Mục đích nghiên cứu 2
Đề tài này đánh giá tiềm năng hóa học của nấm tổ ong lông thô (Hexagonia Apiaria) thông qua việc thu mẫu thực vật, chụp ảnh, tạo tiêu bản và chiết xuất metanol Nghiên cứu còn bao gồm tách chiết, phân lập và xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất, nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu khoa học phục vụ cho các nghiên cứu ứng dụng tiếp theo trong việc phát triển sản phẩm dược phẩm phục vụ cuộc sống.
Nhiệm vụ nghiên cứu 2
Trong đề tài này, chúng tôi có các nhiệm vụ:
- Chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất từ nấm tổ ong lông thô (Hexagonia Apiaria) Perf.)
- Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất từ nấm tổ ong lông thô (Hexagonia Apiaria) Perf.).
Đối tƣợng nghiên cứu và phạm vi nghiên cứu 2
Đối tượng nghiên cứu là quả thể loài nấm nấm tổ ong lông thô (Hexagonia
Apiaria) Perf.) thuộc chi nấm Hexagonia.
Phương pháp nghiên cứu 2
- Thu mẫu và xác định tên khoa học cây
- Chiết với các dung môi có độ phân cực khác như hexan, etyl axetat, butanol…
Sử dụng kết hợp các phương pháp sắc ký như sắc ký cột thường (CC) với silicagel cỡ hạt 230-400/mesh và sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng kính silicagel Merck 60 F254 tráng sẵn, độ dày 0,2 mm, cùng với các phương pháp kết tinh phân đoạn để phân tích hiệu quả.
Cấu trúc hoá học của các hợp chất được phân lập đã được xác định bằng các phương pháp vật lý hiện đại, bao gồm phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều (1D NMR) cũng như hai chiều (2D NMR) Các kỹ thuật cụ thể như 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, 1H-1H COSY, HSQC và HMBC đã được áp dụng để phân tích và xác định cấu trúc.
Cấu trúc lập thể của các hợp chất này, bao gồm cả cấu trúc tương đối và tuyệt đối, được xác định thông qua các phản ứng hóa học và các phương pháp phổ NMR, sử dụng các kỹ thuật như NOE và NOESY.
TỔNG QUAN 1.1 Họ Nấm Lỗ (Polyporaceae) 3
Đặc điểm thực vật và phân bố 3
Họ Polyporaceae, thuộc khung Basidiomycota, bao gồm 92 chi và hơn 636 loài nấm Các loài trong họ này chủ yếu là nấm gỗ mục nát, được chia thành hai loại: 71 loài nấm trắng thối, có khả năng phân hủy lignin với hệ sợi nấm mono- hoặc di-mitic và bề mặt bào tử mịn, lưỡng cực; và 21 loài nấm nâu thối, chuyên phân hủy cellulose, có hệ sợi nấm di- hoặc tri-mitic và tứ cực.
Hầu hết các loài trong họ này có hymenium nằm trong các lỗ chân lông ở mặt dưới của mũ nấm Một số loài như Panus lại có mang, trong khi một số khác sở hữu cấu trúc mang tương tự.
Daedaleopsis là một loại nấm có đặc điểm nổi bật với các lỗ chân lông dài hình mê cung Quả thể của chúng sống hàng năm, trong đó nhiều loài không có cuống, nhưng một số lại có cuống duy nhất Thịt quả thể ban đầu mềm nhưng sau đó trở nên rất cứng khi khô Bào tử của nấm có hình trụ hoặc elip và có màu trắng, chủ yếu mọc trên thân cây gỗ.
Phân bố rộng rãi ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới và chỉ có một ít loài sinh sống ở vùng ôn đới (chi Grifolia Gray).
Thành phần hóa học 3
Nghiên cứu các hợp chất có hoạt tính sinh học mới từ nguồn tự nhiên đã trở thành một lĩnh vực y học quan trọng trong nhiều thập kỷ qua, cung cấp những loại thuốc và hợp chất tiềm năng chữa bệnh Nấm được coi là nguồn truyền thống của các hợp chất này và hiện đang là mục tiêu điều trị đầy hứa hẹn Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào các tác dụng như chống Alzheimer, chống bệnh tiểu đường, chống sốt rét, chống vi khuẩn, chống oxy hóa, chống ung thư, chống virus và hoạt động hạ cholesterol, tất cả đều là những mục tiêu quan trọng trong nghiên cứu thuốc hiện nay.
