Ảnh hưởng của nitrite, CO2 và nhiệt độ lên một số chỉ tiêu sinh lý và tăng trưởng của cá basa giống (Pangasius bocourti Sauvage, 1880).Ảnh hưởng của nitrite, CO2 và nhiệt độ lên một số chỉ tiêu sinh lý và tăng trưởng của cá basa giống (Pangasius bocourti Sauvage, 1880).Ảnh hưởng của nitrite, CO2 và nhiệt độ lên một số chỉ tiêu sinh lý và tăng trưởng của cá basa giống (Pangasius bocourti Sauvage, 1880).Ảnh hưởng của nitrite, CO2 và nhiệt độ lên một số chỉ tiêu sinh lý và tăng trưởng của cá basa giống (Pangasius bocourti Sauvage, 1880).Ảnh hưởng của nitrite, CO2 và nhiệt độ lên một số chỉ tiêu sinh lý và tăng trưởng của cá basa giống (Pangasius bocourti Sauvage, 1880).
1
Đặt vấn đề 1
Ngành nuôi trồng thủy sản của Việt Nam đã trở thành một trong những lĩnh vực kinh tế chủ lực, với tổng sản lượng thủy sản đạt 7.225 nghìn tấn vào năm 2017, trong đó sản lượng nuôi đạt 3.835 nghìn tấn, tăng 5,2% so với năm trước Cá tra và cá basa, hai loài cá da trơn chủ yếu, được nuôi và xuất khẩu tại Đồng bằng sông Cửu Long, đặc biệt ở các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long và Cần Thơ Cá basa (Pangasius bocourti) nổi bật với thịt trắng và tốc độ sinh trưởng nhanh, mang lại giá trị thương phẩm cao Mặc dù nhiều nghiên cứu trước đây đã tập trung vào kỹ thuật nuôi và nhu cầu dinh dưỡng của cá basa, nhưng vẫn còn thiếu các nghiên cứu sâu về khả năng chịu đựng và thích nghi của loài này dưới tác động của các yếu tố môi trường như nitrite, nhiệt độ và CO2.
Nitrite trong ao nuôi thủy sản là một mối nguy hiểm lớn do tính độc hại của nó đối với động vật (Lewis and Morris, 1986) Các quá trình phân hủy xác động thực vật và chất thải trong ao sản sinh ra amonia, được vi khuẩn như nitrosomonas và nitrosospira chuyển hóa thành nitrite (Francis-Floyd et al., 2015) Khi nitrite xâm nhập vào máu cá, nó oxy hóa hemoglobin thành methemoglobin, gây ra bệnh máu nâu và làm giảm khả năng vận chuyển oxy, dẫn đến tình trạng ngạt thở ở cá (Kroupova et al., 2005) Nitrite có thể được hấp thu qua mang cá và tích lũy trong cơ thể (Jensen, 2003) Ngoài ra, nó còn ảnh hưởng đến sinh lý, hô hấp, sự điều hòa ion, nội tiết và tốc độ tăng trưởng của cá (Kosaka and Tyuma, 1987; Siikavuopio and Saether, 2006; Jensen, 2009; Lefevre et al., 2011).
Hàm lượng CO2 trong khí quyển đang gia tăng do sự phát triển kinh tế và công nghiệp hóa Theo Flato et al (2013), nồng độ CO2 đạt 390,5 ppm vào năm 2011 và dự đoán sẽ tiếp tục tăng đến năm 2100.
Nồng độ CO2 trong không khí hiện đạt từ 421 đến 936 ppm, trong khi nước trên bề mặt trái đất hấp thu khoảng một phần ba tổng lượng CO2 này, dẫn đến sự giảm pH trong môi trường nước Dự báo rằng pH toàn cầu của nước sẽ giảm khoảng 0,3-0,4 đơn vị vào cuối thế kỷ 21 (Hartmann et al., 2013) Sự thay đổi này có ảnh hưởng đáng kể đến sinh vật biển, đặc biệt là cá.
Nồng độ CO2 trong nước tăng cao ảnh hưởng đến quá trình khuếch tán CO2 từ máu ra môi trường, dẫn đến mất cân bằng a-xít và ba-zơ Điều này gây rối loạn các quá trình tế bào như sự điều hòa ion và tăng nhịp hô hấp (Ishimatsu et al., 2005; Brauner et al., 2004; Gilmour, 2001; Cameron and Iwama, 1987).
Sự gia tăng nhanh chóng của khí CO2 đã dẫn đến biến đổi khí hậu toàn cầu, làm tăng nhiệt độ môi trường Động vật thủy sản ở khu vực nhiệt đới dự kiến sẽ chịu tác động nghiêm trọng hơn so với các loài ở khu vực ôn đới (Tewksbury et al., 2008) Nhiệt độ ảnh hưởng đến các quá trình sinh lý, sinh trưởng và tỷ lệ sống của sinh vật, đồng thời cũng tác động đến độc tính của nitrite Khi nhiệt độ tăng, sự hấp thu nitrite của cá cũng gia tăng và ngược lại (Jeberg và Jensen, 1994; Huey et al., 1984).
