TỔNG QUAN
Tổng quan về hội chứng tự kỷ
1.1.1 Khái niệm về hội chứng tự kỷ
Tự kỷ, hay còn gọi là “Autism”, là một rối loạn phát triển được đặc trưng bởi sự khiếm khuyết trong việc thiết lập mối quan hệ và tương tác xã hội, thuật ngữ này được nhà tâm lý học Leo Kanner giới thiệu vào năm 1943 Những hành vi của trẻ mắc chứng tự kỷ thường bao gồm thiếu quan hệ cảm xúc với người khác, có thói quen hành vi kỳ lạ và tỉ mỉ, khó khăn trong giao tiếp ngôn ngữ hoặc sử dụng ngôn ngữ không bình thường, thích xoay các đồ vật hình tròn, cùng với khả năng nhận thức không gian cao hoặc trí nhớ xuất sắc.
Năm 1979, Lorna Wing đã đưa ra thuật ngữ “Rối loạn phổ tự kỷ” (tên tiếng anh là
“Autism Spectrum Disorder (ASD)”), do sự đa dạng triệu chứng biểu hiện [66]
Hiện nay, thuật ngữ "Hội chứng tự kỷ" được sử dụng để chỉ các rối loạn phức tạp liên quan đến phổ tự kỷ Các rối loạn này được phân loại thành năm nhóm chính: rối loạn tự kỷ, rối loạn Asperger, rối loạn Rett, rối loạn Disintegrative và rối loạn phát triển lan tỏa không được chỉ định khác.
Tự kỷ, theo khái niệm của Liên hiệp quốc năm 2008, là một dạng khuyết tật phát triển kéo dài suốt đời, thường xuất hiện trong ba năm đầu đời Đây là rối loạn thần kinh ảnh hưởng đến chức năng não bộ, có thể xảy ra ở bất kỳ ai, không phân biệt giới tính, chủng tộc hay điều kiện kinh tế - xã hội Những đặc điểm chính của tự kỷ bao gồm khiếm khuyết trong tương tác xã hội, giao tiếp ngôn ngữ và phi ngôn ngữ, cùng với hành vi và sở thích hạn hẹp, lặp đi lặp lại.
Những khiếm khuyết liên quan đến Rối loạn phổ tự kỷ (ASD) tồn tại suốt đời và ảnh hưởng lớn đến chức năng, xã hội và tài chính của cá nhân, gia đình cũng như cộng đồng.
1.1.2 Dịch tễ học về hội chứng tự kỷ
Theo thống kê của Tổ chức Y tế Thế giới WHO (2021), ước tính trên toàn cầu có khoảng 1 người mắc ASD trên 270 người Mặc dù đây là con số trung bình, tỷ lệ mắc ASD có thể khác nhau đáng kể giữa các nghiên cứu Một số nghiên cứu được thực hiện bài bản đã ghi nhận tỷ lệ mắc cao hơn nhiều Đặc biệt, tỷ lệ mắc ASD ở các quốc gia có thu nhập thấp và trung bình vẫn chưa được xác định rõ ràng.
Tỷ lệ trẻ em mắc rối loạn phổ tự kỷ (ASD) đang gia tăng trên toàn cầu Theo báo cáo của Trung tâm Kiểm soát và Phòng ngừa Dịch bệnh Hoa Kỳ (CDC) vào năm 2014, tỷ lệ mắc ASD là 1/68, tức là cứ 68 trẻ thì có 1 trẻ mắc bệnh, cho thấy sự gia tăng 30% so với năm 2012.
Nhiều nghiên cứu từ các quốc gia, bao gồm cả Việt Nam, cho thấy tỷ lệ mắc rối loạn phổ tự kỷ (ASD) ở trẻ em trai cao gấp ba lần so với trẻ em gái.
Tại Việt Nam, Bộ Lao Động - Thương Binh và Xã Hội ước tính có khoảng 200.000 người mắc chứng tự kỷ, với số trẻ em được chẩn đoán và điều trị đang tăng nhanh Theo cách tính của Tổ chức Y tế Thế giới, con số này có thể lên đến khoảng 500.000 người Nghiên cứu của Hoàng Văn Minh và các cộng sự năm
Năm 2019, tỷ lệ mắc rối loạn phổ tự kỷ (ASD) ở trẻ 18-30 tháng tuổi tại miền Bắc Việt Nam là khoảng 75.2/10,000 trẻ, tương đương với tỷ lệ trung bình toàn cầu khoảng 0.76% Nghiên cứu cho thấy trẻ em sống ở thành phố có tỷ lệ mắc ASD cao hơn so với trẻ em ở nông thôn, phản ánh mức độ đô thị hóa gia tăng làm tăng nguy cơ mắc hội chứng này Đáng chú ý, tỷ lệ mắc ASD cũng cao hơn ở những trẻ có mẹ làm nghề nông, cho thấy khả năng có mối liên hệ giữa ASD và thực hành canh tác, đặc biệt là việc sử dụng thuốc bảo vệ thực vật phổ biến tại Việt Nam.
1.1.3 Các yếu tố nguy cơ của rối loạn phổ tự kỷ
Nguyên nhân gây ra rối loạn phổ tự kỷ hiện vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ
Rối loạn tự kỷ (ASD) là một hội chứng phức tạp, với nhiều nguyên nhân khác nhau ảnh hưởng đến từng cá nhân Các nghiên cứu khoa học hiện nay chỉ ra rằng có nhiều yếu tố, bao gồm cả yếu tố môi trường và di truyền, có thể làm tăng nguy cơ mắc ASD ở trẻ em.
1.1.3.1 Yếu tố di truyền học
Theo nghiên cứu năm 2015 về di truyền của rối loạn phổ tự kỷ, tiền sử gia đình là yếu tố quan trọng làm tăng nguy cơ mắc ASD, với ước tính từ 64% đến 91% rủi ro liên quan đến việc có người trong gia đình mắc hội chứng này.