Nấm dược liệu chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học, bao gồm polysaccharides, protein, và chất béo, cùng với các hợp chất chuyển hóa phức tạp như terpenoid, steroid, polypeptide, alkaloid, và benzaldehyde Những hợp chất này đã được nghiên cứu bởi các nhà khoa học trong nhiều năm qua, cho thấy tiềm năng lợi ích trong việc chữa bệnh Ngoài ra, các hợp chất có khối lượng phân tử cao mới cũng thể hiện hoạt tính sinh học đáng kể.
12 polysaccharides (β-glucans), protein và polysaccharide protein phức hợp đã được nghiên cứu rộng rãi cho miễn dịch hiệu quả và hoạt tính sinh học khác [8]
1.1.2.1.1 Lanostanes triterpenoit và dẫn xuất của nó
Nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng triterpenoids có khả năng kích thích tế bào chết Các triterpenoids tự nhiên và bán tổng hợp như avicins và axit cyano-3,12-dioxooleana-1,9(11)-dien-28-oic (CDDO), cùng với methyl ester của nó (CDDO-Me) và dẫn xuất imidazolide (CDDO-Im), đã được Petronelli và các cộng sự xem xét gần đây Hơn nữa, các hợp chất này và dẫn xuất của chúng cũng đã thu hút sự quan tâm nghiên cứu từ nhiều nhà khoa học khác.
Lanostan là một nhóm triterpenoit tetracyclic được chiết xuất từ lanosterol, nổi bật với các đặc tính sinh học và dược lý Chúng có khả năng gây độc tế bào thông qua việc kích thích quá trình apoptosis, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong y học.
Ganoderma lucidum cùng với một số loài nấm khác như Poria cocos, Laetiporus sulphureus, Inonotus obliquus, Antrodia camphorata, Daedalea dickinsii và Elfvingia applanata, đều có tiềm năng lớn trong việc chống ung thư nhờ vào khả năng gây độc tế bào và tác động đến quá trình apoptosis.
Nấm thuộc họ Polyporaceae là nguồn gốc của triterpenes tetracyclic nhóm lanostane, với hơn ba mươi hợp chất, đặc biệt là axit cacboxylic C30 hoặc C31 đã được phân lập Gần đây, các nhà khoa học đã chú ý đến nhiều loài nấm khác trong họ này, như Polyporus umbellatus và Poria cocos.
Laetiporus sulphureus, Antrodia camphorata và Daedalea dickinsii là những loài nấm chứa nhiều lanostanoit, trong đó axit cacboxylic chiếm tỷ lệ lớn Các axit cacboxylic này được phân loại thành 4 cấu trúc chính: khung trametenolic, khung eburicoic, khung lanosterol và khung cycloartenol.
Hình 1.1: Các kiểu cấu trúc lanostanoit cơ bản
Ngoài 4 loại khung cơ bản trên, khi cô lập hợp chất lanostanoit từ các loài nấm trong họ Polyporaceae còn có một số khung như sau [59]:
Hình 1.2: Các kiểu cấu trúc lanostanoit khác
Từ năm 1991 đến 1996, Tai T và cộng sự đã phân lập 12 hợp chất lanostanoit từ lớp bề mặt khô của nấm Poria cocos, trong đó có 7 hợp chất triterpenoit mới, bao gồm axit poricoic A, B, axit dehydropachymic, axit pachymic, axit 3-epi-dehydrotumulosic, axit methyl 25-hydroxy-3-epi-dehydrotumulosate, và axit poricoic E, BM Ngoài ra, còn có axit dimethyl poricoate F và axit dehydrotumulosic.
