TỔNG QUAN
Tổng quan về chất chiết nấm men
Theo định nghĩa của Food Chemical Codex, "yeast extract" là sản phẩm chứa các thành phần hòa tan từ nấm men, bao gồm amino acid, đoạn peptide, carbohydrate và muối Sản phẩm này được tạo ra thông qua quá trình thủy phân các chuỗi peptide nhờ enzyme của tế bào nấm men hoặc enzyme được thêm vào trong thực phẩm.
Hình 1.1: Chất chiết nấm men dạng bột (Yeast extract)
Chất chiết nấm men, hay còn gọi là "yeast extract", là sản phẩm thu được từ các thành phần trong tế bào nấm men sau khi phá vỡ tế bào Nó được sử dụng rộng rãi trong ngành công nghệ thực phẩm như một phụ gia và gia vị, có mặt trong nhiều loại thực phẩm như súp, nước chấm, bánh snack và đồ hộp Ngoài ra, trong kỹ thuật vi sinh, chất chiết nấm men cũng là một thành phần dinh dưỡng quan trọng trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật.
Nghiên cứu của Youk và Ingram (1996) cho thấy một số vitamin có trong chất chiết nấm men có lợi cho sức khỏe con người và đóng vai trò quan trọng trong môi trường nuôi cấy vi sinh vật Nhiều nghiên cứu đã được thực hiện về quy trình sản xuất chất chiết nấm men (Breddam và Beenfeld, 1991; Roman và cộng sự, 1991; Choi và Chung, 1998) Hiện nay, có nhiều phương pháp sản xuất chất chiết từ tế bào nấm men, nhưng về bản chất, chúng chủ yếu dựa vào hai quá trình chính: tự phân (autolysis) và thủy phân (hydrolysis).
Chất chiết nấm men hiện nay được sản xuất và thương mại hóa với ba dạng chính: dạng lỏng, dạng paste và dạng bột Trong đó, chất chiết nấm men dạng bột được ưa chuộng hơn cả nhờ vào những ưu điểm vượt trội trong việc vận chuyển và bảo quản.
Chất chiết nấm men là thành phần tự nhiên nổi bật trong việc tạo vị cho thực phẩm Theo quy định của luật thực phẩm châu Âu, chất này được ghi nhãn là “yeast extract” hoặc “natural flavour” và không cần phải liệt kê danh sách thành phần.
Chất chiết nấm men có hai hướng ứng dụng chính:
Trong sản xuất thực phẩm
Trong ngành công nghệ thực phẩm, chất chiết nấm men được ứng dụng phổ biến nhằm hai mục đích chính: nâng cao hương vị cho sản phẩm và cải thiện giá trị dinh dưỡng của thực phẩm (Moresi và cộng sự, 1995) [10].
Chất chiết nấm men chủ yếu được sử dụng để tạo ra hương vị thơm ngon và cảm nhận vị umami, được biết đến như vị ngọt thịt Umami là một trong năm vị cơ bản, bên cạnh vị ngọt, chua, đắng và mặn, và đã được công nhận chính thức tại hội thảo khoa học quốc tế về vị umami vào năm 1985.
Umami là vị đặc trưng của acid amin L-glutamate và các ribonucleotide như GMP và IMP, giúp tạo ra vị hài hòa và làm “tròn vị” cho món ăn Monosodium glutamate (MSG) thường được sử dụng để mang lại vị umami Hiện nay, chất chiết nấm men với hàm lượng acid glutamic tự do cao đã trở thành một lựa chọn thay thế cho bột ngọt trong sản xuất thực phẩm.
Nghiên cứu của Kunikawa (1960) đã chỉ ra rằng 5’-GMP có khả năng kích thích vị giác, và nấm men chứa nhiều RNA, vốn rất giàu 5’-GMP Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho việc nghiên cứu sản xuất chất chiết nấm men giàu 5’-GMP, ứng dụng trong công nghệ thực phẩm.
Chất chiết nấm men được ứng dụng ngày càng nhiều trong công nghiệp thực phẩm:
Trong sản xuất thực phẩm chay, chất chiết nấm men được coi là thành phần tự nhiên mang vị ngọt thịt "umami", giúp cải thiện hương vị Ngoài ra, nấm men còn chứa nhiều acid amin, peptide và protein, cung cấp nguồn dinh dưỡng quan trọng cho người tiêu dùng thực phẩm chay.
Trong ngành sản xuất thực phẩm, các sản phẩm như súp, nước chấm, món ăn từ thịt, snack và thực phẩm chế biến sẵn đóng vai trò quan trọng (Berry, 1982; Peppler, 1982; Erten và Tanguler, 2006).
Trong kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật
Nguồn dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy đóng vai trò quan trọng đối với sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật Cacbon là yếu tố cần thiết cho việc tổng hợp các hợp chất hữu cơ, trong khi nitơ chủ yếu hỗ trợ tổng hợp acid nucleic Ngoài ra, các thành phần như phospho, sulfur và các vi chất dinh dưỡng như khoáng chất và vitamin cũng rất quan trọng, vì chúng là cofactor thiết yếu cho các phản ứng chuyển hóa sinh học.
Chất chiết nấm men đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự phát triển và sinh trưởng của nấm men trong quá trình lên men, giúp tăng tốc độ lên men và sự tổng hợp các sản phẩm từ quá trình này (Thomas và Ingledew, 1990; Jones và cộng sự, 1994; Bafrncova và cộng sự, 1999).
Chất chiết nấm men chứa nhiều thành phần quan trọng như protein, acid amin, lipid, vitamin và khoáng chất, tất cả đều cần thiết cho sự phát triển của nấm men.
Chất chiết nấm men được ứng dụng rộng rãi trong kỹ thuật nuôi cấy vi sinh vật nhờ vào hàm lượng vitamin, đặc biệt là các vitamin nhóm B, và khoáng vi lượng phong phú Những thành phần này rất có lợi cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật.
Tổng quan về nấm men
1.2.1 Cấu trúc tế bào nấm men
Nấm men Saccharomyces cerevisiae là loại nấm đơn bào phân bố rộng rãi, thường xuất hiện trong đất trồng nho, các khu vực trồng hoa quả, trên trái cây chín, trong không khí, nhụy hoa và trong quá trình sản xuất rượu vang.
