TỔNG QUAN
Tổng quan về bất thường sinh sản
Bất thường sinh sản bao gồm vô sinh và các vấn đề thai sản, thường biểu hiện qua nhiều dạng bệnh lý như sẩy thai sớm, sẩy thai muộn, thai chết lưu, thai trứng, chửa ngoài tử cung, thai chậm phát triển trong tử cung, đẻ non, sơ sinh nhẹ cân, thai già tháng, dị tật bẩm sinh và chết sơ sinh.
1.1.1 Vô sinh Định nghĩa: Vô sinh là bệnh của hệ thống sinh dục nam hoặc nữ được xác định là không đạt dược mục đích mang thai sau 12 tháng quan hệ tình dục thường xuyên không được bảo vệ 19
Vô sinh nam chiếm khoảng 20% trường hợp vô sinh ở các cặp vợ chồng Nguyên nhân gây vô sinh ở nam giới thường chưa được nghiên cứu đầy đủ, và xét nghiệm tinh dịch đồ là phương pháp chủ yếu để đánh giá khả năng sinh sản của nam.
Vô sinh nữ được chia làm 2 nhóm: nguyên phát và thứ phát: 20
Vô sinh nguyên phát (vô sinh I) là tình trạng khi hai vợ chồng chưa từng có thai, mặc dù họ đã sống chung với nhau hơn một năm và không sử dụng biện pháp tránh thai nào.
Vô sinh thứ phát, hay còn gọi là vô sinh II, xảy ra khi một cặp vợ chồng đã từng có con hoặc đã từng mang thai nhưng hiện tại không thể có thai lại Tình trạng này được xác định khi họ sống chung với nhau trong hơn một năm mà không áp dụng biện pháp tránh thai nào.
1.1.2 Các bất thường thai sản
Sẩy thai là hiện tượng kết thúc thai nghén một cách tự nhiên trước khi thai nhi có thể sống bên ngoài tử cung, thường được định nghĩa là trường hợp thai bị tống ra khỏi buồng tử cung trước 22 tuần hoặc có trọng lượng dưới 500 gram Theo Tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG), sẩy thai xảy ra khi thai nhi chưa đạt đến độ tuổi sống độc lập Tại Việt Nam, Bộ Y tế cũng công nhận định nghĩa này, nhấn mạnh rằng sẩy thai là sự trục xuất thai và rau trước 22 tuần kể từ ngày đầu của kỳ kinh cuối.
Sẩy thai được chia ra các thể lâm sàng như sau: 23
- Sẩy thai hoàn toàn: người bệnh có dấu hiệu của có thai và đã sẩy hoàn toàn ra ngoài Siêu âm buồng tử cung sạch
Sẩy thai không hoàn toàn là tình trạng khi người bệnh có dấu hiệu mang thai nhưng đang trong quá trình sẩy thai Sau khi thai ra, bệnh nhân vẫn cảm thấy đau bụng và có hiện tượng ra máu kéo dài Khi khám, cổ tử cung có dấu hiệu mở và tử cung vẫn còn lớn Kết quả siêu âm cho thấy hình ảnh âm vang không đồng nhất trong buồng tử cung.
Sẩy thai đã chết là tình trạng khi người bệnh có dấu hiệu mang thai nhưng không còn sự sống của thai nhi Các triệu chứng bao gồm giảm triệu chứng nghén, ra máu đen kéo dài, và khi khám, tử cung nhỏ hơn so với tuổi thai Siêu âm có thể cho thấy hình ảnh túi ối méo mó, không có âm vang phôi hoặc có phôi nhưng không thấy hoạt động của tim thai Ngoài ra, người bệnh cũng có thể gặp dấu hiệu của dọa sẩy thai, đang sẩy thai, hoặc sẩy thai hoàn toàn hay không hoàn toàn.
Sẩy thai liên tiếp là hiện tượng xảy ra khi một phụ nữ trải qua từ hai lần sẩy thai trở lên, với thai nhi bị tống xuất khỏi buồng tử cung trước tuần thứ 22 Nguy cơ sẩy thai có thể thay đổi tùy thuộc vào số lần sẩy thai trước đó, tình trạng đã từng sinh con khỏe mạnh hay có con bị dị tật.
Thai chết lưu được hiểu khác nhau tùy theo quốc gia, chủ yếu dựa vào quy định về thời gian mang thai và trọng lượng của thai nhi.
