TỔNG QUAN
Quercetin
- Quercetin là một trong những flavonoid bền vững với nhiều hoạt tính sinh học khác nhau, thuộc nhóm flavonol, có màu vàng
Quercetin là một flavonoid có nhiều trong các thực phẩm như táo, nho, hành tây, tỏi và rượu vang đỏ Trong các nguồn thực vật này, quercetin chủ yếu tồn tại dưới dạng glycosid, tức là liên kết với đường, và hiếm khi xuất hiện dưới dạng tự do (aglycon).
Tại Việt Nam và một số quốc gia châu Á, quercetin chủ yếu được chiết xuất từ rutin có trong nụ hoa khô của cây hòe (Sophora japonica L.) thông qua phương pháp thủy phân Bên cạnh đó, hoạt chất này cũng có thể được tách chiết từ các dược liệu khác như củ hành tím (Allium cepa L.) và cây diếp cá (Houttuynia cordata Thunb.).
- Quercetin sử dụng trong các nghiên cứu thường ở dạng quercetin dihydrat
Hình 1.1 Cấu trúc hóa học của quercetin [124]
- Tên IUPAC: 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-1-benzopyran-4- one
- Khối lượng mol phân tử: 302,23 đvC [124]
Quercetin có cấu trúc hóa học dạng C 6 - C 3 - C 6, bao gồm hai vòng benzen A và B liên kết qua một mạch ba carbon Phân tử quercetin chứa năm nhóm hydroxyl tại các vị trí 3, 3’, 4’, 5 và 7, khiến nó trở thành một trong những hoạt chất chống oxy hóa mạnh nhất trong nhóm flavonoid Do phần lớn flavonoid là các dẫn chất có gốc phenyl, quercetin được xem là polyphenol với tính acid yếu.
- Cảm quan: Tinh thể hình kim màu vàng nhạt Bình thường tồn tại ở dạng dihydrat, trở nên khan ở 95 - 97 o C
Quercetin được phân loại vào nhóm II trong bảng phân loại sinh dược học bào chế (BCS) do có tính thấm tốt với hệ số thấm đạt (7,30 ± 1,95) x 10 -4 cm/s, mặc dù độ tan của nó lại thấp Ở nhiệt độ 25 oC, quercetin có độ tan khoảng 1 àg/ml trong nước, 5,5 àg/ml trong dịch dạ dày nhân tạo, 28,9 àg/ml trong dịch ruột nhân tạo, 2 mg/ml trong ethanol và 30 mg/ml trong DMSO Độ tan của quercetin còn phụ thuộc vào nhiệt độ và pH của môi trường.
140 o C, độ tan trong nước của quercetin tăng từ 0,00163 mg/ml lên 1,49 mg/ml
[121] Sự gia tăng độ tan quercetin cũng nhận thấy khi pH thay đổi từ 1,2 - 7,4 [69]
- Hệ số phân bố là 1,82 ± 0,32 trong môi trường n-octan/nước [106]
Quercetin có khả năng hấp thụ tia tử ngoại nhờ hiệu ứng liên hợp từ hai vòng benzen Theo tiêu chuẩn USP 41, hoạt chất này có cực đại hấp thụ tại bước sóng 255 nm và 371 nm trong methanol.
- Quercetin có tính acid yếu Hằng số phân ly pKa 1 = 7,17 (phenol); pKa 2 8,26 (phenol); pKa 3 = 10,13 (phenol); pKa 4 = 12,30 (phenol); pKa 5 = 13,11 (phenol) [50]
- Phản ứng của nhóm hydroxyl (-OH) [2]:
Quercetin, dưới tác động của các chất oxy hóa như bạc nitrat và enzym polyphenoloxydase, sẽ trải qua quá trình oxy hóa để hình thành các gốc ArO Những gốc này có khả năng dimer hóa hoặc phản ứng với các gốc tự do khác, dẫn đến việc tạo ra các liên kết mới như C - C, C - O hoặc O - O.
