Tách chiết, tinh sạch và xác định glucan từ tế bào nấm men sacharomyces cerevisiae

TỔNG QUAN

SƠ LƯỢC ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA TẾ BÀO NẤM MEN

Giới : Nấm Ngành : Nấm túi Phân ngành : Saccharomycotina

Nấm men là cơ thể đơn bào phổ biến, thường lớn gấp 10 lần vi khuẩn Loại nấm men thường được sử dụng trong sản xuất rượu và bia là Saccharomyces cerevisiae, với kích thước dao động từ 2,5-10 µm x 4,5-21 µm, dễ dàng quan sát dưới kính hiển vi quang học.

Hình dạng của nấm men rất đa dạng và không ổn định, có thể là hình cầu, hình trứng, hình ovan hoặc hình elip, tùy thuộc vào loại nấm men, điều kiện nuôi cấy và tuổi thọ của chúng Chẳng hạn, Saccharomyces cerevisiae có hình bầu dục trong môi trường giàu chất dinh dưỡng, nhưng lại chuyển sang hình tròn khi ở trong điều kiện yếm khí.

Có loài nấm men có khuẩn ti hoặc khuẩn ti giả chưa thành sợi rõ rệt, mà chỉ là

Hình 2.1 : Tế bào nấm men dưới kính hiển vi

Tế bào nấm men được cấu tạo chủ yếu từ các thành phần cơ bản như thành tế bào, màng nguyên sinh chất, nhân và các cơ quan con khác.

Hình 2.2 : Cấu tạo nấm men Đặc điểm thành tế bào nấm men

Thành tế bào nấm men dày từ 15-25% sinh khối khô, chủ yếu cấu tạo từ polysaccharide, chiếm 80-90% thành tế bào Các thành phần chính bao gồm glucan, mannan và chitin, trong đó glucan cung cấp năng lượng cho nấm men Thành tế bào chứa cả -1,6 và -1,3-glucan, phân biệt bởi tính hòa tan trong acid hoặc kiềm Mannan có cấu trúc với liên kết -1,6 và chuỗi -1,2, -1,3, trong khi chitin, một polymer của N-acetylglucosamine, chiếm 2-4% trong S cerevisiae và là thành phần chính ở sẹo mầm Một số nấm men sợi như C albican chứa nhiều chitin, trong khi một số khác lại không có Ngoài ra, thành tế bào nấm men còn chứa protein, lipid và phosphate vô cơ.

Thành phần hóa học của thành tế bào sẽ phụ thuộc vào chủng nấm men, vào tuổi của tế bào và điều kiện phát triển

Bảng 2.1 : Thành phần thành tế bào nấm men

Trọng lượng phân tử trung bình (kDa)

Tỉ lệ phân tử tương đối

Thành tế bào nấm men là một cấu trúc phân lớp, với lớp ngoài cùng chứa nhiều mannoprotein liên kết chéo qua tương tác kỵ nước và cầu nối disulfua Các mannoprotein này kết hợp với glucan bên trong thông qua liên kết cộng hóa trị, đóng vai trò quan trọng trong việc xác định tính xốp của thành tế bào Bên cạnh đó, một số -glucan ở lớp bên trong cũng liên kết chéo với chitin, một thành phần chính trong quá trình nảy chồi của nấm men Chitin tổng hợp tạo ra isozyme, góp phần quan trọng vào việc hình thành và tạo hình vách ngăn.

Thành tế bào nấm men không chỉ là bộ xương ngoài bảo vệ màng sinh chất, mà còn đóng vai trò như một cơ thể sống với chức năng thay đổi trong suốt quá trình trao đổi chất và phát triển của nấm men S cerevisiae.

Bảng 2.2 : Chức năng sinh lý của thành tế bào nấm men

Bảo vệ cơ thể Ổn định thẩm thấu

Những chướng ngại vật thấm được

Nhận biết tế bào – tế bào

Dính chặt tế bào với tế bào

- Cũng như bảo vệ thể nguyên sinh và duy trì hình dạng tế bào nấm men

- Sự di chuyển của thành tế bào dẫn đến sự tiêu thể nguyên sinh với sự có mặt của chất ổn định thẩm thấu

- Chất tan lớn hơn 600 Da không thấm được qua vách Vách cũng đóng vai trò kiểm soát sự đi vào nấm men của nước

- Các enzyme làm mềm vách (ví dụ : glucanases) và hydrolase (ví dụ : invertase) thì được giữ cố định trên chất nền của vách tế bào

- Nhiều cation biết đến được cô lập có kết quả bởi vách tế bào, bao gồm nhiều kim loại nặng.

- Nhận biết vị trí của pheromone và các độc tố giết nằm trên vách tế bào

- Sự dính kết giới tính nấm men – nấm men, sự kết bông, sự kết tụ là hiện tượng liên kết tế bào.

Sự kết dính tế bào nấm men – người thì tương hợp ở khả năng gây bệnh của một số loài (ví dụ :

Thành tế bào nấm men là một cấu trúc đa chức năng, có nhiệm vụ bảo vệ tế bào, duy trì hình dạng, tương tác với các tế bào khác, tiếp nhận thông tin, hàn gắn tổn thương và chứa các enzyme đặc biệt.

