Gan tụy là nơi bị hoại nặng nhất làm mất chức năng tiêu hóa và gây chết.Trong ương giống, bệnh thường xuất hiện ở môi trường nước giàu dinh dưỡng, nhiều chất hữu cơ, xác bã.Trong sản xuấ[r]
Mục tiêu của đề tài
Xác định thành phần loài và vi khuẩn phân lập từ tôm thẻ chân trắng là nghiên cứu quan trọng, cung cấp cơ sở khoa học cho việc phòng ngừa và điều trị bệnh vi khuẩn trên tôm Việc hiểu rõ các loại vi khuẩn có thể gây hại giúp nâng cao hiệu quả quản lý sức khỏe tôm nuôi, từ đó giảm thiểu thiệt hại kinh tế trong ngành thủy sản.
Nội dung của nghiên cứu
- Quan sát gan tụy bằng cảm quan và phết kính
- Phân lập và định danh vi khuẩn từ gan tụy tôm thẻ chân trắng.
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: từ tháng 1-7/2012 Địa điểm: Phòng Thí nghiệm Bộ môn Sinh học và Bệnh Thủy Sản, KhoaThuỷ Sản, Trường Đại Học Cần Thơ.
2.1 Sơ lược về tình hình nuôi thủy sản
Nghề nuôi trồng thủy sản có lịch sử lâu dài nhưng phát triển rõ nét hơn trong những năm gần đây Tổng sản lượng thủy sản đã tăng nhanh chóng, từ 116,1 triệu tấn năm 1995 lên 144 triệu tấn năm 2006, với mức tăng trung bình 7,6% mỗi năm trong giai đoạn này Sản lượng nuôi trồng thủy sản đạt 24,6 triệu tấn, cho thấy sự phát triển mạnh mẽ của ngành này.
1995 (21,2% tổng sản lượng thủy sản trên toàn thế giới) và 50 triệu tấn vào năm 2006 chiếm 34,7% (Lê Xuân Sinh, 2010).
Nghề nuôi tôm ven biển đã trở thành động lực quan trọng cho sự phát triển kinh tế của nhiều quốc gia trong những năm gần đây, bao gồm Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ, Philippines, Việt Nam và Ecuador.
Nghề nuôi trồng thủy sản ngày càng quan trọng trong phát triển kinh tế xã hội toàn cầu, với sản lượng tôm nuôi thế giới từ 50.000 tấn năm 1975 đã tăng lên 200.000 tấn vào năm 1985, trong đó 70% đến từ Châu Á Đến năm 1988, sản lượng đạt 450.000 tấn, nhưng từ năm 1995, sự tăng trưởng chậm lại do dịch bệnh virus toàn cầu Dù vậy, nhờ áp dụng công nghệ mới, sản lượng tôm toàn cầu năm 1996 đã đạt 900.000 tấn Đến năm 2000, tổng sản lượng tôm nuôi đạt 45,71 triệu tấn, tăng 6,3% so với năm 1999, và năm 2001 đạt 48,42 triệu tấn Năm 2002, sản lượng nuôi trồng thủy sản toàn cầu, bao gồm thực vật thủy sinh, đạt 51,4 triệu tấn với giá trị 60 tỷ USD, tăng 6,1% so với năm 2000, trong đó các quốc gia Châu Á chiếm 91,2% tổng sản lượng, với Trung Quốc dẫn đầu, chiếm 71,2% sản lượng thế giới (FAO, 2006).
Bờ biển Việt Nam dài 3.260km từ Bắc vào Nam tạo điều kiện thuận lợi cho nuôi trồng thủy sản nước mặn và nước lợ Diện tích nuôi tôm đã tăng mạnh từ 50.000ha vào năm 1985 lên 295.000ha vào năm 1998, với sự phát triển của 30 tỉnh có hoạt động nuôi tôm sú (Bộ Thủy sản 1999).
Ngành thủy sản Việt Nam đã trải qua nhiều giai đoạn phát triển và ngày càng khẳng định vị thế của mình qua từng năm Diện tích nuôi trồng thủy sản liên tục gia tăng, từ 230 nghìn ha vào năm 1981 lên 384,6 nghìn ha trong những năm gần đây.
Từ năm 1981 đến 2003, ngành thủy sản Việt Nam đã có sự phát triển mạnh mẽ Năm 1981, tổng sản lượng thủy sản chỉ đạt 596.356 tấn, trong đó khai thác đạt 416.356 tấn và nuôi trồng đạt 180.000 tấn, với kim ngạch xuất khẩu chỉ 11,2 triệu USD Đến năm 1986, tổng sản lượng đã tăng lên 840.906 tấn, kim ngạch xuất khẩu đạt 100 triệu USD Năm 1991, diện tích nuôi trồng thủy sản đạt 520.000 ha, sản lượng 335.910 tấn, và đến năm 1996, diện tích này đã tăng lên 585.000 ha với sản lượng 411.000 tấn Năm 2000, diện tích nuôi trồng đạt 652.000 ha, sản lượng 723.110 tấn, và đến năm 2003, tổng sản lượng thủy sản đã đạt 2.536.361 tấn, kim ngạch xuất khẩu lên tới 2.240 triệu USD Diện tích nuôi tôm cũng tăng từ 250.000 ha năm 2000 lên 959.900 ha vào năm 2005, với sản lượng tôm TCT tăng từ 10.000 tấn năm 2002 lên 30.000 tấn năm 2003.
2004 đạt sản lượng 50.000 tấn(FAO,2004)
Diện tích nuôi trồng thủy sản nước mặn và lợ ở Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chủ yếu tập trung tại các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Trà Vinh, Kiên Giang và Bến Tre Đến năm 2008, tỉnh Cà Mau có diện tích nuôi trồng đạt 248.957 ha, Bạc Liêu 125.529 ha, Kiên Giang 90.253 ha, Sóc Trăng 47.918 ha, Bến Tre 35.692 ha và Trà Vinh 56.424 ha.
Bảng 2.1: Diện tích nuôi thủy sản nước mặn, lợ vùng ĐBSCL (đơn vị tính ha)
Bạc Liêu 115.616 116.791upload.123doc.net.095119.802 125.509
Toàn vùng 537.795 581.491 586.123 595.577 617.341 (Nguồn: Sở thủy sản, Sở Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn (2008)
2.2 Tổng quan về tôm thẻ chân trắng( Penaeus vannamei Boone, 1931) 2.2.1 Đặc điểm phân loại và phân bố
Loài: Litopenaeus vannamei Boone, 1931 hay Penaeus vannamei Boone, 1931
Tên tiếng Anh: White leg shrimp
Tên tiếng Việt: Tôm bạc Thái Bình Dương, Tôm chân trắng (theo FAO), ở Việt Nam thường gọi là Tôm chân trắng.(Trần Viết Mỹ,2009)
Tôm thẻ chân trắng là loài bản địa ở đông Thái Bình Dương từ Sonora ở
Mexico đến bắc Peru, chủ yếu phân bố ở khu vực Mỹ Latinh và Hawaii Hiện nay, loại cây này đã được nuôi trồng ở nhiều quốc gia trên thế giới, bao gồm Đài Loan, Trung Quốc và Việt Nam.
2.2.2 Đặc Điểm sinh thái và tập tính sống:
Tôm chân trắng là loài tôm nhiệt đới, có khả năng thích nghi với giới hạn rộng về độ mặn và nhiệt độ.
Tôm có khả năng thích nghi với độ mặn từ 0,5 đến 45 ‰, nhưng mức độ tối ưu là từ 7 đến 34 ‰, với sự tăng trưởng tốt nhất ở độ mặn 10–15 ‰ Nhiệt độ lý tưởng cho sự phát triển của tôm dao động từ 23 đến 30°C, trong đó nhiệt độ tối ưu cho tôm nhỏ (1g) là 30°C và cho tôm lớn (12–18g) là 27°C Tuy nhiên, tôm có nguy cơ cao mắc các bệnh do virus như bệnh đốm trắng và hội chứng Taura khi sống trong điều kiện nhiệt độ thấp.
Tôm chân trắng sinh sống chủ yếu ở các vùng biển tự nhiên có đáy cát bùn, với độ sâu dưới 72m, tập trung nhiều ở ven biển gần bờ Tôm con thường phân bố tại các cửa sông, nơi có nguồn dinh dưỡng phong phú Chúng hoạt động chủ yếu vào ban đêm để kiếm ăn, trong khi ban ngày thường vùi mình trong bùn Trong điều kiện thí nghiệm, hiện tượng tôm ăn thịt lẫn nhau rất hiếm gặp.