Trong bối cảnh hiện nay, khi nhiệt độ và nồng độ CO2 đang gia tăng do biến đổi khí hậu và thâm canh trong ương cá basa, việc nghiên cứu ảnh hưởng của nitrite, nhiệt độ và CO2 đến cá basa là vô cùng cần thiết Đặc biệt, sự hiện diện của khí độc như nitrite trong ao nuôi có thể tác động tiêu cực đến sự phát triển của cá Do đó, việc tìm hiểu những yếu tố này sẽ cung cấp thông tin quan trọng cho việc quản lý ương nuôi cá basa hiệu quả hơn.
Mục tiêu nghiên cứu 2
Mục tiêu của nghiên cứu là cung cấp thông tin về đặc điểm sinh lý và khả năng thích ứng của cá basa dưới tác động của biến đổi khí hậu Kết quả nghiên cứu sẽ giúp người nuôi hiểu rõ hơn về ảnh hưởng của các yếu tố môi trường đến cá basa và các loại cá khác, từ đó áp dụng biện pháp hiệu quả để giảm thiểu tác động tiêu cực đến sức khỏe của cá trong quá trình ương nuôi.
Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu là đánh giá tác động của các yếu tố môi trường như nitrite, nhiệt độ và nồng độ CO2 tăng cao trong nước đến sinh lý và sự phát triển của cá basa trong điều kiện thí nghiệm.
Nội dung nghiên cứu 2
Nghiên cứu này tập trung vào bốn nội dung chính: đầu tiên, phân tích ảnh hưởng của nitrite và nhiệt độ đến các chỉ tiêu sinh lý và tăng trưởng của cá basa; thứ hai, khảo sát tác động của nitrite kết hợp với CO2 lên các chỉ số sinh lý và tăng trưởng của loài cá này; thứ ba, nghiên cứu ảnh hưởng của nitrite đến hoạt tính của enzyme metHb reductase và tiêu hao oxy (MO2) của cá basa; cuối cùng, khảo sát các yếu tố môi trường trong ao ương cá basa.
Hình 1.1: Sơ đồ nội dung nghiên cứu của luận án
Ý nghĩa của luận án 3
Nghiên cứu này cung cấp thông tin quan trọng về ảnh hưởng của nitrite, nhiệt độ và CO2 đến sinh lý và tăng trưởng của cá basa, đồng thời là nghiên cứu đầu tiên chứng minh sự điều hòa tăng hoạt tính enzyme metHb reductase trong hồng cầu cá Kết quả nghiên cứu không chỉ giúp người nuôi nhận thức được những tác động tiêu cực của nitrite và CO2 mà còn là cơ sở khoa học để đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố này trong bối cảnh biến đổi khí hậu đối với ngành nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là nghề nuôi cá basa Từ đó, người nuôi cần áp dụng biện pháp hạn chế sự tồn tại của các yếu tố này trong hệ thống nuôi để quản lý sức khỏe cá hiệu quả và phát triển nghề nuôi thủy sản bền vững Ngoài ý nghĩa khoa học, kết quả nghiên cứu còn là tài liệu tham khảo quan trọng cho giảng dạy và các nghiên cứu tiếp theo liên quan đến cá basa và ảnh hưởng của nitrite, nhiệt độ, CO2 đến các loài khác.
Điểm mới của luận án 4
Luận án xác định nồng độ gây độc cấp tính (LC50-96 giờ) của nitrite đối với cá basa ở nhiệt độ 27ºC là 0,88 mM và 33ºC là 0,60 mM Khi cá basa tiếp xúc với nitrite ở nồng độ 0,22 mM và 0,44 mM, số lượng hồng cầu, Hb và Hct giảm sau 24 giờ và 48 giờ, nhưng phục hồi sau 7 đến 14 ngày Tại nồng độ 0,44 mM ở 27ºC, phần trăm metHb tăng lên 34,8%, và nồng độ nitrite huyết tương cao hơn 2,7 lần so với môi trường sau 48 giờ, không phục hồi sau 14 ngày Nitrite làm giảm tăng trưởng, tỷ lệ sống và tăng FCR của cá basa khi tiếp xúc lâu dài, đồng thời ảnh hưởng đến hoạt tính các enzyme tiêu hóa và khả năng hô hấp Ngoài ra, nitrite còn làm giảm khả năng miễn dịch của cá qua việc giảm hoạt tính của lysozyme và Ig sau 60 ngày tiếp xúc Khi cá basa tiếp xúc với cùng nồng độ nitrite ở nhiệt độ 33ºC, hoạt tính enzyme tiêu hóa, lysozyme và Ig cùng các chỉ tiêu tăng trưởng cao hơn so với 27ºC.
