Thiết lập chủng bacillus subtilis đối chiếu sử dụng trong kiểm nghiệm dược phẩm

TỔNG QUAN

Đại cương về vi khuẩn Bacillus subtilis

Bacillus subtilis, được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa vào năm 1941 bởi Tổ chức y học Nazi của Đức, ban đầu được sử dụng để phòng bệnh lị cho các binh sĩ ở Bắc Phi Việc điều trị bệnh bằng vi khuẩn này chỉ bắt đầu vào những năm 1949 – 1957 khi Henry, Albot và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết Từ đó, “subtilistherapie” ra đời, cung cấp thuốc Subtilin để điều trị các bệnh viêm ruột, viêm đại tràng và tiêu chảy do rối loạn tiêu hóa Hiện nay, Bacillus subtilis đã trở nên phổ biến và được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực chăn nuôi, y học và thực phẩm.

Theo khóa phân loại của Bergey, vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc:

Vi khuẩn Bacillus subtilis được tìm thấy rộng rãi trong không khí, đất và môi trường nước, thuộc nhóm vi sinh vật cần thiết cho hệ tiêu hóa Chúng thường xuất hiện trong các môi trường thiếu dinh dưỡng và phân bố tự nhiên ở nhiều nơi như cỏ khô, bụi, đất và nước Trong đất trồng trọt, mật độ Bacillus subtilis dao động từ 10 đến 100 triệu cfu/g, trong khi ở các khu vực đất nghèo dinh dưỡng như sa mạc, chúng rất hiếm Ngoài ra, bào tử và tế bào sinh dưỡng của Bacillus subtilis cũng có mặt trong nước và bùn ở cửa sông cũng như nước biển.

Bacillus subtilis là trực khuẩn Gram dương, hai đầu tròn, kích thước nhỏ (3 –

5) ì 0.6àm, đứng thành chuỗi ngắn hoặc đơn lẻ, cú khả năng di động, gồm 8 – 12 lụng, cú bào tử hỡnh elip nhỏ hơn tế bào sinh dưỡng, kớch thước 0.8 – 1.8 àm Vị trớ của bào tử trong tế bào sinh dưỡng không theo bất cứ một nguyên tắc chặt chẽ nào, có thể lệch tâm hoặc gần tâm nhưng không chính tâm Bacillus subtilis là loài sinh vật tự dưỡng, hiếu khí hoặc kị khí tùy tiện [2]

Bacillus subtilis là một vi khuẩn nổi bật với khả năng tạo bào tử trong những điều kiện nhất định, mỗi tế bào sinh dưỡng có thể sinh ra một bào tử Vi khuẩn này hình thành bào tử trong chu trình phát triển tự nhiên hoặc khi gặp điều kiện bất lợi như thiếu dinh dưỡng, nhiệt độ không phù hợp, hoặc pH không ổn định Bào tử của B subtilis là một khối nguyên sinh chất đặc, chứa các thành phần hóa học tương tự như tế bào sinh dưỡng nhưng có sự khác biệt về tỷ lệ các thành phần và có thêm một số yếu tố mới Vi khuẩn này phát triển bằng cách nảy mầm từ bào tử, không có khả năng kháng acid nhưng lại có khả năng chịu nhiệt, ẩm, tia tử ngoại và tia phóng xạ.

Bacillus subtilis là vi khuẩn hiếu khí nhưng có khả năng phát triển trong môi trường thiếu oxy, phát triển tối ưu ở nhiệt độ 37 o C, pH = 7.0 – 7.4, tối ưu ở pH 7.2

Vi khuẩn lên men không sinh khí có khả năng tiêu hóa nhiều loại đường như glucose, maltose, manitol, saccharose, xylose và arabinosse Một số dòng vi khuẩn này có thể gây dung huyết trên thạch máu ngựa và thỏ nhờ vào tác động của hemolysine Bacillus subtilis sở hữu một hệ enzyme phong phú và đa dạng, bao gồm protease, amylase, glucoamylase, glucanase, cellulase, dextranase và pectinase.