Hình 1.2: Tế bào nấm men S cerevisiae trong giai đoạn sinh sản bằng phương pháp tạo chồi
Saccaromyces có khoảng 40 loài (Van Der Walt, 1970) Trong đó,
Saccharomyces cerevisiae là một loài nấm men phổ biến trong ngành thực phẩm, đặc biệt trong công nghệ lên men Nấm men này có hình elip, với kích thước tế bào lớn khoảng 5 – 10 µm và nhỏ từ 1 – 7 µm, thường lớn gấp 5 – 10 lần tế bào vi khuẩn Kích thước tế bào nấm men thay đổi theo điều kiện nuôi cấy và tuổi sinh lý, với thể tích khoảng 29 µm³ cho tế bào đơn bội và 55 µm³ cho tế bào lưỡng bội Saccharomyces cerevisiae thể hiện hầu hết các cấu trúc và chức năng của tế bào nhân chuẩn, do đó được sử dụng như một mô hình cho các tế bào nhân chuẩn sinh học Thành phần của nấm men bao gồm protein, glucoprotein, polysaccharide, polyphosphate, lipid và nucleic acid.
Bảng 1.1: Bảng phân loại các thành phần trong nấm men [25]
Nhóm cao phân tử Loại Thành phần chính
Protein Cấu trúc actin, tubulin (bộ khung tế bào) histones (H2A,
Glycoprotein Thành tế bào mannoprotein
Enzyme Enzyme chức năng (Invertase)
Polysaccharide Thành tế bào glucan, mannan, chitin
Polyphosphate Dự trữ Polyphosphate trong không bào
Nấm men là sinh vật đơn bào hiển vi có cấu trúc tế bào tương tự như động vật và thực vật So với vi khuẩn, nấm men thể hiện sự tiến hóa vượt bậc từ tế bào nhân sơ sang tế bào nhân chuẩn Sự tiến hóa này không chỉ liên quan đến sự hình thành của nhân có màng và các thể nhiễm sắc, mà còn dẫn đến sự xuất hiện của nhiều bào quan như ti thể và lục lạp, mà không có ở tế bào nhân sơ.
Tế bào nấm men, giống như nhiều loại tế bào khác, bao gồm các thành phần cơ bản như thành tế bào, màng nguyên sinh chất, nhân và các cơ quan con khác.
Hình 1.3: Sơ đồ của tế bào và các cơ quan của nấm men
Lipid Cấu trúc Sterol tự do trong màng tế bào
Dự trữ Hạt lipid (sterol ester và triglyceride) Chức năng Dẫn xuất phosphoglyceride, acid béo tự do Nucleic acid DNA Hệ gen học DNA (80%); ty thể (10-20%)
RNA rRNA (80%); mRNA (5% cytosol, ER, mitochondria), tRNAs, snRNAs
Thành tế bào của nấm men có độ dày từ 100 đến 200nm, chiếm khoảng 15 đến 25% khối lượng tế bào Nó đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào khỏi các tác động bên ngoài, đồng thời điều chỉnh mức độ thẩm thấu của chất dinh dưỡng và thải ra các sản phẩm trao đổi chất.
Thành tế bào nấm men được cấu tạo từ nhiều thành phần, trong đó glucan, manan, protein, lipid và kitin là những thành phần chính Polysaccharide chiếm 80 – 90% cấu trúc tế bào, chủ yếu là glucan và mannan, trong khi protein, lipid và glucosemin chiếm phần còn lại Bề mặt tế bào có nhiều lỗ giúp hấp thu dưỡng chất và thải các sản phẩm trao đổi chất.
Manan là hợp chất cao phân tử được cấu thành từ D-manose, với mỗi phân tử manan chứa từ 200 đến 400 thành phần manose Manan thường liên kết với protein theo tỷ lệ 2:1 và có các mối liên kết α-1,6; α-1,2; β-1,3 Phân tử lượng của manan khoảng 5 x 10^4 KDa.
Glucan là một polysaccharide cao phân tử được cấu thành từ D-glucose, với các liên kết β-1,6 và β-1,3 Hai thành phần này phân bố đều trong cấu trúc của thành tế bào.
Protein: thường được liên kết với các thành phần khác, ví dụ như manan
The composition of these substances includes various amino acids such as glycine, alanine, tyrosine, leucine, isoleucine, asparagine, glutamine, and phenylalanine, along with trace amounts of serine, histidine, and tryptophan The protein-mannan complex is highly stable, making yeast cells difficult to break down Typically, polysaccharides are located on the outer layer, while proteins are found closer to the cytoplasm.
Kitin, chiếm khoảng 3% trong cấu trúc, thường nằm ở phần nảy chồi và là chất rất bền vững, không bị enzyme phân hủy Chất này có tác dụng bảo vệ chồi khi còn non Khi tế bào con phát triển và tách khỏi tế bào mẹ, khu vực tạo ra tế bào con sẽ hình thành vết sẹo và không còn khả năng tạo ra chồi mới tại vị trí đó.
Thành tế bào bao gồm ba lớp chính: lớp ngoài là màng nhẵn dày từ 10 đến 30nm, chủ yếu cấu tạo từ lipoprotein; lớp giữa chứa phức hợp mannan protein dày khoảng 100nm; và lớp trong cùng có thể là chất keo hoặc sợi li ti dày từ 10 đến 250nm, được hình thành từ các gốc glucan với 94% là glucose và khoảng 6% là hexoamin.
Trong thành tế bào nấm men, lipid tồn tại dưới dạng phospholipid, chiếm từ 1% đến 10% tổng thành phần Thành tế bào này có hai vùng với tính thẩm thấu chọn lọc đối với các chất khác nhau, cho phép nước và các chất dinh dưỡng cần thiết đi vào bên trong thông qua các lỗ có đường kính lên đến 3,6nm.
Các enzyme được chiết xuất từ tế bào tập trung ở các lớp, có khả năng thủy phân các đường phân tử lớn như maltose và saccarose, giúp chúng dễ dàng thẩm thấu vào bên trong tế bào Nhờ vào quá trình này, các đường maltose và saccarose được đồng hóa hiệu quả bên trong tế bào.
