TKf V*: -u LỊÌ CÁM ƠN Trước hết tịi xin bày tị lơng tri ơn sâu sắc tới ThS Nguyền Thị Phương Thúy Giang viên Bộ môn Hỏa sinh làm sảng Khoa Kỳ thuật Y hợc, Trường Đại học Y Hã Nội người thầy, người Inrớng dản khoa học tận tinh giúp (lờ động viên tòi suốt trình học lụp trục tiểp hướng dần tơi thực nghiên cửu góp ý sửa chừa luận văn Tỏi xin gửi lởi câm ơn chân thành tới cãc thầy cô cãc anh chị nhàn viên Trung tâm xét nghiệm da khoa Chcmedic dã nhiệt tính hướng dần giúp dờ tạo diều kiện dê cỏ cãc số liệu luận vãn Tôi xin gửi lởi cam ơn tới Ban giám hiệu Phông Quan lỷ tạo Dại học Bộ mơn Hồ Sinh lảm sàng Khoa Kỳ thuật Y học Trưởng Dại Học Y Hà Nội đâ tạo điều kiện thuận lợi cho tỏi suốt quãng thời gian học tập trường Cuối cũng, tơi xin cam ơn cịng ơn sinh thành, ni dường tinh yêu thương cua bỗ mọ tỏi úng hộ dộng xiên tòi phẩn dấu dề tỏi yén tâm học tập hoàn thành luận ván Dù dã cố gang dế thực khóa luận cách tốt nhắt, lã lần dầu tiên thực nghiên cứu tầm hiểu biết, kiến thức côn hạn hẹp nén khóa luận cua tịi cịn nhiều thiếu sót Tỏi mong nhận dược nhùng ý kiến dóng góp quỳ bảu cua thầy cị bạn dê khỏa luận dược hồn thiện hem Tơi xin chân thảnh cam ơn! Hà Nội ngày ỉ ỉ tháng năm 2021 Nguyễn Thị Loan LỜI CAM ĐOAN Tôi Nguyền Thị Loan, sinh viên năm cuối chuyên ngành Xét nghiệm Y học Trưởng đại học Y Hà Nội xin cam đoan: Đây luận văn ban thân tòi trực tiếp thực hướng dần cua ThS Nguyền Thị Phutmg Tliúv Giang viên Bộ môn Hỏa sinh làm sàng Khoa Kỳ thuật Y học Trường Dại học Y Hà Nội Tôi cam doan rang nhửng sổ liệu nghiên cúu lã cô thật trực tiếp thực Trung tám xẽt nghiệm đa khoa Chemedic Kct qua thu thập dược nghiên cứu không nùng lạp với bầt kỳ tạp clũ hay cóng trinh khoa học trưởc Các tài liệu trích đản đà cơng nhận Tịi xin hồn tồn chịu trách nhiệm tnrớc pháp luật nhùng cam kết Hà Nội ngày ỉ thùng nám 2021 Người vict cam đoan Nguyễn Thị Loan DANH -MỤC TỪVIÉT TẢT RLCHBS Rối loạn chuyển hóa bầm sinh PCR Polymerase Chain Reaction (Kỳ thuật khuếch đại gen) DNA Deoxynucleic acid FAOD Fam- acid oxidation disorder (Rối loụn q trình oxy hóa acid béo) CPTI Carnitine palmitoyltransferase I CPTII Carnitine palmitoyltransferase II CACT Carnitine acylcamitine translocase RFLP Restriction Fragment Length Polymorphisms dNTP Deoxynucleotide Triphosphate ddNTP Dideoxynucleotide Triphosphate NST Nhiễm sắc the Tn Teampreture melting (Nhiệt độ nóng chay) Ta Teampreture annealing (Nhiệt độ gán mồi) MỤC LỤC KIẾN NGHỊ .39 TÀI LIỆU THAM KHAO DANH MỤC BÁNG Bảng 1.1: VỊ trí exon trẽn gen CPTII 12 Bang 12: VỊ trí exon trèngen SLC25A20 TM/ V*: 15 DANH AIỤC HÌNH TM/ V*: DẠT VÁN DÈ Rối loạn hấp thu Carnitine nhỏm bệnh thiểu hụt enzyme cua q trinh p oxy hóa acid béo dẫn tới khơng sân xuất dược nàng lượng từ nguồn dự trừ chất béo cua cư thê [1] Nguyên nhân lả dột biến gen mà hỏa cho cãc enzyme tham gia vào q trinh chun hóa chắt béo dơ bệnh thiều hụt Carnitine palmitoyltransferase II (CPT n) bệnh thiếu hụt Carnitine acylcamitine translocase (CACT) hai bệnh cỏ dặc diem lãm sàng tương tự có liên quan với cư che gảy bệnh rỗi loạn hấp thu Carnitine Bệnh thiểu hụt CPT u bệnh lý di truyền lặn nhiễm sầc thê thường đột bicn gen CPT II nằm trẽn nhành ngần nhi cm sằc thê số mà hóa enzyme CPT II CPT II enzyme gản màng cua ti the giúp chuyên dạng Acyl- camitine