14 dehydroeburiconic (11), và axit 3-O-acetyl-16α-hydroxytrametenolic (12), axit tumulosic (13) [9, 10, 11, 12]
In 1996, researchers led by Nukaya H isolated two carboxylic acids, 3β, 16α-dihydroxylanosta-7,9(11),24-trien-21-oic and 16α-hydrodehydropachymic, along with 16α-hydroxytrametenolic acid, from the methanol extract of this mushroom species These compounds demonstrated inhibitory activity against 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) in mouse skin.
Vào năm 1997, Kawagishi H và các cộng sự đã phát hiện ra một hợp chất lanstane triterpenoit mới, được gọi là polyporenic acid C, từ dịch chiết của quả thể nấm Daedalea dickinsii Hợp chất này cho thấy hoạt tính ức chế collagen ở người với giá trị IC50 là 126 µM.
In 1999, Rürsecke J and colleagues identified 12 lanostanoid derivatives from the hexane and methanol extracts of the hard shell fungus Fomitopsis pinicola, including six novel compounds: pinicolic acid A, trametenolic acid B, 21-hydroxylanosta-8,24-dien-3-one, 21-hydroxylanosta-7,9(11),24-trien-3-one, and lanosta-7,9(11),24-trien.
3β,21-diol (22), axit 3α-acetoxylanosta-8,24-dien-21-oic (23), axit fomitopsic B (24), lanosta-7,9(11),24-trien-3-on (25), pinicolol B (26); axit pinicolic B, C, D (27- 29)
Vào năm 2000, Bae K G và các cộng sự đã chiết xuất thành công axit lanostenoid hydroxy từ quả thể nấm Daedalea dickinsii, cụ thể là axit 31-hydroxycarboxyacetylquercinic, có khả năng kháng khuẩn và ức chế vi khuẩn gây bệnh ở người.
Năm 2002, Ukiya T và cộng sự đã phát hiện hai hợp chất triterpenes mới từ quả thể nấm khô Poria Cocos, bao gồm axit poricoic G (axit 16α-hydroxy-3,4-seco-lanosta-4(28),8,24-triene-3,21-dioic) và axit poricoic H (axit 16α-hydroxy-3,4-seco-24-methyllanosta-4(28),8,24(24)-triene-3,21-dioic) Hợp chất axit poricoic G cho thấy khả năng gây độc mạnh đối với tế bào ung thư, đặc biệt là tế bào bạch cầu HL-60, với giá trị GI50 đạt 39.3 µM, đồng thời gây độc vừa phải với các loại tế bào khác.
Năm 2004, Một triterpene lanostanoid mới với 5 triterpenes được phân lập từ quả thể của nấm Laetiporus sulphureus bởi León F và cộng sự là axit 3-oxo-sulfurenic
Axit sulfurenic, axit acetyl eburicoic, axit acetyl trametenolic và 15α-hydroxytrametenolic acid đều có khả năng kháng khuẩn, kháng virus, ức chế protease, chống oxy hóa, chống viêm và tăng cường miễn dịch Các hợp chất này cho thấy tiềm năng chống lại tế bào HL-60, trong đó 33, 34 và 36 là những chất cảm ứng mạnh nhất với giá trị IC50 lần lượt là 14, 15 và 12 μM Hợp chất 32 có hiệu ứng yếu hơn với IC50 là 407 μM, trong khi các hợp chất còn lại có giá trị IC50 cao hơn.