 Lớp không gian chu chất

Lớp không gian chu chất mỏng từ 35-45 A0 nằm giữa thành tế bào và màng tế bào chất, chứa mannoprotein Tại đây, các cơ chất không thấm qua màng tế bào chất sẽ được thủy phân thành các phân tử nhỏ hơn và sau đó được vận chuyển vào bên trong tế bào chất.

Màng tế bào chất có độ dày khoảng 7nm và chứa một số chỗ lõm, được cấu tạo từ lớp lipid kép kết hợp với protein Thành phần lipid chủ yếu bao gồm phosphatidylcholine, phosphatidylethanolamine và một lượng nhỏ các loại lipid khác như phosphatidylinositol, phosphatidylserine, phosphatidylglycerol, cùng với sterol như ergosterol và zymosterol Màng protein của nấm men có vai trò quan trọng trong việc bảo vệ nguyên sinh chất, tổng hợp enzyme, điều hòa vận chuyển chọn lọc các chất dinh dưỡng từ bên ngoài vào trong và bài tiết các thành phần có hại ra ngoài.

Tế bào chất của nấm men là một dung dịch keo có tính acid (pH = 5,5), chứa các ion và hợp chất hữu cơ với trọng lượng phân tử thấp và trung bình, cũng như các hợp chất cao phân tử hòa tan như enzyme, factor và glycogen Các enzyme trong tế bào chất chủ yếu tham gia vào chu trình đường phân, tổng hợp acid béo và protein.

Nhân tế bào là cơ quan hình cầu có nhân thùy, đường kính khoảng 1,5 µm, được bao bọc bởi màng nhân Màng nhân được cấu tạo từ hai lớp với các lỗ nhỏ có đường kính từ 50-100 nm Nhân đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân chia tế bào, phân bào và tạo chồi Khác với các eukaryote khác, màng nhân của nấm men không bị hòa tan trong suốt quá trình phân bào.

Trong nhân tế bào, thông tin di truyền được lưu trữ và xử lý trong quá trình phân bào và sửa chữa sai sót khi sao chép DNA, cùng với histone và non-histone, tạo thành chuỗi nhiễm sắc thể, đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì và truyền đạt thông tin di truyền.

Mỗi tế bào nấm men có một hoặc nhiều không bào, được bao bọc bởi lớp màng lipoprotein và chứa đầy dịch Hình dạng của màng không bào thay đổi theo độ tuổi và trạng thái sinh lý của tế bào Không bào chứa các enzyme protease, đóng vai trò quan trọng trong quá trình tự phân Chức năng của không bào bao gồm việc chứa các enzyme tiêu hóa như endopeptidase, aminopeptidase, carboxypeptidase, tích trữ acid amin, polyphosphate và các ion kim loại cần thiết, cũng như điều chỉnh sự thẩm thấu.

Volutin thường xuất hiện trong môi trường nuôi cấy đặc biệt, không phải là thành phần cấu trúc của tế bào Sự hiện diện của chúng phụ thuộc vào các yếu tố như tỷ lệ C:N, sự có mặt của lưu huỳnh và vitamin, cũng như pH của môi trường Trong điều kiện lên men, tế bào có xu hướng chứa ít hạt volutin hơn so với khi phát triển trong điều kiện hiếu khí Volutin đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào.

- Là chất dự trữ chứa các chất dự trữ dinh dưỡng của tế bào

- Tham gia vào việc điểu hòa quá trình sinh trưởng, phát triển của tế bào

Polyphosphate của volutin đóng vai trò quan trọng trong việc cung cấp năng lượng cho tế bào, hỗ trợ quá trình sinh hóa thông qua hệ thống ATP Ngoài ra, polyphosphate này còn tham gia vào các quá trình lên men và hô hấp của tế bào.

KHÁI QUÁT VỀ BETA-GLUCAN

Polysaccharide là một nhóm polymer sinh học quan trọng, bao gồm chuỗi dài các đơn vị đường lặp lại Một loại đặc biệt của polyglucose, được gọi là glucan hay β-glucan, thường xuất hiện trong vi khuẩn, nấm, nấm ăn, tảo và thực vật.

Loại - glucan Cấu trúc Mô tả

Vi khuẩn -1,3–glucan dạng thẳng (Curdlan)

Vi nấm -1,3–glucan phân nhánh -1,6 ngắn (Schizophyllan)

Nấm men -1,3–glucan phân nhánh -1,6 dài

(Beta glucan WGP, Betafectin TM )

Ngũ cốc -1,3/-1,4–glucan (yến mạch, lúa mì, lúa mạch đen)

Hình 2.3 : Cấu trúc mạch beta-glucan

Các hợp chất này được chú ý vì có nhiều dược tính và hoạt tính sinh học, bao gồm khả năng kích thích miễn dịch, kháng viêm, kháng vi sinh vật, kháng lây lan, kháng virus, kháng u bướu, giảm cholesterol, chống phóng xạ và hỗ trợ làm lành vết thương Tác dụng của -1,3-D-glucan vẫn chưa được nghiên cứu đầy đủ và có thể phụ thuộc vào cấu trúc phân tử đặc biệt, bao gồm trọng lượng phân tử và tính chất phân nhánh.