Bacillus subtilis đã được ứng dụng khá nhiều trong các ngành công nghiệp, đặc biệt là công nghiệp sản xuất enzyme như protease, amylase…

Bacillus subtilis có kháng nguyên H và O, cùng với cấu trúc kháng nguyên dạng D và L của acid glutamic Loài vi khuẩn này sản sinh ra các kháng sinh như subtilin và bacitracin, có khả năng ức chế vi khuẩn Gram dương và Gram âm Đáng chú ý, hầu hết các chủng Bacillus subtilis không gây bệnh cho con người.

Bảng 1 1 Các phản ứng sinh hoá của Bacillus subtilis

Chú thích: (+) dương tính, (-) âm tính

Các phương pháp định danh vi sinh vật

Trước đây, việc phân loại vi sinh vật chủ yếu dựa vào các đặc tính hình thái, sinh lý và sinh hóa như nhuộm, hình dạng tế bào khuẩn lạc, khả năng di động, nhu cầu dinh dưỡng, khả năng sinh acid trong môi trường và sắc tố tạo thành Tuy nhiên, những đặc trưng này có thể gặp hạn chế, vì chúng có thể phù hợp với nhóm vi sinh vật này (Enterobacteriaceae) nhưng lại không có ý nghĩa đối với nhóm khác như vi khuẩn Gram âm.

Hạn chế của các phương pháp phân loại truyền thống đã dẫn đến việc cần xác định lại tên phân loại cho nhiều vi sinh vật Truyền thống, loài được xem là đơn vị cơ bản trong việc định danh vi sinh vật, bao gồm các nhóm cơ thể có sự tương đồng cao về đặc điểm hình thái.

Kit sinh hóa là phương pháp dựa vào các phản ứng sinh hóa của vi sinh vật, nổi bật với tính đơn giản, nhanh chóng và dễ thực hiện Tuy nhiên, phương pháp này có nhược điểm là có thể xảy ra sai số, đặc biệt khi gen quyết định phản ứng nằm trong plasmid bị mất do nhiều nguyên nhân như tuổi tế bào, lượng giống cấy hoặc thay đổi trong quá trình nuôi cấy Hiện nay, hai bộ kit thương mại phổ biến để định danh nhanh vi sinh vật là bộ kit Api và Vitek.

Phân biệt bằng thực khuẩn thể cho thấy các vi khuẩn có độ mẫn cảm khác nhau với thực khuẩn thể Một số thực khuẩn thể xâm nhiễm và làm tan tế bào ngay lập tức, trong khi một số khác không làm tổn thương tế bào vi khuẩn và cùng tồn tại với tế bào chủ Dựa vào sự khác biệt này, người ta sử dụng các thực khuẩn thể khác nhau để phân loại vi khuẩn Tuy nhiên, phương pháp này gặp khó khăn do tính mẫn cảm của vi khuẩn có thể thay đổi theo điều kiện môi trường, và vi khuẩn cũng có mức độ mẫn cảm khác nhau với từng thực khuẩn thể Hơn nữa, thực khuẩn thể có khả năng thay đổi đặc tính, ảnh hưởng đến cơ chế xâm nhiễm vào vi khuẩn chủ.

Phân biệt theo tuýp huyết thanh là một phương pháp lâu đời nhưng hiệu quả, dựa vào nhóm kháng nguyên trên bề mặt tế bào vi sinh vật Phương pháp này có ưu điểm là sử dụng các kháng huyết thanh để phân biệt nhiều chi khác nhau, thường đặc trưng cho từng loài Mặc dù ổn định, phương pháp này cũng gặp phải hạn chế do yêu cầu kỹ thuật trong sản xuất kháng huyết thanh và tiêu chuẩn hóa phản ứng không đồng nhất, cũng như tính ổn định giữa các lần lặp lại.

Bacteriocin là peptid kháng khuẩn được sản sinh bởi vi khuẩn nhằm chống lại các vi khuẩn khác Mỗi loại vi khuẩn có khả năng kháng lại loại bacteriocin mà chính nó tạo ra Do đó, nhiều loại vi khuẩn đã được phân loại dựa trên kiểu bacteriocin mà chúng sản sinh.

1.2.2 Phương pháp sinh học phân tử

Ngày nay, tiến bộ trong sinh học phân tử đã tạo ra cơ hội ứng dụng hiệu quả trong phân loại và nghiên cứu đa dạng vi sinh vật Khác với các phương pháp truyền thống chỉ tập trung vào một số loại vi sinh vật nhất định, sinh học phân tử cho phép nghiên cứu trên mọi đối tượng vi sinh vật.