Axit Acetyl eburicoic ( ) Axit Acetyl trametenloic R = Ac, R = H ( )
Năm 2005, Yoshikawa K và cộng sự đã tách được 3 hợp chất lanostane triterpenoids và 5 hợp chất lanostane triterpene glucosides mới từ quả thể nấm
Daedalea dickinsii gồm : axit daedaleanic A (37), B (43), và C (44); daedaleasides
A (38), B (39), C (40), D (41) và E (42) ; với một axit carboxyacetyl quercinic (45) hoạt động gây độc với dòng tế bào bạch cầu (HL-60) và tế bào khối u ruột (HCT-
15) Đối với HCT-15 có giá trị IC50 khác nhau là 32,3 và 60,0μM; dòng tế bào HL-
60 với giỏ trị IC 50 là 9.4 và 15.0àM [19]
Trong 2 năm 2007 và 2009, nhóm của Akihisa T đã phân lập được 22 axit lanostane triterpene từ biểu bì khô của quả thể nấm Poria Cocos gồm: axit eburicoic
(46), axit 3-epidehydrotrametenolic (47), axit 15α-hydroxydehydrotumulosic (48), axit dehydrotrametenonic (49), axit 16α,25-dihydroxydehydroeburiconic (50), axit 5α,8α- peroxydehydrotumulosic (51), axit 25-hydroxyporicoic H (52), axit 16-deoxyporicoic
Bài viết đề cập đến các axit như axit poricoic C, D, AM, CM, DM và nhiều axit khác như axit 16α,27-dihydroxy-dehydrotrametenoic, axit 25-hydroxy-3-epidehydrotumulosic, axit 25-hydroxy-3-epi-tumulosic, axit 16α-hydroxyeburiconic, axit 25-methoxyporicoic A, axit 26-hydroxyporicoic DM, axit 25-hydroxy-poricoic C, axit poricoic HM, và axit 6,7-dehydroporicoic H Các hợp chất 46, 47, 49, 54, 55, 56 có tác dụng chống lại các kháng nguyên vi rút Epstein-Barr (EBV-EA), trong khi các hợp chất 59, 60, 61, 62, 63, 64 cho thấy khả năng gây độc tế bào đối với hai dòng tế bào ung thư là bạch cầu (HL60) và khối u ác tính (CRL1579).
Hoạt tính sinh học 25
Một số loài nấm thuộc họ Polyporaceae đã được nghiên cứu về hoạt động sinh học, cho thấy nhiều loại nấm trong họ này có hoạt tính đáng kể Các thử nghiệm đã chỉ ra rằng chúng mang lại hiệu quả tích cực trong việc gây ra các hoạt động sinh học khác nhau.
Nghiên cứu đã chỉ ra rằng 34 độc tế bào trên nhiều dòng ung thư khác nhau ở người, bao gồm ung thư phổi, ung thư vú, ung thư cổ tử cung và khối u ác tính, cho thấy tiềm năng trong việc phát triển các loại thuốc mới Các loại nấm có thể là nguồn cung cấp dồi dào cho việc phát triển thuốc nhờ vào các hợp chất có hoạt tính sinh học mạnh mẽ, bao gồm cả khả năng chống HIV và kháng khuẩn.
1.1.3.1 Hoạt tính gây độc tế bào
Một số hợp chất triterpenoid và sterols được phân lập từ các loài nấm trong họ Polyporaceae đã cho thấy khả năng gây độc tế bào đối với nhiều dòng tế bào ung thư ở người, bao gồm bạch cầu (HL-60), ung thư phổi (A549), ung thư vú (SK-BR3), ung thư cổ tử cung (HeLa229), khối u ác tính (CRL1579), khối u ruột (HCT-15), ung thư tuyến tiền liệt (DU145), ung thư dạ dày (AZ521), ung thư đại tràng (HT-29), ung thư gan (HeP37) và ung thư tuyến tụy Các hợp chất này có giá trị IC50 và khả năng gây độc tế bào khác nhau, cho thấy tiềm năng ứng dụng trong điều trị ung thư.
In addition to their cytotoxic properties, triterpenoid and sterol compounds exhibit inhibitory activities, including the inhibition of collagen in humans with an IC50 of 126 µM for compound 17 They also demonstrate protease inhibition and affect two isoforms of steroid 11β-dehydrogenases, specifically 11β-HSD1 and 11β-HSD2.
Ba hợp chất 134, 135, 136 có hoạt tính ức chế protein tyrosine phosphatase 1B
(PTP1B) ở IC 50 với giá trị là 8.9 ± 0.3, 6.5 ± 0.6 và 7.5 ± 0.2 μg/mL [38] Hợp chất 97 cú hoạt tớnh ức chế tăng trưởng cõy trồng với IC 50 giỏ trị 1,3àM và 1,7àM
Nhiều loài nấm trong họ này không chỉ sở hữu hoạt tính sinh học cao mà còn có khả năng chống lại tế bào HIV, đồng thời thể hiện tính chống oxy hóa, chống viêm, và khả năng kháng khuẩn Ngoài ra, chúng còn có khả năng chống lại virus Epstein-Barr (EBV-EA) và hỗ trợ hệ miễn dịch thông qua việc tăng cường globulin miễn dịch.