Mặc dù nguyên nhân của rối loạn phổ tự kỷ (ASD) là phức tạp và đa yếu tố, các nghiên cứu song sinh đã chỉ ra rằng yếu tố di truyền đóng vai trò quan trọng Cụ thể, tỷ lệ mắc tự kỷ ở trẻ sinh đôi cùng trứng cho thấy nếu một đứa trẻ bị tự kỷ, nguy cơ mắc bệnh của đứa trẻ còn lại có thể lên tới 70-90% Trong khi đó, tỷ lệ này ở trẻ sinh đôi khác trứng thấp hơn nhiều.
Tỷ lệ mắc hội chứng tự kỷ (ASD) ở anh chị em là khoảng 30% và từ 3-19% ở các anh chị em nói chung Đặc biệt, tỷ lệ này cao gấp đôi ở các anh chị em cùng huyết thống so với anh chị em cùng mẹ khác cha Những phát hiện này cho thấy yếu tố di truyền có vai trò quan trọng trong sự phát triển của ASD, từ đó thúc đẩy các nỗ lực nghiên cứu nhằm làm rõ các yếu tố di truyền gây ra hội chứng này.
Các rối loạn di truyền đơn gen liên quan đến ASD
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các rối loạn đơn gen thường xuất hiện cùng với rối loạn phổ tự kỷ (ASD), trong đó bệnh xơ cứng củ và hội chứng Fragile X là những rối loạn phổ biến nhất Ngoài ra, bệnh Phenylketon niệu và hội chứng Smith-Lemli-Opitz cũng được ghi nhận nhưng ít gặp hơn Mặc dù tỷ lệ ASD gia tăng trong các rối loạn này, không phải tất cả các cá thể mang đột biến đều biểu hiện triệu chứng.
Nguyên nhân dẫn đến hội chứng Fragile X là sự mở rộng của bộ ba nucleotid CGG lặp lại trong vùng 5’ chưa được dịch mã của gen Fragile X Mental Retardation
Hai loại nucleotid là Adenin và Cytosin có khả năng bị methyl hóa, dẫn đến sự siêu methyl hóa promoter của gen FMR1, gây ức chế phiên mã Khoảng 1-3% trẻ em mắc chứng tự kỷ có hội chứng Fragile X, trong khi 18-33% trẻ em mắc hội chứng Fragile X lại có hành vi tự kỷ.
Tổng quan về ruồi giấm
1.2.1 Lịch sử nghiên cứu, hình thành và phát triển
Ruồi giấm (Drosophila melanogaster) thuộc họ Drosophilidae là sinh vật được sử dụng trong di truyền học từ đầu thế kỷ 20 Chúng phân bố rộng rãi trên toàn cầu, bao gồm cả các hòn đảo Hiện nay, ruồi giấm không chỉ là mô hình nghiên cứu trong di truyền học cổ điển và phân tử, mà còn được áp dụng trong nhiều kỹ thuật sinh hóa, sinh học tế bào và sinh lý học, phục vụ cho các nghiên cứu đa ngành như sinh học phát triển và sinh học thần kinh.
1.2.2 Đặc điểm sinh học và phát triển của ruồi giấm
1.2.2.1 Đặc điểm bên ngoài của ruồi giấm
Ruồi giấm có màu vàng nâu với các vòng đen ngang bụng, trong đó con cái trưởng thành dài khoảng 2.5 mm, trong khi con đực nhỏ hơn và có phần bụng sẫm màu Sự khác biệt về màu sắc với mảng đen rõ rệt ở bụng giúp dễ dàng phân biệt giữa con đực và con cái.
Hình 1.2: Ruồi giấm đực và cái [18]
1.2.2.2 Hệ gen của ruồi giấm
Hệ gen của ruồi giấm bao gồm khoảng 139.5 triệu cặp base và 17,000 gen, được phân bố trên 4 cặp nhiễm sắc thể, trong đó có 3 cặp nhiễm sắc thể thường và 1 cặp nhiễm sắc thể giới tính So với con người có 23 cặp nhiễm sắc thể, sự đơn giản này khiến ruồi giấm trở thành một trong những sinh vật đầu tiên được sử dụng trong phân tích và sàng lọc di truyền.
1.2.2.3 Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm
Vòng đời của ruồi giấm bao gồm 4 giai đoạn: trứng, ấu trùng, nhộng và ruồi trưởng thành Một con ruồi cái có khả năng đẻ đến 2000 trứng trong suốt cuộc đời Sau khi thụ tinh, trứng phát triển thành phôi trong 18-24 giờ, rồi trải qua 2 lần lột xác qua ba giai đoạn ấu trùng trước khi hóa nhộng và biến thái thành ruồi trưởng thành Ở nhiệt độ 25°C, quá trình phát triển từ thụ tinh đến ruồi trưởng thành chỉ mất khoảng 10 ngày Tuổi thọ trung bình của ruồi giấm trưởng thành là khoảng 60-70 ngày.
Hình 1.3: Chu kỳ vòng đời của ruồi giấm [22]
1.2.3 Mô hình ruồi giấm đột biến gen Rugose mang hội chứng tự kỷ
Năm 2015, nghiên cứu của tác giả Wise và cộng sự đã chỉ ra mối liên hệ giữa đột biến gen Rugose, tương đồng với gen NBEA ở người, và rối loạn tự kỷ trên mô hình ruồi giấm Các nghiên cứu bổ sung cũng xác nhận rằng đột biến mất chức năng của gen Rugose gây ra cấu trúc synap bất thường ở ấu trùng, dẫn đến khiếm khuyết trong tương tác xã hội và suy giảm vận động ở ruồi trưởng thành.
Các nghiên cứu cho thấy đột biến gen Rugose ở ruồi giấm thể hiện các đặc điểm tương tự như rối loạn phổ tự kỷ (ASD) ở con người Điều này cho thấy rằng ruồi giấm với đột biến gen Rugose có thể là một mô hình lý tưởng để nghiên cứu ASD, từ đó giúp chúng ta hiểu rõ hơn về vai trò của gen NBEA trong rối loạn này.