Nghiên cứu đầu tiên trên cá basa cho thấy có sự điều hòa làm tăng hoạt tính của enzyme metHb reductase trong hồng cầu Hằng số hoạt động của enzyme này cao hơn ở nhóm cá tiếp xúc với nitrite Đặc biệt, enzyme hoạt động mạnh hơn khi nhiệt độ tăng, với giá trị k đạt 0,017 phút -1 ở 27ºC và 0,024 phút -1 ở 33ºC khi tiếp xúc với nitrite 0,44 mM.
Luận án chỉ ra rằng CO2 ảnh hưởng đến khả năng điều hòa a-xít và ba-zơ cũng như điều hòa ion của cá basa ở các nồng độ 7, 14 và 21 mmHg Sự tiếp xúc lâu dài với CO2 dẫn đến giảm tăng trưởng và tăng FCR sau 60 ngày, trong khi tỷ lệ sống của cá basa chỉ giảm ở nồng độ cao nhất 21 mmHg Quá trình điều hòa a-xít và ba-zơ giúp hạn chế sự hấp thu nitrite qua kênh Cl-/HCO3 - Ngoài ra, nghiên cứu cũng phát hiện rằng cấu trúc mô mang cá bị tổn thương khi tiếp xúc với nitrite đơn.
CO2 đơn hoặc sự kết hợp của cả hai nhân tố này.
5
Sơ lược về cá basa (Pangasius bocourti)
Cá basa (Pangasius bocourti) là loài cá thuộc giống Pangasius, phân bố chủ yếu ở các quốc gia như Myanmar, Indonesia, Thái Lan, Campuchia và Việt Nam Loài cá này sống trong các sông lớn và có dòng chảy mạnh, đồng thời cũng có thể tồn tại ở hồ nước lớn với nhiệt độ thích hợp từ 26-32°C, trong khoảng nhiệt độ sống từ 18-40°C Cá basa là loài ăn tạp, có khả năng tiêu thụ nhiều nguồn thức ăn khác nhau, đặc biệt là ngũ cốc, và đạt tốc độ tăng trưởng tối đa khi được cung cấp tinh bột lên đến 30 g/kg/ngày, vượt trội hơn so với cá tra.
Cá nuôi bè có tốc độ tăng trưởng nhanh, đạt khối lượng trung bình 1 kg/con sau 1 năm nuôi, với lượng thức ăn khoảng 10 g/kg/ngày (Phuong, 1998; Hung et al., 2004; Lê Như Xuân và ctv., 2000).
Trong những năm qua, cá basa và cá tra là hai loài cá da trơn chủ yếu được nuôi ở ĐBSCL, đặc biệt là tại An Giang và Đồng Tháp Cá tra có sản lượng cao, đạt 1.251 nghìn tấn vào năm 2017, chủ yếu nuôi trong ao Ngược lại, cá basa có sức chịu đựng kém hơn và thường được nuôi trong lồng hoặc bè, với sản lượng trước đây đạt 13.000 tấn mỗi năm Sản lượng cá basa thay đổi theo hình thức nuôi, với nuôi đơn đạt 111-167 kg/m³ và nuôi ghép đạt 98,9-103 kg/m³, trong khi nuôi bè trung bình đạt 119 kg/m³ Tuy nhiên, diện tích nuôi cá basa đang thu hẹp do giá cả không ổn định và khó khăn trong thị trường xuất khẩu, hiện sản phẩm chủ yếu tiêu thụ nội địa.
Tình hình biến đổi khí hậu hiện nay
Quá trình công nghiệp hóa hiện nay đã làm gia tăng lượng khí CO2 thải ra môi trường, với tổng lượng khí thải CO2 đạt 53,5 giga tấn vào năm 2017, tăng 0,7 giga tấn so với năm 2016 Sự gia tăng này dẫn đến a-xít hóa đại dương, làm giảm độ pH và ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển và đa dạng của các loài thủy sinh vật Nhiệt độ trung bình bề mặt trái đất đã tăng 0,87°C trong giai đoạn 2006-2015, và dự báo sự nóng lên toàn cầu sẽ tăng từ 0,1°C đến 0,3°C mỗi thập kỷ Nhiệt độ cực đoan trên đất liền có thể ấm hơn khoảng 3°C-4°C so với nhiệt độ trung bình, dẫn đến gia tăng số ngày nóng, đặc biệt ở vùng nhiệt đới Biến đổi khí hậu toàn cầu đang gây ra những tác động nghiêm trọng đến đời sống con người và sinh vật, bao gồm cả động vật thủy sản, với dự báo sản lượng đánh bắt giảm 1,5 triệu tấn khi nhiệt độ tăng 1,5°C và hơn 3 triệu tấn khi tăng 2°C Đồng bằng sông Cửu Long, nơi có sản lượng nuôi trồng thủy sản lớn nhất Việt Nam, dự kiến sẽ chịu ảnh hưởng nặng nề từ biến đổi khí hậu Trong 50 năm qua, nhiệt độ trung bình năm ở Việt Nam đã tăng 0,5°C, với xu hướng lượng mưa giảm ở phía Bắc và tăng ở phía Nam Nhiệt độ trung bình hiện tại ở Việt Nam khoảng 27°C, và có thể tăng đến 33°C vào thế kỷ 21, do đó hai mức nhiệt độ này sẽ được sử dụng để tiến hành thí nghiệm về tác động của nhiệt độ trong nghiên cứu này.
