Bộ Y TÉ Bộ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỘC Y HÀ NỘI NGUYÊN THỊ HÒNG GÁM ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR ĐA MÔI ĐẶC HIỆU, XÁC ĐỊNH METHYL HĨA PROMOTER EBNA1 CỦA EBV TRONG UNG THU VỊM MŨI HỌNG Chuyên ngành: Miền dịch Mă số: 607204 LUẬN VĂN THẠC SỲ Y HỌC Người hướng dẩn khoa học: TS Nguyễn Văn Đơ TS Bùi Cơng Tồn Hà Nội, 2012 -W -ÍM Qỉ ugc V Hl LỜI CÀM ƠN Đẻ hoàn thành luận án tỏi xin bày tỏ lỏng biết ơn sấu sắc đến: TS Nguyền Văn Đô, người thầy trực tiếp hướng (lẫn tạo (liều kiện giúp đờ tơi suốt quủ trình nghiên cứu, học rập hoàn thành luận vãn TS Hùi Cơng Tồn, Phỏ giám đốc Bệnh viên K Trưởng khoa Xạ trị tổng hợp Bênh viên K, người thầy dà hưởng dẫn, đỏng góp ý kiến cho tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận văn GS TSKH Phan Thị Phi Phi, Nguyên Chủ nhiệm môn Sinh lý bệnh — miễn dịch trường Đại học Y ỉỉà Nội, người thầy dà giúp đỡ, tạo diều kiện cho tói học tập nghiên cừu khoa học PGS TS Phạm Đãng Khoa, Chù nhiệm môn Sinh lỷ bệnh - miễn dịch trường Đại học Y Hà Nội PGS TS Nguyễn Thị Vinh Hà, Nguyên Chủ nhiệm môn Sinh lý bệnh — miễn dịch trường Đại học Y Hà Nội PGS TS Đỗ Hịa Bình, Là người thầy, nhà khoa học dã giáng dạy, hưởng dãn, quan tám, dộng viên có ý kiến dóng góp q bàu cho tơĩ suốt q trình học tập hồn thành luận văn Tơi xin gửi lời câm ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu Khoa Sau Đại học Trường Dại học Y Hà Nội tập cán nhân viên cùa môn Sinh lý bệnh - Miễn dịch trường Dại học y Hà Nội tạo điều kiện cho q trình học tập nghiên cứu -c -ÍM Qỉ ugc V Hl Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể bác sĩ y tá Khoa Khám bệnh Đầu mặt cồ Bềnh viện K người giúp dở tòi íhờì gian tỏi thu th(ĩp sổ liệu nghiên cứu Tỏi xin cám ơn Ban giâm hiệu, thầy cô giảo, đồng nghiệp lĩộ môn Sinh lý bệnh - Miễn Trường Đợi học y Thải Nguyên dã giúp đỡ tơi thời gian nghiên cừu hồn ihành luận vân Cuối xin vô cảm ơn den người thân gia dinh tỏi người bên nâng đỡ mang đến cho niềm vui lịng tự tin say mê cơng vĩệc Hà Nội ngày tháng năm 2012 f - —-* _ « Ngun Thị Hơng Gấm LỞĨ CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan toàn số liệu luận văn kết quã trung thực tiến hành nghiên cứu tại: Phịng thi nghiệm cùa Bộ mơn Miền dịch - Sinh lý bệnh, Trường Đại học Y Hà nội Bệnh viện K Hả Nội Những số liệu chưa dược sử dụng công bố tài liệu hay tạp chí khoa học 'loi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm sổ liệu mà dưa Tác gỉả luận văn Nguyền Thị Hồng Gấm -ÍM Qỉ ugc V Hl DANH MỤC CHỮ VIẾT TÁT Acid Desoxyribonucleic ADN Acid RibonucleicARỈV CD Cluster of Diffcrcnciation Cộng cs Early Antigen EA EBV Epstein Barr