2.2.3 Đặc điểm dinh dưỡng và tăng trưởng
Tôm chân trắng là loài ăn tạp, chủ yếu tiêu thụ động vật, với khẩu phần ăn đa dạng và khả năng săn mồi mạnh mẽ Chúng có thể sử dụng nhiều loại thức ăn tự nhiên có kích thước phù hợp, từ mùn bã hữu cơ đến các động và thực vật thủy sinh.
Nhu cầu protein trong khẩu phần thức ăn cho tôm chân trắng (20 – 35%), thấp hơn so với các loài tôm nuôi cùng họ khác (36 – 42%)
Theo nghiên cứu của Thái Bá Hồ và Ngô Trọng Lư (2003), tôm có khả năng chuyển hóa thức ăn rất hiệu quả Trong điều kiện nuôi lớn bình thường, lượng thức ăn cần cung cấp chỉ chiếm 5% trọng lượng cơ thể của tôm.
Tôm có tốc độ tăng trưởng nhanh, trong điều kiện nuôi, với môi trường sinh thái phù hợp, tôm có khả năng đạt 8 - 10g trong 60 - 80 ngày, hay đạt 35 - 40g trong khoảng
180 ngày Tôm tăng trưởng nhanh hơn trong 60 ngày nuôi đầu Sau đó, mức tăng trọng giảm dần theo thời gian nuôi.
Tôm chân trắng thường lột xác vào ban đêm, với thời gian giữa hai lần lột xác dao động từ 1 đến 3 tuần Đối với tôm nhỏ dưới 3g, trung bình mỗi tuần lột xác một lần Khi tôm lớn hơn, khoảng 15 đến 20g, thời gian lột xác kéo dài hơn, trung bình là 2,5 tuần một lần.
2.3 Tình hình dịch bệnh trên tôm
Từ những năm đầu thập niên 90, nghề nuôi tôm công nghiệp tại Việt Nam đã phát triển mạnh mẽ, nhưng cũng đồng thời xuất hiện "dịch bệnh" tôm Theo thống kê của Bộ Thủy sản vào năm 1995, từ năm 1993 đến 1995, dịch bệnh tôm đã gây thiệt hại nghiêm trọng trên toàn quốc, ước tính lên đến hàng ngàn tỷ đồng Cụ thể, trong năm 1994, tổng diện tích nuôi tôm bị ảnh hưởng bởi dịch bệnh lên tới 84.558ha, với sản lượng thiệt hại ước tính rất lớn.
Tính đến hiện tại, dịch bệnh đã gây ra thiệt hại nghiêm trọng với tổng khối lượng lên đến 5225 tấn và giá trị khoảng 294 tỷ đồng Tình hình dịch bệnh vẫn tiếp tục lây lan, đặc biệt nghiêm trọng nhất tại đồng bằng sông Cửu Long Tôm, loài thủy sản dễ mắc bệnh, thường gặp rủi ro chết trong khoảng thời gian từ 1.5 đến 2 tháng tuổi.
Trong năm 2008, tại ĐBSCL có 148.000 ha tôm bị chết, tập trung tại Cà Mau với 57.789 ha, Kiên Giang 40.000 ha, Sóc Trăng 28.000 ha, Bạc Liêu 19.000 ha(Huỳnh Thế Anh,2010).
Sơ lược về tình hình nuôi thủy sản
Ngành nuôi trồng thủy sản có một lịch sử lâu dài, nhưng sự phát triển rõ nét của nó chỉ diễn ra trong những năm gần đây Tổng sản lượng thủy sản đã tăng nhanh chóng, đạt 116,1 triệu tấn vào năm 1995, và sau hơn 11 năm, con số này đã vươn lên 144 triệu tấn vào năm 2006 Đặc biệt, sản lượng nuôi trồng thủy sản tăng trung bình 7,6% mỗi năm, với 24,6 triệu tấn trong năm gần nhất.
1995 (21,2% tổng sản lượng thủy sản trên toàn thế giới) và 50 triệu tấn vào năm 2006 chiếm 34,7% (Lê Xuân Sinh, 2010).
Trong những năm gần đây, nghề nuôi tôm ven biển đã trở thành động lực quan trọng cho sự phát triển kinh tế ở nhiều quốc gia, bao gồm Trung Quốc, Thái Lan, Ấn Độ, Philippines, Việt Nam và Ecuador.
Nghề nuôi trồng thủy sản ngày càng quan trọng trong phát triển kinh tế xã hội toàn cầu, với sản lượng tôm nuôi từ 50.000 tấn năm 1975 tăng lên 200.000 tấn năm 1985, trong đó 70% đến từ các quốc gia Châu Á Năm 1988, sản lượng tôm đạt 450.000 tấn, nhưng từ năm 1995, sự tăng trưởng chậm lại do dịch bệnh virus toàn cầu Dù vậy, nhờ áp dụng công nghệ mới, sản lượng tôm toàn cầu năm 1996 đạt 900.000 tấn Đến năm 2000, tổng sản lượng tôm nuôi đạt 45,71 triệu tấn, tăng 6,3% so với năm 1999, và năm 2001 đạt 48,42 triệu tấn Năm 2002, sản lượng nuôi trồng thủy sản toàn cầu đạt 51,4 triệu tấn, trị giá 60 tỉ USD, tăng 6,1% so với năm 2000, trong đó các quốc gia Châu Á chiếm 91,2% tổng sản lượng, với Trung Quốc đứng đầu, chiếm 71,2% sản lượng năm 2002.
Bờ biển Việt Nam kéo dài 3.260km từ Bắc vào Nam mang lại tiềm năng lớn cho nuôi trồng thủy sản nước mặn và nước lợ Diện tích nuôi tôm đã tăng nhanh chóng từ 50.000ha vào năm 1985 lên 295.000ha vào năm 1998, với sự phát triển của 30 tỉnh có hoạt động nuôi tôm sú (Bộ Thủy sản 1999).
Tình hình phát triển thủy sản Việt Nam đã có những bước tiến rõ rệt qua các giai đoạn, với sự gia tăng liên tục về diện tích nuôi trồng Kể từ năm 1981, diện tích nuôi trồng thủy sản đã tăng từ 230 nghìn ha lên 384,6 nghìn ha, cho thấy sự phát triển bền vững của ngành thủy sản qua từng năm.
Từ năm 1981 đến 1986, tổng sản lượng thủy sản tăng từ 596.356 tấn lên 840.906 tấn, trong đó sản lượng khai thác và nuôi trồng đều gia tăng, giá trị xuất khẩu đạt 100 triệu USD Đến năm 1991, diện tích nuôi trồng đạt 520.000 ha với sản lượng 335.910 tấn, và vào năm 1996, diện tích này đã tăng lên 585.000 ha, sản lượng đạt 411.000 tấn Năm 2000, diện tích nuôi trồng đạt 652.000 ha với sản lượng 723.110 tấn, và đến năm 2003, tổng sản lượng thủy sản đạt 2.536.361 tấn, trong đó khai thác đạt 1.426.223 tấn, nuôi trồng đạt 1.110.138 tấn, giá trị xuất khẩu đạt 2.240 triệu USD Diện tích nuôi tôm cũng gia tăng mạnh mẽ từ 250.000 ha năm 2000 lên 959.900 ha vào năm 2005, với sản lượng tôm TCT tăng từ 10.000 tấn năm 2002 lên 30.000 tấn năm 2003.
2004 đạt sản lượng 50.000 tấn(FAO,2004)
Diện tích nuôi trồng thủy sản nước mặn và lợ của Đồng bằng sông Cửu Long (ĐBSCL) chủ yếu tập trung tại các tỉnh Cà Mau, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Trà Vinh, Kiên Giang và Bến Tre Đến năm 2008, tỉnh Cà Mau có diện tích nuôi trồng đạt 248.957 ha, Bạc Liêu 125.529 ha, Kiên Giang 90.253 ha, Sóc Trăng 47.918 ha, Bến Tre 35.692 ha và Trà Vinh 56.424 ha.
Bảng 2.1: Diện tích nuôi thủy sản nước mặn, lợ vùng ĐBSCL (đơn vị tính ha)
Bạc Liêu 115.616 116.791upload.123doc.net.095119.802 125.509
Toàn vùng 537.795 581.491 586.123 595.577 617.341(Nguồn: Sở thủy sản, Sở Nông Nghiệp và Phát triển Nông thôn (2008)
Tổng quan về tôm thẻ chân trắng( Penaeus vannamei Boone, 1931)
Loài: Litopenaeus vannamei Boone, 1931 hay Penaeus vannamei Boone, 1931
Tên tiếng Anh: White leg shrimp
Tên tiếng Việt: Tôm bạc Thái Bình Dương, Tôm chân trắng (theo FAO), ở Việt Nam thường gọi là Tôm chân trắng.(Trần Viết Mỹ,2009)
Tôm thẻ chân trắng là loài bản địa ở đông Thái Bình Dương từ Sonora ở
Mexico và bắc Peru là hai vùng phân bố chủ yếu của một loại cây trồng, chủ yếu ở Châu Mỹ Latinh và Hawaii Hiện nay, loại cây này đã được nuôi trồng rộng rãi tại nhiều quốc gia trên thế giới, bao gồm Đài Loan, Trung Quốc và Việt Nam.