Vòng thơm có khả năng tham gia phản ứng thế dễ hơn so với benzen, và phản ứng diazo cùng azo hóa thường được áp dụng để phát hiện quercetin trên sắc ký đồ Các amin thơm thường được sử dụng làm thuốc thử trong các phản ứng này.
- Phản ứng của nhóm carbonyl [2]:
Phản ứng Shinoda, hay còn gọi là phản ứng cyanidin, là một quá trình khử có sự tham gia của các kim loại như sắt, kẽm và magnesi trong môi trường HCl Phản ứng này đặc trưng cho các flavonoid có nhóm carbonyl tại vị trí C4 và nối đôi giữa C2 = C3, điển hình là flavonol như quercetin.
Quercetin có khả năng tạo chelat với kim loại nặng, một tính chất quan trọng liên quan đến hoạt tính sinh học của nó Nhờ có nhóm carbonyl ở vị trí C4 và nhóm hydroxy ở vị trí C3 - C5, quercetin dễ dàng hình thành phức với kim loại.
Độ ổn định của flavonoid phụ thuộc vào cấu trúc hóa học của chúng Các hợp chất có nhiều nhóm -OH phenol thường kém ổn định hơn Tuy nhiên, quercetin với hơn một vòng benzen cho thấy rằng độ ổn định của hoạt chất không chỉ phụ thuộc vào số lượng nhóm -OH phenol.
- Tại pH kiềm, quercetin kém ổn định Sản phẩm trung gian của quá trình phân hủy này là 2,4,6-trihydroxymandelat và 2,4,6-trihydroxyphenylglyoxylat [39]
Quercetin dễ bị phân hủy khi tiếp xúc với nhiệt độ cao, và số lượng phân tử nước cũng ảnh hưởng đến độ nhạy cảm của nó với nhiệt độ Trong số đó, quercetin dihydrat cho thấy tính ổn định cao nhất.
1.1.5 Các phương pháp định lượng quercetin
Dược điển Mỹ USP 41 sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) để định lượng quercetin với pha động là hỗn hợp methanol, nước và acid phosphoric theo tỷ lệ 100:100:1 Điều kiện sắc ký bao gồm cột C18, tốc độ dòng 1 ml/phút, thể tích tiêm mẫu 20 µl và detector UV ở bước sóng 370 nm Mẫu thử và mẫu chuẩn được pha trong hỗn hợp methanol - nước để xác định hàm lượng quercetin Một số nghiên cứu trong nước đã chọn pha động khác với tỷ lệ methanol - acetonitril - đệm phosphat 0,01 M pH 3 là 30:60:10 và có điều kiện sắc ký khác như thể tích tiêm 10 µl và tốc độ dòng 0,6 ml/phút Ưu điểm của HPLC là độ nhạy cao và khả năng xử lý nhiều mẫu trong thời gian ngắn, nhưng quy trình chuẩn bị mẫu và chạy sắc ký phức tạp Trong trường hợp không yêu cầu độ chính xác cao, phương pháp đo phổ tử ngoại ở bước sóng 370 nm hoặc 374 nm có thể được sử dụng để định lượng quercetin.
Chất chống oxy hóa có khả năng trung hòa các gốc tự do, được hình thành từ các hợp chất oxy hóa mạnh chứa kim loại như sắt (Fe) hoặc các hợp chất hữu cơ với các nhóm như nitrit (NO), carboxyl (O C=O) và carbonyl (C=O) Những tác động này giúp bảo vệ tế bào khỏi tổn thương do oxy hóa.
Oxy hóa là một quá trình gây hại cho cơ thể, do các yếu tố như oxy phân tử (O2), tia cực tím (UV), phóng xạ và các chất xúc tác (enzym) tạo ra gốc tự do, dẫn đến lão hóa, đột biến và các bất thường sinh tế bào như ung thư Những tác động này cũng ảnh hưởng tiêu cực đến hoạt động sinh lý, bao gồm sinh hóa máu và rối loạn tiêu hóa, gan thận Quercetin, một hoạt chất có khả năng chống oxy hóa, giúp bảo vệ cơ thể khỏi những tác động xấu này nhờ vào cấu trúc phân tử đặc biệt của nó.