Virus EBER Epstein Barr virus Encoded RNAs EBNA Epstein Barr Virus Nuclear /Xntigen ỈỈLA Human Leucocyte Antigen IMP Latent Membrane Protein MIIC Major Histocompatibility Complex PCR Polymerase Chain Reaction ƯCNT Undifferentiated Carcinoma of Nasopharyngeal Type Ung thư YÒm mũi họng UTVMH Viral Capsid Antigen VCA Bam Hl EBV Replication Actlvatcur ZEBRA International Agency For Research on Cancer IARC MỤC LỤC ĐẶT VÁN ĐÈ CHƯƠNG 1: .4 1.1 Tình hỉnh ung thư vịm mùi họng giới Việt Nam 1.2 Nhưng yếu tổ nguy liên quan đến UTVMH 1.2.1 Vai trò cùa virut Epstcin-Barr .4 1.2.2 Mơi trường sổng thói quen sinh hoạt .5 1.2.3 Yếu tố di truyền 1.3 Bệnh học UTVMH 1.3.1 Triệu chứng lâm sàng 1.3.2 Chần đoán .7 1.3.2.1 Lâm sàng .7 1.3.2.2 Cận lâm sàng 1.32.3 Chần đoán giai đoạn 1.3.3 Điều trị 1.3.4 Tiên lượng 10 1.4 Virut Epstein- Barr .10 1.4.1 Sinh học EBV .10 1.4.2 Cấu trúc EBV 18 1.4.3 Thể tiềm ẩn cùa EBV 13 1.4.4 Các gen ABV thể tiềm ẩn .14 1.4.4.1 EI3NA1 14 1.4.4.2 EBNA2 15 4.4.3 Gia dinh EBNA3 15 1.4 4.4 EBNA - LP ZZZZL 16 1.4.4.5 LMP1 16 1.4.4.6 LMP2A/2B 16 1.5.Yếu tổ ngoại di truyền 17 1.5.1 Methyl hóa ADN diều hòa biểu lộ gcn 17 1.5.2 Methyl hóa ADN promotorcùa EBNA1 18 CHƯƠNG 2: ĐÓI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứu 20 2.1.Thời gian địa điểm nghiên cửu 20 2.2 Đổi tượng nghiên cứu 20 2.2.2 Ticu chuẩn chọn bệnh nhân 20 2.2.3 Tiêu chuẩn loại trừ 21 2.3 Phương pháp chi tiêu nghicn cứu: 21 2.3.2 Biến sổ chi số nghiên cứu: .28 2.3.3 Phương pháp thu thập thông tin 28 2.4 Phương pháp xử lý sổ liệu 29 2.5 Sơ đồ nghicn cửu .29 CHƯƠNG 3: KÉT QƯẢ 30 CHƯƠNG 4: BÀN LƯẬN 39 CHƯƠNG 5: KÉTLƯẶN 40 MỤC LỤC HÌNH Hình l:Sơ dồ cấu trúc cùa EBV .12 Hình 2:Cấu trúc EBNA1 14 Hình 3: Một chế khơng biểu lộ gen methyl hóa ADN .18 Hình 4: Các promoter cúa EBV điều khiển phiên mã EBNA1 19 Hình 5: DNA xử lý bisulfite .22 Hình 6: Ảnh điện di DNA .24 DẶT VÁN DÊ Theo báo cáo tổ chức ung thư quốc tc (IARC - 1903), ung thư vòm mùi họng tám loại ung thư hay gặp [I] Tỷ lệ ung thư vòm mũi họng (UTVMH) thay dổi khác quần thể dàn cư vùng dịa lý khác -W -ÍM Qỉ ugc V Hl the giới Nơi có tỳ lệ ung thư vịm cao miền Nam Trung Quốc Grơnlcn, châu Âu lại có tỳ lệ thấp Các nước dơng nam Á, dó có Việt Nam có tỷ lệ UTVMH trung binh (4) Virut Epstein-Barr (EBV), yếu tổ môi trường khác nhạy câm di truyền dều dược cho liên quan đến nguyên nhân ung thư vòm mùi họng EBV yếu tố dược nghiên cứu nhiều EBV cỏ mặt 100% khối u vòm mùi họng thể ung thư biểu mơ khơng biệt hóa [UCNT] trì thể nhiễm tiềm ẩn I II, dó EBV biểu lộ gcn quan trọng EBNA1, LMP1 LMP2 (7], [35] EBNA1 giúp trì gen EBV tế bào chủ, LMPI lại gcn có chức quan trọng