Công nghệ sản xuất insulin từ E.coli LỜI MỞ ĐẦU Hiện công nghệ sinh học sóng phát triển khoa học cơng nghệ Đây coi cơng nghệ cao bao gồm nhiều lĩnh vực công nghệ di truyền, công nghệ tế bào, cơng nghệ vi sinh vật,…Trong cơng nghệ di truyền hay công nghệ gen cụ thể kỹ thuật tái tổ hợp DNA nghiên cứu thành công việc chuyển đổi gen để tạo tế bào cá thể mang gen nhằm tạo vật chất cần thiết cho người Đó thành tựu to lớn lồi người nhẳm cứu chữa phịng ngừa bệnh hiểm nghèo mà trước người chưa thể tìm Chẳng hạn có loại interferon chống virus ung thư; enkephalin chữa bệnh thần kinh;các loại vaccin tái tổ hộp phòng chống viêm gan B, viêm não Nhật Bản, dịch tả, sởi, bại liệt,…; protein huyết tương, relaxin hỗ trợ sản phụ;… Trong báo cáo này, nhóm chúng tơi xin giới thiệu đến cô bạn công nghệ sản xuất insulin từ tế bào vi khuẩn E.coli sau đưa vào quy mơ cơng nghiệp giới để thấy rõ việc ứng dụng kỹ thuật tái tổ hợp DNA sản xuất loại hormone dùng để điều trị bệnh tiểu đường loại người Bài báo cáo không tránh khỏi thiếu sót nên mong bạn đóng góp ý kiến để nhóm chúng tơi rút kinh nghiệm cho lần sau Xin chân thành cảm ơn Nhóm SV thực Nguyễn Thị Thanh Hằng Phạm Văn Hưng Công nghệ sản xuất insulin từ E.coli Giới thiệu insulin: 1.1 Insulin bệnh tiểu đường: Người ta nhận thấy bệnh tiểu đường bệnh đe dọa nghiêm trọng tới sức khoẻ người Trên giới, số người mắc bệnh tiểu đường ước tính khoảng từ 151 triệu đến 171 triệu (năm 2000), dự kiến số 221 triệu (năm 2010), năm 2030 lên đến 366 triệu người Và đương nhiên, việc gia tăng số người mắc bệnh tiểu đường kéo theo gia tăng biến chứng bệnh thần kinh, xơ vữa động mạch… Theo ước tính, số người tử vong giới bệnh tiểu đường năm 2000 2,9 triệu số cịn tiếp tục gia tăng Trong đó, tiểu đường type chiếm khoảng 90% tổng số ca bệnh Điều địi hỏi phải tìm hướng tiếp cận cho việc ngăn ngừa điều trị bệnh Bệnh tiểu đường bệnh chịu ảnh hưởng nhiều yếu tố Tiểu đường gây tác động phức tạp gene yếu tố mơi trường, từ dẫn tới bất bình thường q trình điều hịa lượng glucose thể liên quan tới vấn đề hormone insulin Insulin hormone tiết tế bào beta đảo Langerhans tuyến tụy động vật tiêu ăn thức ăn, hormone quan trọng cho trình lưu trữ, sử dụng đường, acid amin acid béo trì lượng đường máu Hàm lượng đường máu (hay gọi hàm lượng glucose máu) nguồn lượng thiết yếu cho thể Nếu lượng đường máu không trì mức bình thường gây bệnh nguy hiểm Hàm lượng đường máu tăng gây tiết đường qua nước tiểu, kết bị glucose, tượng cịn gọi bệnh tiểu đường Nếu tình trạng tiếp diễn thời gian dài, gây biến chứng nguy hiểm mô, quan thể Mặt khác, hàm lượng đường máu giảm dẫn đến lượng cung cấp cho thể bị thiếu hụt gây nguy hiểm cho trì thể sống Hàm lượng đường máu trì mức bình thường cân Công nghệ sản xuất insulin từ E.coli yếu tố làm tăng lượng đường máu (như glucagon, hormone, cortisol, catecholamine) với yếu tố làm giảm lượng đường máu Insulin hormone làm giảm lượng đường máu Do đó, khả tiết hormone giảm (do số nguyên nhân) insulin khơng cung cấp đủ cho thể gây bệnh tiểu