điểm vi học
Nghiên cứu đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu được thực hiện theo tài liệu [5, 7, 8] Cụ thể, mẫu sau khi thu hái sẽ được xử lý bằng phương pháp phù hợp trước khi tiến hành nghiên cứu.
- Chọn mẫu có kích thước lá và thân thích hợp.
Để tạo tiêu bản vi phẫu, cần cắt ngang đoạn thân thứ tư tính từ đầu cành đối với tiêu bản vi phẫu thân Đối với tiêu bản vi phẫu lá, vị trí cắt nên nằm khoảng 1/4 đến 1/3 từ dưới gần gốc của lá trưởng thành.
- Xử lý lát cắt: chọn những lát cắt mỏng đem nhuộm và làm tiêu bản vi phẫu theo quy trình chuẩn [8]
Tại Bộ môn Dược liệu - Dược học cổ truyền, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội, chúng tôi thực hiện việc quan sát và mô tả các đặc điểm vi phẫu, đồng thời chụp ảnh bằng kính hiển vi có gắn camera để ghi lại những hình ảnh chi tiết và rõ nét.
2.3.3.2 Đặc điểm bột dược liệu
- Mẫu nghiên cứu được sấy khô, nghiền thành bột.
- Quan sát trực tiếp, nếm, ngửi, xác định màu, mùi, vị.
Làm tiêu bản bột dược liệu bằng phương pháp giọt ép, sau đó quan sát và mô tả những đặc điểm điển hình của bột dưới kính hiển vi có gắn camera Các hình ảnh đặc điểm của bột sẽ được chuyển vào máy tính để phân tích.
2.3.4 Định tính các nhóm chất hữu cơ
Chiết xuất bằng các dung môi có độ phân cực khác nhau như nước, ethanol và n-hexan giúp thu được dịch chiết, từ đó tiến hành định tính sơ bộ một số nhóm chất hữu cơ.
14 trong dược liệu bằng các phản ứng hóa học thích hợp, theo quy trình chuẩn ghi trong tài liệu [1, 7]
2.3.5 Phương pháp chiết xuất, phân lập và nhận dạng cấu trúc
2.3.5.1 Phương pháp chiết xuất và phân lập hợp chất
Mẫu thân và lá cây C diffusa (1,0 kg) được ngâm chiết bằng dung môi EtOH 70% qua ba lần, mỗi lần sử dụng 6 L, với thiết bị chiết siêu âm ở nhiệt độ 40 o C trong 30 phút Sau đó, dịch chiết EtOH được lọc qua giấy lọc, gộp lại và cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được 80 g cao chiết tổng ethanol.
Lấy 60 g cao chiết phân tán trong nước cất (400 mL) và chiết phân đoạn bằng n-hexan và EtOAc (mỗi dung môi 3 lần, mỗi lần 500 mL) Các dịch chiết n-hexan, EtOAc được cất loại dung môi dưới áp suất giảm để thu được phân đoạn tương ứng n-hexan (20,8 g) và ethyl acetat (24,9 g).
Xử lý và phân lập hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat chủ yếu thông qua phương pháp sắc ký cột, trong khi các phân đoạn được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng.
Sắc ký cột được thực hiện bằng cách sử dụng chất hấp phụ là silicagel, bao gồm cả pha thường và pha đảo Để đạt hiệu quả tối ưu, cần lựa chọn hệ dung môi có độ phân cực tăng dần Silicagel pha thường có cỡ hạt từ 0,063 - 0,200 mm và 0,040 - 0,063 mm, được cung cấp bởi Merck, phù hợp với các loại cột sắc ký có kích cỡ khác nhau.