Bảng 1 2 Một số phương pháp phân loại vi sinh vật

Thành phần tế bào Phương pháp phân tích Phạm vi phân loại

Biến tính ADN: ADN Loài

Các phần ADN được cắt bằng enzyme giới hạn

Loài và dưới loài Đa hình chiều dài các đoạn giới hạn của ARN riboxom

Loài, chi và trên chi Lai ADN: rARN

Trình tự axit amin Chi và trên chi

So sánh bằng phản ứng huyết thanh

Loài và chi Các kiểu điện di Điện di enzyme đa vị trí Các dòng trong loài

Nói chung các phương pháp sinh học phân tử tập trung vào các kỹ thuật chủ yếu sau:

Phân tích acid nucleic là một kỹ thuật quan trọng trong nghiên cứu sinh học, tập trung vào việc xác định kích thước và cấu trúc của acid nucleic, cũng như mối tương quan về trình tự thông qua giải trình tự ADN và lai ADN Các phương pháp phân tích acid nucleic bao gồm kỹ thuật phân tích ADN plasmid và ADN nhiễm sắc thể, giúp cung cấp thông tin chi tiết về cấu trúc di truyền.

Phương pháp phân tích plasmid là một kỹ thuật phổ biến trong các phòng thí nghiệm chẩn đoán vi sinh vật, giúp cung cấp thông tin đáng tin cậy khi kết hợp với enzym cắt hạn chế Tuy nhiên, cần lưu ý rằng plasmid có thể bị mất qua các thế hệ phân chia, dẫn đến sai lệch kết quả Phân tích điện di trong trường xung điện (PFGE) với plasmid lớn giúp khắc phục hạn chế của các phương pháp hiện tại đối với plasmid nhỏ PFGE hiện đang được áp dụng rộng rãi, đặc biệt trên các đối tượng dễ nuôi cấy, mặc dù yêu cầu kỹ thuật và thiết bị cao Việc sử dụng enzym cắt cũng gặp khó khăn trong việc phát hiện mức độ sai khác Do đó, sự kết hợp giữa phân tích plasmid, PFGE và lai ADN sẽ mang lại kết quả tin cậy hơn.

- Phân tích protein: bao gồm các kỹ thuật sau đây:

Để tinh sạch protein, việc chuẩn bị dịch chiết tế bào là rất quan trọng, vì nó giúp phân lập và làm sạch protein, từ đó hiểu rõ hơn về chức năng của chúng Các bước tinh sạch protein thường dựa vào các đặc tính riêng biệt như kích thước, hình dạng, điện tích và đôi khi là chức năng của từng loại protein.

Sắc ký cột là phương pháp chiết suất và tinh chế protein phổ biến nhất, được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu và ứng dụng sinh học Bên cạnh sắc ký cột, còn có các phương pháp khác như sắc ký trao đổi ion và sắc ký lọc gel, góp phần vào quá trình tinh sạch protein hiệu quả.

Sắc ký ái lực là một phương pháp hiệu quả trong quá trình tinh chế protein, nhờ vào việc tận dụng các đặc tính riêng biệt của từng loại protein Một trong những kỹ thuật phổ biến trong lĩnh vực này là sắc ký ái lực miễn dịch, giúp tăng cường hiệu quả tinh sạch protein mong muốn.

 Phân tích protein trên gel polyacrylamid: Các phân tử protein được điện di trên gel polyacrylamid

Phương pháp thẩm tách miễn dịch là một kỹ thuật định tính protein, tương tự như thẩm tách ADN và ARN, nhưng dựa trên nguyên tắc miễn dịch đặc hiệu của protein Kỹ thuật này cho phép xác định sự hiện diện của protein thông qua các phản ứng miễn dịch đặc trưng.

Giải trình tự trực tiếp protein là quá trình xác định thành phần và thứ tự các acid amin trong chuỗi polypeptide, mặc dù protein có cấu trúc phức tạp hơn ADN và ARN Hai phương pháp phổ biến được sử dụng để thực hiện việc này là phương pháp biến tính Dman và phương pháp khối phổ kế tiếp.