Theo TCYTTG, thai chết lưu được định nghĩa là tình trạng thai nhi không còn sự sống trước khi được sinh ra hoàn toàn, không phụ thuộc vào thời gian mang thai Để chẩn đoán thai chết lưu, cần dựa vào ba tiêu chuẩn chính: trọng lượng thai, tuổi thai và chiều dài cơ thể thai TCYTTG phân loại thai chết lưu thành hai nhóm: thai chết lưu sớm, với trọng lượng tối thiểu 500 gram, tuổi thai từ 22 tuần trở lên và chiều dài thai tối thiểu 25 cm; và thai chết lưu muộn, với trọng lượng từ 1000 gram trở lên.
28 tuần tuổi và chiều dài cơ thể ≥ 35cm 23
Theo Nguyễn Đức Hinh và cộng sự năm 2013 24 và theo hướng dẫn của
Bộ Y tế đã ban hành hướng dẫn chẩn đoán và điều trị các bệnh sản phụ khoa, đặc biệt là thai chết lưu trong tử cung Thai chết lưu được xác định là tất cả các trường hợp thai nhi đã chết nhưng vẫn còn lưu lại trong buồng tử cung.
Trong vòng 48 giờ, các định nghĩa pháp lý về thai chết lưu ở các quốc gia có sự khác biệt lớn, thường yêu cầu ghi nhận thai chết lưu ở những độ tuổi thai nhất định như 12, 16, 20 hoặc 22 tuần Điều này ảnh hưởng đến khả năng chăm sóc sơ sinh và các mục đích so sánh trong nghiên cứu.
Tại Hoa Kỳ, các tiểu bang có nhiều định nghĩa khác nhau về thai chết lưu dựa trên tuổi thai (24, 26 hoặc 28 tuần) và cân nặng (350, 400, 500 hoặc 1000 gram) Hầu hết các tiểu bang quy định thai chết lưu bắt đầu từ tuần thứ 20 và trọng lượng từ 350 gram trở lên, trong khi một số tiểu bang ghi nhận thai chết lưu ở tất cả các giai đoạn của thai kỳ.
Bảng 1.1 Quy định về thai chết lưu ở một số nước
Nước Tuổi thai Trọng lượng thai Đức 27 Không quy định ≥ 500 gam
Na Uy 28 ≥ 12 tuần Không quy định
Hà Lan 27 ≥ 16 tuần Không quy định Úc 28 ≥ 20 tuần Hoặc ≥ 400 gam
Hungary 27 ≥ 24 tuần Hoặc ≥ 500 gam Ý 27 ≥ 180 ngày Không quy định
Tây Ban Nha 27 ≥ 26 tuần Không quy định
Thụy Điển 27 ≥ 28 tuần Không quy định
Thai chết lưu được chia làm 2 nhóm: 22
Thai chết lưu dưới 20 tuần thường không có triệu chứng rõ ràng, dẫn đến việc phát hiện muộn Nhiều trường hợp, người bệnh chỉ nhận thấy bụng không lớn lên hoặc có dấu hiệu bé đi, mặc dù đã mất kinh một thời gian dài.
- Bệnh cảnh lâm sàng hay gặp:
+ Người bệnh đã có dấu hiệu của có thai như chậm kinh, hCG dương tính, siêu âm đã thấy có thai và hoạt động của tim thai
Vai trò của homocystein, folat và đa hình gen MTHFR
Hcy, hay homocystein, là một acid amin chứa lưu huỳnh, được hình thành trong quá trình chuyển hóa methionin (Met) thành cystein (Cys) Hcy có cấu trúc tương tự như Cys nhưng có thêm một nhóm methylen Hcy có thể được tái chuyển hóa thành Met hoặc chuyển đổi thành Cys nhờ vào sự hỗ trợ của một số loại vitamin nhóm B.
1.2.1.1 Cấu trúc phân tử của homocystein
Công thức hóa học là C4H9NO2S, trọng lượng phân tử 135,181 g/mol Hcy tồn tại ở dạng pH trung tính
Hình 1.1: Cấu trúc 2 và 3 chiều của Homocystein
Công thức hóa học C4H9NO2S bao gồm 17 nguyên tử, với cấu trúc hóa học phức tạp Nó chứa 7 liên kết không phải H, 1 liên kết đa nguyên tử, 3 liên kết xoay, 1 liên kết đôi, 1 nhóm cacboxylic acid, 1 amin bậc một, 1 nhóm hydroxyl và 1 liên kết thiol.