liên quan dên dẫn truyền tin hiệu, chống lại chết theo chương trình cùa tế bào cỏ khả nâng sinh ung thư cho tế bảo bị nhiễm Các gcn nằm cách xa gen EBV dược biểu lộ hoạt hóa promoter khác EBNA1 dược biểu lộ thể nhiễm tiềm ẩn nhờ hoạt hóa promoter: cp, wp Qp Tuy nhiên, ung thư vòm mùi họng hai promoter Cp Wp không hoạt dộng mà chi cỏ Qp diều hịa biểu lộ gen EBNAI [10], [34] Methyl hóa DNA vùng promoter yếu tổ ngoại di truyền cỏ vai trò rẩt quan trọng diều hòa biểu lộ gcn Mức độ methyl hỏa diễn vị trí CpG vùng promoter cxonl cỏ vai trò diều hòa biểu lộ gcn, cỏ thề làm giâm biểu lộ không biểu lộ hồn tồn gcn mà bình thường dược biểu lộ [36] Methyl hóa promoter ngàycàng dược cơng nhận che hàng dầu chi phổi im lặng gcn liên quan đến ƯTVMH [18], [37] Trong nghiên cứu cùa Nguyễn Vãn Đô cs (2006) chi mức dộ biểu gen ức che u CDH13 dòng tế bào UTVMI1 từ mầu sinh thiết tương quan với tình trạng methyl hóa promoter Sự methyl hổa cụ thể dược xác định bàng kỳ thuật PCR dặc hiệu (MSP: Methylation Spccofic PCR) Sự biểu gcn khác thể tiềm ẩn cùa EBV dược quy định bời methyl hỏa hay không -W -ÍM Qỉ ugc V Hl vị trí CpG cùa promoter khác [36] Vi vậy, việc xác định mức độ methyl hóa vùng promoter gcn cỏ thể có ỷ nghĩa quan trọng tìm hiểu chế bệnh sinh cùa bệnh liên quan dến chức nàng gen dó nhiều q trình bệnh lý ác tính Ngồi ra, dùng chất hóa học đe làm methyl hóa cỏ tác dụng làm gen hoạt dộng trờ lại thực chức nâng chúng, giúp cho việc diều trị nhùng rối loạn hay bệnh lý khác Ngày nay, nhờ tiến sinh học phân tử người ta có thề xác dịnh dược mức dộ methyl hóa gcn dặc hiệu hay toàn bộ gcn Các kỳ thuật dựa vào nhùng nguyên lý khác nhau, có kỳ thuật phức tạp, có nhừng kỳ thuật dơn giàn thông dụng [16] Chủng sử dụng kỹ thuật PCR dặc hiệu methyl hóa sau xử lýDNA phương pháp bisulfite dể xác định mức dộ methyl hỏa promoter \Vp,Cp Qp liên quan đến biểu lộ gen EBNA1, dồng thời phát triển PCR da mồi dối với promoter dó Việc phát triển PCR da mồi dặc hiệu methyl hỏa khơng chi giúp ích cho nghicn cứu ngoại di -W -ÍM Qỉ ugc V Hl truyền mửc dộ DNA EBV mà rẩt nhiều gcn khác liên quan đến ung thư, dặc biệt gcn ức chế ung thư Đe tài nlìằm mục ticu sau: / Xác định điều kiên tổi ưu phản ứng PCR đa mồi đặc liiệu methyl hóa phát mức độ methyl hóa promoter Wp, Cp vù Qp cùa ERV té bào (lịng IÌ95-8, Namahva Raji ứng dụng PCR đa mồi đặc hiệu (lể xác (lịnh mức (lộ methyl hóa promoter (liều hòa biểu lộ gen EỈỈNA1 cùa E1ỈV mẫu sinh thiểt ung thư vòm họng -■c -ÍM Qỉ ugc V Hl K Marker H?o Namalwa M K M B95.8 Hình 14 Kei t/ua hãng 3.4 Nồng (lộ Aíg ' cùa cúc phan ừng PCR (ỉa mồi sữ dụng cập mai khàng methyl hóa methyl hóat Nhận xét: Hang 3.4 rể bảo dịng Namalwa B95.8 cho kết quã tốt the bàng rõ nét cá mồi khơng methyl hóa methyl hỏa Hang 3.5 Mửe dộ khàng met hy! hòa methyl hòa cãc promoter cua HHNA / 20 mầu sinh thiềt ung thư vòm họng khác Mầu sinh thiết X \S(n=25) K Promoter M x N % n % Wp 0% 17 68 Cp 19 24 20 76 12 Ọp Nhộn xétĩ Ọp không methyl hỏa hầu hết mầu nghiên cứu Wp methyl hóa hầu hết mầu nghiên cứu, dó \V|> khơng methyl hóa thi khơng xác định dược Cp khơng methyl hóa /25, chiếm tỷ lệ 24 %, Cp methyl hóa xác định dược 5/25 với tỳ lệ thẩp20 % -c -ÍM Qỉ ugc V Hl 5 CIIUƠNG BÀN LUẬN Những biến dổi ngoại di truyền, dó có methyl hóa promoter gcn dang dược nhiều lác già quan tâm Sự methyl hóa có mối liên quan đến biểu lộ gcn Việc xác dinh methyl hóa cho gcn dặc hiệu, sử dụng cảc kỹ thuật khác nhau, dó PCR loại phổ biến nhốt Tuy nhiên, PCR da mồi vần chưa có nhiều cơng trình dược cơng bố Chúng tơi lien hành nghiên cứu methyl hóa promoter diều hịa biểu lộ gen EBNAI, bao gồm \Vp, cp Qp theo phương pháp PCR da mồi Vật liệu nghiên cứu mẩu ADN dược chiết tách từ tế bào dòng mẫu sinh thiết UTVMH Chất lượng ADN dược kiếm tra diện di thạch agarose dược trình bày Hình mật độ quang học Các ADN dược chiết tách lừ te bào dòng có trọng lượng phân từ cao chiết tách từ mầu sinh thict ung thư vòm họng, SŨ dụng quy trình chiết tách khác Tuy nhiên, chất lượng sử dụng cho phản ứng PCR với cập mồi cỏ kích thước nhỏ Các cặp mồi dược thiết ke phần mem chuyên dụng, có khả nâng loại bớt nhừng yếu tố ảnh hường den kỷ thuật cho nhiệt độ gắn mồi dao dộng khoảng nhiệt dộ hẹp tính đến nồng độ Mg++ Theo Nguyền Văn Đó cs, kỹ thuật PCR da mồi dặc hiệu , methyl hóa dà dược sử dụng xác dinh mức dộ methyl hóa gcn ' ức che ung thư (số liệu dà gửi đãng báo quốc te) Đối với gen EBV, tế bào dòng chuẩn Namalwa dược sử dụng dề tìm diều kiện tối ưu, độ nhạy dộ dàc hiệu phàn ứng Dẻ tìm điều kiện lối ưu cho cập mồi phàn ứng PCR, người ta cần phải thử thành phần tham gia nồng độ Mg++, lượng mồi, dNTPs enzyme thành phần khác tham gia Nồng độ cặp mồi dược sù dụng tham kliào từ câc -ÍM Qỉ ugc V Hl nghiên cứu cùa Kct cho thấy với nồng dộ mồi Wp (ND2) cho kết quà tôt nhất, nhiên với dộ phân giải thạch agarose nồng dộ 2.5% dộ sác net chưa cao (Hình A, B, C) Độ nhạy cùa kỳ thuật dựa lượng ADN tương dương ỉ Ooo te bào pha loãng 10 lần Kết quà cho thấy mức dộ methyl hóa dược xác định nồng độ 1000 te bào ket quà tốt thề mức độ dương tính khác dược quy định dấu (+) Cũng phù hợp với nghiên cứu trước chứng Sự tối ưu phàn ứng dà dược xem xét den yểu tổ khác phản ứng PCR, nồng độ Mg++ vài phân ứng khác Hình ? cho thấy kết quà tốt điều kỉcn phàn ứng, có dẩy dủ thành