Bảng 1.3 So sánh giữa phương pháp truyền thống và phương pháp sinh học phân tử

Phương pháp truyền thống Phương pháp sinh học phân tử

- Hạn chế với các vi sinh vật gần nhau

- Đơn giản, dễ tiến hành

- Thiết bị, máy móc phức tạp, hóa chất đắt tiền

- Giảm rủi ro khi tiến hành trên các vi sinh vật độc hại

Với sự tiến bộ trong kỹ thuật sinh học phân tử, phân loại sinh vật hiện nay chủ yếu dựa vào nghiên cứu axit nucleic như ADN và ARN, giúp phản ánh chính xác mối quan hệ tiến hóa giữa các nhóm sinh vật Tuy nhiên, vai trò của các phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm bên ngoài vẫn rất quan trọng Do đó, việc kết hợp cả hai phương pháp này là cần thiết để đạt được kết quả phân loại chính xác hơn.

Một số phương pháp bảo quản vi sinh vật

Có nhiều phương pháp bảo quản giống khác nhau, tùy theo từng loại vi sinh vật, điều kiện trang thiết bị mà ta có cách bảo quản riêng

1.3.1 Phương pháp cấy truyền vi sinh vật Đây là phương pháp bảo quản đơn giản, các chủng vi sinh vật được cấy trên môi trường thích hợp (dịch thể hay trên thạch) trong ống nghiệm hay bình tam giác và để trong điều kiện thích hợp cho vi sinh vật phát triển Sau đó các chủng vi sinh vật này được chuyển đến nơi bảo quản có nhiệt độ thích hợp Quá trình này được lặp lại trong một thời hạn nhất định, đảm bảo chủng vi sinh vật luôn được chuyển đến môi trường mới trước khi già và chết Thực tế có nhiều chủng vi sinh vật thích hợp với phương pháp bảo quản này như: Staphylococi, Coliform có thể sống được vài năm theo cách này Cho dù phương pháp này là phương pháp khá phổ biến được dùng trong các cơ sở nghiên cứu và sử dụng các chủng vi sinh vật đặc biệt là các chủng đang dùng cho nghiên cứu Tuy nhiên, phương pháp này cũng bộc lộ nhiều nhược điểm sau:

- Dễ bị tạp nhiễm và dễ dẫn đến mất chủng giống gốc

- Mất hay nhầm lẫn nhãn hiệu giữa các chủng trong quá trình bảo quản

- Phải nghiên cứu và theo dõi thời gian cấy truyền thích hợp đối với các chủng bảo quản

- Tốn nhiều công sức để cấy truyền

- Giống gốc có thể mất do sai sót khi dùng môi trường cấy truyền không thích hợp

- Chủng vi sinh vật cấy truyền dễ bị thay đổi các đặc điểm sinh học do đột biến xuất hiện sau mỗi lần cấy truyền

1.3.2 Giữ giống dưới lớp dầu khoáng

Phương pháp bảo quản vi sinh vật do A Lumière và J Chevotier đề xuất lần đầu vào năm 1914 hiện nay có hiệu quả cao, bảo quản 73% nấm mốc, 100% xạ khuẩn, 80% nấm men và 73% vi khuẩn Tuy nhiên, một số vi sinh vật như Aerobacter, Alcaligens, Leuconostoc, Pseudomonas, Streptococcus và Vibrio không phù hợp với phương pháp này Cách thực hiện là phủ một lớp dầu khoáng lên môi trường agar đã có vi sinh vật phát triển, giúp bảo quản giống lên đến 12 tháng, giảm thiểu công sức cấy truyền so với phương pháp thạch nghiêng và hạn chế nguy cơ thoái hoá hoặc nhiễm tạp.

Phương pháp này được sử dụng để bảo quản vi sinh vật có bào tử trong điều kiện phòng mát hoặc tủ lạnh ở nhiệt độ 4°C, giúp giữ nguyên chất lượng trong thời gian trên 1 năm Trước khi sử dụng, cần cấy giống lên môi trường agar và chọn các khuẩn lạc điển hình để đảm bảo tính chính xác trong nghiên cứu.

Cách làm: Silicagen nghiền mịn 1 mm, xử lý và tiến hành như phương pháp giữ giống trên cát

Nhiều vi sinh vật được bảo quản trên gelatin, một phương pháp an toàn và dễ thực hiện được giới thiệu từ năm 1947 và ngày càng được ưa chuộng Phương pháp này có hai cách thực hiện.