Sắc ký lớp mỏng: thực hiện trên bản mỏng nhôm tráng sẵn silicagel 60G
Bản mỏng F254 (Merck) với độ dày 0,2 mm và RP-18 F254 với độ dày 0,25 mm đã được sử dụng trong quá trình sắc ký Sau khi thực hiện sắc ký, bản mỏng được kiểm tra bằng đèn tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm Tiếp theo, bản mỏng được phun dung dịch H2SO4 10% trong ethanol và được đốt nóng trên bếp điện từ để hoàn thiện quá trình phân tích.
2.3.5.2 Phương pháp xác định cấu trúc của hợp chất
Xác định cấu trúc các hợp chất phân lập qua 2 bước chính:
Bước đầu tiên là đo nhiệt độ nóng chảy và thực hiện các phân tích phổ khối (ESI-MS) cùng với phổ cộng hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT) để thiết lập bộ dữ liệu cho chất phân lập.
Bước 2: So sánh dữ liệu các chất thiết lập đó với dữ liệu các chất đã công bố.
KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
Kết quả nghiên cứu đặc điểm thực vật của cây Thài lài trắng
3.1.1 Mô tả đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu
Cây bò lan là loại cây thảo sống lâu năm, có thân hình trụ mịn màng, màu xanh lá với các sọc đỏ dọc theo thân Thân cây dài từ 2-10 cm và có rễ sợi dài, màu trắng ngà đến nâu nhạt, đường kính từ 0,2-0,4 cm Lá cây mọc so le, không có cuống, với bẹ lá dài 0,8-1,7 cm có sọc đỏ và được bao phủ bởi các sợi lông tơ Phiến lá nguyên, hình mác hoặc hình elip, thường tròn hơn ở phần gần cuống, có kích thước 3-
10 cm x 1-3 cm Bề mặt lá hầu như không có lông, gân hình cung.
Hoa nở vào buổi sáng và nhanh chóng tàn sau vài giờ đồng hồ.
Hoa thường mọc thành từng xim ở nách lá, với cuống dài từ 0,5-2 cm, màu xanh nhạt và không có lông Mỗi xim hoa có lá bắc hình lưỡi liềm hoặc hình trái tim, rộng 0,9-2 cm và dài 1,2-1,8 cm, màu xanh nhạt hơn so với lá bình thường Cuống hoa hình trụ, màu trắng đến xanh lá nhạt, nhẵn Đài hoa có 3 phần, hình lòng thuyền, rộng 0,2-0,3 cm và dài 0,3-0,5 cm, màu trắng nhạt hoặc phớt xanh lam Tràng hoa cũng có 3 phần, hình hoa hồng, dài 0,6-1 cm và rộng 0,2-0,4 cm, màu xanh lam Nhị hoa có 6 phần, xếp thành 2 vòng; 3 nhị vòng ngoài bất thụ và 3 nhị hữu thụ có kích thước khác nhau Nhụy hoa có bầu hình elip thuôn, dài 0,2-0,3 cm và vòi nhụy hình sợi dài 0,6-0,9 cm, màu xanh lam Quả nang có 3 ô, kích thước dài từ 0,6-0,8 cm x 0,2-0,4 cm.
Hình 3.1: Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng
Chú thích: 1.Toàn cây; 2 Bẹ lá; 3.Thân cây; 4 Mặt sau của lá;
5 Mặt trước của lá; 6 Rễ cây
Hình 3.2: Đặc điểm cơ quan sinh sản
Chú thích: 1 Cụm hoa; 2 Hoa nguyên vẹn nhìn từ trên xuống;
3 Hoa nguyên vẹn nhìn từ dưới lên; 4 Đài; 5 Tràng; 6 Nhụy; 7 Quả;
8 Nhị bất thụ; 9 Nhị hữu thụ; 10 Bộ nhị
3.1.2 Đặc điểm vi phẫu thân
Hình 3.3: Đặc điểm vi phẫu thân
Chú thích: 1 Biểu bì; 2 Mô nâng đỡ; 3 Mô mềm vỏ; 4 Nội bì;
5 Trụ bì; 6 Libe sơ cấp; 7 Gỗ sơ cấp; 8 Mô mềm ruột
Vi phẫu thân có tiết diện tròn, cấu tạo gồm có hai phần là vỏ và trụ giữa.