Tế bào chất được bao bọc bởi một lớp màng mỏng chỉ dày khoảng 0,1nm, cấu tạo từ các hợp chất phức tạp như protein, phospholipid và enzyme permease Trong giai đoạn non, màng nguyên sinh chất bám sát thành tế bào, giúp nấm men có khả năng trao đổi chất mạnh mẽ Tuy nhiên, khi tế bào già đi, màng nguyên sinh chất co lại, tạo khoảng trống giữa thành tế bào và chất nguyên sinh, dẫn đến việc khả năng trao đổi chất của nấm men bị hạn chế.
Màng nguyên sinh chất có bốn chức năng chính: tạo rào chắn thẩm thấu, điều chỉnh dinh dưỡng từ môi trường vào tế bào và thải sản phẩm trao đổi chất ra ngoài, tham gia vào sinh tổng hợp các thành phần của tế bào như vỏ tế bào, và chứa các enzyme cũng như cơ quan tế bào như ribosome Quá trình vận chuyển chất qua màng liên quan chặt chẽ đến tính thẩm thấu, phụ thuộc vào hoạt động của các enzyme phospholipase và lipase.
Phương pháp phá vỡ tế bào
Trong sản xuất chất chiết nấm men, quá trình phá vỡ tế bào đóng vai trò quan trọng và ảnh hưởng lớn đến hiệu suất Chất chiết nấm men có thể được sản xuất qua các phương pháp như tự phân (autolysis), co nguyên sinh chất (plasmolysis) và xử lý enzyme (enzymatic hydrolysis), trong đó tự phân là phương pháp phổ biến nhất Ngoài ra, còn có nhiều kỹ thuật phá vỡ tế bào khác như phương pháp cơ lý, nhiệt và sóng siêu âm.
Trong công nghệ sản xuất chất chiết nấm men, quá trình tự phân và xử lý enzyme thường được áp dụng để phá vỡ thành tế bào, từ đó thu nhận hầu hết các chất chiết bên trong một cách hiệu quả.
1.3.1 Phá vỡ tế bào nấm men bằng phương pháp tự phân [39]
Tự phân là phương pháp hiệu quả để thu nhận các thành phần của tế bào nấm men, phục vụ cho việc sản xuất chất chiết nấm men trong ngành công nghiệp thực phẩm (Reed và Nagodawithana, 1991).
1.3.1.1 Đặc điểm của quá trình tự phân
Tự phân là quá trình phân hủy các polymer sinh học trong tế bào chết thông qua hoạt động của enzyme thủy phân, dẫn đến việc tạo ra các phân tử có khối lượng thấp.
Khi tế bào nấm men chết, thành tế bào mất khả năng tự bảo vệ và bị phá hủy bởi các enzyme nội bào Quá trình này dẫn đến sự phân hủy các chất bên trong tế bào như protein, nucleotide và carbohydrate bởi hệ enzyme này (Taguler và Erten, 2008) [37].
In the autolysis process, hydrolytic enzymes, primarily proteases and nucleases, present in cells catalyze the hydrolysis of proteins and nucleic acids Proteases specifically facilitate the breakdown of yeast proteins into peptides and amino acids.
Chất chiết nấm men thường được sản xuất từ Saccaromyces cerevisiae, bao gồm nấm men bánh mì và bã nấm men bia Đối với bã nấm men bia, cần xử lý trước khi sử dụng để loại bỏ các hợp chất từ hoa hublon và chất rắn trong quá trình lên men, nhằm giảm vị đắng của sản phẩm (Walker, 1999) Ngược lại, nấm men bánh mì không cần qua quá trình xử lý này (Bridson và Brecker, 1970).
Theo nghiên cứu của A.J Martínez-Rodríguez và cộng sự (2001), quá trình tự phân của tế bào nấm men dẫn đến nhiều thay đổi trong cấu trúc tế bào, đặc biệt là ở các cấu trúc cơ bản và vi cấu trúc bên trong Nghiên cứu được thực hiện trên chủng nấm men, cho thấy sự biến đổi đáng kể trong cấu trúc tế bào trong quá trình này.
Saccharomyces cerevisiae EC1118 cho thấy sự khác biệt rõ rệt về hình thái trong hai điều kiện thí nghiệm khác nhau Sau 24 giờ trong môi trường nuôi cấy tổng hợp với 5% glucose và 1% chất chiết nấm men, nấm men có hình dạng kéo dài và tròn, với một không bào lớn chứa các cấu tử hình cầu ở rìa Khi tiến hành thí nghiệm tự phân trong môi trường rượu vang theo công thức Feuillat (1987), bao gồm 10% ethanol, 4g/l acid tartaric, 3g/l acid malic, 0,1g/l acid acetic, 0,1g/l potassium sulfate và 0,025g/l magnesium sulfate, sau 24 giờ, thể tích nấm men giảm đáng kể do hòa tan tế bào chất vào môi trường Quan sát dưới kính hiển vi quang học Nomarsky cho thấy sự gia tăng thể tích của không bào, gần như chiếm trọn thể tích tế bào chất.
Hình 1.4 minh họa cấu trúc tế bào nấm men dưới kính hiển vi quang học Normasky sau 24 giờ nuôi cấy trong môi trường tổng hợp (a) và sau 24 giờ tự phân trong môi trường rượu vang (b) [27].
Với sự hỗ trợ của thiết bị LTSEM (Low Temperature Scanning Electron
Kính hiển vi điện tử quét ở nhiệt độ thấp cho phép quan sát rõ hơn hình thái cấu trúc của tế bào nấm men Sau 24 giờ tự phân, tế bào nấm men xuất hiện nhiều "vết sẹo" (bud scars), nếp nhăn (wrinkles) và nếp gấp (folders) chủ yếu theo chiều dọc, tương tự như các nghiên cứu trước đây của Avakiantz (1982), Charpentier và cộng sự (1986), Kollar và cộng sự (1993) Nguyên nhân chính là do tế bào nấm men mất hầu hết tế bào chất, điều này được chứng minh khi tế bào nuôi cấy trong môi trường tổng hợp không xuất hiện nếp nhăn hay nếp gấp Quan sát hình thái tế bào nấm men còn cho thấy nhiều vết nứt gãy và hình ảnh ba chiều cho thấy chúng trống rỗng, mất hết tế bào chất Kết luận rằng, sau 24 giờ trong môi trường rượu vang (wine medium), quá trình tự phân đã kết thúc, phù hợp với nghiên cứu của Maritenez Rodriguez và Polo (2000).