Các bước tiến hành Cách A Cách B

Chuẩn bị môi trường gelatin

Môi trường nước thịt + 10% gelatin + 5% inosit

Môi trường nước thịt + 10% gelatin + 0.25 axit ascorbic

Chuẩn bị giống Trộn tế bào đã chuẩn bị trước vào gelatin

Nuôi vi sinh vật trên môi trường gelatin đến 1x10 10 / ml Phân làm các miếng nhỏ gelatin

Cho môi trường gelatin đã có vi sinh vật từng giọt lên đĩa petri vô trùng

Dùng micropipet nhỏ từng giọt lên miếng giấy nến trên các đĩa petri

Sấy khô Sấy trong tủ hút chân không, dùng P 2 O 5 hấp thu nước

Sấy trong tủ hút chân không, dùng P 2 O 5 hấp thu nước Bảo quản Trong ống nghiệm ở +5 o C Trong ống nghiệm ở +5 o C

Lấy gelatin cho vào 1ml môi trường lỏng thích hợp nuôi ở

37 o C, 24 giờ, sau đó cấy vào môi trường agar, chọn khuẩn lạc điển hình

Lấy gelatin cho vào 1ml môi trường lỏng thích hợp nuôi ở

37 o C, 24 giờ, sau đó cấy vào môi trường agar, chọn khuẩn lạc điển hình

1.3.6 Phương pháp đông khô Đông khô là phương pháp được sử dụng để bảo quản vi sinh vật trong nhiều thập kỉ và ngày càng được dùng phổ biến trong các ngân hàng chủng chuẩn trên thế giới như American Type Culture Collection (ATCC), National Collection of Type Cultures (NCTC) Sản phẩm đông khô dễ dàng bảo quản và vận chuyển [8] Đông khô là quá trình mà nước được lấy ra khỏi mẫu khi các mẫu đang ở trạng thái lạnh sâu Ở đây vi sinh vật được huyền phù trong môi trường thích hợp và được làm lạnh trong môi trường chân không Thiết bị đông khô sẽ hút nước và cuối cùng mẫu được làm khô đến mức nhất định Mẫu được hàn kín để cho môi trường chứa mẫu là chân không Đây là phương pháp phổ biến có hiệu quả cao cho bảo quản các đối tượng vi sinh vật khác nhau như nấm sợi, nấm men, vi khuẩn và một số virut Tuy nhiên, phương pháp này ít được ứng dụng đối với tảo, động vật nguyên sinh và tế bào động vật

Quy trình đông khô gồm có 3 giai đoạn:

- Tiền đông lạnh: đông lạnh mẫu hoàn toàn

- Làm khô sơ cấp: khoảng 90% tổng lượng nước trong mẫu được loại bỏ bằng thăng hoa (tất cả những nước tự do và một số nước ở vùng ngoại biên)

Làm khô thứ cấp là quá trình tiếp tục giải phóng nước ngoại biên và bên trong sản phẩm, giúp giảm độ ẩm của sản phẩm xuống dưới 1 – 3 % Giai đoạn này yêu cầu khoảng 1/3 – 1/2 thời gian so với quá trình làm khô sơ cấp.

Tùy thuộc vào cấu hình máy, quá trình tiền đông lạnh và làm khô có thể diễn ra trong cùng một thiết bị hoặc hai máy riêng biệt, bao gồm máy đông lạnh và máy đông khô.

Các phương pháp đông khô: có 3 phương pháp:

Phương pháp manifold là kỹ thuật làm khô hiệu quả, trong đó các bánh làm khô được kết nối với các lỗ riêng biệt trên một manifold trung tâm Mẫu được lưu trữ trong các lọ nhỏ, thường được đông lạnh bằng phương pháp shell và sau đó được đặt vào các bình làm khô để kết nối nhanh chóng với manifold Quá trình này diễn ra dưới chân không nhằm ngăn ngừa hiện tượng tan chảy Phương pháp này thường phù hợp cho các thể tích tương đối nhỏ.

Phương pháp batch cho phép làm đông khô đồng thời một số lượng lớn các vật chứa có kích cỡ tương tự, chẳng hạn như ống huyết thanh Hệ thống khay được sử dụng thay cho manifold, với yếu tố nhiệt trong các khay cung cấp nhiệt cần thiết Hầu hết các hệ thống lô đều có cơ chế hàn kín các ống trước khi chúng tiếp xúc với không khí.