Homocystein được chuyển hóa chủ yếu ở gan và thận, chỉ có khoảng 1% được lọc qua cầu thận ra nước tiểu 61 Hcy toàn phần trong huyết thanh bao gồm: 62
+ Homocystein tự do: chiếm khoảng 1%
+ Homocystein kết hợp: 2 phân tử Hcy liên kết với nhau bởi cầu nối disulfua (Homocystein – Homocystein), chiếm 5-10%
Homocysteine can be metabolized through three pathways: it can be converted into methionine via the remethylation pathway, transformed into cysteine through the transsulfuration pathway, or it can be converted into homocysteine thiolactone (HTL).
S-Adenosylmethionin (SAM) là chất điều hòa quan trọng trong cả hai con đường chuyển hóa homocysteine (Hcy) Khi nồng độ methionin thấp, mức SAM giảm, dẫn đến việc Hcy chuyển trực tiếp sang con đường tái methyl hóa để tạo ra methionin nhờ enzym methionine synthetase (MS), với vitamin B12 làm cofactor Phản ứng này sử dụng methyltetrahydrofolat (methylTHF) làm cơ chất, được tạo ra dưới tác dụng của enzym Methyltetrahydrofolate reductase (MTHFR), enzym này có ảnh hưởng mạnh mẽ đến quá trình tái gắn methyl của Hcy.
Sơ đồ 1.1 Chuyển hóa của homocystein 63
Khi nồng độ SAM cao, Hcy được chuyển hóa thành cystathionin và cystein qua hai phản ứng cần vitamin B6 Nghiên cứu trên chuột cho thấy SAM vừa ức chế MTHFR vừa kích thích enzym cystathionine beta synthetase (CBS).
1.2.1.3 Cơ chế gây xơ vữa động mạch, huyết khối của homocystein
Tăng nồng độ homocystein và stress oxy hoá
Hình 1.2: Cơ chế stress oxy hóa của Hcy Nguồn (http://www.lipidworld.com/content/5/1/1)
Hcy có khả năng tạo ra các loại oxy phản ứng, dẫn đến stress oxy hóa Sự hiện diện của nhóm thiol trong Hcy cho phép nó tự oxy hóa nhanh chóng trong tuần hoàn nhờ vào crruloplasmin, một protein gắn đồng có trong huyết thanh, tạo ra Hcy và hydrogen peroxide (H2O2) Hcy cũng có thể làm giảm hoạt tính của các enzym chống oxy hóa như glutathion peroxidase (GPx) và superoxide dismutase (SOD), từ đó gián tiếp gây ra stress oxy hóa Stress oxy hóa liên quan đến Hcy chủ yếu do tế bào giảm khả năng khử độc H2O2 và các peroxides lipid khác, dẫn đến sự gia tăng biểu hiện của các cytokine tiền viêm và PAI1, góp phần vào các bệnh mạch máu.
Tăng homocystein máu và chuỗi phản ứng đông máu
Hình 1.3: Nồng độ homocystein và con đường đông máu
Nguồn:(http://www.lipidworld.com/content/5/1/1)
Trong tổn thương mạch, yếu tố mô, một glycoprotein gắn màng liên quan đến phospholipid, tạo phức hợp 1:1 với yếu tố VII, khởi động chuỗi phản ứng đông máu Nồng độ Hcy tăng có thể làm tăng hoạt tính tiền đông máu và hoạt tính yếu tố mô tế bào Hcy cũng có khả năng gắn nhanh vào yếu tố V, gây lỗi bất hoạt Va do protein C đã hoạt hoá (APC) APC, một protein phụ thuộc vitamin K, được hình thành từ hoạt động của thrombin với protein C trong sự hiện diện của thrombomodulin Đồng thời, Hcy ức chế hoạt tính cofactor của thrombomodulin, làm suy yếu con đường chống đông thrombomodulin-APC, dẫn đến giảm hình thành APC và ức chế sự bất hoạt yếu tố Va.