Phần vỏ của thực vật chiếm 1/6 tiết diện, bao gồm lớp biểu bì được cấu tạo từ một hàng tế bào hình đa giác xếp sát nhau, với vách ngoài được hóa cutin.
Mô nâng đỡ bao gồm 1-2 hàng tế bào nằm sát ngay dưới biểu bì, trong khi mô mềm được cấu tạo từ các tế bào hình đa giác, sắp xếp lộn xộn và có kích thước lớn hơn mô nâng đỡ.
20 bì (4) gồm một lớp tế bào hình đa giác, vách dày lên hình chữ U, phần vách dày lên bắt màu xanh.
Phần trụ giữa của thân cây bao gồm trụ bì, với 1-2 lớp tế bào hình đa giác, nhỏ hơn tế bào nội bì và có vách dày bắt màu xanh Các bó libe-gỗ phân bố rải rác trong mô mềm ruột, tập trung chủ yếu gần trụ bì và trung tâm của vi phẫu thân, với các bó ở phía tâm có kích thước lớn hơn so với phía ngoài Mỗi bó này bao gồm gỗ sơ cấp.
Gỗ sơ cấp (7) được xếp thành hai bó bên ngoài libe sơ cấp (6), với các tế bào hình tròn, vách dày hóa gỗ, bắt màu xanh và kích thước giảm dần từ tâm ra vỏ Libe sơ cấp (6) chứa những tế bào nhỏ, bắt màu hồng, nằm giữa hai bó gỗ Mô mềm ruột (8) bao gồm các tế bào hình đa giác lớn, sắp xếp lộn xộn và có nhiều khoảng gian bào.
3.1.3 Đặc điểm vi phẫu lá
Hình 3.4: Đặc điểm vi phẫu lá
Chú thích: 1 Biểu bì trên; 2 Mô mềm trên; 3 Gỗ; 4 Libe; 5 Mô mềm dưới;
6 Mô nâng đỡ; 7 Biểu bì dưới; 8 Lông che chở; 9 Khí khổng;
Vi phẫu lá có cấu trúc đối xứng hai bên với tiết diện lõm xuống ở gân giữa Biểu bì trên gồm một hàng tế bào hình đa giác, xếp sát nhau và có vách ngoài hóa cutin, kèm theo lông che chở đa bào Mô mềm trên bao gồm 2-3 lớp tế bào lớn, sắp xếp lộn xộn với nhiều khoảng gian bào Bó libe gỗ nằm gần giữa, với libe ở phía ngoài gồm các tế bào đa giác nhỏ bắt màu hồng, trong khi gỗ gồm vài tế bào hình tròn, vách dày hóa gỗ bắt màu xanh Biểu bì dưới cũng có cấu trúc tương tự như biểu bì trên Phần phiến lá chứa khí khổng, và mô nâng đỡ dưới gồm một lớp tế bào dày, bắt màu hồng, chuẩn bị hóa mô cứng để nâng đỡ cây Mô mềm nằm phía trong mô nâng đỡ, có kích thước lớn và sắp xếp lộn xộn, trong khi tinh thể canxi oxalat xuất hiện nhiều ở mô mềm với kích thước không đều.
3.1.4 Đặc điểm bột dược liệu
Bột dược liệu có màu xanh, soi dưới kính hiển vi thấy có những đặc điểm sau: Mảnh mạch vạch (1), lông che chở (2), mảnh mô mềm (3), tinh bột
(4), tinh thể canxi oxalat (5), khí khổng (6)
Hình 3.5: Đặc điểm bột dược liệu
Chú thích: 1 Mảnh mạch vạch; 2 Lông che chở; 3 Mảnh mô mềm;
4 Tinh bột; 5 Tinh thể canxi oxalat; 6 Khí khổng
Kết quả nghiên cứu về hóa học
3.2.1 Định tính thành phần hóa học
Để kiểm tra phản ứng tạo bọt, cho 5 ml nước cất và 0,1 g bột dược liệu vào ống nghiệm, lắc mạnh trong 5 phút và để yên trong 15 phút Nếu bọt vẫn còn bền vững sau thời gian này, kết quả sẽ được coi là dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
Kết luận: Mẫu nghiên cứu không có saponin.