Ruồi giấm (Drosophila melanogaster) đã được ứng dụng sớm trong di truyền học từ những năm đầu thế kỷ XX nhờ vào những ưu điểm nổi bật của chúng.
Các nhà khoa học đã hoàn thành việc giải trình tự toàn bộ hệ gen của ruồi giấm, phát hiện rằng khoảng 60% gen của chúng tương đồng với gen của con người Đặc biệt, khoảng 75% các gen liên quan đến bệnh tật ở người cũng có sự trùng khớp rõ ràng trong bộ gen của ruồi giấm.
So với các thử nghiệm trên động vật như chuột và khỉ, việc sử dụng ruồi giấm trong nghiên cứu y sinh học ít gặp phải các vấn đề đạo đức hơn.
Ruồi giấm có tốc độ phát triển nhanh chóng, chỉ mất khoảng 10 ngày để trở thành ruồi trưởng thành Chúng có khả năng đẻ trứng với số lượng lớn, lên đến 100 trứng mỗi ngày, cho phép tạo ra một lượng lớn ruồi trong thời gian ngắn Điều này giúp các nhà nghiên cứu có thể tiến hành nghiên cứu nhiều thế hệ trong vài tuần.
- Ruồi giấm có kích thước nhỏ nên tiết kiệm chi phí nguyên vật liệu và không gian khi làm thí nghiệm
- Điều kiện sống đơn giản giúp dễ dàng tạo quần thể lớn ruồi, là tiềm năng trong sàng lọc dược chất và thuốc
- Dễ dàng và an toàn khi gây mê ruồi giấm Hơn nữa, hình thái ruồi cũng rất dễ nhận biết khi được gây mê
- Trong khi con người có tới 23 cặp nhiễm sắc thể, D.melanogaster chỉ có
4 Sự đơn giản này là một trong những lý do khiến ruồi giấm thuộc những sinh vật đầu tiên được sử dụng trong phân tích, sàng lọc di truyền [29]
T.H Morgan, cha đẻ của mô hình nghiên cứu di truyền học, đã sử dụng ruồi giấm để phát hiện quy luật di truyền liên kết gen và giới tính, từ đó đặt nền tảng cho di truyền học hiện đại Hiện nay, ruồi giấm vẫn được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu, đặc biệt là trong việc xây dựng mô hình nghiên cứu các bệnh thoái hóa thần kinh, như các mô hình chuyển gen mã hóa protein gây bệnh Alzheimer như β-amyloid và Tau.
Chúng tôi đã chọn mô hình ruồi giấm chuyển gen Rugose để nghiên cứu tác dụng sinh học và đánh giá khả năng kéo dài tuổi thọ của cao chiết cồn TTRC, nhờ vào nhiều ưu điểm đã được ghi nhận, cùng với yếu tố dễ quan sát và định lượng.
Mặc dù, có nhiều lợi thế cho việc sử dụng D melanogaster để nghiên cứu các bệnh ở người, nhưng vẫn tồn tại một số nhược điểm :
- Thiếu phương pháp để đo lường xu hướng hành vi
- Tác dụng thuốc có khác biệt đáng kể khi so sánh với các nghiên cứu ở người
Sử dụng D melanogaster làm sinh vật mẫu mang lại nhiều lợi ích, mặc dù vẫn còn một số nhược điểm chưa được khắc phục Mô hình ruồi giấm đột biến gen liên quan đến hội chứng tự kỷ đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp bằng chứng khoa học, từ đó tạo cơ sở cho việc đánh giá hiệu quả điều trị tự kỷ của các dược liệu Việt Nam trên mô hình động vật thực nghiệm trong tương lai.
Tổng quan về dược liệu nghiên cứu: Thạch tùng răng cưa
1.3.1 Tên gọi – vị trí phân loại
- Thạch tùng răng cưa (cây Thông đất) có tên khoa học:
- Tên tương tự: Lycopodium Serrata (Thunb.) Trevis
- Vị trí phân loại của loài Huperzia serrata trong hệ thống phân loại thực vật:
Họ: Thông đất (Lycopodiaceae) [69]hoặc Huperziaceae [21];
1.3.2 Đặc điểm thực vật, phân bố, giá trị sử dụng
Cây có thân đứng, thường mọc ở vùng đất cao với chiều cao từ 10-40 cm, có thân đơn hoặc lưỡng phân 1-2 lần, đường kính khoảng 2mm Lá cây hình bầu dục, đầu nhọn, dài 15 mm và rộng 3 mm, với phiến lá tương đối mỏng, gân giữa nổi rõ và mép lá có răng cưa Túi bào tử nằm ở nách lá, có hình thận và màu vàng tươi.
Hình 1.4: Cây Th ạ ch tùng r ă ng c ư a [3]
1: Ảnh chụp tại thực địa; 2: Phần ngọn của cây; 3: Lá;
4: Túi bào tử mọc ở nách lá; 5,6: Túi bào tử đã mở; 7: Túi bào tử hình thận
Cây Thạch tùng răng cưa thường sinh trưởng trên các cành cây, hốc cây hoặc bề mặt đá và đất mùn trong những khu rừng ẩm ướt, với độ cao khoảng 1000m so với mực nước biển Loài thực vật này được biết đến rộng rãi ở Trung Quốc với tên gọi Qian Ceng.
Thạch tùng răng cưa được sử dụng trong các bài thuốc chữa bệnh như cầm máu và lợi tiểu Tại Hoa Kỳ, loại cây này được tiêu thụ rộng rãi như thực phẩm bổ trợ Ngoài ra, Thạch tùng răng cưa còn đang được nghiên cứu với tác dụng tăng cường trí nhớ và điều trị bệnh Alzheimer Ở Việt Nam, cây này chủ yếu được tìm thấy tại Sapa (Lào Cai) và Đà Lạt (Lâm Đồng).