phần PCR thích hợp vả cho bàng phân biệt dược methyl hóa khơng methyl hóa cứa mẫu nghiên cứu Phân ứng PCR da mồi dược ứng dụng dể xác dịnh mức dộ methyl hóa promoter Wp, Cp Qp mẫu sinh thiết ung thư vòm mũi họng Wp methyl hỏa dương tinh hầu hết mầu nghiên cứu, cặp mồi không methyl hỏa lại âm tính hồn tồn Điều dó cỏ the gian tiếp cho thấy methyl hỏa promoter có thề liên quan den biều lộ gen EBNAI mầu ung thư vịm mùi họng, dó ọp yếu tổ chù yếu diều hòa bicu lộ EBNAI trường hợp -W -ÍM Qỉ ugc V Hl Mức độ methyl hóa pro motor \vp Qp phù hợp với nhiều tác già () Riêng Cp, số mẫu khơng xác định dược cà methyl hóa khơng methyl hỏa dột biến vị tri cặp mồi dược thiết kế -ÍM Qỉ ugc V Hl V*: V -*i 4*,: Tài liệu tham khào I Tài liệu tham khảo tiếng Việt Phạm Hoàng Anh, Nguyễn Hoài Nga, Trần Hồng Trưịmg cs (2000) "Tình hình bệnh ung thư Hà Nội giai đoạn 1996 - 1999." Tạp chiy học thực hành, 431 ,tr 4-7 Trần Thị Chính, Phạm Thị Minh Phương, Lê Ngọc Anh, Nguyền Văn Đồ, Đỗ Thị Nguyệt Hằng, Phan Thị Phi Phi cs (2007) "Định typ Epstein - Barr virus mô sinh thiết bệnh nhân ung thư vòm mùi họng kỳ thuật PCR." Tọp chi nghiên cửu y học 50 (4),tr 12-16 Nguyễn Bá Đức, Nguyền Văn Hiếu, Phạm Duy Hiển cs (2000), "Chẩn đoán điều trị bệnh ung thư ", Nhà xuất Y học, tr 100-112 4.Trần Ngọc Dung (2000) "Nghiên cửu thông sổ miễn dịch - sinh học giúp tiên lượng, phát sớm tái phát ƯEVH kết hợp viên M sau xạ trị nhằm giâm tái phát", Luận án Tiến sĩ Y học, Trường đại học Y Hà Nội, Nguyền Thị Bích Hà (1995) "Nghiên cừu giả trị chấn đoán tiên lượng ung thư vòm mùi họng kỹ thuật đặc hiệu IgA kháng VCA EA cùa EBV tể bào diệt tự nhiên máu ngoại vi", Luận án Tien sĩ Y học, Học viện Quân Y, Trần 'Phị IIọ-p cs (1999), "Ung thư vòm mũi họng", Nhà xuất bàn Y học, tr 97-101 Nguyền Hữu Thợi cs (2003), "Ưng Thư vòm mùi họng", Nhà xuất bân Y học, tr 227-237 Nghiêm Đúc Thuận (2002) "Nghiên Cứu Đặc điểm lâm sàng, mô bệnh học hoạt tinh gen virus Epstein - Barr ung thư vòm họng", Luận án Tiến sĩ Y học, Học viện Quân Y, -■c -ÍM Qỉ ugc V Hl 11 Tài lieu tham khảo tiếng Anlì Aitken, c., Sengupta, S.K., Aedes, c., Moss, D.J andSculley, T.B.(I994), Heterogeneity within the Epstein - Barr virus nuclear antigen gene in different strains of the Epstein - Barr virus, J Gen Virol, 75(Pt I), p 95-100 10 Altiok, E., Minarovits, J andllu, L.F.(1992), Hott- eel) -phenotype- depdent control of thr BCR2/BWR1 promoter complex regulates the expression of Epstein Barr viruss nuclear antigens 2-6, Proc Natl Acad Sei USA, 89, p 905-909 I.Ambidcr, R.F., Mullen, M.A., Chang, Y.N., Hayward, G.s andllayward, S.D (1991), Functional domains of Epstein - Barr virus nuclear antigen EBN Al J Virol, 65(3), p 1466-1478 12 Andersson - Anvret, M., Klein, G., Forsby, N andHcnlc, w.