Nguồn cung cấp -1,3-D-glucan quan trọng nhất đến từ thành tế bào nấm men, một loại vi nấm đơn bào được sử dụng lâu đời trong làm bánh và sản xuất ethanol Các nhà máy chiết xuất nấm men thường áp dụng phương pháp tự phân kết hợp với enzyme hoặc máy móc để tách biệt phần nội bào và ngoại bào Phần nội bào được cô lập và sử dụng làm chất phụ gia thực phẩm nhờ chứa nhiều protein và nucleotide, trong khi phần ngoại bào, tức thành tế bào, hiện đang được sử dụng phi thương mại làm chất bổ sung cho thức ăn động vật, vì đây là nguồn nguyên liệu thô rẻ và giàu glucan, rất lý tưởng cho sản xuất.

Năm 1073, Manners phát hiện hai loại glucan trong vách tế bào nấm men, bao gồm beta-1,3-D glucan (chiếm 3%) với liên kết beta-1,6-glucosidic (85%) và beta-1,6-D glucan, hay còn gọi là pustulan, với các nhánh beta-1,3-glucosidic (15%) Để phân biệt beta-glucan với các polysaccharide khác như tinh bột, glycogen và dextrin, người ta dựa vào các dạng liên kết của phân tử glucose Các liên kết (1,4-) có mặt trong chuỗi chính của beta-glucan, trong khi các chuỗi phụ được liên kết bằng (1,6-) Khác với cấu trúc thẳng của polysaccharide thông thường, beta-glucan có cấu trúc xoắn đặc trưng nhờ vào các liên kết duy nhất và liên kết hydrogen nội phân tử Hình dáng cấu trúc này có thể được hệ thống miễn dịch ở động vật nhận biết và kích thích phản ứng miễn dịch.

Hình 2.4 : Vị trí glucan trong vách tế bào

KHÁI QUÁT CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT, TINH SẠCH VÀ XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN TẾ BÀO NẤM MEN

2.3.1 Ph ươ ng pháp tách chi ế t

Có hai phương pháp để thủy phân thành tế bào nấm men : tự phân và xử lý bằng enzyme

Quá trình tự phân là phương pháp phá vỡ tế bào nấm men, đóng vai trò quan trọng trong sản xuất dịch chiết nấm men trong ngành thực phẩm Nhiều tác nhân lý, hóa và sinh học có ảnh hưởng đáng kể đến sự phá vỡ này, góp phần nâng cao hiệu quả trong quy trình sản xuất.

Tế bào nấm men có thể bị tổn thương nghiêm trọng khi tiếp xúc với nhiệt độ cực đoan, phóng xạ ion hóa, áp suất thủy tĩnh và áp suất thẩm thấu cao Khi các phản ứng sinh lý, bao gồm cả phản ứng có enzyme và không có enzyme, không đủ khả năng bảo vệ tế bào, chúng sẽ dẫn đến cái chết của tế bào nấm men do những hư hại không thể khắc phục, gây ra ức chế vật lý.

Sự phá vỡ tế bào xảy ra do nhiều phản ứng hóa học và sinh hóa cả bên ngoài lẫn bên trong Các tác nhân bên ngoài gây chết tế bào bao gồm hợp chất hữu cơ độc hại, pH bất thường, thiếu hụt dinh dưỡng, các gốc oxy tự do và kim loại nặng Bên cạnh đó, các tác nhân hóa học nội bào như ethanol cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình này.

Sự phá vỡ tế bào nấm men do nhiều tác nhân bên trong và bên ngoài gây ra Các yếu tố nội tại như sinh lý, di truyền, hình thái và sinh thái trong tế bào có thể dẫn đến sự tự gây chết của chúng Phản ứng sinh hóa cho thấy sự tự phân nấm men là quá trình tự hủy khi tế bào thiếu dinh dưỡng hoặc khi sự đồng hóa ngừng lại trong khi dị hóa vẫn tiếp tục Quá trình này diễn ra khi protease thủy phân trong không bào phân hủy chất nguyên sinh và các enzyme như glucanase, chitinase, mannose thủy phân vách tế bào Việc áp dụng nhiệt độ cao vừa phải, muối hoặc dung môi lipid trong sản xuất có thể tăng cường hoạt tính của enzyme tự phân Ngoài ra, việc bổ sung enzyme thủy phân như papain cũng hỗ trợ hiệu quả trong việc phá vỡ vách tế bào nấm men.

Enzyme, hay còn gọi là men, là chất xúc tác sinh học chủ yếu là protein, có mặt trong tế bào của mọi sinh vật Chúng không chỉ xúc tác cho các phản ứng hóa học trong cơ thể (in vivo) mà còn hoạt động trong các phản ứng ngoài tế bào (in vitro) Do có nguồn gốc từ vi sinh vật, enzyme được xem là chất xúc tác sinh học, phân biệt với các chất xúc tác hóa học khác.

Tính ưu việt của enzyme

 Enzyme hoạt động xúc tác trong điều kiện ”nhẹ nhàng ”, nhiệt độ từ 30-

35 0 C với áp suất thông thường, pH thường là acid yếu, kiềm yếu hay trung tính

 Enzyme có tính đặc hiệu cao trên những cơ chất nhất định và xúc tác theo kiểu phản ứng nhất định

Vận tốc phản ứng được enzyme xúc tác có thể dễ dàng điều chỉnh thông qua các yếu tố như nhiệt độ, pH, chất kìm hãm và chất hoạt hóa.