Quercetin chứa các nhóm hydroxyl liên kết với vòng thơm, cho phép hoạt chất này nhường hydro và tham gia vào các phản ứng oxy hóa khử, từ đó có khả năng bắt giữ các gốc tự do như gốc peroxyl (ROO·).
Tổng quan về phytosome
Phytosome, với "phyto" có nghĩa là thực vật và "some" tương tự như tế bào, sở hữu cấu trúc giống màng tế bào sinh học Điều này giúp phytosome có tính tương hợp sinh học cao, dễ dàng hơn trong việc vận chuyển vào bên trong tế bào.
Phytosome là phức hợp giữa hoạt chất dược liệu như polyphenol và triterpen với phospholipid ở cấp độ phân tử Trong môi trường nước, phytosome hình thành micell có cấu trúc tương tự như liposome.
Hình 1.4 Cấu trúc của phytosome [95]
Hai thành phần cơ bản cấu tạo nên tiểu phân phytosome: Hoạt chất và PL
- Cấu trúc của phospholipid gồm 2 phần: Phosphatidyl có bản chất thân dầu và cholin có bản chất thân nước
Hình 1.5 Cấu trúc hóa học của phopsholipid [95]
- Phân loại phospholipid dựa vào nguồn gốc:
Lecithin, một thuật ngữ phổ biến để chỉ phospholipid tự nhiên, có nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp “lekithos”, nghĩa là chất màu cam, dẻo dính được chiết xuất từ lòng đỏ trứng Tên gọi này đã được chuyển sang tiếng Anh là “lecithine” Lecithin bao gồm hỗn hợp phosphatidyl cholin (PC), phosphatidyl ethanolamin (PE), phosphatidyl serin (PS) cùng với các phospholipid khác, triglycerid, acid béo và carbon hydrat, trong đó phosphatidyl cholin chiếm tỷ lệ lớn nhất Phospholipid tự nhiên thường có giá thành thấp hơn so với các dạng tổng hợp và bán tổng hợp, tuy nhiên độ tinh khiết càng cao thì giá càng tăng.
+ PL tổng hợp: Các PL tự nhiên thường rất khó tinh chế được loại đơn chất
Các nhà nghiên cứu đã tổng hợp hoặc bán tổng hợp phospholipid để tạo ra các chất có cấu trúc và cấu hình đặc biệt Phospholipid này nổi bật với độ tinh khiết cao và tính bền vững hóa học vượt trội so với các loại phospholipid khác.
Dự án phân loại phospholipid (PL) dựa vào các alcol trong cấu trúc bao gồm glycerophospholipid và sphingomyelin Glycerophospholipid gồm các loại như PC, PE, PS, acid phosphatidic (PA) và phosphatidyl inositol (PI), trong đó PC, PE và PS là những phospholipid thường được dùng để bào chế phytosome PC được ưa chuộng nhất nhờ vào những ưu điểm vượt trội, như là thành phần chính của màng sinh học, giúp phytosome có cấu trúc tương tự màng tế bào, từ đó tăng cường khả năng hấp thu Ngoài ra, PC còn có tác dụng bảo vệ gan, hỗ trợ điều trị các bệnh về gan và đường tiêu hóa, cũng như cung cấp dinh dưỡng cho hoạt động của não Hiện nay, PA cũng đang được nghiên cứu và ứng dụng trong bào chế phytosome siramesine.
Hình 1.6 Cấu trúc phân tử của phosphatidyl cholin [113]
Hoạt chất có nguồn gốc từ thực vật, đặc biệt là các polyphenol như flavonoid (rutin, quercetin, silybin), saponin và terpenoid, mang lại nhiều tác dụng sinh học quý giá Tuy nhiên, ứng dụng lâm sàng của chúng thường bị hạn chế do tính không ổn định, khả năng hấp thu kém qua màng sinh học và tốc độ đào thải nhanh khỏi cơ thể Do đó, việc ứng dụng công nghệ phytosome để tăng cường hiệu quả trị liệu trong lâm sàng là rất cần thiết.