Bộ phận dùng là phần thân cây trên mặt đất, có thể dùng tươi hoặc sấy khô để bảo quản lâu dài [69]
1.3.3 Thành phần hoá học và tác dụng sinh học
Thạch tùng răng cưa chứa nhiều thành phần hoá học có tác dụng dược lý như alkaloid Huperzin A, Triterpen, Flavoles và acid Phenoliques Nhiều nhóm nghiên cứu trên thế giới đã thành công trong việc tách chiết các hoạt chất này.
Nhóm nghiên cứu tại Trung Quốc đã thành công trong việc phân lập hai alkaloid chính là Huperzin A và Huperzin B Tiếp theo, họ tiếp tục nghiên cứu và phân lập thêm các alkaloid khác như Huperzin E, F, G, I, J, K, L và R.
P, Huperzin Q và N-oxyhuperzin Q, Huperzin S, T và U, Huperzin O, Huperzin W, Huperzin B [21]
Chang-Heng Tan và cộng sự đã phân lập được 9 alkaloid: Huperzin P, Fawcettimin và Phlegmariunin B Huperzin Q N-oxyhuperzin Q serratadin, 6f- hydroxycerratadin, 4f-hydroxyserratadin và 4f,6f-dihydroxycerratidin, Phlegmariurin
Nhóm nghiên cứu tại Nhật Bản đã phân lập được 17 alkaloid: Lycoposerramin-
Kazuaki Katakawa and his team isolated eight alkaloids, including Lycothunin, Serratin, and Serratanidin, along with several derivatives such as 11alpha-hydrofawcettidin and 2alpha,11alpha-dihydroxy-fawcettidin Additionally, they identified seven more alkaloids from the plant, which comprised Lycoposerramin-R, Lycoposerramin-T, and N-methyl and N-formyl derivatives of Lycoposerramin-T, as well as N-dimethyl-beta-obscurin, lycodin, and fawcettimin.
Huperzin A, một alkaloid có nguồn gốc từ loài Thạch tùng răng cưa, có khả năng ức chế enzym Acetylcholinesterase (AChE), giúp giảm lượng AChE trong não và tăng hàm lượng Acetylcholin Điều này cải thiện trí nhớ và hỗ trợ chức năng thần kinh Nghiên cứu lâm sàng cho thấy Huperzin A thúc đẩy dẫn truyền thần kinh cholinergic, bảo vệ hệ thần kinh và có tác dụng hướng thần, chống lại chứng mất trí nhớ.
Nghiên cứu cho thấy Huperzin A có vai trò bảo vệ thần kinh, hoạt động như một chất chống oxy hóa và tăng cường enzym chống oxy hóa trong não Nó giúp ngăn ngừa tác hại của gốc tự do, từ đó tăng tuổi thọ của tế bào não và cải thiện chức năng thần kinh.
Chỉnh biểu hiện của protein apoptotic có vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ ty thể tế bào não, trung tâm năng lượng chính của mỗi tế bào Điều này giúp bảo vệ não khỏi độc tính của glutamat thông qua cơ chế hoạt động như một chất đối kháng thụ thể NMDA Ngoài ra, việc điều chỉnh chuyển hoá protein tiền thân beta-amyloid cũng rất cần thiết, vì beta-amyloid ảnh hưởng đến mức ATP trong ty thể và có thể gây rối loạn các chức năng, dẫn đến các bệnh như Alzheimer.
Huperzin A không chỉ nổi bật với khả năng ức chế enzyme acetylcholinesterase (AchE) mà còn có tác dụng chống viêm đáng chú ý Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng Huperzin A có khả năng ngăn chặn các phản ứng viêm, bao gồm sự tăng sinh tế bào T và sản xuất cytokine, tương tự như các chất ức chế AchE khác.
Mặc dù Huperzin A chưa được nghiên cứu nhiều trên mô hình ruồi giấm, nhưng các nghiên cứu chủ yếu trên chuột cho thấy nó có nhiều tác dụng tích cực, bao gồm khả năng chống ung thư và chống co giật Do đó, có khả năng khi thử nghiệm trên ruồi giấm, Huperzin A cũng sẽ cho kết quả tương tự.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dược liệu nghiên cứu
Cao chiết cồn 90% từ toàn cây TTRC (Huperzia serrata (Thunb.) Trevis ) với hiệu suất chiết 5.18%
Nguồn gốc của TTRC là từ khoa Tài Nguyên thuộc Viện Dược liệu, nơi thu hái nguyên liệu Sau đó, khoa Hóa thực vật tại Viện Dược liệu thực hiện quá trình tách chiết tổng hợp và cung cấp sản phẩm Mẫu nghiên cứu được bảo quản và lưu giữ tại Phòng Tiêu bản của khoa Tài Nguyên, Viện Dược liệu.
Đối tượng nghiên cứu
Ruồi giấm (Drosophila melanogaster) là một loài côn trùng quan trọng trong nghiên cứu sinh học, được giáo sư Masamitsu Yamaguchi từ Viện Công nghệ Kyoto, Đại học Kyoto, Nhật Bản, cung cấp thông tin về các giai đoạn phát triển của chúng Nghiên cứu này tập trung vào hai chủng khác nhau của ruồi giấm.
Canton-S (FBst0064349): chủng ruồi giấm hoang dại được sử dụng làm nhóm chứng sinh lý
Rugose (FBst0009801-CG44835): chủng ruồi giấm chuyển gen rugose mang hội chứng tự kỷ
Ruồi giấm được nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản tại phòng thí nghiệm với nhiệt độ ổn định 25±1 o C và chu kỳ sáng tối 12/12, trong đó ánh sáng từ 7 giờ đến 19 giờ Các thí nghiệm hành vi của ruồi giấm được tiến hành trong khoảng thời gian từ 9 giờ đến 18 giờ.