 Enzyme có cường lực xúc tác rất cao nên chỉ cần một lượng nhỏ có tnể chuyển hóa một lượng lớn cơ chất, trong khoảng thời gian ngắn

Nguồn nguyên liệu thu nhận enzyme

Nguyên liệu để thu nhận enzyme chủ yếu là tế bào thực vật, mô động vật và vi sinh vật Tuy nhiên, việc khai thác enzyme từ thực vật và động vật gặp nhiều khó khăn do nguồn nguyên liệu hạn chế và hiệu suất thấp, dẫn đến giá thành cao Do đó, hiện nay, phần lớn enzyme được sản xuất từ tế bào vi sinh vật So với nguồn gốc động vật và thực vật, việc sản xuất enzyme từ vi sinh vật mang lại nhiều ưu điểm vượt trội.

- Vi sinh vật có tốc độ sinh sản cao, sinh trưởng và phát triển mạnh, vì vậy tốc độ tổng hợp enzyme cũng rất cao

- Hệ enzyme của vi sinh vật vô cùng phong phú và có hoạt tính khá cao

Cải tạo giống vi sinh vật nhằm tạo ra các chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme theo yêu cầu được thực hiện nhanh chóng nhờ vào khả năng thích ứng môi trường vượt trội của chúng.

Vi sinh vật có khả năng sản xuất enzyme mà không cần nghiên cứu môi trường dinh dưỡng nghiêm ngặt, cho phép tận dụng phế liệu từ nông nghiệp và công nghiệp Bằng cách điều chỉnh các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy, có thể đạt được hiệu suất cao trong sản xuất enzyme từ vi sinh vật.

Sản xuất enzyme từ vi sinh vật có thể được thực hiện quy mô công nghiệp và mang lại hiệu quả kinh tế cao hơn so với phương pháp sản xuất enzyme từ động vật và thực vật.

Vi sinh vật, mặc dù nhỏ bé, nhưng có khả năng khai thác enzyme vượt trội hơn so với động vật và thực vật Hiện nay, hàng trăm loại enzyme khác nhau đã được sản xuất thông qua phương pháp tổng hợp từ vi sinh vật.

Phương pháp thu nhận enzyme

Quá trình thu nhận chế phẩm enzyme tinh khiết bao gồm nhiều giai đoạn như thu nhận, tách chiết và tinh sạch, nhằm loại bỏ tạp chất mà vẫn giữ được hoạt tính của enzyme Điều này phụ thuộc vào các tính chất lý hóa của enzyme và nguồn liệu Do đó, việc xây dựng sơ đồ tinh sạch enzyme đúng đắn là rất quan trọng, cần chú ý đến các tính chất cơ bản như hoạt tính, độ ổn định của enzyme đối với pH, nhiệt độ, lực ion, tính hòa tan và tính bền vững trong các dung môi hữu cơ cũng như dung dịch muối.

Hiện nay, để thu nhận enzyme, người ta thường sử dụng hai phương pháp chính: Đối với enzyme ngoại bào, chỉ cần loại bỏ xác tế bào bằng lọc hoặc ly tâm, phần dịch thu được sẽ được tinh sạch để tạo ra dung dịch enzyme thô Còn đối với enzyme nội bào, bước đầu tiên là phá vỡ màng tế bào bằng các phương pháp thích hợp.

- Phương pháp cơ học : nghiền

- Phương pháp vật lý : sử dụng nhiệt, áp suất thẩm thấu, làm lạnh nhanh, sóng siêu âm, ion hóa

- Phương pháp hóa học : sử dụng các loại acid, kiểm, muối, dung môi hữu cơ, chất hoạt động bề mặt

Phương pháp enzyme và sinh học sử dụng enzyme như lyzozyme và dịch ốc sên Helix pomatia để phá hủy màng tế bào Đối với tế bào động vật và thực vật, phương pháp nghiền cơ học có thể dễ dàng phá vỡ màng tế bào Tuy nhiên, với tế bào vi sinh vật, cần áp dụng các phương pháp lý hóa học khác do vách tế bào của chúng rất bền vững, thậm chí có thể so sánh với độ bền của thép Để tăng cường khả năng phá vỡ màng tế bào, người ta thường sử dụng bột thủy tinh hoặc cát trắng tinh sạch trong quá trình nghiền.

Sau khi phá vỡ vách tế bào, enzyme được chiết xuất bằng nước, dung dịch đệm phù hợp hoặc dung dịch NaCl 1-3%, từ đó thu được dung dịch enzyme thô.

2.3.2 Ph ươ ng pháp tinh s ạ ch [6]

TỔNG QUAN VỀ CHẤT KÍCH THÍCH MIỄN DỊCH VÀ CƠ CHẾ TÁC ĐỘNG CỦA  -GLUCAN

2.4.1 Khái ni ệ m v ề ch ấ t kích thích mi ễ n d ị ch [23]

Chất kích thích miễn dịch là các hợp chất hóa học kích hoạt tế bạch cầu, giúp tăng cường sức đề kháng cho động vật trước các bệnh lây nhiễm Khi được quản lý hiệu quả từ giai đoạn đầu, chúng có thể giảm thiểu thiệt hại do bùng phát dịch bệnh.