2.2.2 Đặc Điểm sinh thái và tập tính sống:
Tôm chân trắng là loài tôm nhiệt đới, có khả năng thích nghi với giới hạn rộng về độ mặn và nhiệt độ.
Tôm có khả năng thích nghi với độ mặn từ 0,5 đến 45 ‰, nhưng mức độ mặn tối ưu cho sự phát triển là từ 7 đến 34 ‰, với điều kiện tốt nhất là từ 10 đến 15 ‰ Nhiệt độ lý tưởng cho sự phát triển của tôm nằm trong khoảng 23 đến 30°C; đặc biệt, tôm nhỏ (1g) phát triển tốt nhất ở 30°C, trong khi tôm lớn (12-18g) tối ưu ở 27°C Tuy nhiên, khi nhiệt độ giảm, tôm sẽ dễ bị mắc các bệnh do virus, như bệnh đốm trắng và hội chứng Taura.
Tôm chân trắng thường sống ở vùng biển tự nhiên có đáy cát bùn, với độ sâu dưới 72m Tôm trưởng thành chủ yếu phân bố ven bờ, trong khi tôm con tập trung nhiều ở vùng cửa sông, nơi giàu dinh dưỡng Chúng kiếm ăn vào ban đêm và thường vùi mình trong bùn suốt cả ngày Trong điều kiện thí nghiệm, hiện tượng tôm ăn thịt lẫn nhau ít xảy ra.
2.2.3 Đặc điểm dinh dưỡng và tăng trưởng
Tôm chân trắng là loài ăn tạp, chủ yếu tiêu thụ động vật, với chế độ ăn đa dạng và khả năng bắt mồi mạnh mẽ Chúng có thể sử dụng nhiều loại thức ăn tự nhiên, từ mùn bã hữu cơ cho đến các động thực vật thủy sinh có kích cỡ phù hợp.
Nhu cầu protein trong khẩu phần thức ăn cho tôm chân trắng (20 – 35%), thấp hơn so với các loài tôm nuôi cùng họ khác (36 – 42%)
Theo nghiên cứu của Thái Bá Hồ và Ngô Trọng Lư (2003), tôm có khả năng chuyển hóa thức ăn rất hiệu quả Trong điều kiện nuôi dưỡng bình thường, lượng thức ăn cần cung cấp chỉ khoảng 5% trọng lượng cơ thể của tôm.
Tôm có tốc độ tăng trưởng nhanh, trong điều kiện nuôi, với môi trường sinh thái phù hợp, tôm có khả năng đạt 8 - 10g trong 60 - 80 ngày, hay đạt 35 - 40g trong khoảng
180 ngày Tôm tăng trưởng nhanh hơn trong 60 ngày nuôi đầu Sau đó, mức tăng trọng giảm dần theo thời gian nuôi.
Tôm chân trắng lột xác vào ban đêm, với thời gian giữa hai lần lột xác dao động từ 1 đến 3 tuần Tôm nhỏ dưới 3g lột xác trung bình mỗi tuần một lần, trong khi tôm lớn từ 15 đến 20g lột xác trung bình 2,5 tuần một lần Thời gian giữa các lần lột xác tăng dần theo độ tuổi của tôm.
Tình hình dịch bệnh trên tôm
Từ đầu thập niên 90, nghề nuôi tôm công nghiệp tại Việt Nam đã chứng kiến sự bùng phát của dịch bệnh Theo thống kê của Bộ Thủy sản năm 1995, từ năm 1993 đến 1995, dịch bệnh tôm đã gây thiệt hại nghiêm trọng trên toàn quốc, với thiệt hại lên đến hàng ngàn tỷ đồng Năm 1994, tổng diện tích nuôi tôm bị ảnh hưởng bởi dịch bệnh lên tới 84.558 ha, dẫn đến sản lượng thiệt hại ước tính rất lớn.
Tổng thiệt hại do dịch bệnh lên đến 5225 tấn tôm, tương đương khoảng 294 tỷ đồng Dịch bệnh vẫn tiếp tục lây lan, gây ra tổn thất nghiêm trọng, đặc biệt là tại đồng bằng sông Cửu Long Tôm thường dễ mắc bệnh và có tỷ lệ chết cao trong giai đoạn từ 1.5 đến 2 tháng tuổi.
Trong năm 2008, tại ĐBSCL có 148.000 ha tôm bị chết, tập trung tại Cà Mau với 57.789 ha, Kiên Giang 40.000 ha, Sóc Trăng 28.000 ha, Bạc Liêu 19.000 ha(Huỳnh Thế Anh,2010).
Trong 6 tháng đầu năm 2010, tỉnh Kiên Giang đã ghi nhận thiệt hại hơn 10.000 ha tôm nuôi do xâm nhập mặn, buộc nhiều nông dân phải thu hoạch sớm để giảm thiểu chi phí Tại Sóc Trăng, tình trạng tôm chết đột ngột cũng gia tăng nhanh chóng, với diện tích thiệt hại lên tới 5.000 ha, chủ yếu ở huyện Vĩnh Châu và Trần Đề Hiệp hội Tôm Mỹ Thanh cho biết thiệt hại tập trung ở ao tôm 80 ngày tuổi trở lại, và dự báo có thể đạt 18-20% diện tích nuôi Các chuyên gia từ Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản II cho rằng nguyên nhân có thể do ký sinh trùng và vi khuẩn tấn công tôm, trong khi người nuôi tôm ở Trần Đề lo ngại dịch bệnh có thể lây lan từ nước xả thải của các ao nuôi tôm thẻ chân trắng bị thiệt hại.
Theo báo cáo của Vụ Nuôi trồng Thủy sản (Tổng cục Thủy sản), tính từ đầu năm đến nay, cả nước đã ghi nhận 81.782 ha nuôi tôm bị thiệt hại, tăng 294% so với cùng kỳ năm 2010 Trong đó, tôm sú chiếm 78.849 ha và tôm thẻ chân trắng (TTCT) là 2.933 ha Tỉnh Sóc Trăng là nơi bị thiệt hại nặng nề nhất với 28.477 ha, chiếm hơn 67% diện tích thả nuôi, tăng 21.233 ha so với cùng kỳ Bạc Liêu cũng chịu thiệt hại nặng nề với hơn 16.500 ha trong cả hai vụ nuôi Nhiều chủ trang trại mặc dù đã xử lý ao và thả lại tôm giống nhưng vẫn gặp thiệt hại do dịch bệnh tái diễn.
Trong 4 tháng đầu năm 2012,tại Cà Mau tình hình tôm chết cũng đang diễn biến hết sức phức tạp Theo báo cáo của Sở NN-PTNT tỉnh Cà Mau, tính đến thời điểm này toàn tỉnh đã có 555ha (cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng) bị chết. Trong đó tập trung nhiều ở các huyện như Đầm Dơi (với 234 ha tôm chết), Phú Tân (215 ha), Cái Nước (67 ha) và TP Cà Mau (38 ha) Tình hình tôm nuôi bị chết đã khiến cho những nông dân ở các vùng trọng điểm nuôi tôm công nghiệp ở Cà Mau rất hoang mang Tại tỉnh Bạc Liêu, diện tích tôm chết cũng đang tăng vọt Thống kê mới đây của ngành nông nghiệp tỉnh này cho biết, hiện đã có trên 1.270 ha tôm nuôi bị chết, ước tính thiệt hại lên đến hàng tỉ đồng.Tại Sóc Trăng,theo ông Nguyễn Văn Khởi - Phó Giám đốc Sở NN -PTNT tỉnh Sóc Trăng: Trong tháng 2/2012, toàn tỉnh mới thả giống có1.200ha tôm thẻ chân trắng nhưng đã bị thiệt hại đến trên 500ha(http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/68/bnn.aspx).
Sơ lược về một số bệnh vi khuẩn trên tôm
2.4.1 Bệnh do vi khuẩn vibrio
Một số loài vi khuẩn thuộc nhóm Vibrio spp đã được xác định là nguyên nhân gây bệnh nghiêm trọng ở thủy sản, với Vibrio anguillarum và V ordalii là những tác nhân chính Ngoài ra, nhiều loài khác trong nhóm Vibrio cũng được ghi nhận là tác nhân gây bệnh ở các đối tượng nuôi thủy sản quan trọng.