Nguồn gốc và ảnh hưởng của các yếu tố nitrite, CO 2 và nhiệt độ lên
2.3.1 Nitrite a) Nguồn gốc của nitrite trong môi trường nuôi thủy sản
Nitrite là thành phần tự nhiên trong chu trình nitơ và có thể gây độc cho tôm cá trong ao nuôi, do đó, sự hiện diện của nó là một nguy cơ tiềm ẩn cho động vật thủy sản (Lewis and Morris, 1986) Nitrite hình thành từ nitơ dư thừa, sản sinh từ sự phân hủy xác động thực vật, thức ăn thừa và chất thải sinh vật Dư lượng nitơ ở dạng ammonia (TAN, NH3 và NH4) được chuyển hóa thành nitrite nhờ vi khuẩn Nitrosomonas sp., trong khi nitrite được chuyển thành nitrate bởi vi khuẩn Nitrobacter sp (Durborow et al., 1997) Nitrate không độc hại cho cá ở nồng độ thông thường trong ao (Chappell, 2008) Quá trình khử nitơ diễn ra nhờ các vi khuẩn kỵ khí, chuyển nitrate thành nitơ với các sản phẩm trung gian như NO2-, NO.
N2O và amoniac có thể được thủy phân và hấp thu trong ao nuôi thông qua việc sử dụng trực tiếp của thực vật phù du (Chappell, 2008) Bên cạnh đó, nitrite có cơ chế trao đổi và gây độc cho động vật thủy sản nước ngọt, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của chúng.
Nitrite có thể xâm nhập vào hệ thống tuần hoàn của cá qua mang, dẫn đến việc oxy hóa hemoglobin (Hb) trong tế bào hồng cầu và chuyển đổi thành methemoglobin (metHb), một hợp chất không có khả năng vận chuyển oxy Điều này khiến cá có thể bị ngạt thở mặc dù nồng độ oxy trong nước đầy đủ Biểu hiện của cá bị nhiễm độc nitrite thường là thở gấp và mang hoạt động nhanh do máu không lấy được oxy như bình thường Nồng độ nitrite trong nước không ô nhiễm thường rất thấp (dưới 1 µM), nhưng sự chuyển hóa từ nitrate và khử nitrate có thể làm tăng nồng độ nitrite lên đến 1 mM hoặc cao hơn.
According to Avnimelech et al (1986) and Kamstra et al (1996), elevated nitrite levels can significantly impact environments with high nitrogen concentrations and low oxygen levels, as noted by Williams and Eddy (1986).
Ngộ độc nitrite ở động vật có xương sống và động vật thủy sản chủ yếu xảy ra do hấp thu nitrite và nitrate qua thức ăn và nước uống Trong ống tiêu hóa, nitrate có thể được khử thành nitrite, dẫn đến sự hình thành metHb và các hợp chất chuyển hóa như N-nitroso, có khả năng gây đột biến và ung thư khi bị nhiễm độc nitrite Đặc biệt, động vật thủy sản sống trong môi trường nước có nguy cơ cao hơn do nitrite có thể được hấp thu qua biểu mô của mang và tích lũy với nồng độ cao trong các chất dịch cơ thể.
Cơ chế hấp thu nitrite tương tự như quá trình hấp thu các ion qua màng, đã được nghiên cứu và mô tả trên cá nước ngọt bởi Evans et al (1999) (Hình 2.1).
Hình 2.1: Cơ chế trao đổi ion qua mang cá nước ngọt (Nguồn: Evan et al ,.
Quá trình hấp thu nitrite (NO2-) ở động vật thủy sản nước ngọt xảy ra do sự tương đồng giữa NO2- và ion Cl- trong cơ chế trao đổi Cl-/HCO3- Khi NO2- hiện diện trong môi trường nước, một phần sự hấp thu ion Cl- sẽ bị thay thế bằng sự hấp thu nitrite, dẫn đến những ảnh hưởng nhất định đến sức khỏe của động vật thủy sản.
Nitrite khi vào máu sẽ phản ứng với oxy-Hb, dẫn đến việc nguyên tử Fe 2+ trong phân tử Hem bị oxy hóa thành Fe 3+, tạo ra metHb Đồng thời, nitrite cũng bị oxy hóa thành nitrate, trong khi oxy-Hb bị khử thành dạng khác.