Nhóm chất kích thích -1,3/-1,6–glucan được coi là triển vọng nhất nhờ cấu trúc hóa học rõ ràng và cơ chế tác động lên hệ miễn dịch đã được xác nhận qua nhiều nghiên cứu Chất này không độc hại và kích hoạt hệ miễn dịch theo một cơ chế chung cho tất cả các nhóm động vật, bao gồm cả con người Đặc biệt, -1,3/-1,6–glucan thể hiện hoạt tính không chỉ khi tiêm mà còn khi được tiêu thụ qua đường tiêu hóa hoặc tiếp xúc với các bề mặt niêm mạc.

Chất kích thích miễn dịch là các hợp chất hóa học giúp kích hoạt tế bào bạch cầu, tăng cường khả năng kháng lại virus, vi khuẩn, nấm và ký sinh trùng ở động vật Chúng cũng có tác dụng chống lại bệnh ung thư bằng cách kích hoạt tế bào bạch cầu nhận diện và tiêu diệt tế bào ung thư Qua quá trình tiến hóa, động vật đã phát triển khả năng phát hiện các cấu trúc hóa học đặc trưng của vi sinh vật gây hại, sử dụng chúng như tín hiệu cảnh báo để kích hoạt hệ miễn dịch Khi có sự hiện diện của các tín hiệu hóa học này, hệ miễn dịch sẽ phản ứng như thể đang đối mặt với một mối đe dọa thực sự Do đó, việc cung cấp chất kích thích miễn dịch cho vật nuôi có thể tăng cường hàng rào phòng vệ của chúng, từ đó bảo vệ khỏi các mối xâm nhiễm gây nguy hiểm đến tính mạng.

2.4.2 Ngu ồ n g ố c các ch ấ t kích thích mi ễ n d ị ch [23]

Hầu hết các chất tồn tại dưới dạng phân tử cấu trúc của vi khuẩn, nấm sợi và nấm men, nhưng cũng có một số hợp chất được tổng hợp hoàn toàn nhân tạo với các mục đích khác nhau, đồng thời cho thấy đặc tính kích thích miễn dịch.

Bài báo của Raa (1996) mô tả bản chất hóa học và mô hình hoạt động của nhiều chất kích thích miễn dịch khác nhau, và đã được phân loại thành các nhóm cụ thể.

- Các yếu tố cấu trúc của vi khuẩn (lipopolysaccharide (LPS), lipopeptide, các glycoprotein vỏ (capsular glycoprotein) và muramylpeptide)

- Các sản phẩm -1,3 – glucan khác nhau từ vi khuẩn (curdlan) và nấm sợi (krestin, lentinan, schizophyllan, scleroglucan, …)

- -1,3/-1,6–glucan từ vách tế bào nấm men bánh mì (macrogard, betafectin)

- Các cấu trúc carbonhydrate phức tạp (glucan) từ các nguồn sinh học khác nhau như tảo biển

- Các peptide hiện diện trong các dịch chiết của động vật hay được làm từ quá trình thủy phân protein cá bằng enzyme.

- Các sản phẩm tổng hợp (bestatin, muramylpeptide, … )

Các chất kích thích miễn dịch thường được đánh giá qua khả năng kích hoạt tế bào bạch cầu trong điều kiện in vitro Tuy nhiên, các thí nghiệm này không cung cấp nhiều thông tin về tác động của chúng đối với toàn bộ cơ thể Để hiểu rõ hơn về hiệu quả của một chất kích thích miễn dịch, cần tiến hành các thí nghiệm trên sinh vật sống.

Beta-1,3-glucan, được tìm thấy trong nấm sợi và nấm men, khác biệt với các chất kích thích miễn dịch từ vi khuẩn về cấu trúc hóa học và cơ chế hoạt động Sản phẩm này có hiệu quả cao và hoạt động theo một quy luật nhất định Cấu trúc hóa học và cơ chế hoạt động của beta-1,3-glucan đối với hệ miễn dịch rất đặc hiệu và đã được nghiên cứu chi tiết Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng beta-1,3-glucan không chỉ tăng cường sức khỏe mà còn cải thiện khả năng tăng trưởng và hình dạng tổng thể của nhiều loài động vật Với khả năng hoạt động khi hấp thụ qua thức ăn, beta-1,3-glucan đang được ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực mỹ phẩm và sức khỏe, nhờ vào sự phát triển nhanh chóng của sản phẩm này.

2.4.3 L ợ i ích khi dùng ch ấ t kích thích mi ễ n d ị ch [23]

Chất kích thích miễn dịch hiện nay được áp dụng trong nuôi trồng thủy sản và chăn nuôi truyền thống để giảm tỷ lệ tử vong do nhiễm bệnh và cải thiện sức khỏe tổng thể của động vật.

 Giảm tỉ lệ chết do các mầm bệnh cơ hội

Các mầm bệnh có thể gây chết cho vật nuôi khi chúng bị suy yếu do điều kiện môi trường bất lợi Những vi sinh vật này làm giảm sức khỏe tổng thể của vật nuôi, ngay cả khi môi trường và thức ăn tốt, và không biểu hiện triệu chứng bệnh lý rõ ràng Việc sử dụng các chất kích thích miễn dịch giúp tăng cường hệ thống phòng vệ của vật nuôi chống lại mầm bệnh cơ hội, từ đó nâng cao năng suất, tăng trưởng và giảm tỷ lệ tử vong.