thành Acyl-CoA tham gia vào trinh oxy hóa acid béo đe tạo thành nâng lượng dồng thừi giai phóng carnitine Đen ba the lảm sảng cua bệnh đà dược mõ ta bao gồm: dạng sư sinh gảy tử vong, dạng cư tim nặng trê sư sinh dạng (thưởng nhọ vá cõ the biểu từ giai đoạn sơ sinh đền trương thãiih) [2] Bệnh thiếu hụt CACT lả bệnh lý di truyền lặn nhiềm sắc the thưởng dột biến gen SLC25A20 nầm nhánh ngan nhiêm sắc thè số CACT lã enzym gắn màng ty the có nhiệm vụ vận chuyên Acyl carnitine từ vảo ty thê đê tham gia trinh oxy hóa acid bẽo đồng thời vận chuyên carnitine khời ty the Bệnh thiếu hụt CACT có hai thè lảm sàt§: the nặng khơi phát tre sư sinh the nhẹ Ca hai dọng dặc tnmg bơi tinh trạng co giật nõn hôn mẽ hạ huyết ảp bệnh lim, yếu loạn chức náng gan suy hơ hấp dó bệnh nhãn dạng nhọ dãp ứng tốt với diều trị [3] [4] Đột biến gen CPT H/SLC25A2O làm gỉàm mắt hoạt độ cua enzyme CPT II/CACT dần đen khơng chun hóa acid béo dế tạo nâng lượng Hiện 90 đột biến gáy thiểu hụt CPT II khoáng 41 đột biền gảy thiếu hụt CACT đà TM/ V*: 88 xác định Bệnh gây hậu nghiêm ưọng không chân đoán, điều trị kịp thin dặc biệt dồi tượng tre SƯ sinh Chân đoán bệnh thiếu hụt CPT II/ CACT dựa triệu chúng lâm sàng kết hụp với xét nghiệm hóa sinh chi chương trinh sàng lọc ban dầu chưa chắn đoán xác định bệnh Trong nhùng năm gần đây, xu hướng nghiên cúu chuyên sáu chế bệnh sinh mức độ phản tư hứa hẹn làm tiền đề triển khai chân đoán trước sinh liệu pháp điều trị gen dồng thời giúp xác định quan lý tốt lum nhùng người mang gen gảy bệnh Bệnh nhân dược chân đoán xác định bệnh bang cách xác định dột biển ưẽn gen CPT H/SLC25A20 thòng qua kỹ thuật sinh học phàn tử như: Kỳ thuật khuếch dại chuỗi gen (PCR) hay giai trinh tự gen (Sequencing) Kỳ thuật PCR giúp xảc định xác dặc hiệu dột biến gen gày thiếu hụt CPT II/CACT bệnh nhàn nghi ngừ mầc bệnh Tuy nhiên muốn ãp dụng kỹ thuật PCR xác định dột bicn gen CPT n/CACT vào chân đoản bệnh cằn phai đâm bao òn định cua kỳ thuật vi PCR bị anh hương nhiều yếu tố cô the làm giám hiệu qua cua phan ứng Chinh vi chúng tơi thực dề tài: “Tối ưu hóa quy trinh kf thuật PCR khuếch đại số exon gcn CPT II SLC25A20” nhằm hai mục tiéu: ỉ Tối ưu hóa nhiệt (tộ gắn mồi (Tj nồng độ mồi ĩrong PCR khuếch dại gen CPTII SLC25A20 Tồi ưu hòa số chu kỳ nhiệt PCR khuếch dụi gen CPT II SLC25A20 CIIƯONG TỐNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh rối loạn chuyền hóa acid béo bẩm sinh Rối loạn chuyên hóa bẩm sinh (RLCHBS) lả thuật ngừ Achibal Garrod dưa dê mõ tá bệnh lý di truyền phân tư loạn VC cẩu trúc gen dẫn tới khiếm khuyết khác trinh chuycn hóa như: thiểu TM/ TC V*: V*: enzym receptor, protein vận chuyến vả đồng yểu tổ (Cofactor) Cho den khoáng 1000 loại RLCHBS dà phát hiện, cỏ nhiều cách phân loại cãc bệnh RLCHBS khác cách phân loại theo hõa sinh bệnh học sinh lý bệnh học có ỷ nghía thực tiền lâm sảng dược sư dụng nhiều [1] Theo câc đường chuyến hóa bán cỏ the chia RLCHBS thành nhóm: RLCHBS Caibohydrate: Lã dạng rối loạn ưong tơng hợp phản giái Glycoside hay Alcohol the Dạng RLCH xuất tre án sỗ loại Carbohydrate; RLCHBS acid bẽo: Là bệnh thiếu hụt cãc enzym tham gia vào trinh |l oxy hóa acid béo dần dến không sứ dụng dược nguồn nâng lượng dự trử từ acid bẽo cùa the; RLCHBS protein gồm: RLCHBS acid hữu acid amin vã