Hb không oxy (Hb(Fe 2+ )) phản ứng với nitrite tạo ra metHb và nitrite oxide (NO) NO sau đó kết hợp với Hb(Fe 2+ ) để hình thành nitrosyl-Hb (HbNO) Các phản ứng này phức tạp và tạo ra các sản phẩm trung gian như H2O2, NO2, ferrylhemoglobin và gốc tự do NO2 Quá trình này được tóm tắt qua các phản ứng đã được nghiên cứu trước đó.
4 Hb(Fe2+)O2+ 4 NO2 - + 4 H+ → 4 Hb(Fe3+) + 4 NO3 -+ O2 + 2 H2O (1)
4 Hb(Fe2+) + NO2 - + H + → 4 Hb(Fe3+) + NO + OH-
(2) Hb(Fe 2+ ) + NO → Hb(Fe 2+ )NO (3)
Trong điều kiện bình thường, metHb hình thành với nồng độ thấp ngay cả khi không có nitrite MetHb không thể vận chuyển oxy và NO liên kết chặt chẽ với hem trong hình thức HbNO Do đó, các dạng Hb này làm giảm khả năng vận chuyển oxy ở cá khi tiếp xúc với nitrite.
Khi metHb được hình thành nhiều trong máu, nó gây ra bệnh máu nâu, một bệnh phổ biến ở cá nước ngọt khi tiếp xúc với nitrite, dẫn đến thiệt hại lớn cho các ao nuôi thâm canh (Boyd and Tucker, 1998) Mức độ nhiễm độc nitrite có thể được xác định qua màu sắc của máu cá: cá nhiễm nhẹ có máu nâu đỏ, trong khi cá nhiễm nặng có máu hoàn toàn màu nâu Tỷ lệ phần trăm Hb chuyển sang metHb và nồng độ oxy hòa tan trong nước quyết định khả năng sống sót của cá Ví dụ, cá trong ao có nồng độ oxy hòa tan 7 mg/L có thể sống, nhưng trong ao chỉ có 2 mg/L oxy, cá có khả năng không sống sót (Chappell, 2008) Nghiên cứu về ảnh hưởng của nitrite đối với các chỉ tiêu sinh lý, tăng trưởng và cấu trúc mô mang của động vật thủy sản là rất cần thiết.
Nitrite là một yếu tố quan trọng trong ao nuôi, ảnh hưởng lớn đến sức khỏe động vật thủy sản do tính độc của nó Chất này không chỉ gây ra các vấn đề cấp tính như bệnh máu nâu, mà còn tác động đến quá trình điều hòa ion, hô hấp và bài tiết của cá (Jensen, 1996; Lefevre et al., 2011) Ngoài ra, nitrite còn tích lũy trong cơ, gan và tim cá, gây tổn thương cho các cơ quan nội tạng (Jensen and Hansen, 2011) Để đánh giá độ độc cấp tính của nitrite, giá trị LC 50 được sử dụng, với thời gian thử nghiệm từ 24 đến 96 giờ tương tự như các chất độc khác (Lewis and Morris, 1986) Aggergaard và Jensen (2001) cũng khẳng định thời gian này là phù hợp để đánh giá.
Trong 48 giờ, cá có thể tích lũy nitrite tối đa, với một số loài như cá lóc (Channa striata) và cá pike sông châu Phi (Hepsetus odoe) cho thấy khả năng chịu đựng nitrite cao, với giá trị LC50-96 giờ lần lượt là 4,7 mM và 3,04 mM (Lefevre et al., 2012; Ekwe et al., 2012) Ngược lại, cá trê phi và cá rô phi lại có khả năng chịu đựng nitrite rất thấp, với giá trị LC50-96 giờ tương ứng là 0,15 mM và 0,35 mM (Ekwe et al., 2012).
Nghiên cứu trước đây cho thấy nitrite gây rối loạn chức năng sinh lý của cá, dẫn đến bệnh máu nâu và ảnh hưởng đến quá trình điều hòa ion, hô hấp, nội tiết và bài tiết (Jensen, 1996; Lefevre et al., 2011) Lefevre et al (2011) đã chỉ ra rằng cá tra (P hypophthalmus) có khả năng chịu đựng nitrite với giá trị LC 50 -96 giờ là 1,65 mM Nồng độ nitrite trong huyết tương đạt đỉnh sau 1 ngày tiếp xúc nhưng không vượt quá nồng độ trong môi trường và giảm dần đến cuối thí nghiệm Đồng thời, nồng độ metHb, HbNO và nitrate cũng cao nhất sau 1 ngày và sau đó giảm xuống, trong khi Hb chức năng giảm sau 1 ngày và tăng trở lại vào ngày thứ 7, nhưng vẫn thấp hơn so với nhóm đối chứng.