 Ngăn ngừa các bệnh do virus

Phát triển vaccine chống virus là một quá trình tốn thời gian và chi phí, và việc tạo ra sản phẩm hiệu quả cho nhiều loại virus khác nhau là thách thức lớn Do đó, chiến lược hiệu quả để giảm thiểu tổn thất do bệnh tật là kết hợp chăm sóc tốt với việc sử dụng các chất kích thích miễn dịch, nhằm nâng cao khả năng kháng bệnh của vật nuôi.

Mô hình hoạt động của -1,3 – glucan ở động vật có xương sống

-1,3/1,6 – glucan kết hợp với receptor trên bề mặt của thực bào, được tìm thấy ở tất cả các nhóm động vật và con người, giữ vai trò quan trọng trong hệ miễn dịch Khi receptor này liên kết với -1,3/1,6 – glucan, các tế bào bạch cầu trở nên hoạt động hơn, giúp tiêu diệt vi khuẩn và tiết ra cytokine kích thích hình thành tế bào bạch cầu mới Ở động vật có hệ miễn dịch đặc hiệu, các thực bào hoạt hóa sản sinh cytokine kích thích tế bào B và T sinh kháng thể Do đó, -1,3/1,6 – glucan ảnh hưởng đến nhiều quá trình sinh học, bao gồm kháng bệnh, tăng trưởng, làm lành vết thương và sửa chữa tế bào tổn thương.

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

VẬT LIỆU – THIẾT BỊ - HÓA CHẤT

- Nấm men bánh mì Saccharomyces cerevisiae được cung cấp bởi công ty men thực phẩm Mauri La Ngà

 Mùi : đặc trưng của nấm men

 Thành phần : chỉ có tế bào nấm men, không có các phụ gia khác

- Chuột nhắt trắng Mus musculus

Trong phòng thí nghiệm, các dụng cụ như đĩa petri, đũa thủy tinh, bóp cao su, ống nghiệm, pipette, phễu lọc, giấy lọc, bình định mức, becher, burret, chén nung bằng sứ, ống trộn bạch cầu và buồng đếm Neubauer là rất cần thiết cho các thí nghiệm khoa học Những dụng cụ này hỗ trợ trong việc thực hiện các phép đo chính xác, xử lý mẫu và phân tích kết quả, đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu và phát triển trong lĩnh vực hóa học và sinh học.

- Lò nung, bình hút ẩm, bình chưng cất, bể ổn nhiệt, tủ sấy, bếp đun, cân phân tích độ chính xác 0,01g và 0,0001g

- Máy đo quang phổ UV- Vis

- Máy Kjeldahl bán tự động của hãng Prolabo

- Thiết bị đồng nhất tế bào French Press của hãng Thermo Electron Coporation

- Na 2 SO 4 khan nước hay cát sạch

- Ete etyl hay ete dầu hỏa

- Chất xúc tác: Là hỗn hợp của 60 g selenium + 75 g CuSO 4 + 865 g

- Hỗn hợp chất chỉ thị màu:

 Hoà tan 0,264 g methyl đỏ trong 250 ml cồn tuyệt đối

 Hoà tan 1,28 g bromocresol blue trong 50 ml cồn tuyệt đối

 Trộn đều 2 dung dịch trên , bổ sung 96 ml HCl 0,25N Bổ sung đến một lít bằng cồn tuyệt đối.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.2.1 Ph ươ ng pháp tách chi ế t và tinh s ạ ch beta-glucan

Theo nghiên cứu của TS Hoàng Quốc Khánh và Phan Thị Thúy Phượng (2005), phương pháp thủy phân tế bào nấm men bằng NaOH cho hàm lượng carbohydrate cao nhất Điều kiện tối ưu để đạt được kết quả này là thủy phân trong 1 giờ ở nhiệt độ 90°C với nồng độ NaOH 1M Do đó, phương pháp này có thể được cải tiến để thu nhận -glucan trong nghiên cứu hiện tại.

Nguyên tắc hoạt động của thiết bị đồng hóa tế bào :

Nguyên liệu tế bào đông lạnh được đẩy qua lỗ hẹp dưới áp suất cao và nhiệt độ khoảng -20°C Trước khi đưa vào thiết bị, các tế bào được làm lạnh và huyền phù trong dung dịch.