2.3 Hóa chất, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
STT Tên hóa chất Nguồn gốc
8 Sữa bột nguyên kem Việt Nam
10 Một số hóa chất khác đạt tiêu chuẩn phòng thí nghiệm
STT Dụng cụ, thiết bị Nguồn gốc
1 Buồng tam giác và kính Việt Nam
2 Bút lông để thu ấu trùng Nhật Bản, Trung Quốc
3 Chai, ống, bô-can thủy tinh để đựng thức ăn, nuôi ấu trùng
5 Cân phân tích Mettler Toledo, Mỹ
6 Đĩa petri 9cm và 15cm, nắp đục lỗ Corning, Mỹ
7 Đồng hồ bấm giờ Nhật Bản
8 Kính hiển vi huỳnh quang Olympus IX73 Olympus, Nhật Bản
9 Lò vi sóng Electrolux, Thụy Điển
10 Máy quay phim Canon, Nhật Bản
12 Miếng lót mềm Việt Nam
14 Hệ thống theo dõi nhịp sinh học trên ruồi giấm
15 Một số dụng cụ, thiết bị khác
2.4.1 Căn cứ để chọn lựa mức liều 2mg/ml và 4mg/ml
Chúng tôi đã thực hiện dò liều trên dải nồng độ từ 1 mg/ml đến 10 mg/ml Kết quả cho thấy nồng độ 2 mg/ml và 4 mg/ml là phù hợp cho nghiên cứu chính thức dựa trên khả năng sống sót và mô hình tương tác cộng đồng của ruồi trưởng thành.
2.4.2 Nhân dòng ruồi giấm tự kỷ và hoang dại phục vụ nghiên cứu
Tiến hành lai giữa các cặp bố mẹ chủng Rugose và Canton-S với tỷ lệ đực cái 1:1 để tạo ra dòng ruồi tự kỷ và dòng ruồi đối chứng sinh lý Các dòng ruồi lai tạo được phân chia thành nhiều nhóm khác nhau.
Nhóm sinh lý: Ruồi bố mẹ chủng Canton-S được lai (tỷ lệ 1:1) và nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản
Nhóm mang hội chứng tự kỷ: Ruồi bố mẹ chủng Rugose được lai (tỷ lệ 1:1) và nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản
Thức ăn cho ruồi được thay 3 ngày một lần để đảm bảo cung cấp đầy đủ dinh dưỡng cho chúng trong suốt quá trình thí nghiệm Tất cả ruồi mang gen nghiên cứu được nuôi ở nhiệt độ 25±1 o C và chu kỳ sáng tối 12/12, với thời gian sáng từ 7 giờ đến 19 giờ Các thí nghiệm hành vi được thực hiện từ 9 giờ đến 18 giờ Sau khi lai tạo, các chủng ruồi sẽ được kiểm tra ngẫu nhiên về kiểu gen và đột biến gen tại Bộ môn Y Sinh học di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội, nhằm đảm bảo tính chính xác của chủng ruồi được sử dụng trong mô hình nghiên cứu.
Thành phần thức ăn (cho 500 ml)
Quy trình chuẩn bị thức ăn
- Cân Natri Benzoate vào ống falcon, thêm nước, dùng máy vortex hoà tan đến khi dung dịch đồng nhất
- Cân sữa bột vào cốc thuỷ tinh, hoà thêm một ít nước nguội và đánh đều, tạo dạng kem
- Cân Agar vào trong bát sắt, bổ sung ~200 ml H2O, đun nóng đến khi dung dịch trong
- Bổ sung đường và nấm men vào trong bát sắt, thêm ~100 ml H2O, đun sủi lăn tăn trong 10 phút
- Đổ dung dịch ra cốc dung tích 1 lít, để nguội về 60 o C, phối hợp sữa vào, khuấy đều Bổ sung thêm nước nóng đủ 500 ml, khuấy đều
- Bổ sung Acid Propionic và Natri Benzoate, tiếp tục khuấy đều
- Chia vào ống nuôi ~5 ml Bảo quản ở 4 o C đến khi sử dụng (dùng tối đa trong 1 tháng)
Thành phần Hàm lượng Đường 25 g (5% w/v)
Acid Benzoic 20% hoặc Natri Benzoate 20%
2.4.3 Thu ấu trùng và ruồi trưởng thành phục vụ nghiên cứu
Ruồi bố mẹ được chuyển vào ống thức ăn có chứa mẫu nghiên cứu để đẻ trứng trong khoảng 2-3 ngày Sau đó, toàn bộ ruồi bố mẹ sẽ được chuyển sang ống mới Cuối cùng, tiến hành thu ấu trùng ở giai đoạn thích hợp cho thí nghiệm.
Lưu ý rằng ruồi bố mẹ đã tiêu thụ thức ăn chứa mẫu nghiên cứu này không nên được sử dụng cho các mẫu nghiên cứu khác Sau khi ăn thức ăn chứa mẫu, ruồi bố mẹ có thể được sử dụng lại trong khoảng thời gian 4-6 ngày, tương đương với 1-2 lần chuyển.
Ruồi bố mẹ được chuyển vào ống thức ăn chứa mẫu nghiên cứu để đẻ trứng trong 2-3 ngày Sau đó, ruồi bố mẹ sẽ được chuyển sang ống mới để tiếp tục nhân dòng hoặc loại bỏ Ấu trùng sẽ nở và đóng kén trong khoảng 6-8 ngày, và cần theo dõi ngày nở của kén để thu ruồi nở trong ngày xác định (có thể sai khác 1 ngày) Ruồi nở sẽ được chuyển sang ống chứa thức ăn mới và cho ăn trong 3 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm.
Lưu ý rằng ruồi bố mẹ đã tiêu thụ thức ăn chứa mẫu nghiên cứu này không nên được sử dụng cho các mẫu nghiên cứu khác Các ruồi bố mẹ này có thể được sử dụng lặp lại trong khoảng thời gian 4-6 ngày, tương đương với 1-2 lần chuyển.