Vibrio spp là loại vi khuẩn gram âm, có hình dạng chữ V hoặc dấu phẩy, di động và có thể sống trong môi trường hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc Chúng có khả năng tồn tại ở nhiều mức độ muối khác nhau, nhưng phát triển tối ưu trong khoảng 20 – 40‰ Có 6 loài vi khuẩn như V parahaemolyticus và V alginolyticus phát triển ở độ muối 6 – 8‰, trong khi V fluvialis, V furinissii và V anguillarum sống ở 0 ppt Vibrio spp chủ yếu xuất hiện trong vùng nước biển ấm, với nhiệt độ phát triển lý tưởng từ 25 – 30C Trên môi trường đặc trưng TCBS, khuẩn lạc của chúng được phân loại thành hai nhóm: nhóm có khả năng lên men đường sucrose tạo khuẩn lạc màu vàng và nhóm không lên men sucrose tạo khuẩn lạc màu xanh lá cây.
Một số loài vi khuẩn thuộc chi Vibrio, như Vibrio harveyi, V splendida, V orientalis, V fischeri và Vibrio vulnificus, có khả năng phát sáng Đặc biệt, Vibrio harveyi được xác định là tác nhân gây bệnh phát sáng ở trai ngọc Pinctada maxima.
Tôm sú Penaeus monodon và tôm he Nhật Bản Penaeus japonicus đã bị ảnh hưởng nặng nề bởi bệnh do vi khuẩn phát sáng, gây thiệt hại kinh tế trong ngành nuôi tôm công nghiệp tại Philippines, Ấn Độ và Indonesia Nghiên cứu chỉ ra rằng sự suy giảm sản lượng tôm nuôi có liên quan đến bệnh vi khuẩn này Tại Việt Nam, nhiễm vi khuẩn phát sáng thường xảy ra ở các trại sản xuất và ương tôm giống Khi vi khuẩn phát sáng xâm nhập với số lượng lớn, tôm có thể bị nhiễm bệnh và phát sáng trong bóng tối Vibrio phát sáng có khả năng gây dịch và dẫn đến tỷ lệ chết lên đến 100% ở ấu trùng, tôm giống và tôm trưởng thành.
Bảng 2.2: Một số bệnh ở tôm do vi khuẩn vibrio gây ra
STT Tên bệnh Giai đoạn tôm Vi khuẩn gây bệnh Tác hại
1 Bệnh phát sáng Ấu trùng, giống V parahaemoliticus V harveyi gây chết hàng loạt
2 Bệnh đỏ dọc thân Ấu trùng, giống V alginolyticus gây chết rải rác
3 Bệnh đỏ thân, đỏ chân hay bệnh ăn mòn vỏ kitin
Các giai đoạn của tôm cua.
Pseudomonas spp Proteus sp gây chết rải rác
4 Bệnh đen mang Tôm thịt Vibrio spp và một số vi khuẩn khác. gây chết rải rác hàng loạt
Tôm nhiễm bệnh thường có biểu hiện yếu ớt và màu trắng đục, nổi trên mặt nước hoặc ven bờ khi sắp chết Trong trường hợp nhiễm bệnh nặng, tôm sẽ phát sáng trong bóng tối, bỏ ăn và lắng xuống đáy bể, tạo thành một thảm sáng xanh, dẫn đến tỷ lệ chết hàng loạt từ 80-100% Quan sát cơ thể và máu của tôm sắp chết cho thấy sự hiện diện của nhiều vi khuẩn di động, với gan tụy là bộ phận bị hoại tử nặng nhất, gây mất chức năng tiêu hóa Bệnh thường xuất hiện trong môi trường nước giàu dinh dưỡng và nhiều chất hữu cơ Trong sản xuất giống, mầm bệnh lây truyền từ ruột giữa của tôm bố mẹ sang ấu trùng trong giai đoạn sinh sản Ấu trùng nhiễm bệnh thường có màu đen ở đỉnh các phụ bộ, bỏ ăn và có ruột rỗng, dẫn đến tỷ lệ chết có thể lên đến 100%.
2.4.2 Bệnh đục cơ của tôm càng xanh
Tác nhân gây bệnh là cầu khuẩn Lactococcus garvieae (Enterococus seriolicida ) gam dương,hình quả trứng Vi khuẩn phát triển ở nhiệt độ 10-
40ºC Độ muối từ 0.5-0.6%,pH 9,6 (theo Winton Cheng, Jiann-Chu Chen, 1988-2001)
Khi tôm nhiễm bệnh, chúng sẽ kém ăn và hoạt động chậm chạp Đầu tiên, phần đuôi của tôm chuyển sang màu trắng đục, sau đó màu trắng này lan dần lên phần đầu ngực Nếu bệnh nặng, mang tôm cũng sẽ chuyển màu trắng đục, vỏ tôm trở nên mềm, dẫn đến tỷ lệ chết cao.
Chuẩn đoán bệnh dựa vào dấu hiệu bệnh lí và phân lập vi khuẩn để xác định bệnh.(Bùi Quang Tề, 2003)
2.4.3 Bệnh đốm nâu ở tôm càng xanh.
Theo Bùi Quang Tề (2006), tác nhân gây bệnh chủ yếu là vi khuẩn Aeromonas hydrophila Đây là loài vi khuẩn Gram âm, có hình dạng que ngắn, di động với hai đầu tròn, kích thước khoảng 0,5x1,0-1,5 µm Vi khuẩn này thuộc loại yếm khí tùy tiện và có phản ứng cytochrom oxidase dương tính.
Tôm mắc bệnh thương yếu thường có biểu hiện hoạt động chậm chạp, nằm yên ở đáy và kém ăn hoặc bỏ ăn Vỏ tôm xuất hiện các vết ăn mòn chuyển từ màu nâu sang đen, và các phần phụ bị cụt dần Bên trong vỏ kitin có đốm đen, trong khi trên bề mặt vỏ và phần phụ có nhiều sinh vật bám.
Bệnh tôm càng xanh nuôi thương phẩm thường gặp với tỷ lệ nhiễm từ 10-30%, và tăng cao vào cuối chu kỳ nuôi Trong các ao nuôi có nước ô nhiễm, tỷ lệ nhiễm bệnh có thể lên tới 60-70%, dẫn đến hiện tượng tôm chết rải rác Bệnh thường bắt đầu xuất hiện từ tháng thứ 3 cho đến khi kết thúc chu kỳ nuôi.
2.4.4 Bệnh vi khuẩn dạng sợi ở Tôm.
Tác nhân gây bệnh chủ yếu là vi khuẩn dạng sợi: Leucothrix mucor ngoài ra có thể gặp một số vi khuẩn dạng sợi khác: Thiprix sp., Flexibacter sp.,
Cytophaga sp và Flavobacterium sp là những vi khuẩn có khả năng gây bệnh cho mang, thân và các phần phụ của động vật thủy sinh, có thể hoạt động độc lập hoặc phối hợp với nhau Các vi khuẩn dạng sợi thuộc họ Flexibacteraceae không hình thành bào tử và chỉ tồn tại ở giai đoạn tế bào dinh dưỡng, sống tự do trong môi trường nước biển và cửa sông, đồng thời có khả năng bám dính trên bề mặt của nhiều loài động vật thủy sinh Chúng cũng có khả năng phân giải xenlulose, kitin và nhiều hợp chất hữu cơ khác.
Tôm mắc bệnh dạng sợi thường có biểu hiện yếu ớt, khó khăn trong hoạt động Quan sát dưới kính hiển vi với độ phóng đại 100x cho thấy vi khuẩn bám trên bề mặt cơ thể, đặc biệt ở đầu các phần phụ, và ở tôm lớn, vi khuẩn phát triển trên chân bơi, râu, bộ phận miệng và mang Khi bị nhiễm nặng, mang của tôm chuyển từ màu vàng sang xanh hoặc nâu, khiến tôm lờ đờ, bỏ ăn, khó lột xác và có nguy cơ chết hàng loạt Đối với trứng nhiễm bệnh, vi khuẩn tạo thành lớp dày trên vỏ, cản trở hô hấp và sự nở Ở ấu trùng và tôm bột, vi khuẩn phát triển trên bề mặt cơ thể, đặc biệt là trên các lông và phụ bộ Tôm lớn có vi khuẩn trên lông tơ của chân bụng, chân ngực, chân đuôi, vẩy râu, phụ bộ miệng và mang.
Vật liệu nghiên cứu
Tôm thẻ chân trắng có dấu hiệu bất thường được thu ở các ao nuôi tại tỉnh Sóc Trăng
3.1.2 Dụng cụ và thiết bị
Que cấy, bình xịt cồn, đèn cồn, bộ tiểu phẩu, khay nhựa. Ống nghiệm, giá ống nghiệm,ống đong.