Ngâm 10g bột dược liệu trong 100ml nước trong 24 giờ, sau đó lọc lấy dịch chiết và loại bỏ tạp chất bằng chì acetat 30% cho đến khi không còn tủa đục Tiến hành lắng và lọc dịch vào bình gạn, lắc kỹ 3 lần với 25ml cloroform.
Để thực hiện quy trình chiết xuất, đầu tiên cần chuẩn bị 5ml dung dịch, sau đó lắng và gạn lấy dịch chiết Tiếp theo, lọc dịch qua bông để loại bỏ nước Chia đều dịch chiết vào 4 ống nghiệm đã được sấy khô và tiến hành cô cách thủy cho đến khi khô hoàn toàn Sản phẩm thu được sẽ được sử dụng cho các phản ứng tiếp theo.
Cho 1ml anhydrid acetic vào ống nghiệm 1, lắc đều Nghiêng ống 45 0 , cho từ từ theo thành ống 1ml H2SO4 đặc Quan sát nếu thấy mặt tiếp xúc giữa
2 lớp xuất hiện vòng màu đỏ tím thì dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
Thêm 0,5ml ethanol 90% vào ống nghiệm 2 và lắc đều Nhỏ từng giọt thuốc thử Baljet, gồm 1 phần dung dịch acid picric 1% và 9 phần dung dịch NaOH 10% Nếu xuất hiện màu đỏ cam, kết quả là dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính (-).
Thêm 0,5ml ethanol 90% vào ống nghiệm 3 và lắc đều cho tan hết Nhỏ 1 giọt dung dịch natri nitroprussiat 0,5% cùng với 2 giọt dung dịch NaOH 10%, lắc đều; nếu xuất hiện màu đỏ cam, kết quả là dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính(-).
Hòa tan cắn còn lại trong 0,5ml ethanol 90% và thêm vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% pha trong acid acetic, sau đó lắc đều Nghiêng ống nghiệm 45 độ và từ từ cho 0,5ml acid H2SO4 đặc vào thành ống, tránh xáo trộn chất lỏng Phản ứng dương tính sẽ xuất hiện khi giữa hai lớp chất lỏng có vòng màu đỏ.
Kết quả: Phản ứng âm tính(-).
Kết luận: Mẫu nghiên cứu không có glycosid tim.
Phản ứng Borntraeger: Đun sôi dược liệu trong 10ml H2SO4 1N Để nguội, lọc qua giấy lọc, dịch lọc thu được cho vào bình gạn Chiết bằng 10ml
24 cloroform, gạn lấy lớp cloroform vào ống nghiệm, cô bớt dung môi còn khoảng 1ml, thêm 1ml NaOH 10%, lắc nhẹ, xuất hiện màu đỏ sim thì dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính (-).
Kết luận: Mẫu nghiên cứu không có anthranoid.
3.2.1.4 Định tính flavonoid Đun cách thủy 0,5 g bột dược liệu trong 5 ml ethanol 90%, lọc nóng lấy dịch lọc đem làm phản ứng:
Trong một ống nghiệm, cho 1 ml dịch chiết và thêm khoảng 10 mg bột Mg Nhỏ từ 3 đến 5 giọt HCl đậm đặc vào ống nghiệm Để yên trong vài phút, dung dịch sẽ chuyển màu từ vàng sang đỏ, cho thấy phản ứng dương tính.
Kết quả: Phản ứng dương tính.