(1978), The Association between undifferentiated nosopharygeal carcinoma and Epstein - Barr virus shown by correlated nucleic acid hybridization and histopathological studies., I ARC Sei Pitbl, p 347-357 13 Burwell, J,, Boclikcrcv, A., Pfuetzner, R., Tong, II., Yang, D., Frappicr, L andEdwards, A.(1995), Prification and crystallization of the DNA - binding and dimerization main of the Epstein - Barr virus nuclear antigen 1, J Bio.Chem, 270„ p 20556-20559 14 Bedforrd, M.T andRichard, S(2005), Arginine methylation an emerging regulator of protein function Mol Cell, 18, p 263-272 15.Chang, E.T and Adami, 11.0.(2006), The Enigmatic epidemiology of nasopharygeal carcinoma Cancer Epidemiol Biomarker Prev, 15(10), p 1765- 1777 16.Christina, Dahl andPer, Guldbcrg(2003), DNA methylation analysis techniques, Biơgerontolgy, 4, p 233-250 17.Degranges, T.C., Li, J.Y andDe, T.(1977), EBV specific scctetory IgA in saliva of NPC patients Presence of secretory piece in epithelial malignant cells, Ini J Cancer, 20(6), p 881-886 18 Fharcus, R., Fu, ILL., Ernbcrg, I., Finke, J andRowc, M.( 1988), Exspression of Epstein - Barr virus - encoded proteins in nasopharyngeal carcinoma, hit J Cancer, 42» p 329-338 19 Fingeroth, J D., Weis, J J., Tedder, T F., Stromingcr, J L., Biro, p A andFearon, D T.(1984), Epstein - Barr virus receptor of human B lymphocytes is -■c -ÍM QỈ Hgc V Hl Cd3 receptor CR2, Proc Natl Acad Sei USA, 81, p 4510-4514 20 Furukawa, M., Komori, T., Ishiguro, II andưmcda, R.(1986), Epstein - Barr virus early antigen induction in nasopharygeal hybrid cells by Chinese medicinal herbs, Anris Nasus Larynx, 13(2), p 101-105 21 Goldsmith, D.B., West, T.M andMornton, R.(2002), I ILA associations with nasopharygeal carcinoma in Southern Chinese : a metaanalysis, Clin Otolaryngol Allied Sei, 27(1), p 61-67 22 Hennessy, K., Fenncwald, s., Cole, T andKieff, E (1984), A membrane protein encoded by Epstein - Barr virus in latent growth - transforming in fection Proc Natl Acad Sei USA, 81(22), p 7202-7211 23 Hennessy, K andKieff, E.( 1983), One of two Epsticn - Barr virus nuclear angtigens contais a glycine - alanine copolymer domain Proc Natl Acad Sei USA, 80(18), p 5665-5669 24 Joab, I andNicolas, J.( 1991), Detection of anti- Epstein - Barr virus transactivator (ZEBNA) antibodies increase from paticns with nasopharygeal carcinoma, hit J Cancer, 48, p 647-649 25 Li, Q., Spriggs, M.K., Kovats, s., Turk, S.M., Comeau, M.R., Nepom, B andl I Utt-Flotclicr, L.M.