Hình 1.5: Tế bào nấm men sau 24h tiến hành quá trình tự phân trong môi trường rượu vang (wine medium) được quan sát bằng kỹ thuật LTSEM [27]
(a) Vi cấu trúc của tế bào nấm men
(b) (c) quan sát vết đứt gãy của các tế bào trống rỗng, hầu như bị mất hết lượng tế bào chất trong suốt quá trình thủy phân
1.3.1.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tự phân
Quá trình tự phân của nấm men chịu ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, trong đó nồng độ nấm men, ethyl acetate, chitosan, nhiệt độ, pH và thời gian đóng vai trò quan trọng nhất Những yếu tố này có tác động lớn đến chất lượng sản phẩm chiết xuất từ nấm men (Peppler, 1982) [37] Đặc biệt, từng loại nấm men sẽ có những yếu tố ảnh hưởng khác nhau (Satake Kenji, 2002).
Ảnh hưởng của nồng độ nấm men trong dung dịch:
Nồng độ nấm men trong dung dịch tự phân ảnh hưởng đáng kể đến hiệu quả của quá trình này; nồng độ nấm men thấp giúp tăng hiệu quả tự phân Tuy nhiên, nếu dung dịch quá loãng, tính kinh tế sẽ bị giảm sút Do đó, việc lựa chọn nồng độ nấm men phù hợp trong dung dịch tự phân là nhiệm vụ quan trọng cần được chú trọng.
- Theo nghiên cứu của Champagne và cộng sự (2003) dung dịch tự phân thường được pha loãng ở nồng độ 10 – 15% [36] [20] [38]
Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong quá trình tự phân, ảnh hưởng đến tổng hàm lượng chất chiết, hàm lượng amino acid và đặc tính cảm quan của sản phẩm Theo nghiên cứu của Taguler và Erten (2008), sự khác biệt về hàm lượng protein trong dịch thu được sau quá trình tự phân liên quan đến mức độ hoạt động và không hoạt động của enzyme ở các nhiệt độ khác nhau.
Nhiệt độ ảnh hưởng đáng kể đến quá trình thu nhận chất chiết nấm men, với nhiệt độ tối ưu được xác định là 50°C (Taguler và Erten, 2008) Khi nhiệt độ tăng lên 54°C, quá trình tự phân của nấm men bị suy giảm do enzyme có thể bị biến tính ở nhiệt độ cao (Behalova và Beran, 1986).
Quá trình thủy phân RNA thu nhận 5’-GMP bằng enzyme 5’-phosphodiesterase
Nghiên cứu này tập trung vào việc sản xuất chất chiết nấm men thông qua quá trình phá vỡ tế bào bằng cách sử dụng kết hợp giữa enzyme endo và exo Nhiều nghiên cứu trước đây đã chỉ ra hiệu quả của việc kết hợp hai loại enzyme này trong quy trình sản xuất chất chiết nấm men (Breddam và Beenfeld, 1991; Roman và cộng sự, 1991; Choi và Chung, 1998) Theo H.J Chae và cộng sự (2000), hàm lượng exoprotease trong quá trình thủy phân protein của nấm men có ảnh hưởng mạnh mẽ đến hiệu suất thủy phân và đặc tính cảm quan của sản phẩm chất chiết nấm men.
1.4 QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN RNA ĐỂ THU NHẬN 5’-GMP BẰNG ENZYME 5’ - PHOSPHOESTERASE
1.4.1.1 Cấu tạo hóa học và đặc điểm chung của RNA
Axit ribonucleic (RNA) là một loại axit nucleic với hai đặc điểm chính khác biệt so với axit deoxyribonucleic (DNA): cấu trúc đường và bazơ nitơ RNA chứa đường ribose, trong khi DNA chứa đường deoxyribose Các bazơ pyrimidine trong RNA và DNA cũng khác nhau; DNA có cytosine và thymine, còn RNA có cytosine và uracil RNA còn chứa nhiều bazơ thứ yếu hơn DNA Cả RNA và DNA đều được cấu tạo từ nucleotide, liên kết với nhau qua liên kết 3'-5'-phosphodiester để tạo thành phân tử polynucleotide Tuy nhiên, RNA có cấu trúc mạch đơn, khác với cấu trúc mạch kép của DNA, và cấu trúc bậc I của RNA xác định trật tự các gốc nucleotide trong chuỗi polynucleotide.
Hình 1.7: Mô hình biểu diễn khả năng tạo thành cấu trúc xoắn đôi ở những đoạn RNA có các trình tự bazo bổ sung
Cấu trúc bậc II của RNA có hình dạng xoắn, nhưng khác với DNA, RNA là một chuỗi polynucleotide liên tục, do đó cấu trúc xoắn chỉ diễn ra trong một phân tử duy nhất Trong quá trình này, chuỗi polynucleotide tạo thành cấu trúc xoắn thông qua các liên kết hydro giữa adenine và uracil (A−U) cũng như giữa guanine và cytosine (G−C).
RNA nằm trong nguyên sinh chất, trong ribosome và cả trong nhân tế bào, nhưng tập trung chủ yếu trong nguyên sinh chất
RNA thông tin (mRNA) được tổng hợp từ DNA trong nhân tế bào, mang theo thông tin cần thiết cho việc tổng hợp các protein đặc hiệu Kích thước của mRNA phụ thuộc vào kích thước của protein cần tổng hợp, dẫn đến sự đa dạng về kích thước và trình tự nucleotide của các phân tử mRNA trong một tế bào Sau khi tổng hợp, mRNA di chuyển từ nhân tế bào đến ribosome để thực hiện quá trình tổng hợp protein.
Hình 1.8 : Cấu tạo của mRNA
RNA vận chuyển (tRNA) có vai trò quan trọng trong việc chuyển các axit amin đã được hoạt hóa đến ribosome, nơi diễn ra quá trình tổng hợp protein tRNA chiếm khoảng 10% đến 20% tổng lượng RNA trong tế bào và có trọng lượng phân tử nhỏ, chỉ chứa từ 75 đến 90 nucleotide Hiện nay, các nhà khoa học đã xác định được thành phần và trật tự sắp xếp của hơn 100 loại tRNA khác nhau.