đường phụ thuộc insulin (Insulin-Dependent Diabetes Mellitus - IDDM), gọi tiểu đường type I Với bệnh nhân mắc tiểu đường type I insulin phương thuốc điều trị 1.2 Cơ chế trì hàm lượng đường máu insulin: 1.2.1 Insulin trao đổi hydratcacbon: Insulin tuần hoàn máu, gắn với thụ thể màng tế bào tạo phức hợp thụ thể - insulin làm phát tín hiệu truyền thơng tin chuyển glucose khỏi huyết tương Insulin thúc đẩy gan dự trữ glucose dạng glycogen Glucose bị photphoryl hố nhờ enzyme hexokinase nhờ glucose bị bẫy vào tế bào Insulin ức chế hoạt động glucose - photphatase Khi khơng có mặt insulin, trình tổng hợp glycogen bị dừng lại enzym phân huỷ glycogen hoạt động Insulin ngăn cản lượng đường cao máu nên q nhiều insulin, enzym insulinase kiểm sốt mức độ insulin Khi lượng insulin cao enzyme insulinase phân hủy hormone với thời gian phút Quá trình đảm bảo cho hàm lượng insulin ổn định máu lượng glucose không bị giảm xuống mức nguy hiểm 1.2.2 Insulin trao đổi lipit: a) Insulin thúc đẩy sinh tổng hợp axit béo gan Khi lượng glycogen gan cao (> 5% lượng thơ gan) q trình tổng hợp bị ức chế Lượng glucoz hấp thụ vào tế bào gan chuyển sang tổng hợp axit béo chuyển khỏi gan dạng lipoprotein Các lipoprotein vào vòng tuần hoàn, cung cấp axit béo tự cho mô khác mô mỡ để tổng hợp triglyxeride b) Insulin ức chế phân huỷ chất béo mô mỡ: Insulin ức chế trình thuỷ phân triglyxeride thành glixerol axit béo tự Enzym nhạy cảm với hormone trở nên hoạt động photphoryl hoá Công nghệ sản xuất insulin từ E.coli Insulin làm ngăn cản kết hợp với thụ thể màng tế bào Do làm tăng tích tụ triglyxeride tế bào mô mỡ 1.3 Cấu tạo hormone insulin: Insulin người polypeptide bao gồm chuỗi A với 21 acid amin chuỗi B với 30 acid amin, có cầu nối disulfur chuỗi A cầu nối disufur nối hai chuỗi A B Insulin ban đầu tổng hợp dạng “preproinsulin” (tiền insulin) ribosome tế bào beta đảo Langerhans tuyến tụy Preproinsulin phân tử dạng thẳng bao gồm: peptide tín hiệu chứa 24 acid amin (SP), chuỗi B, peptide C với 31 acid amin (A) chuỗi A nối với theo thứ tự SP-B-C-A Khi vận chuyển qua lưới nội chất, peptide tín hiệu bị phân cắt tạo proinsulin (B-C-A) Proinsulin hình thành cầu nối disulfur lưới nội chất, hình thành cấu trúc bậc ba Proinsulin bị phân cắt enzyme PC1/3 liên kết chuỗi B peptide C sau bị phân cắt enzyme PC2 vị trí liên kết chuỗi A peptide C Hai acid amin đầu N peptide nối với đầu C chuỗi B bị phân cắt PC1/3 phân cắt khỏi chuỗi B enzyme carboxypeptidase H Kết cuối trình phân cắt tạo thành insulin Hình Cấu trúc phân tử insulin 1.4 Các phương pháp tổng hợp insulin: Từ thập niên 1920 năm đầu thập niên 1980, insulin tạo cách cô lập từ tuyến tụy động vật heo bị Tuy nhiên, Cơng nghệ sản xuất insulin từ E.coli insulin người có khác biệt thành phần acid amin so với insulin bò (hai vị trí chuỗi A vị trí chuỗi B) insulin heo (một vị trí chuỗi B) Do gây tác dụng khơng mong muốn (như dị ứng) sử dụng insulin có nguồn gốc từ heo hay bị Ngồi ra, q trình sản xuất tinh insulin từ động vật gặp nhiều khó khăn Sau