Chi Hexagonia 26
Hexagonia là một chi nấm thuộc họ nấm lỗ (Polyporaceae), phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới với khoảng 16 loài Năm 1964, Teng đã công bố 7 loài nấm thuộc khu hệ nấm Trung Quốc, trong khi năm 1980, Ryvarden đã công bố 13 loài thuộc khu hệ nấm Đông Phi, bao gồm các loài như H.apiaria, H.tenuis, H.variegata, và nhiều loài khác như H.dermatiphora, H.hirta, H.hydnoides, H.leprosa, H.niam-niamensis, H.nitida, H.vesparia, H.pobeguinii, H.speciosa, H.umbrinella, H.velutina, H.similis, và H.zambesiana.
Chi nấm này được nhận diện qua hệ thống sợi trimitic với màu sắc của sợi nấm và bào tử hình trụ lớn Các loài trong chi thường có lỗ chân lông lớn hình lục giác Nấm thường sống lâu năm, ký sinh trên cây thân gỗ hoặc thực vật cao, có hình dạng giống như quạt với lề mỏng và bề mặt thô Thịt nấm khi khô có màu xám nhạt đến nâu và có chất bì dai Ống nấm thường có hình dạng to tròn hoặc lục giác đều Bào tử có màu khụng, nhẵn bóng, hình trứng hoặc trụ, dài hơn 12 µm, với bề mặt mịn và có lông măng hoặc lông dài, cùng với lỗ chân lông lớn hình lục giác.
Phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới Châu Á, Châu Phi, một số loài ở Châu Âu Ở Châu Á gặp ở Trung Quốc, Việt Nam, Philippin…[4]
Hiện tại, nghiên cứu về thành phần hóa học và giá trị y học của các loài trong chi Hexagonia vẫn còn hạn chế Đến nay, chỉ có hai nghiên cứu được thực hiện đối với nấm H.speciosa.
Năm 2009, Jiang M Y và các cộng sự đã phân lập thành công 11 hợp chất cyclohexanoit mới với tính oxy hóa cao, trong đó có speciosin AK (199–210) và aporpinone A (12), được chiết xuất từ dịch chiết etyaxetat của quả thể nấm.
Năm 2011, Jiang M Y và các cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thêm trên đối tượng này, trong đó họ đã phân lập được 10 hợp chất mới, bao gồm 9 hợp chất cyclohexanoit là speciosin L-T (211 – 219) và 5’-O-acetylaporpinone A (220).
Hexagonia là một loại nấm quý hiếm, chưa phổ biến và chưa được nghiên cứu nhiều tại Việt Nam Tuy nhiên, với hàm lượng hoạt chất cao, loài nấm này có tiềm năng lớn trong lĩnh vực nuôi trồng và khai thác dược liệu.
Nghiên cứu đã kiểm tra hoạt tính sinh học của Speciosin B và Aporpinone A trên các dòng tế bào ung thư người như HL-60, SMMC-7721, A-549, MCF-7 và SW480 Speciosin B cho thấy hoạt tính kháng ung thư mạnh mẽ với giá trị IC50 lần lượt là 0.23 àM (HL-60), 0.70 àM (SMMC-7721), 3.30 àM (A-549), 2.85 àM (MCF-7) và 2.95 àM (SW480) Trong khi đó, Aporpinone A cũng có khả năng ngăn chặn sự phát triển của một số dòng ung thư với giá trị IC50 là 4.07 àM (SMMC-7721), 21.01 àM (A-549) và 10.45 àM (MCF-7).