(I997), Epstein - Barr virus uses HLA classll as a cofactor for infection of B lymphocytes ,J Virol, p 4657-4662 26 Miller, We andEhar, T.N.( 1995), The Epstein - Barr virus latent membrane protein I induces expression of the epidermal growth factor receptor, I J Virol, 69, p 4390-4398 27 Miyamoto, K andUshijima, T.(2005), Diagnostic and therapeutic ỵ V applications of cpigcnctics, Jpn J Clin Oncol, 35(6), p 293-301 I I I -■c -ÍM «£ Hgc V Hl 28 Muray, P.G andYoung, L.S.(2002), The role of the Epstein - Barr virus in human disease Front Biosci 7, p 519-540 29 Nielsen, N.I1, Mikkclscn, F andllanscn, LP(1977), Nasopharygeal cancerin Greenland The incidence in an Arctic Eskimo population, Acta Pathol Microbiol Scand A, 85(6), p 850-858 30 o Rourke Anne, M andMcschcr Matthew, F., (1993),The role of CDS in cytotoxic T lymphocyte funtion immunology today, p 183-187 31 Pathnamathan, R andTraub, Raab (1997),Epstein - Barr virus bĩasopharygeal Carcinoma, p 14-23 32 Reddy, S.P., Raslan, W.F., Goonerantnc, s., Kathuria, s andMarks, J.E.(1995), Prognostic significance of kcratinization in nasopharyngeal carcmoma Am J Otolaryngol, 16(2), p 103-108 33 Rickinson, A.B., E., Kicff, B.N., Field, D.M., Knipe andP.M., I Iowlcy(2001), Epstein-Barr virus in virolory, Lippincott - Raven, p 2575- 2627 34 Roberson, K.D., Hayward, S.D., Ling, P.D., Samid, D andAmbider, R.F (1995), Transcriptional activation of the Epstein - Barr virus latency c promotor after 5azacytidin treament: evidence that demethyllation at a single CpG site is crucial, Mol Celt Biol, 15, p 6150-6159 35 Robertson, E.S., Lin, J andKicff, E.(1996), The amino - terminal domains of Epstein - Barr virus nuclear proteins 3A, 3B, and c interact with RBPJ (kappa), J Virol, 70(5), p 3068-3074 36 Salamon, D., Takacs, M andUjavari, D.(2001), Protein - DNA binding and CpG methylation at nucleotide resolution of latency - asscociated promoters Qp, Cp, an LMPlp of Epstein- Barr virus, J Virol, 75, p 2548-2596 37 Tierney, R.J., Steven, N andYoung, L.s.(1994), Epstein - Barr virus latency in blood mononuclear cells: analysis of viral gene transcription during primary infection and in the carrier state, J Virol 68, p 7374-7385 ‘38 Timothy, T.c and Roger, K E.(l 994), A possible Progsnostic role of Immunoglobulin G- antibody against reconbinant Epstein - Barr virus: BZLF-1 Trasactivator protein ZEBRA in patients with Nasopharygeal carcinoma, Cancer, 74(9), p 2414-2423 I 39 Tugizov, S.M., Bcrlinc, J.w andPalcfsky, J.M.(2003), Epstein - Barr virus infection of polarized tongue and nasopharygeal cphithelial cells, Nat Med, 9, p 307-314 40 Woisctschdacgcr, M., Jin, X.W., Yandava, C.N., Furmanski, L.A andStrongmingcr, J.L.