Chia ruồi thu được ở trên làm 4 lô nghiên cứu:
Lô 1: Nhóm chứng sinh lý: sử dụng chủng CantonS + nuôi trong ống thức ăn chuẩn
Lô 2: Nhóm chứng bệnh lý: sử dụng chủng Rugose + nuôi trong ống thức ăn chuẩn
Lô 3: Nhóm điều trị: sử dụng chủng ruồi Rugose + nuôi trong ống thức ăn chuẩn có bổ sung TTRC ở nồng độ 2 mg/ml
Lô 4: Nhóm điều trị: sử dụng chủng ruồi Rugose + nuôi trong ống thức ăn chuẩn có bổ sung TTRC ở nồng độ 4 mg/ml
2.5.1 Đánh giá tác dụng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa trên mô hình ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ bằng thử nghiệm hành vi
2.5.1.1 Thử nghiệm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm
Thí nghiệm nhằm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm đã được thực hiện để xác định ảnh hưởng của cao chiết cồn TTRC đối với khả năng vận động của chúng.
19 của ấu trùng ruồi giấm Rugose Thí nghiệm được tiến hành dựa trên nghiên cứu của tác giả Nichols và cộng sự năm 2012 [47]
Chuẩn bị một đĩa petri đường kính 15 cm và làm sạch, sau đó đổ thạch Agar 1.2% nóng lên đĩa để tạo bề mặt láng đều, để thạch khô trước khi tiến hành thí nghiệm Thu thập ấu trùng bậc 3 (khoảng 4 ngày tuổi), đặc biệt là ấu trùng đực, nằm trên bề mặt thức ăn và có kích thước đồng đều Cần lưu ý không thu ấu trùng yếu do mật độ quá đông có thể làm ảnh hưởng đến sự phát triển và tránh gây tổn thương cho ấu trùng trong quá trình bắt Sau khi thu thập, giữ ấu trùng trên khăn giấy ẩm.
Để chuẩn bị cho quá trình quay, hãy đặt máy quay song song với bề mặt đĩa và đảm bảo không có rung lắc Sử dụng thước đo và giấy tối màu ít phản quang đặt cạnh đĩa Cuối cùng, đặt miếng lót đen mềm bên dưới đĩa Agar để hỗ trợ quá trình quay (Hình 2.1).
Chuyển 4-6 cá thể ấu trùng lên đĩa Agar và thực hiện quay video với khung hình 640*480, 15 frames/s Bắt đầu quay khi ấu trùng di chuyển để hạn chế việc di chuyển ra rìa đĩa và dừng quay sau khoảng 1 phút.
Hình 2.1 Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm
2.5.1.2 Thử nghiệm đánh khả năng vận động của ruồi giấm trưởng thành
Với mục tiêu đánh giá tác dụng của cao chiết cồn TTRC lên ruồi đột biến gen
Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng leo trèo của ruồi giấm trưởng thành để nghiên cứu hội chứng tự kỷ, dựa trên các nghiên cứu trước đó của Nichols và cộng sự (2012), Liu Quan Feng (2015), và Gargano (2005).
Thời gian lý tưởng để đánh giá hành vi leo trèo của ruồi là vào buổi sáng hoặc không muộn hơn 14 giờ, vì đây là lúc khả năng leo trèo của chúng đạt hiệu quả cao nhất và ổn định nhất Việc tuân thủ nghiêm ngặt về không gian và thời gian trong quá trình quan sát là rất quan trọng.
Thiết kế thí nghiệm
2.4.1 Căn cứ để chọn lựa mức liều 2mg/ml và 4mg/ml
Chúng tôi đã thực hiện khảo sát liều lượng trong khoảng nồng độ từ 1 mg/ml đến 10 mg/ml Kết quả cho thấy nồng độ 2 mg/ml và 4 mg/ml là thích hợp dựa trên khả năng sống sót và mô hình tương tác cộng đồng của ruồi trưởng thành.
2.4.2 Nhân dòng ruồi giấm tự kỷ và hoang dại phục vụ nghiên cứu
Tiến hành lai giữa các cặp bố mẹ chủng Rugose và Canton-S với tỷ lệ đực cái 1:1 nhằm tạo ra dòng ruồi tự kỷ và dòng ruồi đối chứng sinh lý Các chủng ruồi lai tạo sẽ được phân chia thành nhiều nhóm khác nhau.
Nhóm sinh lý: Ruồi bố mẹ chủng Canton-S được lai (tỷ lệ 1:1) và nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản
Nhóm mang hội chứng tự kỷ: Ruồi bố mẹ chủng Rugose được lai (tỷ lệ 1:1) và nuôi trong môi trường thức ăn cơ bản
Thức ăn cho ruồi được thay 3 ngày một lần để đảm bảo cung cấp đầy đủ dinh dưỡng cho ruồi trong quá trình thí nghiệm Tất cả ruồi mang gen nghiên cứu được nuôi ở nhiệt độ 25±1°C và chu kỳ sáng tối 12/12 (sáng từ 7 giờ đến 19 giờ) Các thí nghiệm hành vi được tiến hành từ 9 giờ đến 18 giờ Sau khi lai tạo, các chủng ruồi được kiểm tra ngẫu nhiên về kiểu gen và đột biến gen tại Bộ môn Y Sinh học di truyền, Trường Đại học Y Hà Nội, nhằm đảm bảo tính chính xác của chủng ruồi sử dụng trong mô hình nghiên cứu.