Để kiểm tra phản ứng với hơi amoniac, nhỏ một giọt dịch chiết lên tờ giấy lọc và sấy khô Sau đó, hơ tờ giấy trên miệng lọ chứa amoniac đặc Nếu tờ giấy chuyển sang màu vàng đậm so với mẫu chỉ nhỏ giọt dịch chiết, thì kết quả là dương tính.
Khi cho dung dịch NaOH 10% vào ống nghiệm chứa 1ml dịch chiết, tủa vàng xuất hiện Thêm 1ml nước cất vào, tủa sẽ tan và màu vàng của dung dịch tăng lên, cho thấy kết quả dương tính.
Kết quả: Phản ứng dương tính.
Thêm vài giọt FeCl3 5% vào ống nghiệm chứa 1ml dịch chiết, dung dịch màu xanh đen - phản ứng dương tính.
Kết quả: Phản ứng dương tính.
Kết luận: Mẫu nghiên cứu có flavonoid.
Dịch lọc chuẩn bị như phần định tính flavonoid dùng làm các phản ứng:
- Phản ứng mở đóng vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm mỗi ống 1ml dịch chiết:
+ Ống 2: để nguyên. Đun cả hai ống nghiệm đến sôi, để nguội rồi quan sát:
+ Ống 1 không xuất hiện tủa vàng.
+Ống 2 dung dịch vẫn trong.
Thêm mỗi ống 1ml nước cất:
Thêm vài giọt HCl đặc, ống 1 trở về giống ống 2 thì dương tính.
Kết quả: Phản ứng dương tính.
- Phản ứng với thuốc thử diazo
Để kiểm tra tính dương tính, cho 1ml dịch chiết vào ống nghiệm, sau đó thêm 2ml NaOH 10% Đun cách thủy cho đến khi sôi, rồi để nguội Tiếp theo, thêm vài giọt thuốc thử diazo; nếu xuất hiện tủa màu đỏ gạch, kết quả là dương tính.
Kết quả: Phản ứng dương tính.
Kết luận: Mẫu nghiên cứu có coumarin.
3.2.1.6 Định tính tanin Đun sôi 1 g bột dược liệu với 10 ml nước cất, để nguội, lọc Cho vào mỗi ống 1 ml dịch lọc:
- Ống 1: thêm 1 giọt FeCl3 5%, xuất hiện tủa màu xanh đen.
- Ống 2: thêm 2 giọt đồng acetat 10%, xuất hiện tủa.
- Ống 3: thêm 2 giọt chì acetat 10%, xuất hiện tủa bông.
- Ống 4: thêm 5 giọt gelatin 1%, xuất hiện tủa bông trắng
Kết quả: Phản ứng dương tính.
Kết luận: Mẫu nghiên cứu có chứa tanin.
Ngâm 1g dược liệu trong 15 ml dung dịch H2SO4 1N Đun đến sôi, để nguội Lọc dịch lọc vào bình gạn dung tích 100 ml.
Để kiềm hóa dịch lọc, sử dụng dung dịch amoniac 6N cho đến khi đạt pH 9-10 Tiến hành chiết alcaloid base bằng cloroform qua ba lần, mỗi lần 5 ml Gộp các dịch chiết cloroform lại, sau đó loại bỏ nước bằng natrisulfat khan Tiếp theo, lắc dịch chiết với H2SO4 1N hai lần, mỗi lần 5 ml Cuối cùng, gộp các dịch chiết nước và chia đều mỗi ống 1 ml để thực hiện các phản ứng tiếp theo.
-Ống 1: nhỏ 2 -3 giọt TT Mayer, tủa màu trắng là dương tính.
-Ống 2: nhỏ 2 - 3 giọt TT Bouchardat, tủa màu nâu là dương tính.
-Ống 3: nhỏ 2 - 3 giọt TT Dragendorff, tủa màu da cam là dương tính.