Nitrite có ảnh hưởng tiêu cực đến quá trình hô hấp của sinh vật Lefevre et al (2011) chỉ ra rằng nồng độ nitrite cao làm giảm tiêu hao oxy tối đa (MO2max) và tốc độ bơi lội tới hạn (Ucrit) của cá Mặc dù cá tra có khả năng duy trì phạm vi hiếu khí và hoạt động bơi lội mà không cần hô hấp trong không khí, nhưng chúng vẫn bị ảnh hưởng khi nồng độ oxy trong máu giảm do nitrite Nghiên cứu của Tilak et al (2007) trên cá chép (Cyprinus carpio) cho thấy sự tiếp xúc với ammonia và nitrite ở nồng độ gây chết làm giảm tiêu thụ oxy sau 2 đến 12 giờ.
22
Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành tại Bộ môn Dinh dưỡng và Chế biến Thủy sản, Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ Thời gian thực hiện từ 06/2014 đến 06/2018.
Hoá chất, vật tư và thiết bị nghiên cứu
Một số các thiết bị và dụng cụ phục vụ cho nghiên cứu được thể hiện ở
Bảng 3.1 Các thiết bị phục vụ cho nghiên cứu
STT Thiết bị Chỉ tiêu đo lường
1 Máy đo oxy cầm tay Metler toledo-
2 Máy đo pH cầm tay Metler Toledo-
SG2 (Mỹ); pH trong nước
3 Máy điều khiển CO2 của hãng Oxy
Guard - Đan Mạch CO2 trong nước
4 Cooler – Teco SeaChill TR10 và heater
Hạ nhiệt và nâng nhiệt độ nước
5 Hệ thống đo tiêu hao oxy bán kín 2- phase respirometer được phát triển bởi Trường Đại học Aarhus (Đan Mạch)
6 Cartride CG3 + và máy đo khí máu i-
Stat của hãng Abbott (Mỹ) Khí máu: pHe, pCO2, HCO3 -
7 Advanced Instruments Osmometer - model 3320 của Mỹ Áp suất thẩm thấu
9 Chloride meter 926 của Mỹ Ion Cl -
10 Máy ly tâm hematocrit (Sigma 201m-
11 Máy so màu quang phổ 18 giếng
(Varian Cary 50) Các chỉ tiêu như metHb, nitrite, nitrate, glucose, Ig, enzyme tiêu hóa
12 Máy so màu micro plate reader 96 giếng
13 Máy li tâm lạnh Mikko 220R Ly tâm mẫu
Trong thí nghiệm, khí CO2 được cung cấp từ bình khí của xí nghiệp Mitagas tại khu Công nghiệp Trà Nóc, quận Bình Thủy, thành phố Cần Thơ Nitrite được bổ sung có nguồn gốc từ muối NaNO2 99,9% của Merck (Đức) Đầu tiên, dung dịch gốc với nồng độ NaNO2 1 M được chuẩn bị, sau đó tính toán thể tích NaNO2 1 M cần thiết để đạt được nồng độ NO2 - mong muốn trong bể.
Trong nghiên cứu, một số hóa chất quan trọng được sử dụng bao gồm Natt-herick, Wright, Giemsa, K2HPO4, KH2PO4, MgCl2, NaCl, NaNO3, VCl3 để phân tích các chỉ tiêu sinh lý máu Ngoài ra, các hóa chất cũng được dùng để phân tích enzyme tiêu hóa, lysozyme, enzyme methemoglobin reductase, cùng với các hóa chất khác phục vụ cho việc phân tích nitrite và TAN trong môi trường nước thí nghiệm.
Bể thí nghiệm là bể composite có thể tích 2 m 3 , 500 L, 200 L và xô nhựa
45 L Thức ăn sử dụng trong thí nghiệm là loại dành cho cá da trơn của công ty Cargill với hàm lượng đạm 30% cỡ viên 2 mm.
Đối tượng nghiên cứu 23
Cá basa thí nghiệm, có trọng lượng từ 10-20 g, được mua từ cơ sở sản xuất giống ở Nha Mân - Châu Thành - Đồng Tháp Sau khi vận chuyển về Khoa Thủy sản, Trường Đại học Cần Thơ, cá được thuần dưỡng trong bể composite 2 m³ trong 2 tuần trước khi tiến hành thí nghiệm Trong thời gian thuần dưỡng, cá được cho ăn 2 lần/ngày bằng thức ăn viên công nghiệp Cargill 30% đạm và ngưng cho ăn 1 ngày trước khi bố trí thí nghiệm Những cá thể được chọn cho thí nghiệm là những con khỏe mạnh, không dị tật, không xây xát, có kích cỡ đồng đều và không có dấu hiệu bệnh lý.
Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.4.1 Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nitrite và nhiệt độ lên một số chỉ tiêu sinh lý và tăng trưởng của cá basa
Nghiên cứu này bao gồm ba thí nghiệm, trong đó thí nghiệm đầu tiên nhằm xác định nồng độ gây độc cấp tính (LC 50 - 96 giờ) của nitrite đối với cá basa dưới ảnh hưởng của nhiệt độ.