Lame, lamella, đĩa Petri, giấy nhôm.
Kính hiển vi, giấy lau kính hiển vi.
Chai nấu môi trường 100ml, 250ml, 500ml,cá từ.
Micropipet 1ml, micropipet 5ml. Đầu col 1ml và 5ml, ống hút, ống eppendorf, găng tay.
Tủ sấy, tủ cấy, tủ ấm, tủ lạnh.
Bếp nấu môi trường, nồi thanh trùng.
Cân điện từ, lò viba, máy ly tâm, máy chụp hình UV.
- Cồn tuyệt đối, cồn 96º, NaCl, H2O2, vaselin, paraffin, Oxidase thương mại.
- Ethanol, Crystal violet, ammonium oxalate, iodine, alcohol, acetone, safranin, nước cất.
- Dựng12 loại khỏng sinh để lập khỏng đồ : Neomycin (N/30àg), Florfenicol
The article lists various antibiotics along with their respective dosages, including FFC at 30 µg, Ciprofloxacin (CIP) at 5 µg, Gentamicin (GM) at 10 µg, Doxycycline (DO) at 30 µg, Cefazolin (CZ) at 30 µg, Ampicillin (AMP) at 25 µg, Amoxicillin (AML) at 25 µg, Trimethoprim + sulfamethoxazole (SXT) at 1.25/23.75 µg, Tetracycline (TE) at 30 µg, Norfloxacin (NOR) at 5 µg, and Enrofloxacin (ENR) at 5 µg This information is sourced from Bio-Rad and Oxoid.
-Môi trường thạch: Tryptic soy agar (TSA)(+1,5% NaCl), Trytic soya broth (TSB)(+1,5% NaCl), Muller hinton agar (MHA)(+1,5% NaCl), Thiosulfat Citrate Bile Salt Succo agar(TCBS)(+1,5% NaCl).
-Môi trường lỏng: Tryptic soy broth(TSB)(+1,5% NaCl), Nutrient broth (NB) (+1,5% NaCl)
-Môi trường OF (oxidation-fermentation medium)
Phương pháp nghiên cứu
Tôm TCT được chuyển từ Sóc Trăng đến phòng thí nghiệm, với mỗi mẫu thu gồm 3 con tôm giống sống, được bảo quản trong túi nylon có bơm oxy.
3.2.2 Làm tiêu bản kính phết
- Dùng ben tiệt trùng lấy một ít gan tụy lên lame sạch.
- Nhỏ một giọt dung dịch Davidson’s không chứa acid acetic lên mẫu và phết đều lên lame.
- Để khô nhiệt độ phòng.
- Cố định trong 1% glacial acetic acid trong thời gian 1 phút.
- Để ở ngăn mát (nếu chưa nhuộm liền).
- Nhuộm Gram tiêu bản và quan sát dưới KHV(Phương pháp nhuộm xem Phụ lục 1)
-Khử trùng mặt ngoài cơ thể của tôm bằng cồn 70º,rửa lại bằng nước muối sinh lý (0.85% NaCl)
- Dùng ben tiệt trùng lấy một ít gan tụy cấy trên đĩa môi trường NA+
- Đặt các đĩa này trong tủ ấm ở nhiệt độ 28ºC sau 24 giờ Quan sát ghi nhận màu sắc, hình dạng, kích thước khuẩn lạc.
- Nếu đĩa cấy chưa thuần thì ta tiến hành tách ròng lại cho đến khi có được đĩa cấy thuần.
- Các chủng vi khuẩn được trữ ở -80°C trong môi trường nutrient broth (NB, Oxoid) có chứa 15% glycerol và 1% (w/v) NaCl
Các chủng vi khuẩn phân lập từ gan tụy tôm TCT được xác định dựa trên các chỉ tiêu hình thái, sinh lý và sinh hóa theo hệ thống phân loại của Baumann et al (1984) Đặc điểm sinh lý sinh hóa được xác định dựa trên cẩm nang của Cowan & Steel (Barrow và Feltham, 1993) và phương pháp của West & Colwell (1984) Mỗi chỉ tiêu được kiểm tra ba lần, và kết quả được ghi nhận nếu có ít nhất hai lần lặp lại.
Trước khi xác định chủng vi khuẩn, cần kiểm tra tính ròng bằng cách quan sát các khuẩn lạc có màu sắc và hình dạng đồng nhất trên đĩa agar Sau đó, tiến hành nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi với vật kính 100x có giọt dầu Nếu các tế bào vi khuẩn trên lam mẫu đồng nhất về màu sắc (tím/xanh hoặc hồng/đỏ) và hình dạng (que ngắn, que dài, hình cầu), điều này cho thấy tính ròng của chủng vi khuẩn đã được xác nhận.
- Tiến hành test các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn (phụ lục 1)
+Kiểm tra tính di động
+ Khả năng lên men và oxy hóa đường Glucose (O/F test).
+ Phản ứng O/129 Định danh vi khuẩn bằng bộ kit API20E
+ Cho một ít nước cất vào khuôn nhựa của bộ kít để giữ ẩm trong suốt quá trình ủ trong tủ ấm.
+ Đặt bộ kít API20E vào khuôn nhựa.
- Pha dung dịch vi khuẩn: Dùng que tiệt trùng lấy một ít khuẩn lạc cho vào 5 ml nước muối sinh lý hoặc nước cất tiệt trùng, lắc đều.
- Thực hiện: Dùng pipette với đầu cone tiệt trùng hút dung dịch vi khuẩn cho vào mỗi ô của bộ kít
+ Cho vi khuẩn vào đầy các ô CIT, VP và GEL.
Cho vi khuẩn vào đầy các ụ (ẵ ụ -dưới) ADH, LDC, ODC, H2S và URE, sau đó thêm dầu paraffin tiệt trùng vào đầy (ẵ ụ -trên) của các ụ này Tiếp theo, cho vi khuẩn vào các ụ còn lại.
+ Đậy nắp khuôn nhựa và ủ trong tủ ấm ở 26-28ºC và đọc kết quả sau 24 giờ.
+ Cho một giọt thuốc thử TDA vào ô TDA.
+ Lần lược cho 1 giọt thuốc thử VP1 và 1 giọt thuốc thử VP2 vào ô VP. + Cho một giọt thuốc thử IND vào ô IND.
Bảng 3.1: Thành phần kết quả kiểm tra trong bộ kít API 20E (BioMérieux).
Chất nền Phản ứng/ enzyme Âm tính Dương tính
ONPG Ortho-nitrophenyl galactosidase Beta-galactosidase Không màu Vàng
ADH Arginine Arginine dihydrolase Vàng Đỏ/cam
LDC Lysine Lysine decarboxylase Vàng Cam
ODC Ornithine Ornithine decarboxylase Vàng Đỏ
CIT Sodium citrate Citrate utilisation Vàng Xanh/xanh lá
H 2 S Sodium Thiosulphate H 2 S production Không màu Đen
URE Urea Urease Vàng Đỏ/cam
TDA Tryptophane Tryptophane deaminase Vàng Nâu sậm
IND Tryptophane Indole production Vàng Đỏ (2 phút)
VP Sodium Pyruvate Acetoin production Không màu Hồng/đỏ (10 giây)
GEL Gelatin Gelatinase Kết tủa đen Màu đen hòa tan
GLU Glucose Fermentation/oxidation Xanh/xanh lá Vàng
MAN Mannitol Fermentation/oxidation Xanh/xanh lá Vàng
INO Inositol Fermentation/oxidation Xanh/xanh lá Vàng
SOR Sorbitol Fermentation/oxidation Xanh/xanh lá Vàng
RHA Rhamnose Fermentation/oxidation Xanh/xanh lá Vàng
SAC Sucrose Fermentation/oxidation Xanh/xanh lá Vàng
MEL Melibiose Fermentation/oxidation Xanh/xanh lá Vàng
AMY Amygdalin Fermentation/oxidation Xanh/xanh lá Vàng
ARA Arabinose Fermentation/oxidation Xanh/xanh lá Vàng
3.2.5 Phương pháp lập kháng sinh đồ (theo Geert Huys, 2002)
Lập khỏng sinh đồ của vi khuẩn với 12 loại khỏng sinh là Neomycin (N/30àg),Florfenicol (FFC/30 àg), Ciprofloxacin (CIP/5àg), Gentamicin (GM/10àg),
Doxycycline (DO/30àg), Cefazolin (CZ/30àg), Ampicillin (AMP/25àg), Amoxicillin (AML/25àg), Trimethoprim + sulfamethoxazole (SXT/1.25/23.75 àg), Tetracycline (TE/30 àg), Norfloxacin (NOR/5 àg), Enrofloxacine (ENR/5 àg).