Phương pháp bulk là kỹ thuật được áp dụng cho các mẫu có thể tích lớn, trong đó mẫu được đổ vào khay đặc biệt, đông lạnh và sau đó làm khô bằng máy đông khô Tuy nhiên, các mẫu khô theo phương pháp bulk không thể hàn kín trong thiết bị, dẫn đến việc phơi nhiễm với không khí, điều này có thể ảnh hưởng đến tuổi thọ của sản phẩm Thông thường, vi sinh vật được bảo quản bằng phương pháp đông khô này có thể duy trì từ 10 năm trở lên.

Phương pháp bảo quản vi sinh vật bằng đông khô có nhiều ưu điểm nổi bật so với các phương pháp trước, bao gồm thời gian bảo quản lâu dài, tiết kiệm công sức và giảm thiểu sai sót trong nhãn mác cũng như tạp nhiễm Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất của phương pháp này là chi phí đầu tư cho thiết bị khá cao Độ ổn định của các chủng vi sinh vật được bảo quản theo phương pháp đông khô cũng khác nhau, và trước khi sử dụng, các chủng này cần được kích hoạt trên môi trường thích hợp một vài lần để phục hồi các đặc tính sinh học.

Hình 1 3 Các bước của quá trình đông khô [8]

Vai trò của các chất bảo vệ:

- Đường: đường đôi (lactose, maltose, trehalose, sucrose), đường đơn

Glucose, galactose và raffinose đóng vai trò quan trọng trong việc bảo vệ tế bào vi khuẩn trong quá trình đông đá Cơ chế bảo vệ này hoạt động bằng cách thay thế liên kết hydro trong phân tử nước giữa lớp màng kép, giúp hạ thấp sự chuyển pha màng và duy trì trạng thái protein của tế bào Nhờ đó, các đường này tạo ra tinh thể hỗ trợ cấu trúc khối của sản phẩm khi đông đá và ổn định màng tế bào Đối với những vi khuẩn nhạy cảm với lạnh, số lượng có thể giảm ngay trong giai đoạn đông đá, nhưng các loại đường này giúp tăng điểm nhiệt độ đông lạnh, bảo vệ vi khuẩn tốt hơn.

Cấy vi khuẩn Đông lạnh các vial

Chuyển các vial vào máy đông khô

Chuyển các vial vào máy đông lạnh

Chuẩn bị hỗn dịch vi khuẩn trong môi trường chất bảo vệ Phân phối vào các vial Ủ Thu hoạch

Tc hay Tg, hạn chế sự chết của vi khuẩn Các đường thường sử dụng với nồng độ từ

5 - 15% phụ thuộc các thành phần kết hợp khác (thông thường sử dụng ở nồng độ 7.5% và 12.5%) [8,10,13]

Trehalose và sucrose đã được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực vi sinh vật suốt hơn 20 năm qua nhờ vào khả năng bảo vệ màng và protein Chúng giúp ổn định cấu trúc đại phân tử bằng cách thay thế nước xung quanh các phần phân cực, đồng thời bảo vệ cấu trúc và chức năng của protein thông qua việc hình thành các liên kết hydro, giữ cho cấu trúc bậc 3 của protein không bị ảnh hưởng khi mất nước Trehalose được ưa chuộng hơn nhờ có nhiệt độ chuyển tiếp thủy tinh (Tg) cao, giúp duy trì độ bền của khối nước đá sản phẩm ở nhiệt độ cao hơn Điều này có thể do cấu trúc vô định hình của trehalose, giúp duy trì tính ổn định khi nhiệt độ tăng Hơn nữa, trehalose có khả năng hình thành tinh thể ngậm hai nước, hấp phụ lượng nước nhỏ cần thiết để tạo ra một khối matrix kết tinh bền vững mà không làm giảm Tg.

Protein, bao gồm sữa gầy, huyết thanh, pepton, cao nấm men, albumin huyết tương bò, trypton, trypsin và cao thịt, đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp đạm, acid amin, vitamin và khả năng đệm cho cơ thể.