Hình 1.9 : Cấu tạo của tRNA
Ribosome RNA (rRNA) là cấu trúc ribosome bao gồm hai tiểu đơn vị: một tiểu đơn vị lớn và một tiểu đơn vị nhỏ Mỗi tiểu đơn vị này được hình thành từ ba thành phần chính, bao gồm protein, lipid và rRNA.
1.4.1.2 Đặc điểm RNA trong nấm men
RNA là thành phần thiết yếu trong nấm men, với ba loại chính: mRNA, tRNA và rRNA, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp protein cho tế bào.
Hàm lượng RNA trong tế bào nấm men thường dao động từ 6-12% (w/w), tùy thuộc vào đặc điểm sinh trưởng của từng loại nấm men Nghiên cứu đã chỉ ra điều này trên nấm men Saccharomyces cerevisiae (Furukara và cộng sự, 1983; Parada và cộng sự).
Acevedo, 1983) [35] [18] Chính điều này cho thấy có sự thuận lợi cho việc sản xuất chất chiết nấm men giàu 5’-GMP
1.4.2 Đặc điểm của guanosine 5 monophosphate (5’-GMP)
Guanosine 5 monophosphate có tên gọi khác là 5-guanidylic acid hay guanylic acid và thường được viết tắt là 5’-GMP Nó chính là một trong số các nucleotide cấu tạo nên RNA 5’-GMP chính là ester của acid phosphoric và nucleoside guanosine Thành phần cấu tạo của 5’-GMP gồm có nhóm phosphate, phân tử đường ribose và nucleobase guanine
Hình 1.10 : Cấu tạo của 5’-GMP
GMP được sử dụng trong công nghệ thực phẩm như là một phụ gia thực phẩm (food additives) ở dạng muối như: disodium guanylate (E627), dipotassium guanylate (E628) và calcium guanylate (E629)
Nhóm 5’-nucleotide được ứng dụng rộng rãi trong ngành dược, đặc biệt trong việc tổng hợp kháng sinh và thuốc chống ung thư Ngoài ra, các nucleotide này còn đóng vai trò quan trọng trong điều trị các bệnh liên quan đến thần kinh và hỗ trợ quá trình tuần hoàn máu trong cơ thể.
GMP có thể được thu nhận thông qua quá trình lên men vi sinh vật hoặc sử dụng phương pháp enzyme Theo nghiên cứu của Shi và cộng sự (2006), GMP được chiết xuất trực tiếp từ quá trình lên men, bằng phương pháp hóa học hoặc enzyme Quá trình thu nhận GMP bằng enzyme tương đối đơn giản và đạt hiệu suất thu hồi sản phẩm cao.
1.4.3 Quá trình thủy phân RNA để thu nhận 5’-GMP bằng enzyme 5’ – phosphoesterase
1.4.3.1 Đặc điểm của enzyme 5’ - phosphodiesterase
Chất lượng chiết xuất nấm men, đặc biệt về các đặc tính cảm quan, chịu ảnh hưởng lớn từ hàm lượng 5’-GMP và 5’-IMP Phương pháp thu nhận nucleotide từ RNA của nấm men được đề xuất bởi Kuninaka và cộng sự (1961) thông qua enzyme 5’-phosphodiesterase.
5’-phosphodiesterase (EC 3.1.4.1), hay còn gọi là phosphodiesterase I, là một enzyme ngoại bào thuộc nhóm exonuclease, có khả năng cắt liên kết phospho diester giữa nhóm hydroxyde và phosphoric của acid nucleotide Enzyme này thực hiện quá trình phân giải các phân tử acid nucleic thành các nucleotide riêng biệt như 5’-AMP, 5’-GMP, 5’-CMP và 5’-UMP, đặc biệt là đối với các phân tử RNA.
Hình 1.11 : Cơ chế tác dụng của enzyme 5’-phosphodiesterase
Hoạt tính của enzyme được xác định theo phương pháp của Fujishima và cộng sự (1972), sau đó được phát triển bởi Fujimoto và cộng sự (1974) Phương pháp này dựa trên việc đo lượng acid nucleotide hòa tan thu được từ quá trình thủy phân RNA bằng enzyme Cụ thể, 0,1ml enzyme dạng lỏng được ủ với 1,9ml dịch cơ chất chứa 1% RNA, 0,125M đệm acetate (pH=5,4) và 3mM Zn2+ ở nhiệt độ 69°C trong 15 phút Phản ứng sẽ dừng lại bằng cách thêm 2ml chất làm kết tủa acid nucleic (0,25% ammonium molybdate hòa tan trong 2,5% perchloric acid), sau đó hỗn hợp được giữ lạnh trong 10 phút RNA bị kết tủa sẽ được loại bỏ bằng ly tâm ở 4000rpm trong 10 phút ở 4°C, và phần dịch lỏng còn lại sẽ được pha loãng với nước cất Cuối cùng, dịch lỏng này được đo độ hấp thụ ở 260nm để tính toán hoạt độ enzyme.
Enzyme activity/(U/mL) = A 260 × 4,0 × 50/0,1 × 15 = A 260 × a × 133,3 với a là hệ số pha loãng
Như vậy, một đơn vị hoạt độ enzyme được xác định là lượng 5’nucleotide gây nên sự tăng 1,0 độ hấp thụ trong 1 phút ở 260nm [34]
Theo nghiên cứu của Tyas Utamin và cộng sự (2011), hoạt độ của enzyme 5’ phosphodiesterase được xác định dựa vào hiệu suất thủy phân bis-p-nitrophenyl phosphate (NPP) Quá trình này bắt đầu bằng việc cho 0,1 ml enzyme dạng lỏng vào 0,8 ml đệm acetate 50 mM và ủ ở 60°C trong 1 phút Sau đó, 0,1 ml dung dịch NPP 10 mM được thêm vào và phản ứng được dừng lại sau 10 phút bằng cách thêm 0,3 ml dung dịch sodium carbonate 5% Tiếp theo, dung dịch được pha loãng với 1,7 ml aquadest và màu vàng của p-nitrophenol được đo bằng máy quang phổ ở bước sóng 400 nm Một đơn vị hoạt độ enzyme được định nghĩa là lượng enzyme cần thiết để giải phóng 1 µmol p-nitrophenol trong mỗi phút tại 60°C và pH 5,0 (Dhule và cộng sự, 2006).