Thrombin tương tác với yếu tố Va thông qua APC, trong khi Hcy ảnh hưởng đến cơ chế chống đông nội mô bằng cách tác động lên glycosaminoglycans-antithrombin III giống như heparin Hcy làm giảm khả năng gắn màng của yếu tố hoạt hoá plasminogen mô và tăng cường biểu hiện gen ức chế yếu tố hoạt hoá PAI-1 từ tế bào nội mô và cơ trơn, thông qua cơ chế không phụ thuộc vào TGFβ và TNFα Do đó, nồng độ Hcy tăng cao có thể dẫn đến huyết khối do gia tăng các con đường tiền đông máu và/hoặc ức chế các con đường chống đông.
Tăng homocystein máu và xơ vữa động mạch
Khi nồng độ Hcy tăng cao có thể gây xơ vữa động mạch thông qua các cơ chế: 14
- Hcy gây ra rối loạn tổng hợp cholesterol làm tăng cholesterol máu
Hcy ảnh hưởng đến sự biểu hiện của lipoprotein lipase (LPL) và Lox-1, góp phần vào quá trình xơ vữa động mạch Cụ thể, Hcy tác động đến mức độ phiên mã và dịch mã của LPL trong đại thực bào thông qua cơ chế hoạt hóa protein kinase C (PKC).
Hcy điều chỉnh hoạt động của các gen liên quan đến phản ứng viêm trong tế bào nội mô Trong các tế bào này, các cytokine tiền viêm làm tăng cường sự liên kết của NF-κB với DNA, dẫn đến việc tăng cường điều hòa các gen phụ thuộc vào NF-κB.
- Hcy gây kích thích biểu hiện của MCP-1, VCAM-1 và LOX-1 gây tăng huyết áp, tăng angiotensin II và xơ vữa động mạch
Hcy làm tăng tổng hợp và tích tụ collagen trong tế bào cơ trơn, và một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng Hcy có vai trò là yếu tố gây phân bào cho tế bào cơ trơn động mạch Collagen, một thành phần quan trọng của hệ thống protein ngoại bào, được biết đến là yếu tố chính trong sự hình thành mảng xơ vữa.
Hình 1.4 Cơ chế gây xơ vữa động mạch của homocystein 14
Lớp nội mạc đóng vai trò quan trọng trong việc duy trì cân bằng nội môi mạch máu và cung cấp máu cho mô Homocysteine (Hcy) gây xơ vữa động mạch bằng cách làm tổn thương nội mô, dẫn đến rối loạn khả năng bám dính của bạch cầu và tiểu cầu, hình thành huyết khối, tăng sinh cơ trơn, co thắt mạch, và tích lũy lipid, cuối cùng tạo thành mảng xơ vữa.
Tổn thương nội mô liên quan đến cơ chế oxy hóa của Hcy đã được Wall RT 68 nghiên cứu Sự tự oxy hóa của Hcy được xác nhận qua việc giảm oxy hóa khi bổ sung catalase 69 Hcy không chỉ gây tổn thương trực tiếp cho cơ chất mạch máu mà còn ảnh hưởng đến chức năng sinh tổng hợp tế bào mạch máu Hcy thiolacton, với khả năng phản ứng mạnh với các sản phẩm oxy hóa Hcy, kết hợp với lipoprotein trọng lượng thấp, tạo thành hỗn hợp thu hút thực bào màng nội mạc và hình thành tế bào bọt trong mảng xơ vữa mới 70
Folat là một vitamin nhóm B tan trong nước, còn được gọi là vitamin
B9, hay còn gọi là folacin, là một vitamin quan trọng tồn tại dưới nhiều dạng hóa học Folat tự nhiên có mặt trong thực phẩm và các quá trình trao đổi chất trong cơ thể, trong khi acid folic là dạng tổng hợp chủ yếu có trong thực phẩm bổ sung Các dạng tổng hợp khác bao gồm acid folinic và acid levomefolic Acid folic không có hoạt tính sinh học cho đến khi được chuyển hóa thành folat Folat được hấp thụ dễ dàng ở ruột non, trong khi việc hấp thụ acid folic cần có enzym reductase dihydrofolate, một enzym khá hiếm trong cơ thể.
Cấu trúc phân tử: C19H19N7O6, trọng lượng phân tử: 441,404 g/mol
Hình 1.5 Các dạng cấu trúc của acid folic 71 1.2.2.2 Chuyển hóa của folat trong cơ thể
Quá trình sinh tổng hợp và chuyển hóa của folat
Folat là vitamin thiết yếu cho cơ thể, được hấp thu từ thực phẩm giàu folat như rau sẫm màu và trái cây như súp lơ xanh, rau chân vịt, măng tây, khoai tây, bơ, cam, bưởi, lòng đỏ trứng, gan, thịt gà và ngũ cốc nguyên hạt Khi vào cơ thể, folat được hấp thu tại tá tràng và hỗng tràng nhờ vào vi khuẩn trong môi trường acid Để hấp thu qua ruột, folat cần các chất mang như chất vận chuyển folat gắn cặp với proton (PCFT) và chất mang folat dạng khử (RFC).