đó, phương pháp bán tổng hợp insulin người từ insulin heo bò phát triển sử dụng phản ứng chuyển peptide (transpeptidation) sử dụng trypsin Tuy nhiên, insulin tái tổ hợp sản xuất công nghệ tái tổ hợp di truyền sử dụng chủ yếu chi phí sản xuất thấp hiệu sản xuất cao Insulin người sản xuất kỹ thuật di truyền Công ty Genetech (Hoa Kỳ) sản phẩm đưa thị trường vào năm 1982 Trong lịch sử, lần nhà nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học vào dược phẩm thành công Về sau, nhiều phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp phát triển Ví dụ: phương pháp sản xuất Tập đoàn Eli Lilly: phương pháp sản xuất biểu chuỗi A chuỗi B riêng biệt cách sử dụng Escherichia coli Sau đó, thu chuỗi A chuỗi B, trộn với in vitro tạo cầu nối disulfur Phương pháp có hiệu sản xuất thấp Do đó, Eli Lilly phát triển phương pháp cải tiến hơn, phương pháp biểu proinsulin thay biểu chuỗi A B riêng biệt phương pháp cũ, tạo cầu nối disulfur in vitro, sau phân cắt peptide C khỏi hai chuỗi A B trypsin carboxypeptidase, tạo thành insulin Hình Sản xuất insulin tái tổ hợp với chuỗi A chuỗi B riêng biệt Công nghệ sản xuất insulin từ E.coli Một phương pháp khác phát triển tập đoàn Novo Nordisk, phương pháp biểu miniproinsulin bao gồm chuỗi B chuỗi A nối với acid amin, biểu nấm men, sau xử lý miniproinsulin in vitro trypsin tạo thành insulin Phương pháp có nhiều thuận lợi cầu nối disulfur hình thành trình biểu trình tiết miniproinsulin miniproinsulin tách chiết tinh dễ dàng tiết thẳng môi trường nuôi cấy Hiện tại, người ta tiếp tục phát triển phương pháp sản xuất insulin tái tổ hợp Công ty Hoechst đưa phuơng pháp sản xuất insulin bao gồm: biểu dạng dẫn xuất insulin biểu preproinsulin E coli; tạo cầu nối disulfur invitro; sau đó, xử lý lysylendopeptidase clostripain/carboxypeptidase B; cuối tạo insulin Mới nhất, Công ty Bio-Technology General đưa phương pháp Trong phương pháp này, dạng protein dung hợp (fusion protein) bao gồm superoxide dismutase (SOD) gắn với proinsulin biểu tế bào E coli Bằng cách này, hiệu suất trình biểu protein hiệu trình hình thành cầu nối Sau đó, proinsulin chuyển thành insulin nhờ xử lý với trypsin carboxypeptidase B Bằng cách tương tự thế, người ta đưa ngày nhiều phuơng pháp sản xuất insulin tái tổ hợp cải tiến nhiều để nâng cao hiệu trình biểu protein, hình thành cầu nối disulfur, chuyển proinsulin thành insulin Công nghệ sản xuất insulin từ E.coli Hình Sản xuất insulin tái tổ hợp vi khuẩn Hiện nay, hầu hết phương pháp sản xuất insulin thương mại dựa chủng nấm men (Saccharomyces cerevisiae) vi khuẩn (E coli) kết hợp với kỹ thuật gene để sản xuất insulin người tổng hợp Người ta nuôi cấy chủng quy mô lớn, bồn lên men thép đắt tiền, sau đó, insulin ly trích ra, tinh để sản phẩm cuối Nói hệ thống tế bào dùng để biểu insulin tái tổ hợp, người ta sử dụng đa dạng từ vi sinh vật tới tế bào động vật thực vật Trong số đó, tế bào vi sinh vật sử dụng nhiều chúng dễ thao tác, dễ đưa vào áp dụng quy mô sản xuất công nghiệp, nhiều E coli nấm men Gần đây, người