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu
2.1.1 Bã thải nấm men bia
Nghiên cứu này tập trung vào việc sử dụng bã thải từ nấm men bia Saccaromyces cerevisiae tại nhà máy bia Sapporo, thuộc công ty TNHH Sapporo Việt Nam, tọa lạc tại KCN Việt Hóa – Đức Hòa 3, huyện Đức Hòa, tỉnh Long An.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng ba loại enzyme: enzyme Protamex và enzyme Flavourzyme 500L của hãng Novozyme (Đan Mạch), Phosphodiesterase
I của hãng Sigma Aldrich (Mỹ)
Enzyme Protamex ® (E.C 3.4.21.62) là dòng sản phẩm protease từ vi khuẩn
Bacillus licheniformis và Bacillus amyloliquefaciens của hãng Novozyme A/S
Hoạt độ: 398,7mAU/g (1AU = 550UI)
Sản phẩm có màu nâu Cường độ màu thì không phải là một chỉ tiêu để đánh giá độ hoạt động của enzyme
Dạng vật lý: thể lỏng
Chất ổn định: sodium chloride
Yêu cầu kỹ thuật của enzyme thể hiện trong bảng 2.1
Bảng 2.1: Bảng yêu cầu kỹ thuật của sản phẩm Protamex ®
Chỉ tiêu Giới hạn dưới Giới hạn trên Đơn vị
Tổng tế bào vi sinh vật hiếu khí - 50000 /g
Để bảo quản sản phẩm hiệu quả, cần giữ trong điều kiện khô ráo và tránh ánh sáng mặt trời Nên sử dụng sản phẩm trong vòng 6 tháng kể từ khi mở bao bì.
Enzyme này sẽ bị bất hoạt khi được xử lý nhiệt ở 85 độ C trong 10 phút Sản phẩm enzyme này đã được FAO/WHO, JECFA và FCC công nhận đạt tiêu chuẩn an toàn cho thực phẩm.
Enzyme Flavourzyme ® là dòng sản phẩm protease từ nấm mốc Aspergillus oryzae và của hãng Novozyme A/S (Bagsvaerd, Denmark)
Sản phẩm có màu nâu, nhưng màu sắc có thể thay đổi tùy thuộc vào từng lô hàng Cường độ màu không phải là yếu tố quyết định để đánh giá hoạt động của enzyme.
Dạng vật lý: thể rắn
Chất ổn định: potassium chloride, sucrose
Yêu cầu kỹ thuật của enzyme thể hiện trong bảng 2.2
Bảng 2.2: Bảng yêu cầu kỹ thuật của sản phẩm Flavourzyme ®
Chỉ tiêu Giới hạn dưới Giới hạn trên Đơn vị
Tổng tế bào vi sinh vật hiếu khí - 10000 /g
Để bảo quản sản phẩm enzyme đạt tiêu chuẩn FAO/WHO, JECFA và FCC, cần giữ trong điều kiện khô ráo và tránh ánh sáng mặt trời Sản phẩm nên được sử dụng trong vòng 6 tháng sau khi mở bao bì.
Enzyme phosphodiesterase I là sản phẩm thương mại của Sigma Aldrich Co., Ltd – Mỹ
Hoạt độ: ≥ 0,01 UI/mg chất rắn Một đơn vị hoạt độ (UI) sẽ thủy phân được 1àmol cơ chất bis p nitrophenyl phosphate trong mỗi phỳt ở pH 8,8 và 37 0 C
Dạng vật lý: thể rắn
Nguồn thu nhận: từ nọc rắn (crude dried venom)
Để bảo quản sản phẩm hiệu quả, cần bao gói và lưu trữ trong điều kiện khô ráo, tránh ánh sáng mặt trời Nên sử dụng sản phẩm trong vòng 6 tháng kể từ ngày mở bao bì để đảm bảo chất lượng.
2.1.3 Hệ đệm phosphate – citrate pH môi trường làm thay đổi cấu trúc không gian protein vì một số amino acid có mạch nhánh phân ly COO– và NH 4 tạo liên kết ion Do đó, pH cũng là một yếu tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của các enzyme tự phân, do đó ảnh hưởng đến mức độ phá vỡ màng tế bào nấm men và khả năng giải phóng các thành phần từ lớp không gian chu chất ra bên ngoài tế bào
Dung dịch đệm là dung dịch có khả năng duy trì pH ổn định khi có sự thêm vào của một lượng nhỏ acid (H+) hoặc base (OH-) Nó bao gồm một cặp acid-bazơ liên hợp, bao gồm acid yếu và muối của acid đó, hoặc base yếu và muối của base đó Tỉ lệ giữa chúng sẽ quyết định giá trị pH của dung dịch.
Để pha dung dịch đệm hiệu quả, cần chọn cặp acid – base có hằng số phân ly pK A/B gần với giá trị pH mong muốn của dung dịch đệm Sau đó, tiến hành phối trộn chúng với nhau để đạt được sự ổn định pH cần thiết.
Hệ đệm phosphate-citrate được lựa chọn với hai thông số quan trọng là nồng độ và pH Nồng độ của hệ đệm thường dao động từ 0,1M đến 10M, và có thể pha loãng khi cần thiết pH của hệ đệm được điều chỉnh trong khoảng một đơn vị pH so với pKa của acid-base liên hợp, theo công thức pH = pKa + log ([Base]/[Acid]), với tỉ lệ [Base]/[Acid] là 1,096.