Kết quả: Phản ứng dương tính.
Kết luận: Mẫu nghiên cứu có alcaloid.
3.2.1.8 Định tính đường khử, polysaccharid, acid hữu cơ Đun sôi 2g bột dược liệu với 20ml nước cất, trong 2 phút Để nguội, lọc. Dịch lọc dùng làm phản ứng sau:
Để định tính đường khử, thêm 5 giọt thuốc thử Fehling A và 5 giọt thuốc thử Fehling B vào ống nghiệm chứa 2 ml dịch lọc Đun cách thủy trong 10 phút; nếu thấy kết tủa đỏ gạch xuất hiện, kết quả là dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
+ Ống 1: 4ml dịch chiết và 5 giọt TT Lugol.
+ Ống 2: 4ml nước cất và 5 giọt TT Lugol
Quan sát: ống 1 màu xanh đậm hơn ống 2, phản ứng dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
-Định tính acid hữu cơ: Thêm một ít bột Na2CO3 vào ống nghiệm chứa 4ml dịch chiết, phản ứng dương tính khi có bọt khí bay lên.
Kết quả: Phản ứng dương tính.
Kết luận: Mẫu nghiên cứu có acid hữu cơ, không có đường khử, polysaccharid.
3.2.1.9 Định tính chất béo, sterol, caroten
Ngâm 10 g bột dược liệu trong n-hexan để qua đêm Lọc, thu lấy dịch lọc để làm phản ứng:
-Định tính chất béo: nhỏ 2 giọt dịch chiết lên giấy lọc Hơ nóng bay hơi hết dung môi, nếu còn vết mờ trên giấy lọc thì dương tính.
Kết quả: Phản ứng dương tính.
Để định tính sterol, trước tiên cô cách thủy dung môi cho đến cắn Sau đó, thêm 1 ml anhydrid acetic vào ống nghiệm và lắc kỹ Nghiêng ống nghiệm 45 độ, nhỏ từ từ 3 giọt acid sulfuric đặc theo thành ống nghiệm Nếu thấy mặt phân cách xuất hiện vòng tím đỏ và lớp chất lỏng phía trên có màu xanh lá, kết quả là dương tính.
Kết quả: Phản ứng âm tính.
-Định tính caroten: Cô cách thủy bốc hơi dung môi đến cắn Thêm 2 giọt H2SO4 đặc vào cắn Dung dịch có màu xanh đậm thì dương tính.
Kết quả: Phản ứng dương tính.
Kết luận: Mẫu nghiên cứu có caroten, chất béo; không có sterol.
Kết quả thực nghiệm chỉ ra rằng cây Thài lài trắng chứa nhiều nhóm chất quan trọng như flavonoid, tannin, alcaloid, coumarin, caroten, chất béo và acid hữu cơ, với các kết quả định tính được trình bày trong bảng 3.1.
Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ bằng phương pháp hóa học của loài Commelina diffusa
Chú thích: (-) âm tính, (+) dương tính (+++) dương tính rất rõ
3.2.2 Chiết xuất và phân lập hợp chất
3.2.2.1 Chiết xuất phân đoạn từ cây Thài lài trắng
Mẫu thân và lá cây C diffusa (1,0 kg) được ngâm chiết bằng dung môi EtOH 70% qua 3 lần, mỗi lần 6 L, sử dụng thiết bị chiết siêu âm ở 40 o C trong 30 phút Sau đó, dịch chiết EtOH được lọc qua giấy lọc, gộp dịch lọc và cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thu được 80 g cao chiết tổng ethanol.
Bàn luận
Trong nghiên cứu này, mẫu thực nghiệm được thực hiện với cây Thài lài trắng (Commelina diffusa Burm.F.), được thu hái từ Tây Mỗ, quận Nam Từ Liêm, thành phố Hà Nội.