Các phương pháp định lượng nồng độ homocystein, folat và xác định đa hình gen MTHFR
1.3.1 Các phương pháp định lượng nồng độ Hcy
- Phương pháp miễn dịch hóa phát quang (CMIA)
- Phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang (ECLIA)
- Phương pháp sắc kí lỏng khối phổ (LC-MS/MS)
1.3.1.1 Phương pháp miễn dịch hóa phát quang
- Nguyên lý: dựa trên phương pháp định lượng miễn dịch vi hạt CMIA
Khi kết hợp với một thuốc thử kích hoạt, chất đánh dấu hóa phát quang sẽ tạo ra ánh sáng
Dưới tác động của enzym, Hcy kết hợp chuyển đổi thành Hcy tự do, hay S-adenosyl homocystein (SAH) Kháng thể đơn dòng chống SAH gắn với acridinium sẽ cạnh tranh với SAH tại vị trí kết hợp đặc hiệu S-adenosyl cystein trong mẫu bệnh phẩm Sau khi rửa và tách bằng từ tính, dung dịch kích hoạt và tiền kích hoạt được thêm vào hỗn hợp phản ứng để tăng cường độ phát quang Hàm lượng Hcy trong mẫu bệnh phẩm được biểu thị bằng đơn vị phát quang tương ứng - RLUs (Relative light units).
- Xét nghiệm Hcy có thể được tiến hành tự động trên hệ thống máy miễn dịch của Abbott hoặc Siemens
1.3.1.2 Phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang
Nguyên lý xét nghiệm nồng độ Hcy huyết thanh dựa trên chu trình enzym mới, trong đó đánh giá sản phẩm chuyển đổi thay vì đồng cơ chất Hcy Hcy bị oxy hóa được khử thành Hcy tự do và phản ứng với SAM để tạo methionin và SAH, qua sự xúc tác của Hcy S-methyltransferase SAH được ước lượng thông qua phản ứng enzym, nơi SAH bị thủy phân thành adenosine và Hcy bởi SAH hydrolase Hcy tiếp tục tham gia vào chu trình phản ứng để tạo ra tín hiệu phát hiện Adenosine sau đó bị thủy phân thành inosine và ammonia, và cuối cùng, enzym glutamate dehydrogenase xúc tác phản ứng giữa ammonia và 2-oxoglutarate cùng NADH để tạo NAD+ Nồng độ Hcy trong mẫu tỷ lệ thuận với lượng NADH chuyển hóa thành NAD+ (ΔA340 nm).
Xét nghiệm được thực hiện trên hệ thống máy miễn dịch tự động của Roche bao gồm các modul E802, E601, E411…
1.3.1.3 Phương pháp sắc kí lỏng khối phổ
Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-MS) là một kỹ thuật nghiên cứu các chất bằng cách đo và phân tích khối lượng phân tử chính xác Phương pháp này dựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hoặc ion phân tử trong một điện trường hoặc từ trường nhất định Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) đóng vai trò quan trọng trong chuyển động của các ion Khi biết điện tích của ion, việc xác định khối lượng của ion trở nên dễ dàng hơn.
Trong nghiên cứu khối phổ, chất cần được chuyển sang trạng thái bay hơi và ion hóa bằng phương pháp phù hợp Các ion tạo thành sau đó được phân tích trong máy khối phổ Tùy thuộc vào loại điện tích của ion, người ta sẽ chọn kiểu quét ion dương (+) hoặc âm (-) Kiểu quét ion dương thường cung cấp nhiều thông tin hơn và vì vậy được sử dụng phổ biến hơn.
Sau khi mẫu được tách trong hệ thống sắc ký lỏng, nó sẽ được dẫn đến đầu dò MS, nơi diễn ra quá trình ion hóa trong buồng API bằng các phương pháp ESI, APCI hoặc APPI Ion được tạo ra sẽ được tập trung và gia tốc qua hệ quang học ion trước khi vào bộ phân tích khối Tại đây, tứ cực thứ nhất chọn ion mẹ có m/z xác định, các phân mảnh của ion này được tạo ra trong buồng va chạm nhờ tương tác với khí trơ và được phân tích bởi tứ cực thứ ba, tạo ra tín hiệu đặc trưng tại bộ phận phát hiện ion.