Hệ đệm phosphate - citrate gồm acid citric 0,1M và Na 2 HPO 4 0,2M có pH 2,2 – 8,0
Bảng 2.3: Hệ đệm phosphate – citrate
Na 2 HPO 4 0,2M (mL) Acid citric 0,1M (mL) pH
Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Quy trình thu nhận chất chiết nấm men giàu 5’-GMP
Tự phân Xử lý E Protamex
Ly tâm Thu nhận chất chiết
Ly tâm Thu nhận chất chiết
Xử lý E phosphodiesterase Xử lý E phosphodiesterase
Xử lý nhiệt Xử lý nhiệt
Sản phẩm chất chiết nấm men giàu 5’-GMP
- Rửa với nước vô khuẩn tỷ lệ nấm men : nước vô khuẩn là 1:3 (w/w) Để lắng 1h, gạn nước
- Rửa với nước muối vô khuẩn 0,9% theo tỷ lệ 1:3 (w/w) Để lắng 1h, gạn nước
- Ly tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút để thu sinh khối nấm men ướt
- Rửa với nước nóng pH = 7,0 theo tỉ lệ 1:3 (w/w), ở 60 – 65 0 C trong vòng 0,5h
- Nấm men ướt sẽ được bảo quản ở lạnh 4 0 C trong vòng 2 – 3 ngày
Phá vỡ thành tế bào
Phá vỡ thành tế bào bằng phương pháp tự phân
- Huyền phù nấm men được điều chỉnh về 15% (w/w)
- Tiến hành tự phân nấm men trong dung dịch đệm phosphate – citrate Tiến hành khảo sát các giá trị pH ban đầu, thời gian tự phân
Phá vỡ tế bào bằng phương pháp sử dụng enzyme
- Huyền phù nấm men được điều chỉnh về 15% (w/w) bằng dung dịch đệm phosphate-citrate
Bổ sung enzyme Protamex và thực hiện quá trình thủy phân ở 50°C với pH 7,0, khuấy đảo với tốc độ 200 rpm trong 5 giờ Sau đó, enzyme được vô hoạt ở 95°C trong 10 phút Tiếp theo, làm lạnh về 50°C và bổ sung enzyme Flavourzyme, sau đó tiếp tục thủy phân ở cùng điều kiện 50°C, pH 7,0 và khuấy đảo 200 rpm trong 5 giờ.
- Vô hoạt enzyme ở 95 0 C trong 10 phút
- Ly tâm 10.000 x g, ở nhiệt độ 4 0 C trong khoảng 10 phút để thu dịch nấm men
Xử lý enzyme phosphodiesterase I (5’ – phosphodiesterase)
- Điều chỉnh pH của dịch sau khi thủy phân bởi các enzyme protease về pH tối ưu của Phosphodiesterase I với pH = 8,8
- Nhiệt độ tiến hành thủy phân là 37 0 C
- Sau khi thủy phân xong, hỗn hợp sẽ được gia nhiệt ở 95 0 C trong vòng 5 phút để vô hoạt enzyme
- Hỗn hợp thu được sẽ được ly tâm với chế độ 10,000 x g, ở nhiệt độ là 4 0 C trong khoảng 10 phút
Khảo sát quá trình phá vỡ tế bào nấm men để thu nhận chất chiết
Khảo sát quá trình phá vỡ tế bào nấm men bằng phương pháp tự phân
Khảo sát quá trình phá vỡ tế bào nấm men bằng phương pháp thủy phân kết hợp bởi E Protamex (xử lý trước) và
Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố pH trong quá trình tự phân
Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố thời gian trong quá trình tự phân
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ giữa 2 loại enzyme trong hỗn hợp enzyme xử lý
Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ hỗn hợp enzyme xử lý so với cơ chất
Tối ưu hóa các điều kiện phá vỡ tế bào bằng phương pháp tự phân
Tối ưu hóa các điều kiện phá vỡ tế bào bằng phương pháp thủy phân bởi sự kết hợp của E Protamex và E
Khảo sát hàm lượng enzyme phosphodiesterase thực hiện quá trình thủy phân RNA để thu nhận 5’-
So sánh hiệu suất trích ly protein
Sản xuất thử chất chiết nấm men giàu 5’-GMP Xác định hiệu suất trích ly protein và hàm lượng 5’-GMP trong sản phẩm thu được
2.2.2.1 Nghiên cứu quá trình phá vỡ tế bào bằng phương pháp tự phân
Tự phân nấm men trong dung dịch đệm phosphate – citrate, nồng độ huyền phù là 15% (w/w) Ảnh hưởng của pH đến quá trình tự phân
- Thông số thay đổi: pH 4,0 – 4,5 – 5,0 – 5,5 – 6,0 – 6,5
Thời gian tiến hành tự phân: 30h
Nồng độ huyền phù nấm men: 15% (w/w)
- Hàm mục tiêu: hiệu suất quá trình thủy phân, hàm lượng chất chiết thu được Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình tự phân
- Thông số thay đổi: thời gian tự phân 15h – 20h – 25h – 30h – 35h – 40h
Nồng độ huyền phù nấm men: 15%
pH: chọn pH tối ưu của thí nghiệm trên
- Hàm mục tiêu: hiệu suất quá trình thủy phân, lượng chất chiết thu được
Lưu ý: mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần để kiểm tra ý nghĩa của sự khác biệt của kết quả theo phương pháp ANOVA
Chọn điều kiện tối ưu của quá trình phá vỡ tế bào nấm men bằng tự phân
Tối ưu hóa quá trình bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm
Phương pháp quy hoạch thực nghiệm sử dụng ma trận trực giao cấp 2 có tâm để nghiên cứu ảnh hưởng của hai yếu tố chính là pH và thời gian tự phân đến hiệu suất trích ly protein.