Thành phần thức ăn (cho 500 ml)
Quy trình chuẩn bị thức ăn
- Cân Natri Benzoate vào ống falcon, thêm nước, dùng máy vortex hoà tan đến khi dung dịch đồng nhất
- Cân sữa bột vào cốc thuỷ tinh, hoà thêm một ít nước nguội và đánh đều, tạo dạng kem
- Cân Agar vào trong bát sắt, bổ sung ~200 ml H2O, đun nóng đến khi dung dịch trong
- Bổ sung đường và nấm men vào trong bát sắt, thêm ~100 ml H2O, đun sủi lăn tăn trong 10 phút
- Đổ dung dịch ra cốc dung tích 1 lít, để nguội về 60 o C, phối hợp sữa vào, khuấy đều Bổ sung thêm nước nóng đủ 500 ml, khuấy đều
- Bổ sung Acid Propionic và Natri Benzoate, tiếp tục khuấy đều
- Chia vào ống nuôi ~5 ml Bảo quản ở 4 o C đến khi sử dụng (dùng tối đa trong 1 tháng)
Thành phần Hàm lượng Đường 25 g (5% w/v)
Acid Benzoic 20% hoặc Natri Benzoate 20%
2.4.3 Thu ấu trùng và ruồi trưởng thành phục vụ nghiên cứu
Ruồi bố mẹ được chuyển vào ống thức ăn có chứa mẫu nghiên cứu để đẻ trứng trong khoảng 2-3 ngày Sau khi hoàn tất quá trình đẻ trứng, toàn bộ ruồi bố mẹ sẽ được chuyển sang ống mới Tiếp theo, tiến hành thu thập ấu trùng ở giai đoạn thích hợp để phục vụ cho thí nghiệm.
Lưu ý rằng ruồi bố mẹ đã tiêu thụ thức ăn chứa mẫu nghiên cứu này không được sử dụng cho các mẫu nghiên cứu khác Tuy nhiên, ruồi bố mẹ có thể được sử dụng lại trong khoảng thời gian 4-6 ngày, tương đương với 1-2 lần chuyển.
Ruồi bố mẹ được chuyển vào ống thức ăn chứa mẫu nghiên cứu để đẻ trứng trong 2-3 ngày Sau đó, ruồi bố mẹ được chuyển sang ống mới để tiếp tục nhân dòng hoặc loại bỏ Ấu trùng sẽ nở và đóng kén trong vòng 6-8 ngày, và cần theo dõi ngày nở của kén để thu ruồi nở trong ngày xác định (chấp nhận sai lệch 1 ngày) Ruồi nở sau đó sẽ được chuyển sang ống thức ăn mới chứa mẫu nghiên cứu và cho ăn trong 3 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm.
Lưu ý rằng ruồi bố mẹ đã tiêu thụ thức ăn chứa mẫu nghiên cứu này không nên được sử dụng cho các mẫu nghiên cứu khác Tuy nhiên, ruồi bố mẹ có thể được sử dụng lặp lại trong khoảng thời gian 4-6 ngày, tương đương với 1-2 lần chuyển.
Chia ruồi thu được ở trên làm 4 lô nghiên cứu:
Lô 1: Nhóm chứng sinh lý: sử dụng chủng CantonS + nuôi trong ống thức ăn chuẩn
Lô 2: Nhóm chứng bệnh lý: sử dụng chủng Rugose + nuôi trong ống thức ăn chuẩn
Lô 3: Nhóm điều trị: sử dụng chủng ruồi Rugose + nuôi trong ống thức ăn chuẩn có bổ sung TTRC ở nồng độ 2 mg/ml
Lô 4: Nhóm điều trị: sử dụng chủng ruồi Rugose + nuôi trong ống thức ăn chuẩn có bổ sung TTRC ở nồng độ 4 mg/ml.
Phương pháp nghiên cứu
2.5.1 Đánh giá tác dụng của cao chiết cồn Thạch tùng răng cưa trên mô hình ruồi giấm đột biến gen mang bệnh tự kỷ bằng thử nghiệm hành vi
2.5.1.1 Thử nghiệm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm
Thí nghiệm nhằm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm đã được thực hiện để xác định tác động của cao chiết cồn TTRC đối với khả năng vận động của chúng.
19 của ấu trùng ruồi giấm Rugose Thí nghiệm được tiến hành dựa trên nghiên cứu của tác giả Nichols và cộng sự năm 2012 [47]
Chuẩn bị một đĩa petri đường kính 15 cm và làm sạch, sau đó đổ thạch Agar 1.2% nóng lên đĩa để tạo bề mặt láng đều và để thạch khô trước khi tiến hành thí nghiệm Thu thập ấu trùng bậc 3 (khoảng 4 ngày tuổi), đảm bảo chọn những ấu trùng đực nằm trên bề mặt thức ăn, đang bò ổn định và có kích thước đồng đều Lưu ý không thu ấu trùng yếu do mật độ quá đông và môi trường quá cứng, điều này có thể ảnh hưởng đến sự phát triển và gây tổn thương cho ấu trùng trong quá trình bắt Sau khi thu thập, giữ ấu trùng trên khăn giấy ẩm.
Để quay video, hãy chuẩn bị máy quay và đặt camera song song với bề mặt đĩa, đảm bảo không có rung lắc trong suốt quá trình quay Sử dụng thước đo và giấy tối màu ít phản quang đặt cạnh đĩa Đồng thời, chuẩn bị miếng lót đen mềm và đặt bên dưới đĩa Agar để đảm bảo chất lượng hình ảnh.
Chuyển 4-6 cá thể ấu trùng lên đĩa Agar và bắt đầu quay video với khung hình 640*480, tốc độ 15 frames/s Bắt đầu quay khi ấu trùng bắt đầu di chuyển để tránh việc chúng di chuyển ra rìa đĩa, và dừng quay sau khoảng 1 phút.
Hình 2.1 Thiết kế thí nghiệm đánh giá khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm
2.5.1.2 Thử nghiệm đánh khả năng vận động của ruồi giấm trưởng thành
Với mục tiêu đánh giá tác dụng của cao chiết cồn TTRC lên ruồi đột biến gen
Chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm đánh giá khả năng leo trèo của ruồi giấm trưởng thành trong bối cảnh nghiên cứu về hội chứng tự kỷ Nghiên cứu này dựa trên các công trình của Nichols và cộng sự (2012), Liu Quan Feng (2015), và Gargano (2005).