Nghiên cứu này đã mô tả chi tiết đặc điểm thực vật của loài Commelina diffusa Burm.F, bao gồm các nét đặc trưng của thân, lá và hoa với hình ảnh rõ ràng, dễ quan sát Điều này khác biệt so với các nghiên cứu trước đây chỉ miêu tả bằng lời và hình vẽ Ngoài ra, nghiên cứu còn xác định tên khoa học của mẫu nghiên cứu.
Commelina diffusa Burm.F Kết quả đạt được trên đây sẽ giúp ích cho việc phân biệt loài Commelina diffusa Burm.F với các loài khác trong chi
Commeline L là nền tảng cho nghiên cứu sâu hơn, đóng góp vào việc xây dựng và hoàn thiện tiêu chuẩn cho chuyên luận về dược liệu này trong Dược điển Việt Nam.
Commelina diffusa Burm.F sở hữu những đặc điểm thực vật độc đáo, bao gồm tràng hoa màu xanh, khác biệt so với tràng hoa màu vàng của loài C dielsii Lá của loài này có màu xanh, không giống như lá của loài C catharinensi với đường màu tím chạy dọc mép Ngoài ra, Commelina diffusa có rễ sợi, khác với rễ củ của loài C tuberosa.
Nghiên cứu đã tiến hành phân tích vi phẫu và soi bột toàn cây, cho thấy các đặc điểm vi học của cây Thài lài trắng mang đặc trưng của họ Commelinaceae Vi phẫu của thân và lá có độ mỏng thích hợp, cho phép quan sát rõ ràng các lớp tế bào dưới kính hiển vi Hình ảnh cấu tạo vi học rất sắc nét với nhiều mức phóng đại khác nhau, có thể sử dụng làm tư liệu cho việc tiêu chuẩn hóa và kiểm nghiệm mẫu cây.
Việc phân tích các mẫu Thài lài trắng trên thị trường không chỉ giúp phân biệt và so sánh mà còn ngăn chặn tình trạng dược liệu giả mạo Phương pháp định tính các nhóm chất hữu cơ là một cách tiếp cận thuận tiện, nhanh chóng và tiết kiệm chi phí, hỗ trợ việc hiểu biết về thành phần hóa học của cây Kết quả nghiên cứu cho thấy cây Thài lài trắng thu hái từ Hà Nội chứa các nhóm chất như alcaloid, flavonoid, tannin, coumarin, caroten, chất béo và acid hữu cơ, phù hợp với các nghiên cứu trước đó ở Việt Nam và trên thế giới.
Phương pháp chiết xuất bằng EtOH và phân lập các chất qua sắc ký cột được áp dụng dựa trên các nghiên cứu trước đó, mang lại ưu điểm là sử dụng dung môi rẻ tiền, dễ kiếm và ít độc hại Kết quả của quá trình này đã phân lập thành công một chất có tên là acid pimaric.
Acid pimaric là một acid hữu cơ thuộc nhóm acid nhựa, thường được tìm thấy trong nhựa thông và có mặt ở Thài lài trắng Ngoài ra, acid này cũng xuất hiện trong một số loài cây khác như Aralia cordata.
[36] và Dacrycarpus imbricatus [17] Về tác dụng sinh học, acid pimaric ở loài
Aralia cordata đã được chứng minh có khả năng ức chế sản xuất metalloproteinase-9 và ngăn chặn sự di chuyển của tế bào cơ trơn động mạch chủ do yếu tố hoại tử khối u (TNF)-α Điều này cho thấy tiềm năng của nó trong việc giảm nguy cơ xơ vữa động mạch ở người Do đó, cần nghiên cứu sâu hơn về tác dụng của acid pimaric trong C diffusa.
Quá trình phân lập hiện tại chưa phát hiện thêm các thành phần điển hình đã được đề cập trong các nghiên cứu trước, có thể do thời điểm thu hái không phù hợp, điều kiện môi trường sống khác biệt, hoặc do quá trình di thực, dẫn đến hàm lượng hợp chất trong mẫu Thài lài trắng chỉ chiếm tỉ lệ thấp.