Nấm tổ ong lông thô (Hexagonia Apiaria) Perf.) 28
Loài: Hexagonia apiaria (Pers.) Fries
Tên tương tự: Polyporus apiarius Pers., Hexagonia koenigii Berk.,
Hexagonia atra Lloyd, Hexagonia calignosa Lloyd
Quả thể của nấm không cuống có hình dạng nửa tròn hoặc hình thận, mỏng dẹp Khi còn non, mũ nấm có màu tối đến nâu xám, sau đó chuyển sang màu sẫm gần như đen Mặt mũ phẳng với các vân đồng tâm không rõ rệt và vân phóng xạ, đôi khi có dạng gấp nếp Bề mặt mũ được phủ lông lớn, ban đầu màu nâu và dần tối lại, có chiều dài từ 2-3mm Mép mũ mỏng, sắc và lượn sóng ít nhiều Kích thước mũ nấm dao động từ 5-10 × 8-15(20) × 0,4-2cm.
Quả thể nấm tổ ong lông thô (Hexagonia Apiaria) có ống nấm rộng, hình tổ ong với kích thước từ 0.3-0.6cm và có hình dáng 6 cạnh Thịt ống nấm đồng màu với thịt nấm, trong khi bề mặt nấm khi còn non có màu trắng sáp ong và sẽ nhạt dần khi nấm già Trên lớp sinh sản (hymennium), có các bó sợi nấm hình nón với chiều cao từ 100-150µm, gốc rộng từ 30-70µm, màu nõn và phần trơn gần như không có màu.
Hệ sợi trimitric, phân nhánh mạnh Bào tử hình trụ, màu nâu tối, màng nhẵn bóng, khụng chứa tinh bột, kớch thước 4.5-6.0 ì 11.0-15àm
Nấm thường mọc đơn độc hoặc theo kiểu ngói lợp, có thể sống hoại sinh hoặc ký sinh trên cây lá rộng Tại Việt Nam, loài nấm này ký sinh trên ngọn cành của cây nhãn cao tuổi Đây là một loài nấm thuộc hệ Ấn Độ - Malaysia, được ghi nhận lần đầu bởi Kreisel vào năm 1956, và cũng xuất hiện ở một số đảo cũng như châu Úc.
1.3.3 Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học
Hiện nay chưa có một công trình nghiên cứu nào thành phần hóa học cũng như giá trị sử dụng trong y học của loài nấm này
PHƯƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1 Phương pháp nghiên cứu 31
Phương pháp lấy mẫu 31
Mẫu nấm được thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm và sau đó được rửa sạch Sau khi rửa, nấm được để nơi thoáng mát hoặc sấy khô ở nhiệt độ 40 độ C Tiếp theo, mẫu nấm được xử lý bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi phù hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất phục vụ cho nghiên cứu.
2.1.2 Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất Để phân tích và phân tách cũng như phân lập các hợp chất, sử dụng các phương pháp sắc ký như :
- Sắc ký cột thường, sử dụng silicagel cỡ hạt 230 - 400/mesh
- Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích được tiến hành trên bản mỏng kính silicagel - Merck 60 F 254 tráng sẵn, độ dày 0,2 mm
- Hiện màu: hơi iot và đèn UV 254 nm
- Các phương pháp kết tinh phân đoạn.
Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất 31
Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ:
- Phổ khối lượng phân giải cao (HR-ESI-MS)
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13 C-NMR
Hoá chất, dụng cụ và thiết bị 31
Các dung môi được sử dụng để ngâm chiết mẫu thực vật cần phải là loại tinh khiết Việc sử dụng dung môi tinh khiết là rất quan trọng trong các phương pháp sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột.
40 phân tích (PA) Dung môi được sử dụng là: hexan, metanol, butanol, etylaxetat, axeton, nước cất
2.2.2 Dụng cụ và thiết bị
- Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Yanaco MP-S3
- Phổ hồng ngoại đo trên máy Bruker 270-30, viên nén KBr
- Máy khối phổ phân giải cao HR-ESI-MS Bruker TOF-Q 10187 (Phòng Phân tích Trung tâm, Đại học Khoa học Tự nhiên TP HCM)
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H-NMR được đo trên máy Bruker 500MHz, phổ 13 C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và COSY được đo trên máy Bruker 125 MHz.