Flavonoid thường khó tan trong cloroform, ethyl ether và benzen, nhưng khi ở dạng phytosome, hoạt chất này lại tan rất tốt trong các dung môi này Đặc điểm này có thể được sử dụng để phân tách giữa hoạt chất tự do và hoạt chất trong phytosome.
1.2.3 Phân biệt phytosome với liposome
Bảng 1.1 Phân biệt phytosome và liposome [65], [95], [118]
Phytosome tạo thành một phân tử do liên kết giữa phospholipid và hoạt chất
Liposome hình thành do sự sắp xếp nhiều phân tử phospholipid, có thể mang được các phân tử dược chất mà không có liên kết
Phospholipid tạo thành phức hợp có xảy ra liên kết hóa học với phân tử hoạt chất Tỷ lệ mol PL : hoạt chất là
1:1 hoặc 2:1 Do tỷ lệ PL thấp nên khả năng hấp thu phytosome tốt hơn liposome
Trong liposome, không xảy ra liên kết hóa học, mà các phân tử phospholipid (PL) bao quanh nhân nước chứa dược chất tan trong nước Mỗi liposome được tạo thành từ hàng trăm đến hàng nghìn phân tử PL, và tỷ lệ mol của dược chất so với PL thường rất thấp.
Phytosome tạo thành do liên kết hydro của đầu phân cực của phân tử
PL (phopshat, amoni) với nhóm chức của phân tử hoạt chất Hoạt chất là một phần cấu thành nên lớp lipid kép
Trong liposome, dược chất được nằm trong khoang nước, hoặc xen kẽ trong lớp lipid, không tạo thành phân tử giữa dược chất và PL
Phytosome tạo ra dưới tác động của các dung môi có hằng số điện môi thấp như aceton, dioxin, methylene clorid, hexan, ethyl acetat…
Liposome tạo ra với sự có mặt của nước hoặc dung dịch đệm
Hình 1.7 So sánh cấu trúc của phytosome và liposome [66]
1.2.4 Ưu, nhược điểm của phytosome
Phytosome có nhiều ưu điểm của một giá mang hoạt chất siêu nhỏ:
- Tăng sinh khả dụng thông qua 2 cơ chế:
Cải thiện khả năng hấp thu qua đường uống có thể đạt được bằng cách nâng cao độ tan và tốc độ hòa tan của các hoạt chất Nghiên cứu cho thấy, độ tan của quercetin tăng đáng kể khi tạo phức với lecithin (tỷ lệ 1:1), đặc biệt ở môi trường dịch ruột pH 5,0, đạt 0,2166 mg/ml, so với quercetin dạng tự do và hỗn hợp vật lý chỉ đạt 0,0291 mg/ml và 0,0191 mg/ml Tương tự, curcumin cũng cho thấy sự gia tăng độ tan khi được bào chế dưới dạng phytosome Nghiên cứu in vitro cho thấy rằng phytosome có khả năng tăng sinh khả dụng in vivo, với giá trị C max của quercetin 500 mg luôn thấp hơn 10 ng/ml, trong khi nhóm phytosome 250 mg và 500 mg lần lượt đạt 126,35 ± 14,79 ng/ml và 223,10 ± 16,32 ng/ml Giá trị AUC 0→∞ của phytosome quercetin 500 mg cao gấp 18 lần so với hoạt chất tự do Đối với curcumin, C max của phytosome đạt 803,86 ng/ml với T max 2,21 giờ, trong khi hỗn hợp vật lý chỉ đạt 258,64 và 297,32 ng/ml AUC 0-120 phút của phytosome (Meriva) với liều 340 mg/kg cao gấp 5 lần so với curcumin dạng tự do, góp phần tăng cường hoạt tính bảo vệ gan trên tế bào gan chuột cô lập.