ta đưa hệ thống biểu khác cho loại protein tái tổ hợp – Bacillus brevis Mục đích nghiên cứu, phát minh muốn phát triển hệ thống biểu phương pháp sản xuất insulin có suất cao hiệu sản xuất phải ngang hay vuợt trội so với hệ thống sản xuất insulin Công nghệ sản xuất insulin từ E.coli từ trước tới Hay nói cách khác, nghiên cứu giai đoạn nhằm cải tiến phương pháp cổ điển chuyển tiền chất insulin thành insulin; nghiên cứu tìm mơi trường tối ưu cho việc hình thành cầu nối cần thiết cho việc biểu hoạt tính insulin; tìm hệ thống biểu insulin cho suất, sản luợng cao Quy trình sản xuất insulin kĩ thuật di truyền: 2.1 Sản xuất Insulin kĩ thuật cấy gen: Tiến hành theo bước: Tách ADN mang gen tổng hợp Insulin tế bào người khỏi tế bào, tách plasmit khỏi tế bào vi khuẩn Cắt đoạn ADN có gen tổng hợp Insulin cắt mở vịng plasmit enzyme cắt xác định Nối đoạn ADN mang gen Insulin vào ADN plasmit sau đóng vòng tạo thành plasmit mang ADN tái tổ hợp Đưa ADN tái tổ hợp plasmit vào tế bào nhận (E.coli) tạo điều kiện cho ADN tái tổ hợp hoạt động bình thường tạo hormone Insulin Bằng phương pháp chiết rút người ta lấy Insulin môi trường nôi cấy đem vào sử dụng y học Bước 1: Tách ADN mang gen tổng hợp Insulin tế bào người khỏi tế bào, tách plasmit khỏi tế bào vi khuẩn  Tách chiết DNA:  Trong tế bào sinh vật có loại nucleotide sau đâu: DNA nhân, DNA ty thể, DNA lục lạp, DNA plasmit RNA Muốn tách loại nucleotide này, bước người ta cần phải cáo tế bào sinh vật Bước thứ hai phải phá vỡ tế bào không làm hư hại nucleotide cần tách chiết Thông thường dịch phá vỡ tế bào phải có mặt chất gọng kìm EDTA để ức chế nuclease thủy phân loại nucleotide Ở bước người ta thủy phân protein enzyme protease K, pronase hay phenol Bước thứ tư tách mảnh vỡ tế bào Bước thứ năm tách DNA nhân, plasmid DNA nhân RNA khỏi hỗn hợp dịch tế bào Tiếp theo người ta tủa, tinh đánh giá kết tách chiết điện di agarose  Bằng kỹ thuật tách gen sử dụng sinh học phân tử tách gen mã Công nghệ sản xuất insulin từ E.coli hoá proinsulin người nhiễm sắc thể số 11 Tách mARN gen tổng hợp proinsulin từ mẫu nghiền tuỵ người Dùng phản ứng RT-PCR với mồi đặc hiệu để khuếch đại gen Do hầu hết mARN người có polyA nên sử dụng chuỗi polyT để bắt cặp với polyA Sử dụng sắc kí lực với polyT giữ lại mARN cần thiết cho trình dịch mã; lại loại bỏ ADN ARN khác Cắt bỏ cầu nối A - T thu mARN Phương pháp tách plasmid từ tế bào vi khuẩn E.coli Plasmid: Plasmids cịn nhỏ trịn DNA tìm thấy tế bào vi khuẩn, riêng biệt từ vi khuẩn chromosome nhỏ Họ sẵn sàng chuyển từ tế bào khác, tế bào rõ ràng từ lồi khác nhau, cịn quy mơ evolutionary Do vậy, plasmids sử dụng vectors, cho phép chép nước DNA vi khuẩn cách sử dụng gửi đến hệ thống Phương pháp kiềm Natri: Nguyên lý: Tế bào E.coli mang plasmid nuôi cấy qua đêm (trong môi trường LB, BHI môi trường E.coli khác) ly giải với dung dịch kiềm ( dung dịch II) Dung dịch II có tác dụng phá vỡ tế bào, EDTA ức chế khả phân hủy DNA nuclease Các mảnh vỡ tế bào DNA nhân bào (nhiễm sắc thể) lắng tủa SDS natri