Phương pháp xác định mật số vi khuẩn dựa vào ống chuẩn McFarland số
Sử dụng que cấy tiệt trùng để lấy khuẩn lạc từ đĩa vi khuẩn và cho vào ống nghiệm chứa 5ml nước muối sinh lý (0,85% NaCl) đã tiệt trùng Sau đó, trộn đều và so sánh độ đục với ống McFarland số 3 (gồm 9,7ml 1% H2SO4 và 0,3ml 1% BaCl2) Nếu độ đục thấp hơn ống chuẩn McFarland, tiếp tục thêm khuẩn lạc; nếu độ đục cao hơn, cho thêm nước muối sinh lý cho đến khi đạt độ đục tương đương với ống chuẩn McFarland Khi đạt yêu cầu, mật độ vi khuẩn trong ống nghiệm sẽ khoảng 9 x 10^8 cfu/ml.
Sau khi xác định mật số vi khuẩn, tiến hành cho dung dịch vi khuẩn lên môi trường thạch MHA có bổ sung 1,5% NaCl bằng pipet tiệt trùng, hút 0.1ml và trải đều bằng que thủy tinh tiệt trùng cho đến khi vừa khô Để yên khoảng 1 phút, sau đó dùng pel tiệt trùng đặt đĩa kháng sinh vào đĩa petri với khoảng cách 24mm giữa các đĩa thuốc kháng sinh và 10-15mm từ tâm đĩa kháng sinh đến mép đĩa petri, mỗi đĩa thạch dán 4 loại kháng sinh Sau khi hoàn tất, đặt đĩa vào tủ ấm ở 28 ºC và đọc kết quả sau 24 giờ Đo đường kính vô trùng (mm) và so sánh với chuẩn đường kính của nhà sản xuất để xác định tính nhạy cảm của thuốc kháng sinh.
Bảng 3.2 Các kháng sinh dùng trong nghiên cứu kháng sinh đồ
Kháng sinh Chuẩn đường kính vòng vô trùng
(Công ty Biorad & Oxoid) Kháng Trung bình
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả mẫu kính phết:
4.2.Kết quả phân lập và định danh vi khuẩn
Phân lập vi khuẩn từ gan tụy của 39 mẫu tôm TCT (13 ao) đã được thực hiện bằng cách cấy trên môi trường NA+ và ủ ở nhiệt độ 28 oC trong 24 giờ Kết quả thu được 21 chủng vi khuẩn, được phân loại thành 2 nhóm chính dựa trên đặc điểm hình dạng của khuẩn lạc.
Nhóm 1: Vi khuẩn phát triển trên môi trường NA + sau 24 giờ ở 28 o C, dạng khuẩn lạc tròn, trắng đục, nhỏ li ti đến 1mm.
Nhóm 2: Vi khuẩn phát triển trên môi trường NA + sau 24 giờ ở 28 o C, dạng khuẩn lạc tròn, trắng đục, kích thước 2-5mm.
Tiến hành tách ròng các nhóm khuẩn lạc cho đến khi thu được các dòng thuần Sau đó, kiểm tra các đặc điểm sinh lý và sinh hóa của nhóm 1 (Bảng 4.1) và nhóm 2 (Bảng 4.2), bao gồm nhuộm Gram, hình dạng, tính di động, phản ứng Oxidase, phản ứng Catalase, khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (O/F), cùng với phản ứng O/129 (trừ nhóm 1).
Kết quả kiểm tra các đặc điểm về hình thái, sinh lý và sinh hoá của các chủng vi khuẩn trong đề tài được trình bày ở Bảng 4.1 và 4.2
Bảng 4.1: Các chỉ tiêu cơ bản của 11 chủng vi khuẩn nhóm 1
(Nguồn: Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2011)
Gram Hình dạng Di động Oxidase Catalase
Ghi chú: (+) dương tính; (-) âm tính
Theo bảng kết quả test các chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá, các dòng vi khuẩn được xác định thuộc hai giống Micrococcus spp và Staphylococcus spp, đều là vi khuẩn hình cầu, gram dương, phát triển trên môi trường NA+ sau 24-48 giờ, không di động, catalase dương tính và oxidase âm tính Chúng có khả năng lên men yếm khí và hiếu khí Kết quả này phù hợp với hệ thống phân loại của Baumann et al., 1984, xác nhận rằng chúng là vi khuẩn hình cầu, gram dương Theo Bùi Quang Tề (2006), Staphylococcus spp là dạng cầu khuẩn không có tiêm mao và không có khả năng di động.
Bảng 4.2: Các chỉ tiêu cơ bản của 10 chủng vi khuẩn nhóm 2
Gram Hình dạng Di động Oxidase Catalase O/129 O/F
Chủng vi khuẩn thuộc giống Micrococcus spp và Staphylococcus spp được phân lập từ gan tụy tôm TCT, thể hiện qua các hình ảnh: (A) khuẩn lạc trên môi trường NA+, (B) hình dạng vi khuẩn Gram dương, hình cầu với độ phóng đại 100X, và (C) phản ứng O/F dương tính.
Ghi chú: (+) dương tính; (-) âm tính
Kết quả từ các chỉ tiêu sinh lý và sinh hóa trong Bảng 4.2 cho thấy có 6 chủng vi khuẩn thuộc họ Enterobacteriaceae, đặc trưng bởi hình dạng gram âm, hình que, tính chất oxidase âm tính, catalase dương tính, và có thể di động hoặc không di động Tất cả các chủng này đều âm tính với O/F và O/129.
Theo Từ Thanh Dung và ctv(2005) Vi khuẩn E ictaluri là loài vi khuẩn thuộc
Enterobacteriaceace, gram âm,hình que ngắn, di động yếu hoặc không di động Catalase dương tính, oxidase âm tính và lên men đường glucose.
Còn lại bốn chủng thuộc giống Vibrio spp., là vi khuẩn gram âm, hình que và di động, có phản ứng dương tính với enzyme oxidase Chúng có khả năng phát triển trên môi trường nuôi cấy NA+ và TCBS.
Kết quả phân tích chỉ tiêu sinh hóa của hai chủng vi khuẩn A12C1G và A3C3G3-a cho thấy chúng đều đạt các tiêu chí đặc trưng của giống Vibrio, bao gồm đặc điểm gram âm, hình dạng que, khả năng lên men glucose, và khả năng phát triển trên môi trường chọn lọc dành cho nhóm Vibrio.
(Thiosulfate-Citrate-Bile salts-Sucrose-TCBS),nhạy với hợp chất 2,4-diamino- 6,7-diisopropyl pteridine (O/129,150 μg) là hợp chất giúp phân biệt vi khuẩn
Vibrio và Aeromonas (West et al.1986).
Sau khi kiểm tra các đặc điểm sinh hóa của các chủng, chúng tôi đã sử dụng bộ kít API20E để định danh Kết quả cho thấy chỉ có 2 chủng được xác định ở mức độ loài, bao gồm A12C1G và A3C3G3-a, cả hai đều thuộc loài Vibrio Vulnificus, trong khi 8 chủng còn lại không cho kết quả.
Bảng 4.3: Kết quả định danh chủng vi khuẩn Vibrio spp bằng bộ kít API 20E
Ghi chú: (+) dương tính; (-) âm tính
4.1 Kết quả kháng sinh đồ:
Từ việc phân lập vi khuẩn trên gan tụy của tôm TCT tại Sóc Trăng, đã xác định được 10 chủng vi khuẩn Gram âm, hình que qua ba đợt thu mẫu Kết quả kháng sinh đồ của các chủng vi khuẩn này với 12 loại kháng sinh được trình bày chi tiết trong Bảng 4.2.
Bảng 4.2: Đường kính vòng tròn vô trùng của 10 chủng vi khuẩn
Kết quả kháng sinh đồ cho thấy 9 chủng vi khuẩn nhạy cảm với DO và TE, chiếm 90% tổng số, trong khi chủng A2C2G có mức độ nhạy trung bình đối với cả hai loại kháng sinh này.
- Tất cả 10 chủng đều nhạy với FFC, CIP và NOR.
- Có 7 chủng nhạy với SXT, chủng A10L2G1 có mức độ nhạy trung bình, 2 chủng A8C1G và A8C3G kháng hoàn toàn với SXT
- Có 7 chủng nhạy với ENR, 2 chủng A2C3G3a và A12C1G nhạy trung bình với ENR, chủng A8C1G kháng với ENR
- Đối với kháng sinh AMP chỉ có 2 chủng A24C3Ga và A24C3Gb là nhạy, 8 chủng còn lại đều kháng với AMP
- Đối với CZ nhạy với 4 chủng A24C3Ga, A24C3Gb, A12C1G và A3C3G3, 6 chủng còn lại kháng với CZ.