Phức hợp phospholipid với acid gallic đã được chứng minh là cải thiện hiệu quả bảo vệ gan in vivo, với khả năng hấp thu qua đường uống cao gấp 4,31 lần so với dạng tự do Thời gian tồn tại của hoạt chất phytosome trong cơ thể cũng lâu hơn, với t1/2 đạt 2,12 ± 0,18 giờ, trong khi t1/2 của acid gallic chỉ là 0,98 ± 0,07 giờ Kết quả này nhất quán với nghiên cứu của Tan.
Q và cộng sự [123] đã công bố với thời gian bản thải được kéo dài 2,07 giờ so với evodiamin là 1,33 giờ, giá trị AUC 0→∞ của phytosome cao hơn khoảng 2,2 lần Một nghiên cứu so sánh thời gian bán thải của curcumin dạng tự do và curcumin dạng phytosome nhận thấy t 1/2 của curcumin trong môi trường pH 7,2 (tương ứng với môi trường cơ thể) là không quá 10 phút, trong khi với dạng phytosome sau 240 phút ở cùng pH này vẫn còn 82 % hoạt chất không bị biến đổi [128]
Giảm liều là phương pháp giúp tối ưu hóa việc hấp thu hoạt chất, cho phép giảm liều dùng thuốc mà vẫn đạt hiệu quả điều trị mong muốn Một nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc điều chỉnh liều lượng có thể mang lại lợi ích đáng kể trong quá trình điều trị.
15 nang chứa 50 mg phức hợp lecithin với dịch chiết hạt nho có hiệu quả tương đương với 150 mg hoạt chất proanthocyanidindạng tự do
Tiểu phân phytosome được cấu tạo từ hai thành phần chính: hoạt chất dược liệu và phospholipid (PL) PL là một tá dược sinh học an toàn, không độc hại cho cơ thể và không gây phản ứng miễn dịch khi vào tuần hoàn.
PC không chỉ hoạt động như một chất mang mà còn có khả năng bảo vệ gan, đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc màng tế bào Nó là phân tử nền tảng để tạo ra các lipoprotein và cung cấp cholin thiết yếu cho các tế bào trong cơ thể.
Phytosome được ứng dụng rộng rãi trong ngành mỹ phẩm nhờ khả năng tăng cường tính thấm của hoạt chất qua da, điều này đã được xác nhận qua nhiều nghiên cứu Cụ thể, phytosome rutin đã làm tăng tính thấm qua da chuột thực nghiệm gấp 2,6 lần so với rutin thông thường Ngoài ra, gel chứa 2% phytosome Lawson cho thấy hiệu quả vượt trội trong việc kháng nấm so với gel chứa Lawson và chế phẩm ketoconazol sau 3 ngày sử dụng, nhờ vào khả năng thấm cao của phytosome, với 92,91% hoạt chất thấm qua da sau 6 giờ.
Một số mô hình đánh giá tác dụng bảo vệ tế bào gan
Mô hình in vitro mang lại nhiều lợi ích như sự đơn giản, chi phí thấp, dễ dàng thiết lập và cho kết quả nhanh chóng Nó thường được sử dụng như một công cụ để thăm dò và sàng lọc trước khi tiến hành nghiên cứu trên mô hình in vivo, và có khả năng thay thế cho in vivo nếu được chứng minh hiệu quả.
Quercetin có độ tan thấp và chuyển hóa nhanh trong cơ thể, dẫn đến việc sử dụng mô hình đánh giá in vitro để dự đoán in vivo thường không chính xác Do đó, nghiên cứu này đã lựa chọn mô hình in vivo để đảm bảo tính chính xác hơn trong kết quả.