1.3.2 Các phương pháp xét nghiệm folat
- Phương pháp miễn dịch hóa phát quang
- Phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang
- Phương pháp sắc kí lỏng khối phổ
1.3.2.1 Phương pháp miễn dịch hóa phát quang
Xét nghiệm Architect folat là một phương pháp miễn dịch hai bước sử dụng công nghệ CMIA để định lượng folat trong huyết thanh Quy trình này bao gồm việc tiền xử lý mẫu để giải phóng folat từ protein liên kết, sau đó cho mẫu vào RV thứ ba và thêm Folat Binding Protein (FBP) phủ vi hạt Folat trong mẫu sẽ gắn với các vi hạt này, và sau khi rửa, pteroic acid có đánh dấu acridinium được thêm vào để gắn với các vị trí còn trống Cuối cùng, dung dịch Pre-Trigger và Trigger Solutions được thêm vào, tạo ra phản ứng hóa phát quang được đo bằng đơn vị ánh sáng tương đối (RLUs), cho phép phát hiện tỉ lệ nghịch giữa lượng folat và RLUs bởi bộ phận quang học trong máy miễn dịch.
Xét nghiệm folat được tiến hành tự động trên hệ thống máy miễn dịch của Abbott hoặc Siemens
1.3.2.2 Phương pháp miễn dịch điện hóa phát quang
Nguyên lý xét nghiệm dựa trên miễn dịch cạnh tranh, trong đó mẫu bệnh phẩm trải qua ba bước ủ: đầu tiên, ủ với chất tiền xử lý để giải phóng folat gắn protein; tiếp theo, ủ với protein gắn kết folat đánh dấu ruthenium; cuối cùng, ủ với vi hạt phủ streptavidin và folat đánh dấu biotin để hình thành phức hợp Phức hợp này gắn kết với pha rắn nhờ tương tác giữa biotin và streptavidin Hỗn hợp phản ứng sau đó được chuyển đến buồng đo, nơi các vi hạt đối từ được giữ lại trên bề mặt điện cực, còn các thành phần không gắn kết sẽ bị thải ra ngoài bởi dung dịch ProCell/ProCell M Khi điện áp được áp vào điện cực, sự phát quang hóa học sẽ được tạo ra và đo bằng bộ khuếch đại quang tử.
Xét nghiệm được thực hiện trên hệ thống miễn dịch tự động của Roche bao gồm các modul E802, E601, E411…
1.3.2.3 Phương pháp sắc kí lỏng khối phổ
Nguyên lý xét nghiệm folat sử dụng phương pháp sắc ký lỏng khối phổ tương tự như xét nghiệm Hcy Kết quả đo được dựa trên phổ khối của từng chất, với tín hiệu ion của chất cần phân tích được ghi nhận qua phần mềm Dữ liệu được phân tích bằng phần mềm nhằm đọc kết quả định lượng cho từng chất.
1.3.3 Các phương pháp phát hiện đa hình gen MTHFR
Phản ứng Realtime PCR được thực hiện trong máy gia nhiệt, chiếu sáng mỗi mẫu bằng chùm ánh sáng có bước sóng xác định Máy PCR cũng xác định bước sóng phát ra từ phân tử phát huỳnh quang trong ống PCR, cho phép nhận diện tín hiệu huỳnh quang thay đổi sau mỗi chu kỳ do số lượng DNA tổng hợp tăng lên Do đó, lượng sản phẩm DNA thu được sau phản ứng có thể được tính toán Real time PCR bao gồm hai quá trình đồng thời: nhân bản DNA qua phản ứng PCR và đo độ phát huỳnh quang tỷ lệ với số đoạn DNA tạo thành Kết quả phản ứng Real-time PCR được thể hiện qua biểu đồ khuếch đại, gồm ba giai đoạn.
Giai đoạn ủ là thời kỳ mà tín hiệu huỳnh quang được tích lũy nhưng chưa đủ để thiết bị nhận biết, với nồng độ ở mức 0 và thể hiện dưới dạng một đường thẳng (đường nền) Thời gian của giai đoạn này thường kéo dài từ 3 đến 20 chu kỳ đầu.