Tiến hành 11 thí nghiệm, gồm 3 thí nghiệm ở tâm và 8 thí nghiệm ở các giá trị biên
2.2.2.2 Nghiên cứu quá trình phá vỡ tế bào nấm men bằng phương pháp thủy phân bởi enzyme
Enzyme được sử dụng trong nghiên cứu này là hai hoại enzyme Protamex ® và Flavourzyme ® của hãng Novozyme (Đan Mạch) Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme sử dụng
- Thí nghiệm được thực hiện với việc sử dụng hai loại enzyme Protamex ® và enzyme Flavourzyme ® với tỷ lệ thích hợp
- Thông số thay đổi: tỷ lệ % enzyme Protamex ® trong hỗn hợp enzyme Giá trị thay đổi: 0% - 20% - 40% - 60% - 80% - 100%
Nồng độ huyền phù nấm men: 15% (w/w)
Thời gian xử lý enzyme: 10h
Hàm lượng hỗn hợp enzyme sử dụng: 3% (so với huyền phù nấm men)
- Hàm mục tiêu: hiệu suất trích ly protein Ảnh hưởng của hàm lượng enzyme sử dụng
- Thông số thay đổi: hàm lượng của hỗn hợp enzyme sử dụng (% - so với huyền phù nấm men) Giá trị thay đổi: 1% - 2% - 3% - 4% - 5%
Nồng độ huyền phù nấm men: 15% (w/w)
Thời gian xử lý enzyme: 10h
Tỷ lệ enzyme Protamex ® trong hỗn hợp enzyme: tối ưu từ thí nghiệm trên
- Hàm mục tiêu: hiệu suất trích ly protein
Chọn điều kiện tối ưu của quá trình phá vỡ tế bào bằng phương pháp enzyme
Tối ưu hóa quá trình bằng phương pháp quy hoạch thực nghiệm
Phương pháp quy hoạch thực nghiệm sử dụng ma trận trực giao cấp 2 để nghiên cứu ảnh hưởng của hai yếu tố chính: tỷ lệ và hàm lượng enzyme Mục tiêu chính của nghiên cứu là tối ưu hóa hiệu suất trích ly protein.
Tiến hành 11 thí nghiệm, gồm 3 thí nghiệm ở tâm và 8 thí nghiệm ở các giá trị biên
2.2.2.3 Khảo sát hàm lượng enzyme phosphodiesterase thực hiện quá trình thủy phân RNA để thu nhận 5’-GMP
- Chúng tôi tiến hành quá trình thủy phân RNA trong chất chiết nấm men để thu nhận 5’-GMP bởi enzyme Phosphodiesterase I của Sigma Aldrich Co., Ltd
- Thông số thay đổi: hàm lượng enzyme phosphodiesterase thực hiện quá trình thủy phân RNA để thu nhận 5’-GMP Các giá trị thay đổi là: 0,1%; 0,2%; 0,3% và 0,4%
Điều chỉnh pH = 8,8 bằng đệm phosphate – citrate
Tiến hành thủy phân ở nhiệt độ 37 0 C trong thời gian 15 phút
Sau thủy phân, tiến hành quá trình vô hoạt enzyme bằng cách đun nóng dịch thủy phân ở nhiệt độ 95 0 C trong thời gian 5 phút
Tiến hành định lượng 5 – GMP trong dung dịch thu được bằng phương pháp HPLC
- Hàm mục tiêu: hàm lượng 5’-GMP trong sản phẩm thu được
2.2.2.4 Quá trình sản xuất thử chất chiết nấm men giàu 5’-GMP bằng phương pháp thủy phân RNA bởi enzyme 5’ – phosphodiesterase
Quá trình sản xuất chất chiết nấm men được thực hiện qua hai phương pháp chính: tự phân và thủy phân bằng enzyme, với các điều kiện tối ưu đã được xác định trong nghiên cứu.
Tiến hành xác định các chỉ tiêu để đánh giá chất lượng sản phẩm và khả năng ứng dụng của từng quy trình:
Hàm lượng chất rắn hòa tan
Hiệu suất trích ly protein
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Phương pháp đo hàm ẩm
Trong nghiên cứu này, việc xác định độ ẩm của nguyên liệu được thực hiện trên máy đo độ ẩm tự động Scaltec
Máy đo độ ẩm hoạt động dựa trên ba bộ phận chính: nguồn nhiệt để sấy và tách ẩm, cân phân tích để xác định khối lượng hiện tại, và bộ phận xử lý số liệu cùng điều khiển Quá trình sấy sẽ được ngừng lại khi sự thay đổi về khối lượng không còn đáng kể.
2.3.2 Phương pháp xác định hiệu suất trích ly protein
Hiệu suất trích ly được xác định bằng tỷ lệ giữa hàm lượng protein hòa tan trong dịch chiết và tổng hàm lượng protein thu được, theo nghiên cứu của Basappa và cộng sự (1986).
Sau khi thực hiện quá trình phá vỡ tế bào, hỗn hợp sẽ được ly tâm ở tốc độ 10.000 x g tại 4 độ C trong 10 phút Tiếp theo, hàm lượng protein hòa tan trong dung dịch thu được sẽ được xác định để tính toán hiệu suất trích ly của quá trình.
2.3.3 Xác định hàm lượng protein hòa tan bằng phương pháp Lowry
Hầu hết các loại protein đều chứa hai amino acid quan trọng là tyrosin và tryptophan Tỷ lệ của các amino acid này trong từng phân tử protein phụ thuộc vào loại protein cụ thể, dẫn đến sự khác biệt về tỷ lệ giữa các protein cùng loại.
Khi protein phản ứng với thuốc thử Folin, sẽ hình thành một phức chất có màu sắc Cường độ màu của mẫu thí nghiệm tỷ lệ thuận với hàm lượng tyrosin, tryptophan và protein trong mẫu Do đó, phương pháp so màu có thể được sử dụng để xác định hàm lượng protein tan.
2.3.4 Xác định hàm lượng protein tổng số bằng phương pháp Kjeldahl
Nguyên tắc: vô cơ hóa mẫu thử bằng H 2 SO 4 đậm đặc và có chất xúc tác
Khi K2SO4 và CuSO4 được nung ở nhiệt độ cao, các hợp chất chứa nito sẽ chuyển hóa thành NH3 NH3 sau đó kết hợp với H2SO4 để tạo thành muối (NH4)2SO4 Muối này có thể được sử dụng với kiềm mạnh để tách NH3 ra dưới dạng tự do Cuối cùng, lượng NH3 được định lượng bằng phương pháp axit.
2.3.5 Xác định hàm lượng của 5’-GMP [19][23]
Xác định 5’-GMP bằng phương pháp sử dụng HPLC với cột Enconosphere C18 Column sử dụng đầu dò UV với bước sóng là 254 nm
Trong phương pháp HPLC, pha động sử dụng là đệm kali dihydrophosphate với pH 5,6 Tốc độ dòng chảy được thiết lập ở mức 0,6 ml/phút và thể tích mẫu tiêm vào là 5 µl Quá trình chuẩn bị mẫu bao gồm việc siêu âm trong 10 phút, sau đó mẫu được lọc qua màng lọc 0,45 µm.