Nghiên cứu được tiến hành trên chuột nhắt và chuột cống trắng, mang lại nhiều lợi ích như tính đơn giản về đạo đức, pháp lý và kinh tế so với thử nghiệm trên người Chuột và con người có nhiều điểm tương đồng trong hấp thu và mô hình vận chuyển ở ruột non, nhưng có sự khác biệt về mức độ biểu thị và enzym chuyển hóa ở dạ dày Chuột là loài động vật có vú dễ sinh sản, chi phí thấp và dễ nuôi nhốt, với gen tương đồng 99% so với con người, giúp giảm thiểu sai khác trong phản ứng Tuy nhiên, nhược điểm của việc sử dụng chuột trong nghiên cứu in vivo là sự khác biệt cơ bản về con đường và tốc độ chuyển hóa so với con người, cũng như khó khăn trong việc cho chuột uống thuốc do thể tích dịch sinh học ít và việc lấy mẫu khó khăn.
Mô hình nghiên cứu sử dụng các chất độc hại như hóa chất (rượu, carbon tetraclorid CCl4), thuốc (paracetamol, thioacetamid) và kim loại nặng (cadmium, arsen) để đánh giá khả năng bảo vệ tế bào gan của các hoạt chất Phương pháp gây độc gan bằng CCl4 lần đầu tiên được mô tả bởi Cameron và Karunaratne vào năm 1961.
Mô hình CCl4 vẫn được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu tổn thương gan do tính tương đồng trên nhiều loài Trong cơ thể, CCl4 chủ yếu được chuyển hóa qua CYP2E1, với một phần nhỏ qua CYP2B1, CYP2B2 và CYP3A4, tạo ra gốc tự do tricloromethyl (CCl3•) Gốc tự do này gây tổn thương gan qua hai con đường chính: haloalkyl hóa và peroxy hóa lipid Haloalkyl hóa dẫn đến liên kết cộng hóa trị trực tiếp vào các phân tử quan trọng, làm thay đổi cấu trúc và mất chức năng tế bào gan, trong khi peroxy hóa lipid gây tổn thương gan thông qua chuỗi phản ứng dây chuyền và cần có thời gian.
CCl4 có thể gây tổn thương gan qua nhiều đường dùng như tiêm màng bụng, tiêm dưới da hoặc đường uống, với liều lượng dao động từ 0,02 ml/kg đến 2 ml/kg Các liều này có thể được sử dụng dưới dạng đơn liều hoặc đa liều.
Các thông số trong huyết thanh như AST (aspartat amino transferase), ALT (alanin amino transferase), ALP (phosphatase kiềm), bilirubin toàn phần và albumin đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá chức năng gan Hiệu quả gây độc và giải độc gan thường được xác định qua hoạt độ của AST và ALT, trong đó ALT được coi là chỉ số đặc hiệu hơn cho tổn thương gan do nó chủ yếu tập trung ở gan, trong khi AST lại phân bố rộng rãi hơn ở tim.
Các cơ chất và enzym chính trong gan là chỉ số quan trọng phản ánh chức năng gan Lipid, thành phần thiết yếu của màng tế bào, có liên quan mật thiết đến quá trình peroxy hóa lipid, ảnh hưởng trực tiếp đến tổn hại tế bào in vivo Vì vậy, đây là một thông số đánh giá thường được sử dụng trong y học.
Bảng 1.3 Ảnh hưởng của CCl 4 lên một số thông số phản ánh chức năng gan
Nhóm thông số Thông số Thông số phản ánh Thay đổi
Huyết thanh AST Tổn thương tế bào gan Tăng
ALT Tổn thương tế bào gan Tăng
ALP Tổn thương tế bào gan Tăng
Enzym trong gan Succinat dihydrogenase Ty thể Giảm
Glucose-6-phosphatase Ty thể Giảm
Gama-GT Màng sinh chất Tăng
Superoxyd dismutase Phân đoạn sau ty thể Giảm
Cơ chất trong gan Lipid toàn phần Chứng nhiễm lipid Tăng
Lipid peroxyd Chứng nhiễm lipid Tăng
Cholesterol Cấu tạo màng Tăng