acetate (dung dịch II + III) Sau tủa mảnh vỡ tế bào, người ta lắng tủa plasmid DNA dịch với isopropanol DNA hòa lại đệm TE Hiệu suất thu hồi từ 5ml dịch ni cấy đạt 5-10µg plasmid Có thể áp dụng phương pháp kiềm để tách lượng lớn nhiều lần Vật liệu hóa chất: Tế bào vi khuẩn E.coli Dung dịch I (hòa tế bào): sucrose : EDTA : Tris=1 : : 5, pH = Dung dịch II (ly giải): NaOH, SDS Dung dịch III (trung hòa): Natri acetate, pH=4.8 Đệm TE Hỗn hợp PC: phenol chcloroform, dung dịch EtOH Tiến hành: Công nghệ sản xuất insulin từ E.coli Cho dịch tế bào vào ống ly tâm Ly tâm xong, hút từ từ hết môi trường Thêm dung dịch I lắc rung để hòa tan tủa tế bào Thêm dung dịch II đảo lộn ống để hòa tan Dịch ly giải tế bào trở nên quánh nhớt Để yên dịch thời gian, sau thêm dung dịch III Đảo ngược ống để hòa trộn tế bào Một khối DNA/protein/SDS màu trắng hình thành Ủ khay đá lạnh Ly tâm, sau hút dịch sang ống ly tâm khác Thêm EtOH trộn Ly tâm thời gian ngắn, gạn bỏ bớt ethanol từ từ rửa tủa với EtOH Làm khô máy khô chân khơng bình hút ẩm Rửa tủa với ethanol để khơ ngồi khơng khí Hịa tủa nước hay TE, ta thu plasmid hoàn chỉnh Bước 2: Cắt đoạn ADN có gen tổng hợp Insulin cắt mở vòng plasmit enzyme cắt xác định Cắt gen mã hoá proinsulin plasmit loại enzym giới hạn EcoRI Trình tự DNA bi cắt GAATTC (theo hình 4) Hình 4: trình tự nhận biết vị trí cắt enzyme cắt giới gạn EcoRI 10 Công nghệ sản xuất insulin từ E.coli Bước 3: Nối đoạn ADN mang gen Insulin vào ADN plasmit sau đóng vịng tạo thành plasmit mang ADN tái tổ hợp cDNA: người gồm gene mã hóa khơng mã hóa sequences Các mã hóa gọi cDNA sequences Nó lấy từ đảo ngược transcription RNA tin nhắn Các transcription dịch insulin cDNA cho phép chức sản xuất insulin molecule Nối ADN ligase phageT4 Thiết kế trình tự mã hố cho protein tín hiệu giúp vận chuyển insulin tế bào chất + Nếu sử dụng mARN tách từ tiến hành sau: Sao mARN tinh khiết thành cADN nhờ enzym phiên mã ngược nhờ dNTP (trong phản ứng RT - PCR) Cài đoạn cADN mã hố insulin hồn chỉnh vào plasmit đứng sau promoter mạnh Hình 5: ligase nối hai phân tử DNA đầu nối bổ trợ 11 Công nghệ sản xuất insulin từ E.coli Bước 4: Đưa ADN tái tổ hợp plasmit vào tế bào nhận E.coli (Biến nạp vector tái tổ hợp vào vi khuẩn E.coli) tạo điều kiện cho ADN tái tổ hợp hoạt động bình thường tạo hormone Insulin  Biến nạp chuyển plasmid tái tổ hợp vào E.coli: Việc tiếp nhận plasmid DNA thường thực cách xử lý tế bào với CaCl2 băng sau đặt chúng khoảng 120s nhiệt độ cao (42 oC).Phương pháp có tần số biến nạp tối đa khoảng tế bào biến nạp/1000 tế bào (10 -3) Hiệu biến nạp khoảng 107-108 khuẩn lạc biến nạp µg plasmid DNA nguyên vẹn Việc tiếp nhận plasmid DNA tự thực cách đưa vi khuẩn vào điện trường cao với có mặt plasmid DNA Quy trình gọi tạo lỗ điện (còn gọi xung điện) Các tế bào E.coli (50µL [ microlit]) plasmid DNA đặt vào cuvet ăn khớp với điện cực, xung điện đơn khoảng 2.5 microfara, 2.5 kilovon 200 ohm, thực khoảng 4.6 mili giây Xử lý cho thu nhận hiệu suất biến nạp 10 thể biến nạp micogram plasmid