Nghiên cứu các hợp chất 32
2.3.1 Phân lập các hợp chất
Quả thể nấm tổ ong lông thô (Hexagonia Apiaria) nặng 8,6 kg được phơi khô, nghiền nhỏ và ngâm chiết ba lần bằng dung môi methanol ở nhiệt độ phòng Qua quá trình này, thu được 180 g cao metanol thô màu nâu sau khi cất giảm áp suất Cao thô sau đó được hòa tan trong nước và chiết phân bố với dung môi clorofom, tạo ra hai phần: dịch chiết clorofom nặng 105 g và dịch chiết nước nặng 75 g.
Cao chiết clorofom được thực hiện bằng phương pháp sắc ký cột silica gel với các hệ dung môi n-hexan-axeton (100:0, 25:1, 15:1, 10:1, 7:1, 5:1) và dung môi rửa giải CHCl3-MeOH (10:0, 6:1, 3:1, 2:1, 1:1), từ đó thu được các phân đoạn nhỏ Các phân đoạn này được phân tích bằng sắc ký bản mỏng (TLC) và gộp lại thành 7 phân đoạn chính Tuy nhiên, phân đoạn 7 không có các điểm quan trọng trên bản mỏng, do đó không thể thu được các hợp chất tinh khiết từ phân đoạn này.
Phân đoạn 1 (8,6 g) được tách chiết bằng phương pháp sắc ký cột silica gel (200 gam, kích thước 60 x 5 cm) với các hệ dung môi hexan-axeton theo tỷ lệ 100:0, 25:1, 15:1, 10:1, và 4:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 250 ml, nhằm thu được bảy phân đoạn khác nhau.
Phân đoạn 1.7 (0,5 g) được tiến hành sắc ký cột pha đảo RP-18(100 gam, 60 x 3 cm) với hệ dung môi giải hấp với CH3 OH / H2O thu được hợp chất A (1) (134 mg)
Phân đoạn 3 (2,7 g) được phân tách bằng sắc ký cột silica gel (200 gam, 60 × 3,2 cm) với hệ dung môi hexan - axeton theo các tỉ lệ 9:1, 6:1, 4:1 và 1:1, mỗi hệ sử dụng 250 ml, nhằm thu được bốn phân đoạn nhỏ Phân đoạn 3.2 có khối lượng 0,5 g.
41 tục được sắc ký cột pha đảo RP -18 ( 100 gam, 60 x 3 cm) giải hấp b ng hệ dung môi CH3OH / H2O thu được hợp chất B (2) ( 31 mg )
UV (MeOH) λ max (log ε) 247 (3,18) nm;
HR-ESI-MS m/z 519,3083 [M+Na] + ( theo tính toán C31H44O5Na m/z
1H-NMR (400 MHz, CDCl 3 ) ( ppm): 9,59 (1H, s, CHO-18), 4,32 (1H, ddd, J
(1H, m, H-12), 1,21 (1H, dd, J = 14,0, 5,0 Hz, H-12), 1,10 (3H, s, CH3-22), 1,07 (3H, s, CH3-19), 1,03 (3H, s, CH3-20), 0,95 (3H, d, J = 6,5 Hz, CH3-29), 0,69 (3H, s, CH 3 -21);
1H-NMR (CDCl3 & CD3OD) ( ppm): 3,21 (1H, dd, J=5,5, 10,5 Hz, H-3);
Phổ 13 C-NMR (CDCl3 & CD3OD) ( ppm): 180,7(C-28); 138,1(C-13); 125,5(C-12); 78,9(C-3); 55,2(C-5); 52,7 (C-18); 47,7 (C-17); 47,5(C-9); 42,0(C-14); 39,4(C-8); 39,0(C-19); 38,8(C-20); 38,7(C-4); 38,6(C-1); 36,7(C-22); 36,9(C-10); 33,0(C-7); 30,6(C-21); 28,0(C-23); 27,9(C-15); 26,9(C-2); 24,1(C-16); 23,5(C-27); 23,2(C-11); 21,1(C-30); 18,3(C-6); 16,9(C-26); 16,8(C-29); 15,5(C-24); 15,4(C-25)
Quả thể nấm H.apiaria (8,6kg)
Sơ đồ 2.1 Phân lập các hợp chất trong nấm tổ ong lông thô (Hexagonia