- Đối với N có 7 chủng nhạy với kháng sinh, 3 chủng A2C3G3a, A10C2G, A10L2G1 có mức độ nhạy trung bình.
- Có 3 chủng A24C3Ga, A3C3G3 và A24C3Gb nhạy với AML, 7 chủng còn lại tất cả đều kháng.
- 2 chủng A8C3G, A10C2G kháng với GM, 2 chủng A2C3G3a và A10L2G1 có mức độ nhạy trung bình, 6 chủng còn lại nhạy với GM.
Hình 4.3: Đĩa kết quả kiểm tra kháng sinh đồ với chủng vi khuẩn trên TCT,
Bảng 4.2 Sự mẫn cảm của 10 chủng vi khuẩn với 12 loại kháng sinh
Kháng sinh Kháng Trung bình Nhạy
Theo bảng 4.2, phần lớn các loại kháng sinh cho thấy tỉ lệ nhạy cao, trong đó APM (80%), AML (70%) và CZ (60%) là ba loại kháng sinh kháng nhiều nhất với vi khuẩn Nhóm kháng sinh nhạy có tỉ lệ nhạy cao nhất là FFC, CIP và NOR (100%), tiếp theo là hai kháng sinh DO.
TE có tỉ lệ nhạy đều là 90%, 3 loại kháng sinh có tỉ lệ nhạy 70% là SXT, ENR và N, còn lại là kháng sinh GM có tỉ lệ nhạy là 60%.
Hình: Tỉ lệ chủng vi khuẩn kháng với các loại kháng sinh
Ghi chú: 1: Doxycycline, 2: Tetracycline, 3: Florfenico, 4 : Trimethoprim +
Sulfamethoxazole, 5: Enrofloxacine, 6: Ampicillin, 7: Ciprofloxacin, 8: Cefazolin, 9: Neomycin, 10: Amoxicillin, 11: Norfloxacin, 12: Gentamicin.
Kết quả từ hai bảng 4.1 và 4.2 cho thấy sự đa kháng thuốc trên một số chủng vi khuẩn Cụ thể, chủng A8C3G kháng 5 loại kháng sinh SXT, AMP, CZ, AML và GM; chủng A2C2G kháng AMP, CZ và AML; chủng A8C1G kháng 5 loại SXT, ENR, AMP, CZ và AML; chủng A10C2G kháng 4 loại AMP, CZ, AML và GM Hai chủng A2C3G3b và A10L2G1 đều kháng 3 loại AMP, CZ và AML, trong khi chủng A12C1G kháng hoàn toàn với AMP và AML Tổng kết, 20% các chủng kháng 5 loại kháng sinh, 10% kháng 4 loại, 30% kháng 3 loại và 10% kháng 2 loại kháng sinh.
Hình: Tỉ lệ các chủng vi khuẩn đa kháng với nhiều loại kháng sinh
Hiện tượng đa kháng thuốc của vi khuẩn trong ao nuôi thủy sản đang trở thành vấn đề phổ biến Nghiên cứu của Đặng Thị Hoàng Oanh và cộng sự (2006) cho thấy 100% dòng vi khuẩn gây bệnh phát sáng trên tôm sú kháng với AMP, 15% kháng với 2 loại kháng sinh và 4% kháng với 6 loại kháng sinh Theo Dung et al (2009), 86% trong số 50 chủng vi khuẩn gây bệnh gan, thận mủ trên cá tra kháng ít nhất 3 loại kháng sinh, và hơn 70% kháng từ 6 đến 9 loại Nghiên cứu của Miranda và Zemelman (2002) cũng ghi nhận 74 chủng vi khuẩn trên cá hồi nước ngọt ở Chile kháng đồng thời từ 6 đến 10 loại kháng sinh.
Kết luận
Kết quả kiểm tra kháng sinh đồ của 10 chủng vi khuẩn trên gan tụy tôm TCT với 12 loại kháng sinh cho thấy hầu hết các chủng vi khuẩn đều nhạy cảm với thuốc kháng sinh được thử nghiệm Tuy nhiên, chỉ có ba loại kháng sinh có độ nhạy rất thấp, cụ thể là Ampicillin (20%), Amoxicillin (30%) và Cefazolin (40%).
Đề xuất
Tiếp tục nghiên cứu và phân lập các chủng vi khuẩn từ gan tụy tôm, đồng thời tiến hành gây cảm nhiễm với các nhóm vi khuẩn đã thu được nhằm tìm hiểu về độc lực của chúng.
Kiểm tra những thay đổi mô học trên gan tụy tôm TCT khi bị vi khuẩn tấn công.
1 Austin, B & D.A Austin 1993 Bacterial fish pathogens, Diseases in farmed and wild fish, 2nd edn Ellis Horwood Ltd., Chichester.
2 Baumann, P A L Furnss and J V Lee 1984 Genus 1 Vibrio pacini
1854, 411 al 518-538 pp In: Krieig, N R and J G Holt (eds)
Bergeyf’s manual of systematic bacteriology, Volume1 William and Wilkin Baltimore
3 Bùi Quang Tề, 2006 Bệnh học Thủy Sản Viện nghiên cứu nuôi trồng Thủy sản 1.
4 Bùi Quang Tề,2003 Bệnh của tôm và biện pháp phòng trị Nhà xuất bản Nông Nghiệp.200trang
5 Cao Chí Thuận, 2009 Phát hiện white spot syndrome virus (wssv) trong mẫu thức ăn dùng nuôi vỗ tôm sú bố mẹ (penaeus monodon) Luận văn tốt nghiệp đại học.
6 Châu Ngọc Sơn, 2008 Nghiên cứu sự biến động của quần thể vi sinh vật và chất lượng nước trong ao nuôi tôm sú (penaus monodon) Luận văn tốt nghiệp đại học
7 Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), 2011 Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-First Informational Supplement, M100-S21 (ISBN 1-56238-742-1) Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087 USA
8 Cowan, Steel G.I Barrow and R.K.A Felltham 1987 Manual for the indentification of Media Bacteria 262p.
9 Đặng Thị Hoàng Oanh, Đoàn Nhật Phương, Nguyễn Thị Thu Hằng và Nguyễn Thanh Phương, 2006 Xác định vị trí phân loại và khả năng kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn vibrio phát sáng phân lập từ hậu ấu trùng tôm sú (penaeus monodon) Tạp chí Nghiên cứu Khoa học Đại học Cần Thơ: 42-52
10 Đặng Thị Hoàng Oanh, Nguyễn Thị Thu Hằng và Nguyễn Thanh Phương, 2006 Sưu tập và phân lập vi khuẩn từ mẫu thủy sản nuôi ở Đồng bằng sông Cửu Long Tạp chí Nghiên cứu Khoa học Đại học Cần Thơ: 53-61
11 Đỗ Thị Hòa, Bùi Quang Tề, Nguyễn Hữu Dũng và Nguyễn Thị Muội, 2004.Giáo trình Bệnh học thủy sản Khoa Nuôi Trồng Thủy Sản, trường Đại học thủy sản Nha Trang.
12 FAO, 2005 Hướng dẫn chuẩn đoán bệnh của động vật thủy sản Châu Á Nhà xuất bản Nông Nghiệp Hà Nội-2005.
13 FAO,2004, Introduction and movement of Penaeus vannamei and Penaeus Stylirostris in Asian and the Pacifi c, Bangkok.
14 Geert Huy, 2002 Antibiotic susceptibility testing of aquaculture associated bacteria with the broth macrodilution method (MIC
Determination), Laboratory of Microbiology, K.L Ledeganckstr 35 B-
15 Http://agribank.com.vn/31/834/tin-tuc/thi-truong-nong- nghiep/2011/01/3119/lan-dau tien-viet-nam-xuat-khau-tom-vuot-2- tyusd.aspx
16.http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/72/45/83/93499/tom-tiep-tuc-chet- hang-loat.aspx, 2012 Truy cập 30/06/2012.
17.http://tepbac.com/news/full/1347/Chua-ro-nguyen-nhan-hoai-tu-gan- tuy-cap-tren-tom-nuoc-lo.htm Truy cập 30/06/2012
18.Http://tepbac.com/news/full/1371/Mien-Trung-lai-lao-dao-vi-tom.htm ,
19 Http://thuysanvietnam.com.vn/index.php/news/details/index/1708.let, Tạp chí thủy sản Việt Nam.
20.Http://vi.wikipedia.org/wiki/T%C3%B4m_th%E1%BA%BB_ch
%C3%A2n_tr%E1%BA%AFng#Tham_kh.E1.BA.A3o Truy cập ngày 30/06/2012
22.http://www.tomgionghvb.com/tim-tuc-hvb/tom-the-chan-trang Truy cập 30/06/2012.