Hình 3.1: Thiết bị đồng hóa tế bào French Press

Khảo sát hai quy trình tách chiết khi có và không có xử lý tế bào nấm men bánh mì bằng thiết bị đồng nhất French Press

Quy trình 1 : Quy trình có xử lý tế bào nấm men bằng thiết bị đồng hóa

Thiết bị đồng hóa : French Press discrupter (hãng Thermo Electron Coporation), cell pressure : 30000, Gauge Pressure (Piston 1” Dia) :1900

Huyền phù nấm men trong nước (15%)

Giữ lạnh ở 4 o C trong 3h Đồng hóa tế bào nấm men Huyền phù nấm men trong dung dịch NaOH 1M (1:5(w/v)) Ủ 85 o C/2h

Khuấy đều, để nguội ở nhiệt độ phòng

Ly tâm 4000 vòng/ 5 phút, thu cặn, rửa với nước 3 lần

Huyền phù với dung dịch acid acetic 0.5M (1:5 (w/v)) Ủ 75 o C/1h

Ly tâm 4000 vòng/ 5 phút, thu cặn, rửa với nước 3 lần

Quy trình 2 : Quy trình không có xử lý tế bào nấm men bằng thiết bị đồng hóa

Huyền phù nấm men trong dung dịch NaOH 1M (1:5(w/v)) Ủ 85 o C/2h

Khuấy đều, để nguội ở nhiệt độ phòng

Ly tâm 4000 vòng/ 5 phút, thu cặn, rửa với nước 3 lần

Huyền phù với dung dịch acid acetic 0.5M (1:5 (w/v)) Ủ 75 o C/1h

Ly tâm 4000 vòng/ 5 phút, thu cặn, rửa với nước 3 lần

Mẫu nguyên liệu và mẫu sản phẩm của hai quy trình trên, đem phân tích được ký hiệu như sau :

Mẫu 2 : sản phẩm β-glucan sấy khô của quá trình tế bào nấm men có xử lý qua thiết bị đồng hóa

Mẫu 3 : sản phẩm β-glucan sấy khô của quá trình tế bào nấm men không có xử lý qua thiết bị đồng hóa

3.2.2 Ph ươ ng pháp xác đị nh kh ố i l ượ ng ch ấ t khô [1]

Trong cấu trúc tế bào, mô và cơ quan, nước chiếm tỷ lệ lớn và tồn tại dưới dạng tự do cũng như liên kết với các hợp chất hữu cơ Do đó, để xác định chính xác hàm lượng protein, saccharide, lipid và các thành phần khác trong nguyên liệu, cần phải đo lường hàm lượng của chúng trong nguyên liệu khô tuyệt đối.

Để xác định khối lượng vỏ hộp khô tuyệt đối, đầu tiên, sấy hộp ở nhiệt độ 105°C trong 3 giờ, sau đó để nguội trong bình hút ẩm và cân Đối với mẫu, cho 3g vách tế bào nấm men vào hộp, đặt trong tủ sấy ở nhiệt độ 50-60°C trong 30 phút, rồi nâng dần nhiệt độ đến 105°C và sấy trong 6 giờ Sau khi để nguội trong bình hút ẩm, cân trọng lượng Tiếp tục sấy thêm 1 giờ ở 105°C, để nguội trong bình hút ẩm và cân lại Nếu khối lượng hộp chứa mẫu không thay đổi, điều này chứng tỏ mẫu đã đạt khô tuyệt đối.

3.2.3 Ph ươ ng pháp đị nh l ượ ng đướ ng kh ử b ằ ng 3,5-Dinitrosalycylic acid [8]

Đường có thể được định lượng thông qua các tác nhân dựa trên đặc tính khử của nó Một trong những tác nhân phổ biến là 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS), khi ở trong dung dịch kiềm sẽ chuyển màu vàng và bị khử thành acid 3-amino-5-nitrosalicylic, tạo ra màu vàng đỏ cam.

Phản ứng hóa học rất phức tạp do đường chuẩn không nhất thiết phải đi qua gốc tọa độ, và mỗi loại đường khử sẽ tạo ra các màu sắc khác nhau.

Để chiết xuất mẫu, lấy 1-2g mẫu chứa khoảng 5-50mg đường cho vào cốc thủy tinh 50ml, thêm 10ml cồn 90 độ và đun sôi 3 lần bằng nồi cách thủy Khuấy đều bằng que thủy tinh, để nguội và lọc qua giấy lọc, chỉ lấy phần rượu và bỏ cặn Tiếp theo, cho 10ml cồn 80 độ vào bã, khuấy đều và đun sôi 2 lần Sau khi để nguội, tiếp tục lọc và thực hiện quy trình chiết rút khoảng 2 lần Cuối cùng, rửa bã 2-3 lần bằng rượu 80 độ nóng.

Rượu sau khi được lọc cần được cho bay hơi trong phòng hoặc trên nồi cách thủy với lửa nhỏ Sau khi quá trình bay hơi hoàn tất, mẫu rượu có thể được bảo quản lâu dài trong bình hút ẩm.

Cặn khô trong cốc được pha loãng với 50ml nước cất bằng bình định mức Nếu có cặn, cần để cho lắng xuống Khi tiến hành hiện màu, dung dịch này có thể được pha loãng thêm từ 5-10 lần tùy thuộc vào nồng độ đường có trong dung dịch.