Thí nghiệm này nhằm xác định nồng độ nitrite gây độc cấp tính cho cá basa ở các mức nhiệt độ khác nhau, từ đó làm cơ sở để lựa chọn nồng độ nitrite cho các thí nghiệm tiếp theo.
Thí nghiệm xác định giá trị LC50 – 96 giờ được thực hiện theo phương pháp của Reish et al (2005) trên cá basa có trọng lượng từ 10-20 g, trong điều kiện nước tĩnh, không sục khí, không cho cá ăn và không thay nước Quy trình thí nghiệm bao gồm hai bước: đầu tiên là xác định khoảng gây độc, sau đó là xác định giá trị LC50-96 giờ của nitrite ở các mức nhiệt độ khác nhau.
Bước 1: Thí nghiệm xác định khoảng gây độc
Thí nghiệm được thực hiện để xác định nồng độ nitrite cao nhất gây chết không quá 10% cá trong 96 giờ và nồng độ thấp nhất gây chết khoảng 90% cá trong 1-2 giờ Kết quả của thí nghiệm này sẽ là cơ sở để lựa chọn các nồng độ phù hợp cho các thí nghiệm tiếp theo.
LC50-96 giờ Thí nghiệm được tiến hành với 12 nồng độ nitrite gồm 0; 0,43; 0,54; 0,65; 0,76;
0,87; 0,98; 1,09; 1,20; 1,31; 1,42 và 1,53 mM Mật độ cá thí nghiệm là 10 con/bể 45 L Trong thời gian thí nghiệm ghi nhận số cá chết ở các khoảng thời gian là 1, 3, 6, 9, 12, 24, 48, 72 và 96 giờ.
Bước 2: Thí nghiệm xác định giá trị LC 50 -96 giờ của nitrite ở các mức nhiệt độ khác nhau lên cá basa
Thí nghiệm được thực hiện với 10 nồng độ nitrite từ 0,54 đến 1,53 mM và một nghiệm thức đối chứng ở hai mức nhiệt độ 27°C và 33°C Nhiệt độ 27°C là mức trung bình hiện tại ở Việt Nam, trong khi 33°C là mức cao dự đoán sẽ xảy ra trong thế kỷ 21 Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 4 lần lặp lại, mỗi bể chứa 12 con cá trong 100 L nước Bắt đầu thí nghiệm ở nhiệt độ 27°C, cá được ổn định trong 2 ngày trước khi nâng nhiệt độ lên 33°C bằng cách tăng 2°C mỗi ngày Khi đạt đến nhiệt độ mong muốn, nitrite được bổ sung vào bể theo nồng độ thí nghiệm.
Trong thí nghiệm, chúng tôi theo dõi và ghi nhận số cá chết ở các khoảng thời gian 1, 3, 6, 9, 12, 24, 48, 72 và 96 giờ Cá chết được vớt ngay ra khỏi bể để đảm bảo chất lượng nước thí nghiệm Các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ và oxy được đo hai lần mỗi ngày vào lúc 8 giờ sáng và 15 giờ chiều Giá trị LC 50 - 96 giờ được tính toán bằng phương pháp Probit thông qua phần mềm SPSS 16.0 Thí nghiệm thứ hai nghiên cứu ảnh hưởng của nitrite lên một số chỉ tiêu sinh lý của cá basa ở các mức nhiệt độ khác nhau.
Nghiên cứu này được thực hiện với hai yếu tố chính là hàm lượng nitrite và nhiệt độ, nhằm đánh giá tác động của nitrite ở nồng độ an toàn đối với các chỉ tiêu sinh lý của cá basa Các thí nghiệm được tiến hành ở hai mức nhiệt độ: 27°C (nhiệt độ bình thường) và 33°C (nhiệt độ cao) Kết quả nghiên cứu cung cấp thông tin quan trọng về sự biến đổi các chỉ tiêu sinh lý của cá basa dưới ảnh hưởng của nitrite cũng như sự tương tác giữa nitrite và nhiệt độ Những phát hiện này sẽ là cơ sở cho các thí nghiệm nghiên cứu tiếp theo.
Thí nghiệm được thực hiện ngẫu nhiên với 8 nghiệm thức và 3 lần lặp lại, bao gồm 4 nồng độ nitrite: 0 mM (đối chứng), 0,09 mM, 0,22 mM và 0,44 mM, tại hai mức nhiệt độ 27°C và 33°C Các nồng độ nitrite này tương ứng với 10% (nồng độ thấp), 25% (nồng độ trung bình) và 50% (nồng độ cao) của giá trị LC 50 –96 giờ ở 27°C được xác định trong thí nghiệm trước Sơ đồ bố trí thí nghiệm được trình bày trong hình 3.1.