chu trinh ure; RLCHBS acid amin lâ nhùng bệnh lý thiểu hụt enzym tham gia vào chuyên hỏa cãc acid amin Bệnh dược dặc trưng bới tâng acid amin dặc hiệu máu vã nước tiểu Acid oxy hỏa bẽoxương acid béo lượng dưỡng chinh quan cua trọng dê thê Quá tri trinh cân bang bap nội môi tháng lượng omquan sot, thê nhịn án 80% lâng hoạt lượng dộng cho tim acid béo dóng vànguồn gan vai có trỏ dược trọng lấy từ chúng đáy lã Ởduy dộ trê tuồi SƯ cỏ sinh dự trừ TM/ V*: glycogen cịn hạn chế tý lộ trao dơi chất cao Qúa trình oxy hóa acid béo tạo acetyl- CoA cung cấp lượng cho mõ kliãc nguồn dự trừ glycogen cạn kiệt Các acid béo trung binh ngắn dược vận chuyên trực tiếp vào tế bão ti thê Các acid béo chuỗi dãi sè liên hợp với Carnitine dê vận chuyên qua mảng ty thê vã dược giai phóng dwg Acyl- CoA dược sứ dụng đường p-oxy hỏa acid béo [5] Rối loạn q ưình oxy hóa acid béo (F AOD) có thê xay bước não cúa đường p-oxy hóa acid béo ty thê anh hương đến chức nâng cua màng nguyên sinh chẩt vận chuyên acid béo vào ty thê dường p-oxy hóa acid bẽo chuồi ngăn, trung binh dài Dựa nguyên nhân gây bệnh có thê phán loại bệnh sau: - Rồi loạn mãng nguyên sinh chất: Do thiếu hụt Carnitine khiếm khuyết liên kểt/ vận chuyến với acid béo chuồi dãi - Rối loạn vận chuyên acid béo qua màng ty thê do: + Thiếu hụt CPT (Carnitine palmitoyltransferase) + Thiết hụt CACT (Camitine-ac>icamitine translocase) + Thiếu hụt CPTII (Carnitine palmitoyltransferase II) Rối loạn trinh p-oxy hóa acid béo: + Thiếu VLCAD (Acyl-CoA dehydrogenase chuỗi dải) - Thiếu protein ba chức nâng ty the (NÍTP)Thiếu hụt 3-Hydroxyacyl- CoA dehydrogenase chuỗi dài (LCHAD)'Thicu hụt 3-Ketoacyl-CoA Thiolase chuồi dả (LCKAT) Rối loạn q trình oxy hóa add béo chuỗi trung bình: - Thiếu hụt MCAD (Acyl-CoA dehydrogenase chuồi trung binh) - Thiêu hụt 3-Hydroxyacyl-CoA dehydrogenase chuồi binh ngắn - Thiếu hụt 3-Ketoacyl-CoA Thiolase chuồi trung binh - Rối loạn trinh p-oxy hóa acid bẽo chuỗi ngấn: Thiếu hụt SCAD (Acyl- TM/ V*: 39 7_SLC25A20 có sán phẩm PCR bàng sáng cỏ kích thước với thiết kề; độ sáng cùa Exon 5_CPT II thấp sơ với Exon cịn lại Khơng thấy báng sáng Exon 4_CPT II - PCR vởi 35 chu kỳ nhân lên: Exon 5-CPT II: Exon 5-SLC25A20 Exon 7_SLC25A20 cỏ sán phẩm PCR bảng sáng có kích thước với thiết kế; độ sáng cua Exon SLC25A20 thấp lum so với Exon cịn lại Khơng thay báng sáng Exon CPT II - PCR vởi 40 chu kỳ nhàn lên: Ca Exon 4_CPT II: Exon 5CPT II; Exon 5SLC25A2O Exon SLC25A20 có sán phẩm PCR lã bảng sáng gọn, sắc net có kích thước với thiết 3.4 Kết quà PCR khuếch dại gen CPT II vã SLC25A20 số exon khác hai gen sứ dụng điều kiện tồi ưu dã xác định Sau kháo sát điều kiện PCR phân tích Exon 4_CPT II; Exon CPT II; Exon SLC25A20 vả Exon SLC25A20 nghiên cứu de xuẩt quy trinh kf thuật PCR với điều kiện tối ưu sau: + Nhiệt độ gắn mồi: 53°c + Nồng độ mỗi: 0.5 pmol/L + Số chu kỳ nhiệt: 40 chu kỳ Áp SLC25A20 dụng quy thu trinh cho cxon lại cua gcn CPT II dược kết qua sau: TM/ V*: 40 Hitt II 3.4: Kct PCR kltitềch dại exon Clia gen SLC25A20 exon gen CPTII sir dụng quy trinh PCR dã tối ưu hóa + M: Marker + Giềng Exon SLC25A20: + G/ểng 2: Exon 5-SLC25A20; * Giềng Exon 8SLC25A20: * Giêng Exơn I CPTỈỈ + Giêng 7: Exon 2_CPTH + Giềng ỉ: Exon _ SLC25A2O; + Giỉng8:Exonĩ_CPTII ' ơiéng 4: Exon SLC25A20; * Gi