Giai đoạn lũy thừa là thời điểm tín hiệu huỳnh quang tăng vọt, vượt qua đường ngưỡng do sự gia tăng nhanh chóng của các bản sao Khoảnh khắc này, khi số lượng bản sao vượt qua ngưỡng, được gọi là chu kỳ ngưỡng (Ct) Chu kỳ ngưỡng đóng vai trò quan trọng trong việc đánh giá mức độ sao chép của gen MTHFR cần được phát hiện.
Giai đoạn bình nguyên trong quá trình PCR xảy ra khi nồng độ bản sao đã đạt đến mức bão hòa, khiến cho đồ thị không còn tăng lên nữa Nguyên nhân là do enzym Taq polymerase ngừng hoạt động và lượng dNTP đã cạn kiệt.
Quy trình thực hiện kỹ thuật realtime PCR tuân theo nguyên tắc của phản ứng tổng hợp chuỗi, nhưng điểm khác biệt chính là khả năng phát hiện đoạn DNA được nhân lên tại mỗi thời điểm của phản ứng Nhờ đó, realtime PCR có độ nhạy và độ đặc hiệu cao hơn so với phương pháp PCR thông thường, đồng thời cho phép định lượng chính xác số bản sao được nhân lên trong các chu kỳ phản ứng.
Nguyên lý của phương pháp sequencing dựa trên kỹ thuật "chain termination" sử dụng deoxy nucleotide đã chỉnh sửa, làm mất nhóm hydroxyl ở đầu 3’ của phân tử đường Nhóm 3’-OH cho phép gắn thêm nucleotide mới vào chuỗi, nhưng khi ddNTP được thêm vào, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại do không có nhóm 3’-OH Enzym polymerase xúc tác phản ứng gắn dNTP vào mạch đơn của DNA, kéo dài mạch tại vị trí 3’-OH và dừng lại khi gắn ddNTP Kỹ thuật giải trình tự DNA tự động (Dye termination sequencing) sử dụng dNTP có đánh dấu huỳnh quang, mỗi loại dNTP được gán màu sắc với bước sóng phát xạ khác nhau, cho phép thực hiện giải trình tự trong một phản ứng duy nhất.
Nguyên tắc hoạt động của máy điện di dựa vào việc khi vạch điện di đi qua chùm tia laser, nó sẽ phát sáng và được camera ghi nhận Những tín hiệu này được lưu lại dưới dạng cường độ đỉnh sáng trên biểu đồ Từ biểu đồ các đỉnh cường độ sáng, máy so sánh và phân tích dòng của các đỉnh tương ứng để xác định trình tự của đoạn DNA.
Các nghiên cứu về mối liên quan giữa homocystein, folat và đa hình gen
1.4.1 Các nghiên cứu về mối liên quan giữa nồng độ homocystein, folat huyết thanh và đa hình gen MTHFR ở người khỏe mạnh Để khảo sát mối liên quan giữa nồng độ Hcy, folat huyết thanh và đa hình gen MTHFR đã có nhiều nghiên cứu đã báo cáo về sự liên quan này trong cộng đồng làm cơ sở cho những nghiên cứu trên các bệnh lý khác nhau
Nghiên cứu của Alessio và cộng sự 91 chỉ ra rằng các đa hình 677T và A1298C ở gen MTHFR có mối liên quan đáng kể đến sự gia tăng nồng độ Hcy huyết thanh Tuy nhiên, nồng độ folat không có sự khác biệt rõ rệt giữa các nhóm đa hình Điều này cho thấy yếu tố di truyền từ gen MTHFR có ảnh hưởng đến nồng độ Hcy mà không liên quan đến mức folat trong huyết thanh.
Nghiên cứu của Yang và cộng sự năm 2008 (n=6793) chỉ ra rằng những người mang đa hình MTHFR có nồng độ Hcy huyết thanh cao hơn và mức folat huyết thanh thấp hơn so với nhóm không mang đa hình Cụ thể, người mang đa hình gen MTHFR (C677T) có mức folat huyết thanh thấp hơn 22% và nồng độ Hcy cao hơn 25,7% so với kiểu gen CC Nghiên cứu cũng khẳng định rằng việc bổ sung acid folic giúp giảm nồng độ Hcy trong nhóm người mang đa hình gen MTHFR (p