- Cân chính xác 1,00g glucose (dạng khô không ngậm nước) hòa tan thành 200ml với nước cất Sử dụng bình định mức

- Hút lần lượt 1, 2, 3, 4 và 5ml dung dịch đường này vào 5 bình định mức 50ml Thêm nước cho đến vạch định mức

- Các dung dịch đường mới pha này có nồng độ glucose lần lượt là 0.10, 0.20, 0.30, 0.40 và 0.50mg/ml

- Thực hiện phản ứng như trên

- Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên giữa nồng độ đường và độ hấp thu OD 540nm Đồ thị chuẩn

Hàm lượng đường (mg/ml) 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3

Hàm lượng đường (mg/ml)

Dựa vào đường chuẩn gluco để tính ra hàm lượng đường có trong các mẫu : y = 4.782x – 0.3336

Với : x : hàm lượng đường có trong mẫu (mg/ml) y : giá trị OD 540

Xác định hàm lượng đường

Chỉ pha chế dung dịch thuốc thử DNS dùng cho phản ứng trước khi sử dụng, dung dịch này cần phải được giữ trong chai nâu và tránh CO 2

- Hút 3ml dung dịch mẫu có chứa đường vào một ống nghiệm

- Thêm vào 1ml thuốc thử DNS

- Chuẩn bị ống khử không bằng cách thêm 1ml thuốc thử DNS vào 3ml nước cất

- Dùng một miếng nilon sạch bịt kín đầu ống nghiệm, đặt vào nồi nước đang sôi trong 5 phút

Để đảm bảo độ chính xác trong việc đo độ hấp thu OD ở bước sóng 540nm, cần làm lạnh tất cả các ống nghiệm về nhiệt độ phòng trước khi tiến hành đo Việc này là cần thiết vì độ hấp thu rất nhạy cảm với sự thay đổi nhiệt độ Sử dụng ống thử không để chuẩn độ truyền suốt đạt 100% nhằm đảm bảo kết quả đo chính xác.

- Dựa vào đường chuẩn suy ra nồng độ đường có trong dung dịch

3.2.4 Xác đị nh hàm l ượ ng glycogen [21]

Enzyme amyloglucosidase có khả năng thủy phân các liên kết α-1,4 và α-1,6 trong glycogen thành glucose Lượng glucose tự do được xác định qua phương pháp DNS Nhiệt độ tối ưu để enzyme hoạt động hiệu quả nằm trong khoảng 55°C – 60°C, trong khi pH tối ưu là 4.5 Enzyme này duy trì pH ổn định từ 3.5 đến 5.5 ở 30°C trong khoảng thời gian từ 30 đến 60 phút, và có nhiệt độ ổn định là 50°C trong 60 phút.

- Enzyme amyloglucosidase được pha trong dung dịch đệm acetate 0.2M ở pH 4.2

- Lấy 1ml mẫu sau khi được tách chiết đường, đem xử lý với 2ml enzyme amyloglucosidase trong 30 phút/ 37 0 C

- Xác định hàm lượng đường giống như trên

3.2.5 Xác đị nh hàm l ượ ng glucan [25]

Hàm lượng glucan được xác định bằng hiệu số của hàm lượng đường với hàm lượng glycogen

3.2.6 Ph ươ ng pháp xác đị nh nit ơ t ổ ng s ố - Ph ươ ng pháp Kjeldahl [4]

Chất đạm được vô cơ hóa bằng H 2 SO 4 đậm đặc thành amonisunfat ((NH 4 ) 2 SO 4 ) Muối này đem cho tác dụng với kiềm mạnh như NaOH sẽ phóng ra NH 3

H 2 SO 4 đậm đặc Chất đạm (NH 4 ) 2 SO 4

Xúc tác, t o (NH 4 ) 2 SO 4 + NaOH 2NH 3 + 2H 2 O + Na 2 SO 4

Sau đó lượng NH3 được hơi nước lôi cuốn sang một bình tam giác có chứa một lượng thừa H3BO3 Mà ở đó H3BO3 tự phân ly :

H 3 BO3 HBO 2 + H 2 O Khi cất đạm, NH 3 bay sang sẽ phản ứng với HBO 2

NH 4 OH + HBO 2 NH 4 + + BO 2 - + H 2 O

BO2- là một bazơ mạnh, làm dung dịch chuyển từ màu tím đỏ sang màu xanh lá mạ Lượng BO2- hình thành tương đương với lượng NH3 bị đẩy ra trong quá trình cất đạm Để xác định lượng BO2-, thực hiện chuẩn độ ngược với HCl 0,25N, kết thúc khi dung dịch chuyển từ màu xanh lá mạ sang màu đỏ tím.

Nguyên tắc của sự vô cơ hóa chất đạm là quá trình chuyển đổi tất cả các dạng chất đạm, bao gồm cả protein hữu cơ và vô cơ, thành hợp chất vô cơ amoniac sulfate ((NH4)2SO4) đậm đặc với sự hỗ trợ của chất xúc tác.

Cân 100 mg mẫu đã nghiền kỹ và cho vào ống phá mẫu cùng với 1 g chất xúc tác và 5 ml H2SO4 đậm đặc Kết nối bộ thu khí và tiến hành phá mẫu Sau khi hoàn tất quá trình, để ống phá mẫu nguội, bổ sung 50 ml nước cất, trộn đều và để nguội trước khi lắp vào máy chưng cất.

Lắp ống phá mẫu vào máy chưng cất và bổ sung 80 ml NaOH 32% Khởi động quy trình chưng cất, sau đó chuyển dịch chưng cất sang bình tam giác đã chứa 20 ml dung dịch acid boric 4% có chỉ thị màu.

Ngừng chưng cất khi dịch chưng cất ra không còn NH 3 (thử bằng giấy quỳ)

Chuẩn độ bằng HCl 0,25N Ngừng chuẩn độ khi xuất hiện màu phớt đỏ