Thời gian lý tưởng để đánh giá hành vi leo trèo của ruồi là vào buổi sáng hoặc không muộn hơn 14 giờ, vì đây là thời điểm khả năng leo trèo của chúng đạt hiệu suất tốt nhất và ổn định nhất Hơn nữa, cần tuân thủ nghiêm ngặt các yếu tố về không gian và thời gian trong quá trình đánh giá.
Thí nghiệm bò ngược chiều trọng lực chỉ được thực hiện tại một địa điểm cụ thể và trong một khoảng thời gian nhất định, do sự khác biệt về trọng lực ở các vị trí và thời điểm khác nhau có thể gây ra sai số trong kết quả.
Ruồi đực sau khi nở 3, 7 và 10 ngày được tiến hành đánh giá hành vi, chia thành
Bài viết mô tả việc sử dụng 4 lô, mỗi lô gồm 10 ống nghiệm có đường kính 2 cm và chiều dài 20 cm, với các vạch chia cách đáy ống ở các mức 2 cm, 4 cm, 6 cm, 8 cm và 10 cm Mỗi ống nghiệm chứa từ 8 đến 12 con và được đặt thẳng đứng trong 15 phút.
Sau khi để ruồi tỉnh và làm quen với môi trường trong 20 phút, xếp các ống nghiệm vào khay và gõ nhẹ 3 lần để đảm bảo ruồi ở vị trí xuất phát Cho ruồi tự do di chuyển trong ống nghiệm trong 30 giây và lặp lại quy trình này 4 lần nữa, tổng cộng 5 lần Quá trình thí nghiệm được ghi lại bằng camera Điểm số được đánh giá dựa trên chiều cao của ống nghiệm: 0 (dưới 2 cm), 1 (2.0 – 3.9 cm), 2 (4.0 – 5.9 cm), 3 (6.0 – 7.9 cm), 4 (8.0 – 8.9 cm) và 5 (từ 9 cm trở lên) Tính điểm cho từng con ruồi sau 4 giây đầu tiên của mỗi lần lặp và tính điểm trung bình của ống nghiệm theo công thức đã quy định.
S: số điểm trung bình của một ống thí nghiệm x: số con trong một ống thí nghiệm nik: số con ruồi trong một mức điểm sik: điểm số tương ứng của ruồi trong từng mức điểm
2.5.1.3 Thử nghiệm đánh giá hành vi tương tác cộng đồng của ruồi giấm trưởng thành
Khả năng tương tác cộng đồng và tập trung là yếu tố quan trọng trong việc đánh giá kết quả điều trị hội chứng tự kỷ bằng dược liệu Chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu khả năng cải thiện tính tập trung của ruồi giấm mắc hội chứng tự kỷ thông qua việc sử dụng cao chiết cồn TTRC Thí nghiệm này dựa trên mô hình đánh giá được mô tả bởi Simon (2012) và Ueoka (2019).
Buồng đánh giá hình tam giác bằng nhựa có chiều cao và cạnh đáy dài 15.3 cm, dày 0.5 cm, được che phủ bởi hai tấm kính kích thước 18 cm x 18 cm, tạo điều kiện cho ruồi hoạt động trong không gian hai chiều.
Hình 2.2: Thiết kế thí nghiệm đánh giá hành vi cộng đồng của ruồi giấm
Ruồi mới nở được phân loại theo giới tính và được nuôi trong các ống chứa thức ăn chuẩn với khoảng 40 con mỗi ống trong 3-4 ngày Vào ngày thí nghiệm, ruồi sẽ được gây mê và chuyển vào buồng tam giác, sau đó được đóng kín bằng 2 phiến kính, thực hiện thí nghiệm sau 3-4 tiếng bắt đầu chu kỳ sáng Buồng đếm sẽ được dựng đứng chờ ruồi tỉnh lại, sau đó nhẹ nhàng đập buồng thí nghiệm để đảm bảo tất cả ruồi đều ở đáy buồng cùng một lúc Sau 20 phút cho ruồi tự do vận động và giao tiếp, hình ảnh sẽ được chụp và lưu trữ để tiến hành phân tích kết quả.
2.5.1.4 Thử nghiệm đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm trưởng thành
Chúng tôi thực hiện thí nghiệm nhằm đánh giá nhịp sinh học của ruồi giấm đột biến gen Rugose, liên quan đến hội chứng tự kỷ, bằng cách sử dụng cao chiết cồn TTRC, dựa trên phương pháp được mô tả trong nghiên cứu của Wise và cộng sự (2015).
Thức ăn mẫu dược liệu được làm nóng đến khoảng 65 độ C và sau đó được đổ vào các bô-can phù hợp Tiến hành cho thức ăn vào các ống theo dõi có đường kính 5 mm và chiều dài 8 cm, đảm bảo ống đứng thẳng trong bô-can với độ cao thức ăn khoảng 0.5 cm Sau khi chờ cho thức ăn đông lại ở nhiệt độ phòng hoặc 4 độ C, lấy ống ra và đậy kín hai đầu bằng nút cao su và bông Lưu ý không để hơi nước đọng lại trong ống, vì điều này có thể ảnh hưởng đến ruồi khi chuyển vào ống.
Phân tích kết quả
Chúng tôi đã sử dụng phần mềm ImageJ phiên bản 1.53 để phân tích kết quả thí nghiệm đánh giá hành vi cộng đồng và khả năng di chuyển của ấu trùng ruồi giấm Phân tích thống kê được thực hiện bằng SPSS v25, với các thí nghiệm sử dụng test Kruskal-Wallis 1-Way ANOVA và test One-Way ANOVA Kết quả về khả năng leo trèo và nhịp sinh học của ruồi giấm trưởng thành được tổng hợp qua Microsoft Excel và phân tích bằng SPSS v25, áp dụng test One-Way ANOVA Đối với khả năng sống sót của ruồi giấm, phân tích cũng được thực hiện bằng SPSS v25 với test Kruskal-Wallis 1-Way ANOVA Các kết quả đạt ý nghĩa thống kê khi p < 0,05.