Nghiên cứu về Thài lài trắng chỉ mới bắt đầu, mở ra cơ hội cho các nghiên cứu sâu hơn về cây này Bài viết cũng cung cấp tư liệu quý giá cho việc sử dụng Thài lài trắng trong y học dân gian và hỗ trợ cho lĩnh vực kiểm nghiệm dược liệu trong tương lai.
Thài lài trắng. Đây là lần đầu tiên hợp chất này được phân lập từ cây
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận
Sau một thời gian thực hiện, đề tài đã đạt được mục tiêu đề ra và thu được một số kết quả như sau:
- Đã mô tả được đặc điểm hình thái thực vật và xác định được tên khoa học của mẫu nghiên cứu là Commelina diffusa Burm.F.
- Đã mô tả được đặc điểm vi phẫu thân, lá và đặc điểm bột toàn cây của loài nghiên cứu, góp phần tiêu chuẩn hóa loài này.
Nghiên cứu đã xác định một số nhóm chất có trong mẫu cây Thài lài trắng (Commelina diffusa), bao gồm alcaloid, flavonoid, tannin, coumarin, caroten, chất béo và acid hữu cơ.
- Đã chiết xuất, phân lập bằng phương pháp sắc ký cột thu được 1 hợp chất có trong cây Thài lài trắng.
Cấu trúc của hợp chất phân lập được đã được xác định là acid pimaric thông qua các phương pháp đo lường như nhiệt độ nóng chảy, góc quay cực riêng, phổ khối và phổ cộng hưởng hạt nhân.
- Tiếp tục nghiên cứu phân lập các chất để có thể xác định thêm các thành phần khác từ loài Commelina diffusa.
- Thử đánh giá tác dụng sinh học của dịch chiết loài Commelina diffusa, cụ thể như tác dụng ổn định đường huyết, bảo vệ gan, kháng khuẩn, kháng nấm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt
1 Bộ Y tế (2011), Dược liệu học I, Nxb Y học, Hà Nội, tr 111 - 494.
2 Đỗ Sĩ Hiến, Đỗ Thị Xuyến (2011), "Các loài thực vật được đồng bào dân tộc mường tại khu bảo tồn thiên nhiên hang kia - pà cò sử dụng làm thuốc trị bệnh thận", Hội nghị khoa học toàn quốc về sinh thái và tài nguyên sinh vật lần thứ 4, tr 1121 - 1125.
3 Hà Quang Thanh, Mai Thành Chung, Nguyễn Mai Trúc Tiên, Nguyễn
Thị Thu Hương (2019), "Tác dụng bảo vệ gan của các cao chiết từ rau trai trên mô hình chuột tổn thương gan do ethanol", Tạp chí Dược liệu, 24(6), tr 362 - 368.
4 Lê Bá Khoa (2014), "Thành phần loài và thảm thực vật ven sông vàm cỏ tây, tỉnh Long An", Tạp chí KHOA HỌC ĐHSP TPHCM, 61, tr 60-73
5 Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn (2007), Thực vật học, Nxb Y học Hà Nội, tr 64 - 138.
6 Lê Xuân Đắc và cộng sự (2019), "Đánh giá hàm lượng 20- hydroxyecdysone các loài cây thuốc ở Vườn quốc gia Tam Đảo và vùng đệm Bản B", Tạp Chí Khoa học Và Công nghệ Việt Nam, 61(2), tr 25- 29.
7 Vũ Đức Lợi, Lê Thị Thu Hương (2017), Thực hành: Thực vật Dược liệu
Dược học cổ truyền, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 24-32, 65-87.
8 Nguyễn Viết Thân (2003), Kiểm nghiệm dược liệu bằng phương pháp hiển vi, Nxb Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr 13 - 20.
9 Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam 3, NXB Trẻ, tr 373.