23 Lê Xuân Sinh, 2003 A Bio-economic Model ò a shrimp hatchery in the Mekong River Delta of Viet Nam Luận án tiến sỹ Kinh tế nông nghiệp- Đại Học Sydney, Australia.
24 Lê Xuân Sinh,2010.Giáo trình kinh tế thủy sản.Nhà xuất bản Đại Học Cần Thơ
25 Nguyễn Thanh Phương và Trần Ngọc Hải, 2004 Kỹ thuật nuôi và sản xuất giống thủy sản nước lợ.
26 Nguyễn Văn Hảo và ctv, 2003 Ứng dụng kỹ thuật phân tử để phát hiện bệnh nhiễm trong nuôi trồng thủy sản Trí thức Phú Yên
27 Phạm Thị Tuyết Ngân và ctv, 2008 Biến động mật độ vi khuẩn trong ao nuôi tôm sú ( penaus monodon) Viện nghiên cứu nuôi trồng thủy sản 1.
28 Tài liệu thực tập Giáo trình Bệnh Học Thủy Sản, 2011.Bộ môn sinh học và bệnh Thủy Sản.Khoa Thủy Sản Trường Đại Học Cần Thơ.
29 Thái Bá Hồ-Ngô Trọng Lư, 2003 Kỹ thuật nuôi tôm he chân trắng Nhà xuất bản nông nghiệp Hà Nội.109 trang.
30 Trần Ngọc Hải, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa và Nguyễn Thanh Phương, 2000 Bài giảng bệnh giáp xác.
31 Trần Nguyễn Diễm Tú, 2008 phát triển qui trình mPCR (multiplex polymerase chain reaction) phát hiện wssv(white spot syndrome virus), hpv (hepatopancreatic Parvovirus)và nội chuẩn β-actin trên tôm sú (penaeus monodon).
32 Trần Thế Anh,2010 Phân tích thực trạng nuôi tôm ở Đồng bằng sông Cửu Long Chuyên đề Kinh tế Nông Nghiệp.Khoa KT&QTKD.Trường Đại Học Cần Thơ.
33 Trần Thị Phương Trang, 2009 Ứng dụng kỹ thuật PCR phát hiện WSSV trong mẫu tôm sú (Penaeus monodon).Luận văn tốt nghiệp đại học.
34 Trần Thị Tuyết Hoa, 2004 Bài giảng bệnh virus trên động vật thủy sản Trường Đại học Cần Thơ
35 Trần Viết Mỹ, 2009 Cẩm nang nuôi tôm thẻ chân trắng (Penaeus vannamei) Sở nông nghiệp và phát triển nông thôn Tp.Hồ Chí Minh trung tâm khuyến nông khuyến ngư.
36 Trần Việt Tiên, 2007 Ứng dụng kỹ thuật PCR và RT-PCR trong chẩn đoán wssv (white spot syndrome virus) và gav (gill-associated virus) trên tôm sú (Penaeus monodon) Ở Đồng Bằng Sông Cửu Long Luận văn tốt nghiệp đại học.
37 Từ Thanh Dung, 2011 Bài giảng Bệnh vi khuẩn ở động vật thủy sản Khoa Thủy sản Trường Đại Học Cần Thơ 13 Trang.
38 Từ Thanh Dung, Đặng Thị Hoàng Oanh, Trần Thị Tuyết Hoa, 2005 Giáo trình Bệnh học thủy sản Tủ sách Đại Học Cần Thơ 164 Trang.
39 Từ Thanh Dung, Phạm Thanh Hương, Nguyễn Anh Tuấn (2009) Hiện trạng đa kháng trên vi khuẩn Edwarsiella ictaluri gây bệnh gan thận mủ trên cá tra Pangasianodon hypopththalmus ờ đồng bằn sông cửu long Tạp chí nghiên cứu khoa học Trường Đại học Cần Thơ.
40 Vlak, J.M., J.R Bonami, T.W Flegel, G.H Kou, D.V Lightner, C.F
Lo, P.C Loh, and P.J Walker 2002 NIMAVIRIDAE A new virus family infecting aquatic invertebrates ICTV, Paris, 2002
Phụ lục 1: Phương pháp xác định các chỉ tiêu sinh lý, sinh hóa của vi khuẩn.
1 Quan sát hình dạng và màu sắc khuẩn lạc
Các chủng vi khuẩn thuần được cấy trên môi trường thạch NA+, ủ ở 28 o C sau
Sau 24 giờ quan sát, khuẩn lạc thể hiện hình dạng tròn, hơi lồi, nhẵn và mang màu trắng đục.
Để chuẩn bị tiêu bản, trước tiên nhỏ một giọt nước lên kính lam, sau đó dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn và trải đều lên giọt nước Tiếp theo, để tiêu bản khô ở nhiệt độ phòng, rồi hơ lướt kính lam trên ngọn lửa đèn cồn để cố định vi khuẩn.
1 Nhỏ dung dịch Crystal violet (dung dịch I) lên lame Để 1 phút.
2 Rửa bằng nước cất cho hết màu tím trên lame (khoảng 2 giây), để khô.
3 Nhỏ dung dịch Iodine (dung dịch II) lên lame, để khoảng 1 phút. Lật nghiêng lame kính cho hết dung dịch Iodine trên lame.
4 Dùng dung dịch cồn: Aceton (dung dịch III) để tẩy màu bằng cách nghiêng lame kính rồi nhỏ từ từ dung dịch III cho đến khi giọt nước cuối trên lame không còn màu tím Rửa nước cất và để khô.
5 Nhỏ dung dịch Safranin (dung dịch IV) lên lame, để khoảng 2 phút Rửa nước cất và để khô ở nhiệt độ phòng Quan sát ở vật kính 100X có giọt dầu. Đọc kết quả
Vi khuẩn Gram dương (G+) có màu tím xanh.
Vi khuẩn Gram âm (G-) có màu hồng đỏ.
Để tiến hành quan sát vi khuẩn, bạn hãy cho một giọt nước muối sinh lý lên lam, sau đó thêm một ít vi khuẩn vào giọt nước muối đó Tiếp theo, đậy lamella lại cẩn thận để tránh tạo bọt khí Cuối cùng, quan sát kết quả dưới kính hiển vi với độ phóng đại 100X có sử dụng giọt dầu.
4 Phản ứng Oxidase: Dùng dung dịch Oxidase
Dùng que cấy phết một ít vi khuẩn lên giấy lọc đã tẩm dung dịch Oxidase.
Kết quả: Vi khuẩn cho phản ứng Oxidase (+) sẽ làm giấy lọc chuyển sang màu xanh trong vòng 10 giây và ngược lại.
Sử dụng dung dịch 3% H2O2 (3 ml H2O2 trong 100 ml nước cất). i Dùng que cấy nhặt một ít vi khuẩn để lên lame. ii Nhỏ lên vi khuẩn một giọt 3% H2O2.
Kết quả: Vi khuẩn cho phản ứng Catalase (+) sẽ gây hiện tượng sủi bọt trong dung dịch 3% H2O2 và ngược lại.
6 Khả năng lên men và oxy hóa đường glucose (O/F):
1 Đun và cấy cho tan hoàn toàn môi trường O/F.
2 Tiệt trùng ở 121 o C trong 15 phút, để nguội 45 o C.
3 Thêm 1% glucose tiệt trùng Cho 3-5 ml môi trường vào ống nghiệm.
4 Cấy vi khuẩn vào 2 ống nghiệm có chứa môi trường O/F Sau đó phủ 0,5 – 1 ml dầu parafin tiệt trùng vào 1 ống nghiệm để tạo điều kiện yếm khí trong ống nghiệm Để trong tủ ấm 28 o C.
Theo dõi và đọc kết quả sau từ một đến 7 ngày.
Lên men (F) khi ống có phủ parafin chuyển sang màu vàng.
Oxidation (O) khi ống không có phủ parafin chuyển sang màu vàng.
Không đổi (N) cả hai ống đều có màu xanh lá cây hoặc xanh lơ.
Phản ứng dùng để phân biệt nhóm vi khuẩn Aeromonas và Vibrio Vi khuẩn
Aeromonas kháng (âm tính) và Vibrio (dương tính) với hợp chất này.
1 Nuôi tăng sinh vi khuẩn trong ống nghiệm
2 Dùng pipette tiệt trùng hút vi khuẩn trong ống nghiệm cho 5 giọt lên đĩa agar.
3 Dùng que trãi thủy tinh trãi đều vi khuẩn trên đĩa agar.
4 Đậy nắp đĩa để khoảng 1 phút.
5 Dán các đĩa giấy tẩm O/129 ở nồng độ 10g và 150g lên đĩa agar.
6 Ủ trong tủ ấm 28 – 30 o C và đọc kết quả sau 24 giờ.