nhỏ (3 kilobase) 10 thể biến nạp plasmid lớn (khoảng 136 Kb) Bởi tạo lỗ điện phương pháp hiệu để biến nạp E.coli với plasmid chứa đoạn chèn dài 100 Kb Hình 6: biến nạp plasmid tái tổ hợp E.coli Các vi khuẩn chuyển gen sau đưa vào lên men Ni chúng nồi lên men sử dụng phương pháp nuôi cấy liên tục, chất dinh dưỡng bổ sung thường xuyên để đảm bảo tăng trưởng vi 12 Công nghệ sản xuất insulin từ E.coli khuẩn theo hàm số mũ Sau 20 phút có hàng triệu vi khuẩn nhân lên qua nguyên phân Chỉ sau thời gian ngắn, sinh khối tăng lên nhanh gen insulin tổng hợp Hình 7: Đưa vi khuẩn chuyển gen vào nồi lên men Bước 5: Bằng phương pháp chiết rút người ta lấy Insulin môi trường nôi cấy đem vào sử dụng y học Tiền tinh Sau lên men cần tách tế bào khử trùng nhiệt Dùng enzym lizozyme phá vỡ màng tế bào, sau dùng hỗn hợp chất tẩy rửa để tách lớp màng lipit Bằng phương pháp ly tâm lọc tách proinsulin Hoạt hóa Do hệ thống E.coli có khả biểu gen insulin khơng có khả hoạt hố insulin Hoạt hoá proinsulin invitro cách xử lý dung dịch đệm, giúp đạt cấu trúc bậc 4, sau dùng enzym đặc hiệu trypsin để phân cắt proinsulin Khi sản phẩm thu có hoạt tính cần thiết Hỗn hợp tinh cịn có insulin 13 Cơng nghệ sản xuất insulin từ E.coli Hình 8: Hoạt hóa proinsulin thành insulin Cuối insulin tinh thể hoá Bằng phương pháp sắc ký, tách phương pháp miễn dịch gắn enzym Độ tinh insulin đánh giá qua giai đoạn trung gian trình sản xuất nhờ phịng thí nghiệm chun hố Hình 9: Tinh thể insulin dược tinh chế 14 Công nghệ sản xuất insulin từ E.coli KẾT LUẬN Bệnh tiểu đường loại bệnh lý gia tăng với tốc độ đáng báo động trẻ em niên Người mắc bệnh tiểu đường loại có nguy tiến triển thành tiểu đường loại 2, đột quỵ bệnh tim Đặc biệt bệnh nhân tiểu đường loại không tiêm insulin ngày không sống Hiện với công nghệ sản xuất insulin từ tế bào E.coli, bệnh nhân tiểu đường khơng cịn phải lo lắng nguồn insulin thể thiếu hay khơng tổng hợp Khoa học kỹ thuật phát triển cụ thể công nghệ sinh học giúp người kéo dài thêm tuổi thọ điều trị nhiều bệnh hiểm nghèo Tuy nhiên số lượng người mắc bệnh tiểu đường có khuynh hướng gia tăng, nên cần nghiên cứu thêm công nghệ sản xuất insulin từ tế bào gốc khác để đa dạng hóa nguồn insulin giúp người điều trị dứt bệnh tiểu đường Đồng thời kỹ thuật tái tổ hợp DNA ngày phát triển nên khơng insulin người cịn sản xuất nhiều kháng sinh hormone thay khác mà thể không tổng hợp để cải thiện sức khỏe người 15 ... cầu nối disulfur, chuyển proinsulin thành insulin Công nghệ sản xuất insulin từ E.coli Hình Sản xuất insulin tái tổ hợp vi khuẩn Hiện nay, hầu hết phương pháp sản xuất insulin thương mại dựa chủng... để phân cắt proinsulin Khi sản phẩm thu có hoạt tính cần thiết Hỗn hợp tinh cịn có insulin 13 Cơng nghệ sản xuất insulin từ E.coli Hình 8: Hoạt hóa proinsulin thành insulin Cuối insulin tinh thể... mặt insulin, q trình tổng hợp glycogen bị dừng lại enzym phân huỷ glycogen hoạt động Insulin ngăn cản lượng đường cao máu nên khơng có q nhiều insulin, enzym insulinase kiểm soát mức độ insulin