Các protein có khả năng cải thiện đáng kể đặc tính kết tinh so với đường nhờ tính bền vững cao hơn khi nhiệt độ vượt qua điểm Tg Điều này cho thấy vai trò quan trọng của protein trong quá trình hình thành tinh thể Do đó, skimmed milk và huyết thanh thường được sử dụng trong phương pháp đông khô Việc kết hợp protein với đường có thể tạo ra tác nhân bảo vệ hiệu quả nhất.

Tuy nhiên huyết thanh ngựa không được dùng cho đông khô vi khuẩn thuộc nhóm Enterobacteria do làm thay đổi đặc tính miễn dịch của vi khuẩn [16]

Các nghiên cứu trong và ngoài nước về hướng của đề tài

Bộ sưu tập chủng vi sinh vật là tập hợp các loài vi sinh vật đã được định danh và xác định đặc điểm sinh lý, sinh hóa, được bảo quản trong điều kiện thích hợp Trên thế giới, có nhiều ngân hàng chủng chuẩn uy tín như ATCC, NCTC, NBRC, NCIMB và DSMZ ATCC, được thành lập năm 1925, đã phát triển mạnh mẽ về số lượng và chất lượng, trở thành trung tâm lưu trữ nguyên vật liệu sinh học cho nghiên cứu, bao gồm tế bào, bộ gen và vi sinh vật chuẩn Ngân hàng này lưu trữ hơn 3.400 dòng tế bào của người, động vật, thực vật, cùng với hơn 18.000 chủng vi khuẩn, 2.000 loại virus động vật và 1.000 loại virus thực vật, cũng như hơn 2.000 loại nguyên sinh động vật và 49.000 loại nấm men, nấm mốc, trở thành trung tâm lưu trữ giống lớn nhất thế giới.

Hiện nay, DSMZ là một trong những trung tâm chủng sinh học hàng đầu thế giới với hơn 40.000 loại mẫu, bao gồm trên 20.000 chủng vi khuẩn, 5.000 chủng vi nấm, 700 dòng tế bào người và động vật, 800 dòng tế bào thực vật, 1.000 loại vi rút và hơn 4.800 bộ gen ADN vi khuẩn Trung tâm này cũng cung cấp tài liệu và thông tin chẩn đoán chi tiết về vật liệu sinh học Các nghiên cứu của DSMZ tập trung vào sự đa dạng vi sinh vật, cơ chế tiến hóa, cải thiện tiếp cận và bảo quản đa dạng sinh học, cũng như cơ chế phân tử của các tương tác sinh học Sự đa dạng về chủng loại và quản lý chất lượng đã giúp DSMZ trở thành nhà cung cấp sản phẩm sinh học nổi tiếng trong nghiên cứu khoa học và phòng thí nghiệm, đồng thời là tài liệu tham khảo cho các quốc gia và đối tác công nghiệp.

The National Collection of Type Cultures (NCTC), established in 1920, is one of four centers under the HPA Culture Collections organization It houses over 5,000 bacterial strains and more than 100 mycoplasmas.

Mặc dù đã có nhiều ngân hàng chủng lớn, các nhà khoa học vẫn tiếp tục nghiên cứu và ứng dụng các chủng vi khuẩn trong nhiều lĩnh vực khác nhau Năm 2006, Yu-Kyoung Kim và cộng sự đã phân lập được ba chủng Bacillus subtilis SL9-9, C5-16 và S52-2 có enzyme cellulolytic, giúp chuyển hóa cellulose và hemicellulose Tỉ lệ sống của vi sinh vật rất quan trọng trong bảo quản, và năm 2007, Yikie Miyamoto – Shinohara đã khảo sát tỉ lệ sống của một số chủng vi khuẩn trong quá trình bảo quản bằng phương pháp đông khô, phát hiện rằng tỉ lệ sống của vi khuẩn Gram dương cao hơn Gram âm Khi đông khô với chất bảo vệ như 10% skim milk và 1% sodium glutamate, tỉ lệ sống có thể đạt 100%, nhưng thường chỉ từ 62.8 – 92.4% ngay sau đông khô và giảm theo hàm số log theo năm Nhóm tác giả cũng đề xuất ba phương pháp tăng tỉ lệ sống: giảm độ ẩm trong ống mẫu, bảo quản ở nhiệt độ thấp (