Hình 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nitrite lên một số chỉ tiêu sinh lý của cá basa ở các mức nhiệt độ khác nhau
Cá được nuôi với mật độ 40 con trong bể 500 L (300 L nước) và mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần Sau khi thả cá vào bể ở nhiệt độ bình thường, cá được ổn định trong 2 ngày Đối với nghiệm thức nhiệt độ cao 33°C, nhiệt độ được nâng lên 2°C/ngày bằng heater, trong khi nghiệm thức 27°C sử dụng máy làm lạnh Teco SeaChill TR10 để duy trì nhiệt độ Các bể thí nghiệm được trang bị bơm đảo nước để đảm bảo nhiệt độ phân bố đều Sau khi đạt nhiệt độ thí nghiệm, nitrite được thêm vào bể theo nồng độ yêu cầu Thí nghiệm kéo dài 14 ngày, trong đó bể được sục khí liên tục để cung cấp oxy cho cá Nitrite được kiểm tra 2 lần/ngày và bổ sung nếu cần thiết để duy trì nồng độ yêu cầu Phương pháp phân tích nitrite sử dụng Giess llosvay, Diazonium Cá không được cho ăn trong 96 giờ đầu, sau đó cho ăn mỗi ngày một lần cho đến cuối thí nghiệm Các yếu tố môi trường như pH, nhiệt độ và oxy hòa tan được theo dõi 2 lần/ngày vào lúc 8 giờ sáng và 15 giờ chiều.
Cá được theo dõi và thu mẫu máu (3 con/bể) ở các thời điểm 0; 24; 48;
Nghiên cứu cho thấy nồng độ nitrite trong cá đạt đỉnh sau 24 đến 48 giờ bổ sung, sau đó giảm dần và thấp hơn sau 7 đến 14 ngày (Aggergaard và Jensen, 2001; Lefevre et al., 2011, 2012) Do đó, các thời điểm này được chọn để lấy mẫu Máu cá được thu từ động mạch đuôi bằng kim tiêm 1 mL có tráng heparin, sau khi cá được bắt nhẹ nhàng và gây mê bằng benzocain nồng độ 0,1 g/L Mẫu máu được giữ lạnh trong nước đá và một phần được phân tích ngay lập tức để đo áp suất CO2 (pCO2) và pH máu (pHe) bằng máy iSTAT (Mỹ) với thẻ Cartridge CG3+ Giá trị pHe và pCO2 được điều chỉnh theo nhiệt độ bể thí nghiệm, và nồng độ HCO3- trong huyết tương được tính theo công thức Henderson và Hasselbach (Boutilier et al., 1985).
HCO3 - được tính bằng αCO2 nhân với pCO2 và 10 Một phần mẫu máu được dùng để phân tích các chỉ tiêu sinh lý như hồng cầu, Hb, Hct và metHb Phần mẫu máu còn lại được ly tâm ở tốc độ 6.000 vòng/phút trong 6 phút để thu huyết tương, từ đó phân tích các chỉ tiêu như glucose và [NapHe-pK].
Nghiên cứu này tập trung vào việc xác định ảnh hưởng của nitrite đến sự tăng trưởng và hoạt tính enzyme tiêu hóa của cá basa dưới các mức nhiệt độ khác nhau Các yếu tố như ion kali (K+), ion clo (Cl-), nitrite (NO2-), nitrate (NO3-) và áp suất thẩm thấu (ASTT) sẽ được xem xét để hiểu rõ hơn về tác động của chúng đối với cá basa.
Thí nghiệm này đánh giá tác động của nitrite đến chỉ số tăng trưởng, tỷ lệ sống, hoạt tính enzyme tiêu hóa và các chỉ tiêu miễn dịch như Immunoglobulin (Ig) và lysozyme của cá basa ở các nhiệt độ khác nhau.
Thí nghiệm được thiết kế ngẫu nhiên với hai yếu tố là nitrite và nhiệt độ, tương tự như thí nghiệm trước đó Mỗi nghiệm thức được thực hiện ba lần, với mật độ cá là 40 con trong bể 500 L (300 L nước) Phương pháp ổn định nhiệt độ và bổ sung nitrite vào bể cũng được thực hiện giống như thí nghiệm trước Trong suốt thời gian thí nghiệm kéo dài 60 ngày, bể được sục khí liên tục để đảm bảo cung cấp đủ oxy cho cá.
Cá được cho ăn 2 lần mỗi ngày bằng thức ăn viên công nghiệp Cargill 30% đạm, với lượng thức ăn tương ứng 3% khối lượng thân Thức ăn được cân trước khi cho cá ăn, và sau 30 phút, thức ăn thừa (nếu có) sẽ được thu gom và đếm để xác định lượng thức ăn cá tiêu thụ hàng ngày, từ đó tính toán hệ số FCR Ngoài ra, cá chết được theo dõi hàng ngày, và số lượng cá còn lại sẽ được đếm vào cuối thí nghiệm để xác định tỷ lệ sống sót của cá.