(1991), Role for the Epstein - Barr virus nuclear antigen in viral promoter swiching during initial stages of infection Proc Nat/ Acad Sci USA, 88, p 39423946 41 Zeng, Y., Zhong, J.M., Li, L.Y., Wang, P.Z., Tang, IL, Ma, Y.R., Zhu, J.S., Pan, W.J., Liu, Y.x andWci, Z.N.(1983), Follow - up studies on Epstein - Barr virus IgA /VCA antibody - positive persons in ZangWu Country, China, Intervirolory, 20(4), p 190-194 I i / z f i r Danh sách bệnh nhân Họ Tên Tuổi Giới ST T Địa chì Ngày vào khám Bùi Văn lòa 58 Nguyễn Văn Dân 52 Na m Na 'Thanh Hóa 07/07/2011 Cầm Giang, Hài 13/07/2011 m Dương Thái Hòa, Nghệ An 13/07/2011 Việt Tri 14/07/2011 Nguyen Văn Vinh 51 Nguyễn Văn Hùng 39 Na m Na Phạm Thị Xoa 46 m Nữ Vụ Bủn, Nam Dịnh 21/07/2011 Hồng Văn Xít 58 Lụng Sơn 25/07/2011 Lèo Văn Lâm 54 Na m Na Bắc Giang 27/07/2011 Nông Văn Thao 34 Cao Băng 27/07/2011 Vù Văn Minh 19 m Na m Na Hải Phòng 15/08/2011 10 Trần Thanh Nhất 23 Hả Nội 15/08/2011 11 12 Nguyen Đức Long 155“ m Na m Na Hịa Bình 17/08/2011 Nguyến Thị Kim 54 m Nữ Vĩnh Phúc 17/08/2011 Liên 13 Iran Thị Mai 43 Nừ Hài Phòng 17/08/2011 14 Nguyen Thị Cúc 40 Nử Hài Dương 18/08/2011 15 HỔ Sĩ Trị 53 Yên Thanh, Nghệ An 18/08/2011 14 Nguyền Vùn Thi 43 Na m Na Bắc Giang 18/08/2011 17 Nguyen Dinh Thiệu 59 Hà Nội 22/08/2011 18 19 Định Thị Nguyệt 33 m Na m Nừ Quáng Bình 22/08/2011 Vương Thị Miên 42 Nữ Hà nội 22/08/2011 20 Nguyen Minh Hài 24 Hà Nội 22/08/2011 21 Trân Ngọc Thô 71 Na m Na Thanh Hỏa 23/08/2011 22 23 Bùi Ngọc Kỳ 33 Hà nội 23/08/2011 Kim Văn Cành 64 m Na m Na Vĩnh Phúc 23/08/2011 m -W -ÍM Qỉ ugc V Hl H& 24 Nguyễn Trọng Duật 25 Nguyễn Hữu Hoàn 22 41 Na m Na m Na Hà lĩnh 24/08/2011 Quảng Ninh 24/08/2011 26 27 Nguyen Thọ Thơng 49 Thanh Hóa 24/08/2011 Trương Văn Miên 57 Thải Bỉnh 25/08/2011 40 m Na m Nữ 28 29 Bùi Thị Nhấn Hịa Bình 30/09/2011 Nguyen Thị Tơ 55 Nừ Thanh Hỏa 24/10/2011 Hà Nội, Ngày Tháng Năm 2012 -■c ÌẠ: .C — >A: Xác nhận thầy hướng dần Xác nhận cùa phòng ké hoạch tống hợp % * ị * I TS Nguyền Văn Đô I I /ị / < ị ị ... / Xác định điều kiên tổi ưu phản ứng PCR đa mồi đặc liiệu methyl hóa phát mức độ methyl hóa promoter Wp, Cp vù Qp cùa ERV té bào (lịng IÌ95-8, Namahva Raji ứng dụng PCR đa mồi đặc hiệu (lể xác. .. hóa học dược bồ sung vào tế bào Chúng phát triển kỳ thuật PCR da mồi dặc hiệu methyl hóa mơ hình cùa EBV ung thư vịm mũi họng, dồng thời ứng dụng cho nhiều gcn khác bệnh lý khác Đe xác dinh methyl. .. Bisulfite -20°C 2.3.1.4 Xác địnli mức độ methyl hỏa vùng Promoter EỈÌNA1 kỹ thuật PCR đa mồi methyl hóa (MultiplexMethyỉation Specific PCR - MMSP) •> Kỳ thuật PCR dặc hiệu methyl hóa - Nguyên tắc: