TỔNG QUAN
Dược liệu rễ Ba kích (Radix Morindae officinalis)
1.1.1 V ị trí phân lo ạ i c ủ a Ba kích
Theo “Cẩm nang tra cứu và nhận biết các họ thực vật hạt kín (Magnoliophyta,
Angiospermae) ở Việt Nam” [1] và các tài liệu phân loại thực vật khác: Hệ thống của
Takhtajan năm 2009 [79] và hệ thống APG II [55], vị trí phân loại chi Morinda trong giới thực vật được trình bày trong Bảng 1.1
B ả ng 1.1 Vị trí phân loại của chi Morinda
Phân giới Cormobionta (Thực vật bậc cao)
Ngành Magnoliophyta (Ngành Ngọc lan)
Lớp Magnoliopsida (Lớp Ngọc lan)
Phân lớp Lamiidae (Phân lớp Bạc hà)
Bộ Gentianales (Bộ Long đởm)
Họ Rubiaceae (Họ Cà phê)
Tên khoa học: Morinda officinalis How, họ Cà phê Rubiaceae
Tên gọi khác: Ba kích thiên, Ruột gà, Chẩu phóng xì (Hải Ninh), Thao tày cáy (Tày), Ba kích nhục, Liên châu Ba kích [10]
Cây dây leo có thân cuốn dài từ 3 - 5m, với rễ phình to thành củ hình trụ, mập và vặn vẹo Củ thường có các đốt dài từ 1 - 3 cm, giống như ruột gà, với vỏ ngoài màu hồng nhạt và thịt màu hồng, tím hoặc trắng Bề mặt vỏ có nhiều vân dọc, vỏ nạc và bên trong có lõi cứng với tỷ lệ khác nhau so với đường kính củ.
Thân hình tròn với nhiều cành nhỏ mọc chằng chịt, có thân non nhẵn và phủ lông ngắn-cứng hoặc lông dài Màu sắc của thân có thể là xanh, tím đậm hoặc tím nhạt, sau đó chuyển từ màu xanh sang nâu khi trưởng thành.
Lá đơn, mọc đối, có phiến lá hình mác hoặc bầu dục thuôn nhọn với gốc lá hơi lệch, nhọn, tròn hoặc hơi hình tim Mép lá phẳng hoặc lượn sóng, mặt sau hơi uốn; ngọn lá có thể tròn hoặc nhọn, mặt trên nhẵn hoặc phủ lông dài, trong khi mặt dưới nhẵn hoặc cũng phủ lông Lá non có màu tím, sau đó chuyển sang xanh và có thể có hoặc không có hốc Domatia giữa gân chính và phụ với lớp lông Gân lá hình lông chim, gồm 4 - 9 cặp gân bên, nổi lên ở mặt dưới và lõm ở mặt trên, trong khi gân chính có thể có lông hoặc nhẵn ở mặt dưới Lá kèm dính nhau, ôm lấy thân, mỏng và mỗi lá có 2 thùy nhọn hoặc hàn liền ở dưới, trên chia thành 2 thùy, dài từ 2 cm trở lên.
4 mm, màu trắng, nâu hay tím nhạt, ôm sát vào thân, dài 4 mm [4]
Cụm hoa dạng tán có từ 1-8 tán ở nách lá hoặc đầu cành, mỗi tán chứa 1-14 hoa nhỏ Hoa mới nở có màu trắng, sau đó chuyển sang vàng hoặc tím đen Đài hoa có 3-4 lá, hơi dính nhau ở dưới, có thể đều hoặc không đều Tràng hoa cũng có 3-4 lá, phần móng dính nhau tạo thành ống hình chum hoặc hình trụ, bề mặt nhẵn hoặc phủ lông Phần phiến rời, hình tam giác, với mặt ngoài nhẵn hoặc phủ lông và mặt trong có vòng lông dày đặc, màu trắng Quả hình cầu, từ 1-8 quả trên mỗi tán, có thể rời hoặc dính với nhau thành quả kép Bề mặt quả nhẵn hoặc phủ lông, xanh khi non và chuyển sang màu cam khi chín, với 3 đài còn lại trên đỉnh quả có hình dạng và kích thước không đều.
1.1.3 Phân b ố , thu hái, ch ế bi ế n
Cây mọc hoang thường thấy ở ven rừng, phân bố rộng rãi tại vùng đồi núi thấp của miền núi và trung du ở các tỉnh phía Bắc như Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Phú Thọ, Bắc Ninh và Bắc Giang, cũng như một số tỉnh miền Trung và Tây Nguyên như Quảng Nam, Gia Lai và Kon Tum.
- Thời gian thu hoạch thường vào tháng 10-11, cũng có thể vào mùa xuân để tận dụng lấy giống trồng ngay [4], [5], [10]
- Bộ phận dùng: Rễ (Radix Morindae) [5], [10]
Rễ được rửa sạch đất cát, loại bỏ rễ con và phơi khô cho đến khi không còn dính tay Sau đó, đập nhẹ để làm bẹp và tiếp tục phơi hoặc sấy nhẹ cho đến khi khô hoàn toàn.
Một số nhóm chất trong rễ Ba kích gồm:
- Iridoid: Monotropein (0,042%), acid desacetyl asperulosidic (0,0038%), asperulosid (0,0003%), morindolid (0,0002%) , morofficinalosid (0,0001%), acid asperulosidic (0,0001%) [91]
- Oligosaccharid: Nystose ( 3,0%) [21], l-borneol-6-o-β-D-apiosyl-β-D- glucosid (0,0001%) [91], 1F-fructofuranosylnystose, inulin-type hexasaccharid, heptasaccharid [19], [59], [94]
- Ngoài ra còn có 6 hợp chất Anthraquinon [58], [89], [91], [93]; 2 hợp chất sterol; 1 hợp chất saponintriterpen (acid rotugenic 0,0007%) [91], một hợp chất lacton
[91], [94], và một số acid amin [16], [19]
Theo Đông y, Ba kích là một vị thuốc có vị cay ngọt, tính hơi ôn, có tác dụng quy kinh thận Nó giúp ôn thận, trợ dương, mạnh gân cốt và khử phong thấp.
Dịch chiết Ba kích có một số tác dụng đã được chứng minh như: Chống viêm (nhóm chất iridoid) [35], chống loãng xương (nhóm chất iridoid và anthraquinon)
[27], [96], tăng cường miễn dịch hệ tiêu hoá (nhóm oligosaccharid) [72], tác dụng bảo vệ ADN của tinh trùng người (nhóm oligosaccharid) [45], tác dụng chống trầm cảm (nhóm oligosaccharid) [17]…
1.1.6 Tiêu chu ẩ n ch ất lượ ng dượ c li ệ u r ễ Ba kích
Dược điển Trung Quốc 2015, Bộ tiêu chuẩn dược liệu của Hồng Kông và Dược điển Việt Nam V đều có chuyên luận về rễ Ba kích Các chỉ tiêu kiểm tra chất lượng của dược liệu này được tóm tắt trong Bảng 1.2.
B ả ng 1.2 Tóm tắt chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển
Bộ tiêu chuẩn dược liệu Hồng Kông [47]
5 Hàm lượng nước/độ ẩm 13,0% 15,0% 12,0%
7 Chất chiết được 50% (chiết lạnh)
Ghi chú: (+): Có chỉ tiêu; (-): Không có chỉ tiêu
Theo Dược điển Việt Nam V, chuyên luận về dược liệu rễ Ba kích hiện vẫn còn đơn giản và chưa được tiêu chuẩn hóa về mặt hóa học Điều này cũng được ghi nhận trong Dược điển Trung Quốc.
Bộ tiêu chuẩn dược liệu của Hồng Kông kiểm soát hoạt chất có dược liệu rễ Ba kích dựa vào hàm lượng nystose [37], [47]
Monotropein và nystose là hai hợp chất chính trong rễ Ba kích, thuộc nhóm iridorid và oligosaccharid, có tác dụng dược lý quan trọng Nystose đã được xác định là "marker" của dược liệu này tại Trung Quốc và Hồng Kông Do đó, để đảm bảo chất lượng rễ Ba kích, cần kiểm soát hàm lượng của hai hợp chất monotropein và nystose.
Việc bổ sung chỉ tiêu định tính và định lượng cho hai "marker" monotropein và nystose vào chuyên luận dược liệu rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam là rất cần thiết Do đó, xây dựng phương pháp định tính và định lượng cũng như thiết lập hai chất chuẩn này từ dược liệu rễ Ba kích của Việt Nam sẽ góp phần nâng cao chất lượng và độ tin cậy của tài liệu dược liệu.
Monotropein và nystose
1.2.1.1 Công thức phân tử, tính chất hoá lý
- Tên khoa học: [1S-(1a,4aa,7b,7aa)]-1-(b-D-Glucopyranosyloxy)-1,4a,7,7a- tetrahydro-7-hydroxy-7-(hydroxymethyl)cyclopenta[c]pyran-4-carboxylic acid
- Là một base yếu, pKa (môi trường acid mạnh) = 4,14; pKa (môi trường base mạnh) = -3 [62]
- Thuộc nhóm iridoid, có công thức cấu tạo như Hình 1.1
Hình 1.1 Công thức cấu tạo của monotropein [14]
Bột kết tinh có màu trắng, với nhiệt độ nóng chảy từ 273 đến 275 độ C Chất này hòa tan tốt trong methanol, ethanol và có khả năng tan trong nước với độ hòa tan 50,2 g/l Ngoài ra, nó cũng hấp thụ tia UV, đạt cực đại hấp thụ khoảng 235 nm khi ở trong ethanol.
Monotropein có tác dụng chống viêm mạnh mẽ, được chứng minh qua nhiều nghiên cứu Cụ thể, monotropein ức chế biểu hiện của nitric oxid 18-synthase, cyclooxygenase-2, TNF-α và IL-1β mRNA trong các đại thực bào RAW 264.7 bị kích thích bởi lipopolysaccharide Ngoài ra, nó giảm tác động kết dính của yếu tố hạt nhân κB và ngăn chặn sự phosphoryl hóa cũng như suy giảm ức chế κB-α, dẫn đến hoán vị yếu tố hạt nhân κB Trong mô hình viêm ruột kết do dextran sulfate sodium gây ra, monotropein làm giảm chỉ số hoạt động bệnh, hoạt động myeloperoxidase và các biểu hiện protein liên quan đến viêm thông qua việc ngăn chặn sự hoạt hóa yếu tố hạt nhân κB ở niêm mạc ruột.
Monotropein có tác dụng chống loãng xương hiệu quả, được chứng minh qua nghiên cứu trên chuột bị cắt bỏ buồng trứng Cụ thể, nó giúp gia tăng hàm lượng khoáng xương, mật độ khoáng xương và tỷ lệ thể tích xương, đồng thời cải thiện cấu trúc xương một cách rõ rệt.
Như vậy, monotropein là “marker” của dược liệu rễ Ba kích do monotropein có hoạt tính tạo nên tác dụng của dược liệu rễ Ba kích
1.2.1.3 Phương pháp phân tích monotropein
Huang Lin-yun và cộng sự [49] đã tiến hành định lượng monotropein bằng phương pháp HPLC với điều kiện sắc ký như sau:
- Cột sắc ký: SinoChrom ODS-BP (250 mm x 4,6 mm, 5 àm)
- Pha động: Hỗn hợp dung môi MeOH : Acid phosphoric 0,1 % (1 : 99)
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
Xu J và cộng sự [90] đã tiến hành phương pháp định tính, định lượng monotropein trong Morinda officinalis bằng phương pháp HPLC với điều kiện như sau:
- Cột sắc ký: Kromasil C18 (150 mm x 4,6 mm, 5 àm)
- Pha động: Gradient hỗn hợp dung môi MeOH : Acid phosphoric 0,4 % từ (5 :
- Tốc độ dòng: 1 ml/phút
Phương pháp định tính và định lượng monotropein bằng HPLC sử dụng cột C18 với nhiệt độ 25 oC, detector UV, tốc độ dòng 1 ml/phút, và hệ pha động gồm MeOH và acid phosphoric 0,1% - 0,4%.
1.2.2.1 Công thức phân tử, tính chất hoá lý
- Tên khoa học: (2R,3R,4S,5S,6R)-2-[(2S,3S,4S,5R)-2-[[(2R,3S,4S,5R)-2- [[(2R,3S,4S,5R)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxymethyl]-3,4- dihydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxymethyl]-3,4-dihydroxy-5-
(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol
- Là một base yếu, pKa (môi trường acid mạnh) = 11,54; pKa (môi trường base mạnh) = -3,7 [63]
- Thuộc nhóm oligosaccharid, nystose bao gồm có 3 phân tử fructose liên kết 1 phân tử glucose, có công thức cấu tạo như Hình 1.2
Hình 1.2 Công thức cấu tạo của nystose [85]
- Tính chất: Bột kết tinh màu trắng, không mùi, vị ngọt, dễ tan trong nước (745 g/l) [63]
Oligosaccharid không hấp thụ tia UV, vì vậy detector UV không phù hợp cho việc phân tích chúng Thay vào đó, có thể sử dụng các detector khác như khúc xạ kế vi sai và tán xạ bay hơi để phân tích oligosaccharid.
Nghiên cứu cho thấy nhóm FOS, bao gồm 1-kestose, nystose và fructofuranosyl nystose, kích thích sự phát triển của vi sinh vật có lợi như bifidobacteria, đồng thời giảm số lượng vi khuẩn gây hại như Clostridia perfringens FOS cải thiện khả năng hấp thu và lưu giữ khoáng chất, đặc biệt là canxi và magnesi trong ruột, đồng thời tăng cường miễn dịch hệ tiêu hóa, giảm nguy cơ viêm ruột và ung thư ruột kết bằng cách cải thiện cấu trúc niêm mạc và phát triển hệ bạch huyết FOS không được hấp thu bởi cơ thể, không làm biến động lượng đường trong máu, phù hợp cho bệnh nhân tiểu đường và béo phì Ngoài ra, FOS còn giúp giảm tổng hợp cholesterol, triglycerid và LDL cholesterol, có lợi cho bệnh nhân mắc bệnh tim mạch.
Nghiên cứu cho thấy oligosaccharid trong rễ M officinalis How có khả năng bảo vệ ADN tinh trùng người khỏi H2O2, hỗ trợ điều trị vô sinh Ngoài ra, oligosaccharid còn cải thiện khả năng ghi nhớ trên chuột bị mất trí nhớ do beta-amyloid, có tác dụng chống trầm cảm, bảo vệ xương và ngăn ngừa mất xương.
Thành phần oligosaccharid từ Ba kích có khả năng chống trầm cảm, giúp giảm đáng kể các triệu chứng hành vi trầm cảm do stress kéo dài không thể dự đoán gây ra, được chứng minh qua các thử nghiệm như lựa chọn sucrose và bơi cưỡng bức.
Nystose là hoạt chất có tác dụng dược lý của dược liệu rễ Ba kích Do đó, nystose là “marker” của dược liệu rễ Ba kích
1.2.2.3 Phương pháp phân tích nystose a Phương pháp TLC
Bộ tiêu chuẩn dược liệu Hồng Kông [47] tiến hành định tính nystose trong dược liệu bằng phương pháp TLC với các điều kiện như sau:
Bản mỏng HPTLC silica gel F254 Bình triển khai sắc ký loại 2 ngăn
Pha động: Hỗn hợp dung môi acetat – nước – acid formic – acid acetic băng theo tỷ lệ thể tích (6:3:2:2)
Thuốc thử hiện màu: Cho từ từ 11 ml acid sulfuric đặc vào 89 ml EtOH Thêm 2,75 g -naphthol và 7 ml nước
Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,5 mg chất chuẩn nystose, hoà tan trong 50 ml MeOH
Dung dịch thử: Cân khoảng 0,5 g bột dược liệu rễ Ba kích vào bình nón dung tích 50 ml, thêm 20 ml MeOH Lắc siêu âm trong 15 phút Lọc lấy dịch lọc
Tiến hành chấm 15 µl dung dịch chuẩn và 1,5 µl dung dịch thử lên bản mỏng Trước khi sắc ký, thêm pha động vào một ngăn và đặt bản mỏng vào ngăn còn lại, đậy nắp bình và để yên trong 15 phút Nghiêng bình để pha động tràn sang ngăn chứa bản mỏng, triển khai sắc ký cho đến khi pha động di chuyển khoảng 8 cm, sau đó lấy bản mỏng ra, đánh dấu mức di chuyển của pha động và sấy khô Phun thuốc thử để hiện màu lên bản mỏng, sấy ở nhiệt độ khoảng 100°C cho đến khi vết xuất hiện Cuối cùng, so sánh giá trị Rf của vết chính từ dung dịch thử với vết nystose từ dung dịch chuẩn Phương pháp HPLC cũng được áp dụng trong quá trình phân tích.
Dược điển Trung Quốc năm 2015 và Bộ tiêu chuẩn dược liệu Hồng Kông đã thực hiện định lượng nystose trong Morinda officinalis bằng phương pháp cụ thể.
* Dược điể n Trung Qu ốc năm 2015
- Điều kiện sắc ký: Cột sắc ký RP18 (250 mm x 4,6 mm, 5 àm) Pha động: MeOH
- Nước (3 : 97) Detector ELSD: Nhiệt độ ống bay hơi: 90 ºC Tốc độ dòng: 0,8 ml/phút
- Dung dịch chuẩn: Tiến hành pha dung dịch chuẩn nystose trong pha động để cú nồng độ khoảng 200 àg/ml
- Dung dịch thử: Nghiền dược liệu rễ Ba kích thành bột mịn và cho rây qua rây
250 àm Cõn chớnh xỏc khoảng 0,5 g bột dược liệu rễ Ba kớch vào bỡnh nún nỳt mài
Để thực hiện quy trình, đầu tiên, thêm 50 ml dung môi vào 100 ml mẫu, sau đó đậy nắp và cân để xác định khối lượng Tiếp theo, đun sôi trong cách thủy trong 30 phút, sau đó để nguội và cân lại Nếu khối lượng thiếu so với ban đầu, bổ sung dung môi cho đủ.
Tiến hành tiêm 10 µl và 30 µl dung dịch chuẩn cùng với 10 µl dung dịch thử, sau đó ghi lại sắc ký đồ Yêu cầu số đĩa lý thuyết tính theo pic nystose không được thấp hơn 2.000 Dựa vào phương pháp đường chuẩn, tính hàm lượng nystose theo dược liệu khô kiệt.
2 điểm giữa mối tương quan giữa Ln(nồng độ) và Ln(diện tích pic) của nystose
* B ộ tiêu chu ẩn dượ c li ệ u chu ẩ n H ồ ng Kông
Cột sắc ký HILIC (250 mm x 4,6 mm, 5 àm) được sử dụng với detector ELSD, với nhiệt độ ống bay hơi là 92 ºC và tốc độ dòng khí mang nitơ đạt 1,2 ml/phút Tốc độ dòng sắc ký được thiết lập ở mức 1,0 ml/phút, trong khi pha động áp dụng chương trình gradient dung môi như trình bày trong bảng 1.3.
B ả ng 1.3 Chương trình gradient dung môi định lượng nystose
Nước (% thể tích/thể tích)
Acetonitril (% thể tích/thể tích)
Để chuẩn bị dung dịch chuẩn, cần cân chính xác khoảng 4 mg nystose, sau đó hòa tan và định mức thành 2 ml bằng EtOH 60% Tiến hành pha loãng dung dịch này trong EtOH 60% để tạo ra dãy dung dịch chuẩn với nồng độ nystose khoảng 160.
Để chuẩn bị dung dịch thử, cần cân chính xác khoảng 0,25 g bột dược liệu rễ Ba kích vào bình nón nút mài 50 ml, sau đó thêm 10 ml EtOH 60 % Tiến hành lắc siêu âm trong khoảng 15 phút, sau đó lấy dịch chiết và lọc vào bình định mức 25 ml Quá trình chiết cần được lặp lại, đồng thời rửa bã dược liệu bằng EtOH 60 % Cuối cùng, gộp tất cả các dịch chiết vào bình định mức, thêm EtOH 60 % đến vạch định mức và lắc đều, sau đó lọc qua màng lọc 0,45 µm.
Tình hình thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose
1.3.1 Tình hình thi ế t l ậ p ch ấ t chu ẩ n monotropein, nystose trên th ế gi ớ i và t ạ i Vi ệ t Nam
Tại Việt Nam, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương và Viện Kiểm nghiệm thuốc Tp Hồ Chí Minh được Bộ Y tế giao nhiệm vụ thiết lập chất chuẩn Dược điển Việt Nam và chuẩn phòng thí nghiệm cho hệ thống kiểm nghiệm quốc gia Đến tháng 03/2020, quỹ chất chuẩn của hai Viện có hơn 600 chất chuẩn hóa dược và khoảng 40 chất chuẩn chiết xuất từ dược liệu Tuy nhiên, trong danh mục các chất chuẩn chiết xuất từ dược liệu, không có chất chuẩn monotropein và nystose.
Trên toàn cầu, việc nghiên cứu và phân phối chất chuẩn chủ yếu do các tổ chức như Hội đồng chất đối chiếu Dược điển Mỹ (USPRS), Ban thư ký kỹ thuật Hội đồng Dược điển Châu Âu (EPRS), Trung tâm hợp tác về các chất chuẩn hoá học của Tổ chức Y tế Thế giới (ICRS) và Hội đồng chất chuẩn khu vực ASEAN (ARS) thực hiện Tuy nhiên, hiện tại, tất cả các tổ chức này vẫn chưa thiết lập chất chuẩn cho monotropein và nystose.
Một số đơn vị đã thành công trong việc thiết lập chuẩn chất monotropein và nystose chiết xuất từ rễ Ba kích, như được thể hiện trong Bảng 1.4.
B ả ng 1.4 Một số đơn vị cung cấp chất chuẩn monotropein và nystose
Stt Tên chất chuẩn Nhà cung cấp Hàm lượng
6 Nystose TRC-Canada [82] - Lọ 10 mg 45 USD
Viện Kiểm nghiệm thuốc và thực phẩm Trung ương Trung Quốc
Theo Bảng 1.4, một số công ty toàn cầu cung cấp chất chuẩn monotropein và nystose có giá thành cao, dao động từ 45 đến 290 USD cho mỗi lọ, với quy cách đóng gói từ 5 mg đến 25 mg.
Tại Việt Nam, hiện chưa có đơn vị nào cung cấp các chất chuẩn monotropein và nystose, trong khi thời gian cung cấp các chất này từ 92% - 98% thường kéo dài từ 6 đến 8 tuần Do đó, việc phân lập và thiết lập các chuẩn này từ dược liệu rễ Ba kích là cần thiết để phục vụ cho hệ thống kiểm nghiệm chất lượng dược liệu rễ Ba kích tại nước ta.
1.3.2 Phân l ậ p, tinh ch ế monotropein và nystose t ừ Ba kích
1.3.2.1 Nghiên cứu chiết xuất phân lập monotropein từ Ba kích
Monotropein và hỗn hợp các iridoid có thể tan trong nước, ethanol loãng và methanol Để chiết xuất, nước hoặc ethanol 50% thường được sử dụng làm dung môi, kết hợp với các phương pháp như cô đặc, lọc, kết tinh, sắc ký và chiết dung môi Ngoài ra, methanol thường được áp dụng để chiết xuất monotropein nhằm loại bỏ các thành phần không mong muốn.
Liu Dongfeng và cộng sự [61] đã xây dựng qui trình chiết xuất monotropein từ
Morinda offcinalis gồm các bước sau:
Để chiết xuất rễ Ba kích, đầu tiên nghiền rễ thành bột mịn và rây qua lưới cỡ 40 Sau đó, thêm ethanol 30% với tỷ lệ 8 – 10 lần so với lượng dược liệu Tiến hành lắc siêu âm và lọc để thu dịch chiết Cuối cùng, cô bay hơi dung môi để thu được cao chiết EtOH.
Để phân lập, hòa tan cao chiết khô vào nước và chiết lần lượt với dung môi ethyl acetat và n-butanol Sau đó, lấy lớp propyl carbinol và cô bay hơi dưới áp suất giảm để thu được cao chiết Hòa tan cao chiết trong nước, nạp lên cột resin HPD600 và rửa giải bằng dung dịch NaOH có pH = 10, thu được dịch rửa giải Điều chỉnh pH của dịch rửa giải về pH trung tính, rồi nạp dịch này lên cột resin HPD600 và tiến hành rửa giải bằng EtOH 30%, thu lấy dịch EtOH 30%.
Tinh chế bằng phương pháp kết tinh lại, cô bay hơi dịch EtOH 30% để thu được cao EtOH Sau đó, hòa tan cao EtOH trong ethyl acetat và cô bay hơi để thu được chất kết tinh Quy trình này được lặp lại hai lần, cho ra monotropein với độ tinh khiết đạt 92,54% theo phương pháp HPLC.
Phương pháp này có lợi thế về chi phí thấp, tuy nhiên, độ tinh khiết của nguyên liệu lại không cao Việc sử dụng dung môi EtOH 30% kết hợp với cột resin gặp phải nhược điểm là không loại bỏ triệt để các thành phần khác có tính đồng tan hoặc độ phân cực tương tự với monotropein.
1.3.2.2 Nghiên cứu chiết xuất, phân lập, tinh chế nystose từ Ba kích
Liu Dongfeng và cộng sự [60] đã xây dựng phương pháp chiết xuất nystose từ
Morinda offcinalis gồm các bước sau:
Nghiền dược liệu Morinda officinalis và tiến hành chiết siêu âm từ 2-3 lần, mỗi lần kéo dài từ 20-40 phút với lượng nước gấp 5-10 lần nguyên liệu Sau đó, lọc qua màng lọc cellulose, gộp dịch chiết và cô đặc để thu được cao Cuối cùng, hòa tan cao trong ethanol 95% và để kết tủa qua đêm, sau đó thu chất kết tủa.
Hòa tan chất kết tủa trong nước khử ion, trộn với silica gel và sấy khô Sau đó, nhồi cột sắc ký và rửa giải lần lượt với methanol và nước để thu dung dịch rửa Cuối cùng, cô đặc dung dịch và tiến hành kết tủa bằng ethanol, sau đó làm đông khô để thu được nystose với độ tinh khiết 95,2%.
Phương pháp sản xuất nystose mang lại lợi ích về công nghệ đơn giản, năng suất cao và khả năng công nghiệp hóa dễ dàng Tuy nhiên, việc sử dụng chỉ sắc ký cột silica gel và màng lọc cellulose không đủ để loại bỏ hoàn toàn các thành phần khác, dẫn đến độ tinh khiết của sản phẩm không đạt yêu cầu cao.
Phương pháp phân tích trình tự ADN trong định danh loài Morinda officinalis
Ba kích (Morinda officinalis How) hay bị nhầm lẫn do hình dáng gần giống với
Ba kích lông (Morinda cochinchinensis Lour), cây Mặt quỷ (Morinda villosa Hook) và cây giang mủ (Zygostelma benthami Baillon var lineare Cost) là những loại dược liệu quan trọng Việc định danh các dược liệu này thông qua hình thái học gặp nhiều khó khăn, đặc biệt là sau khi thu hái và xử lý, thông tin về đặc điểm thực vật thường không được đầy đủ Do đó, cần thiết phải áp dụng các phương pháp bổ trợ để hỗ trợ cho việc định danh chính xác hơn.
Ba kích được chính xác Và phương pháp định danh bằng phân tích trình tự ADN là một trong những phương pháp chính xác đáp ứng yêu cầu đó
Phân tích trình tự nucleotid của gen theo nguyên lý mã vạch DNA (DNA barcoding) là quá trình xác định loài bằng cách phân tích các đoạn ngắn chuỗi gen chuẩn hóa được trích xuất từ bộ gen.
1.4.1 Quy trình phân tích mã v ạ ch ADN cho th ự c v ậ t
Mã vạch ADN (DNA barcoding) là các đoạn gen ngắn đã được xác định và lưu trữ trong ngân hàng gen, cho phép định danh các loài sinh vật chưa biết thông qua việc so sánh với trình tự ADN có sẵn.
Qui trình ứng dụng mã vạch ADN trong việc phân loại và theo dõi cây phân loài thực vật được thiết kế và chuẩn hóa, giúp các nhà khoa học trên toàn thế giới dễ dàng tra cứu và cập nhật thông tin vào ngân hàng dữ liệu gen Để đảm bảo tính chính xác, cần tuân thủ quy trình chuẩn hóa hoặc sử dụng các bộ kit thiết kế sẵn cho phân tích các hệ gen như ADN nhiễm sắc thể, ADN ty thể và ADN lạp thể.
- Chọn bộ gen cần phân tích là bộ gen ty thể, lạp thể hay nhân Chiết tách và tinh chế DNA gen đích theo quy trình tương ứng
- Khuếch đại đoạn gen cần phân tích bằng mồi chung hoặc mồi đặc hiệu
- Giải trình tự đoạn gen khuếch đại thu được
- So sánh với ngân hàng dữ liệu gen (GeneBank)
Tính đến cuối tháng 4/2018, GeneBank của NCBI đã lưu trữ tổng cộng 208.452.303 trình tự gen quy ước, và cơ sở dữ liệu này đang tiếp tục gia tăng hàng ngày.
1.4.2 Phương pháp khuếch đạ i gen (PCR)
1.4.2.1 Nguyên tắc của phương pháp PCR
Phương pháp PCR là kỹ thuật tổng hợp ADN, sử dụng một trình tự ADN ban đầu làm khuôn để khuếch đại, nhân số lượng bản sao lên hàng triệu lần Quá trình này được thực hiện nhờ enzym polymerase và một cặp mồi (primer) đặc hiệu cho đoạn ADN mục tiêu.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau:
Trong bước đầu tiên của quá trình PCR, gọi là biến tính tách đôi sợi ADN, nhiệt độ được nâng lên từ 94 đến 95 độ C trong khoảng 30 giây đến 1 phút Nhiệt độ cao này khiến phân tử ADN mạch kép tách thành hai mạch đơn, và chính hai mạch đơn này sẽ đóng vai trò làm khuôn cho việc tổng hợp hai mạch bổ sung mới.
Trong bước 2 của quá trình, gọi là bắt cặp và annealing, nhiệt độ được giảm xuống dưới nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép chúng bắt cặp với mạch khuôn Nhiệt độ này thường dao động trong khoảng 55 – 65 độ C, tùy thuộc vào từng điều kiện cụ thể.
Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài từ 30 – 60 giây
Trong bước 3 của quy trình PCR, nhiệt độ được nâng lên 72 o C để tối ưu hóa hoạt động của DNA polymerase Dưới sự tác động của enzyme này, các nucleotid sẽ lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Thời gian cho giai đoạn kéo dài này phụ thuộc vào độ dài của trình tự ADN cần khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút.
Tổng lượng ADN khuếch đại = m x 2 n trong đó: m: là số bản sao của chuỗi mã hóa; n: là số chu kỳ
Qua một chu kỳ nhiệt, ADN đích được nhân bản thành hai bản sao Nếu quá trình này lặp lại liên tục từ 30 đến 40 lần, số lượng bản sao sẽ tăng lên đáng kể, đạt tới hàng tỷ bản sao từ một ADN ban đầu.
Nguyên tắc của phương pháp PCR được trình bày trong Hình 1.3
(a) Sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase (b) Các chu kỳ của phản ứng chuỗi polymerase Hình 1.3 Sơ đồ và các chu kỳ của phản ứng chuỗi polymerase [15]
1.4.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR
Phản ứng khuếch đại tối ưu của ADN mẫu chỉ xảy ra khi sử dụng ADN tinh sạch Nhiều kỹ thuật chẩn đoán bằng PCR vẫn cho kết quả khả quan ngay cả khi sử dụng ADN trực tiếp từ dịch chiết tế bào Đặc biệt, lượng ADN mẫu cần thiết đã giảm từ 1 µg xuống còn 100 ng nhờ vào việc ứng dụng các DNA polymerase hiệu quả cao.
DNA polymerase là enzym chịu nhiệt quan trọng trong việc tổng hợp ADN mới bằng cách bổ sung nucleotid vào trình tự đích Taq DNA polymerase, enzym đầu tiên và phổ biến nhất, được chiết xuất từ vi khuẩn sống trong suối nước nóng Thermus aquaticus, có khả năng chịu nhiệt độ cao mà không bị phá vỡ Hiện nay, nhiều loại polymerase chịu nhiệt khác đã được phát triển với các chức năng chuyên biệt và cải tiến hơn.
Primer là đoạn ADN đơn ngắn chứa trình tự đích, đóng vai trò quan trọng trong thí nghiệm PCR Enzym polymerase bắt đầu tổng hợp sợi ADN mới từ đầu 3’ của primer Việc thiết kế primer chính xác là yếu tố quyết định sự thành công hay thất bại của thí nghiệm, ảnh hưởng đến kết quả khuếch đại mảnh ADN đơn.
Nồng độ dNTP (deoxynucleotid triphosphat) thường dao động từ 20 đến 200 μM, với nồng độ cao có thể gây ra sự khuếch đại không mong muốn Ngoài ra, sự cân bằng giữa các thành phần dNTP cũng đóng vai trò quan trọng trong hiệu quả của phản ứng PCR.
Sự mất cân bằng trong thành phần các dNTP sẽ làm tăng các lỗi sao chép của DNA polymerase [6]
Nồng độ MgCl2 là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến phản ứng PCR, vì ion Mg2+ cần thiết cho việc liên kết các dNTP và hoạt động của enzym Taq polymerase Nếu nồng độ Mg2+ quá thấp, Taq polymerase không thể hoạt động hiệu quả trong giai đoạn kéo dài, dẫn đến hạn chế quá trình này Ngược lại, nồng độ Mg2+ cao giúp ổn định cấu trúc ADN mạch đôi, ngăn ngừa sự biến tính hoàn toàn và giảm thiểu sản phẩm PCR Tuy nhiên, nồng độ cao cũng có thể làm tăng hiện tượng bắt cặp giả, dẫn đến sản phẩm không mong muốn với số lượng lớn nhưng độ chuyên biệt thấp.
- Dung dịch đệm: Dung dịch đệm có nồng độ cao được sử dụng để tăng cường hiệu quả cho phản ứng PCR [6]
Tính cấp thiết của luận án
Ba kích là dược liệu quý có nhiều tác dụng và nhu cầu sử dụng cao tại Việt Nam, do đó cần kiểm soát chất lượng chặt chẽ Monotropein và nystose là hai "marker" quan trọng của rễ Ba kích, với hoạt tính sinh học và hàm lượng lớn trong dược liệu Để nâng cao chất lượng, cần nâng cấp chuyên luận rễ Ba kích trong Dược điển Việt Nam V, bổ sung chỉ tiêu định tính và định lượng cho hai "marker" này, cũng như phân lập và thiết lập chất chuẩn monotropein và nystose, nhằm cải thiện hệ thống kiểm nghiệm và giảm chi phí, thời gian cung ứng.
Như vậy, luận án "Nghiên cứu nâng cấp tiêu chuẩn dược liệu rễ Ba kích (Radix
Morindae officinalis) của Việt Nam" được thực hiện với 3 mục tiêu chính như trên là cấp thiết.
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Các mẫu dược liệu (có độ tuổi trên 3 năm) được thu hái trong các vùng Quảng Ninh, Bắc Giang, Quảng Nam, Hà Giang, được mã hoá tại Bảng 2.1
B ả ng 2.1 Danh mục mã hoá các mẫu Ba kích
Stt Mã hoá Nơi thu hái Số hiệu tiêu bản Nơi lưu mẫu
1 BK1 Lục Ngạn, Bắc Giang 2018.DT02.BK1 Khoa Kiểm nghiệm Đông dược dược liệu – Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương
2 BK2 Vị Xuyên, Hà Giang 2018.DT02.BK2
3 BK3 Vân Đồn, Quảng Ninh 2018.DT02.BK3
4 BK4 Hoành Bồ, Quảng Ninh 2018.DT02.BK4
5 BK5 Tây Giang, Quảng Nam 2018.DT02.BK5
6 BK6 Quản Bạ, Hà Giang 2018.DT02.BK6
- Nghiên cứu chiết xuất, phân lập, tinh chế monotropein và nystose trên mẫu BK4 Nguyên liệu thu được của quá trình này dùng để thiết lập chất chuẩn
- Đối tượng nghiên cứu để định danh dược liệu rễ Ba kích bằng chỉ thị ADN là
6 mẫu dược liệu thu hái theo Bảng 2.1.
Phương tiện nghiên cứu
2.2.1 Ch ấ t chu ẩ n và dượ c li ệ u chu ẩ n
- Chất chuẩn monotropein: Nguồn gốc: Sigma Aldrich; Số lô: SLBN8437V; Hàm lượng: 99 % C16H22O11 (nguyên trạng)
- Chất chuẩn nystose: Nguồn gốc: Sigma Aldrich; Số lô: BCBT3105; Hàm lượng: 99,6 % C24H42O21 (nguyên trạng)
- Dược liệu chuẩn Ba kích (Morinda officinalis How, họ cà phê (Rubiaceae)): Nguồn gốc: Viện kiểm nghiệm thuốc và thực phẩm Trung ương Trung Quốc; Số lô: 121163-201405
2.2.2 Hóa ch ấ t và thu ố c th ử
- Methanol, ethanol, n-hexan, ethyl acetat, dichloromethan, aceton, acid trichloacetic, acid acetic, acid chlohydric, amoniac, chloroform (hãng Merck)
- Bản mỏng pha đảo, bản mỏng pha thuận, silica gel sắc ký cột (hãng Merck, cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm)
- Mồi chung cho phản ứng PCR, 40 - 50 nucleotid/cặp
- Kit chiết tách Dneasy mini plant kit (Qiagen - Mỹ)
- Thang ADN (DNA ladder) 1000 àl/lọ - Mỹ
- Dung dịch dNTPs 10mM - Mỹ
- Ethidium bromide (lọ 10ml)- Sigma
- Đệm TBE 1X: 89 mM Tris, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA pH 8,3 ± 0,2 (Thermo Scientific – Mỹ)
- Thuốc nhuộm gel Runsafe Stain: Bromophenol Blue, Xylene Cyanol FF, Orange G (Clever Scientific – Anh)
- Loading dye: 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM EDTA, 0,005 % bromophenol blue, 0,005 % xylen cyano FF, 10 % glycerol (Thermo Scientific – Mỹ)
- Bộ sắc ký cột thuỷ tinh
- Buồng đóng chuẩn Terra Universal, model: Glove Series 400 Glovebox
- Cân phân tích: Mettler Toledo MS105 (d = 0,01 mg); Mettler Toledo AB204 (d = 0,1 mg)
- Máy định lượng DNA Biophotometer plus
- Máy đo điểm chảy Buchi 535 Melting point
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân BRUKER AM500 FT-NMR
- Máy đo quang phổ hồng ngoại Thermo Nicolet Nexus 670 FTIR
- Máy đo UV – VIS Hitachi UV 3210
- Máy giải trình tự gen AIB 3130XL
- Máy PCR AB Aplied BioSystems Veriti
- Máy phân tích nhiệt trọng lượng TGA Mettler Toledo
- Máy sắc ký lỏng điều chế Shimadzu LC 10 AT VP, detector PDA
- Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Detector DAD Shimadzu LC 20A
- Máy Sắc ký lỏng hiệu năng cao detector ELSD Hitachi
- Máy soi gel UV transilluminator
- Phổ khối phân giải cao (HR-ESI-MS) Waters QTOF
- Các dụng cụ và thiết bị phụ trợ khác
Các thiết bị đều được hiệu chuẩn theo qui định của ISO/IEC 17025 và GLP.
Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Th ẩm đị nh phương pháp định tính, định lượ ng monotropein và nystose 2.3.1.1 Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein a Phương pháp định tính, định lượng monotropein
Dựa trên tài liệu tham khảo [49], [57] và kết quả khảo sát thực tế, phương pháp định tính và định lượng monotropein trong nguyên liệu cùng với dược liệu rễ Ba kích đã được thực hiện dưới các điều kiện cụ thể.
- Cột sắc ký: Phenomenex Gemini RP 18 (250 mm x 4,6 mm, 5 àm)
- Pha động: Hỗn hợp dung môi MeOH : Acid phosphoric 0,5 % theo tỷ lệ thể tích 5 : 95
- Detector DAD: Bước sóng UV tại 237nm
- Tốc độ dòng: 1ml/phút
* Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Dung dịch chuẩn được tạo ra bằng cách cân chính xác 10 mg chất chuẩn monotropein, sau đó hòa tan và định mức thành 10 ml dung dịch bằng methanol (MeOH) Tiếp theo, lấy 1 ml dung dịch này và pha loãng, định mức thành 20 ml bằng nước.
* Chuẩn bị dung dịch thử
Để định lượng monotropein trong nguyên liệu, cần cân chính xác khoảng 10 mg monotropein và hòa tan trong 10 ml methanol (MeOH) Sau đó, lấy 1 ml dung dịch đã pha loãng và định mức thành 20 ml bằng nước.
Để định lượng monotropein trong dược liệu rễ Ba kích, cân khoảng 0,6 g bột rễ Ba kích vào ống ly tâm thủy tinh, thêm 15 ml EtOH 40% và lắc siêu âm trong 30 phút Sau đó, ly tâm với tốc độ 3.000 vòng/phút trong 10 phút và chiết tiếp 2 lần, mỗi lần 10 ml EtOH 40% Gộp các dịch chiết lại và định mức thành 50 ml dung dịch bằng EtOH 40% Cuối cùng, lấy 1 ml dung dịch pha loãng và định mức thành 10 ml bằng nước.
Hệ thống sắc ký được đánh giá có độ thích hợp cao khi độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu và diện tích pic monotropein từ 6 lần tiêm lặp lại dung dịch chuẩn không vượt quá 2,0% Số đĩa lý thuyết tính trên pic monotropein cần đạt tối thiểu 4.000, và hệ số đối xứng của pic này phải nằm trong khoảng từ 0,8 đến 1,5.
- Hàm lượng (%) monotropein (C16H22O11) trong nguyên liệu được tính theo công thức:
ST và SC là diện tích pic monotropein trong sắc ký đồ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn tương ứng Trong khi đó, mT và mC đại diện cho khối lượng mẫu thử và mẫu chuẩn tương ứng tính bằng miligam (mg).
- Hàm lượng monotropein (%) trong dược liệu rễ Ba kích (tính theo dược liệu khô kiệt) được tính theo công thức:
ST, SC: diện tích pic monotropein trên sắc ký đồ dung dịch thử và dung dịch chuẩn tương ứng
CC: nồng độ dung dịch chuẩn monotropein (mg/ml)
W: lượng cân của mẫu thử (g)
A: độ ẩm của mẫu thử (%) b Thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein trong nguyên liệu và dược liệu rễ Ba kích
Thẩm định phương pháp HPLC-DAD để xác định monotropein trong nguyên liệu và dược liệu rễ Ba kích được thực hiện dựa trên các chỉ tiêu đã nêu trong Bảng 2.2 Phương pháp này bao gồm cả định tính và định lượng, đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy trong việc phân tích thành phần của rễ Ba kích.
B ả ng 2.2 Nội dung thẩm định phương pháp định tính, định lượng monotropein
Chỉ tiêu Cách xác định/đánh giá Giới hạn chấp nhận Độ thích hợp của hệ thống
Hiệu lực phân tách của cột Số đĩa lý thuyết (N)
≥ 4.000 Độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của thời gian lưu, diện tích pic monotropein trong dung dịch chuẩn
Thời gian lưu của pic monotropein trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn và dung dịch thử cho thấy độ tinh khiết của pic chính đạt khoảng 1 Sắc ký đồ của dung dịch mẫu không xuất hiện pic tại thời gian lưu của pic monotropein Độ tuyến tính được thể hiện qua hệ số tương quan r ≥ 0,995 Độ chính xác của phương pháp được xác nhận qua độ lặp lại với giá trị RSD trong kết quả định lượng không vượt quá 2,0 % (n = 6), đồng thời cũng đảm bảo độ chính xác trung gian.
Xác định giá trị RSD kết quả định lượng RSD ≤ 2,0 % (n = 6)
Tập hợp kết quả độ lặp lại và khác ngày RSD ≤ 2,0 % (n = 12) Độ đúng
Xác định tỷ lệ thu hồi của chất chuẩn monotropein trong các dung dịch tự tạo có mức nồng độ tương ứng 80%, 100% và 120% so với nồng độ định lượng
LOD, LOQ Kết quả thực nghiệm
Phương pháp tiế n hành Độ thích hợp của hệ thống
Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần dung dịch chuẩn trên hệ thống sắc ký để ghi lại sắc ký đồ Từ đó, xác định độ lặp lại của thời gian lưu, diện tích pic monotropein và số đĩa lý thuyết, đồng thời đánh giá độ đặc hiệu của phương pháp.
- Mẫu trắng (dung môi): Nước cất
- Dung dịch chuẩn, dung dịch thử: Tiến hành theo Mục 2.3.1.1 – a – Chuẩn bị dung dịch chuẩn, dung dịch thử
Tiến hành sắc ký lần lượt các dung dịch chuẩn, dung dịch thử, dung môi vào hệ thống sắc ký, ghi lại sắc ký đồ Độ tuyến tính
- Dung dịch chuẩn gốc: Cân chính xác khoảng 10 mg chất chuẩn monotropein, hòa tan và định mức thành 10 ml dung dịch bằng MeOH
Bắt đầu từ dung dịch chuẩn gốc, tiến hành pha loãng bằng nước để tạo ra các dung dịch chuẩn với nồng độ monotropein lần lượt là 20%, 60%, 100%, 140% và 200% so với nồng độ định lượng.
Tiến hành sắc ký các dung dịch chuẩn và ghi lại sắc ký đồ để xây dựng đường hồi quy tuyến tính giữa diện tích pic và nồng độ monotropein Đồng thời, xác định hệ số tương quan tuyến tính (r) nhằm đánh giá độ chính xác và độ lặp lại của phương pháp.
- Sử dụng phương trình hồi quy tuyến tính của mục Độ tuyến tính
- Dung dịch thử: Chuẩn bị 6 dung dịch thử theo phương pháp nêu tại Mục 2.3.1.1
– a – Chuẩn bị dung dịch thử
Xác định hàm lượng monotropein trong 6 dung dịch thử, tính độ lệch chuẩn tương đối của 6 giá trị hàm lượng Độ chính xác trung gian
Tiến hành thí nghiệm với những ngày và người thử nghiệm khác nhau để tính toán độ lệch chuẩn tương đối của 6 kết quả định lượng Đồng thời, cũng tính toán 12 kết quả định lượng liên quan đến độ lặp lại và khác ngày Điều này giúp đánh giá độ chính xác của các kết quả.
* Định lượng monotropein trong nguyên liệu: Sử dụng phương pháp mẫu tự tạo
- Dung dịch chuẩn: Tiến hành theo Mục 2.3.1.1 – a – Chuẩn bị dung dịch chuẩn
Để chuẩn bị dung dịch 80%, cần cân chính xác 8 mg chuẩn monotropein, hòa tan và định mức thành 10 ml dung dịch bằng methanol (MeOH) Sau đó, lấy 1 ml dung dịch này và pha loãng thành 20 ml bằng nước Quy trình này cần thực hiện trên 3 mẫu khác nhau.
Để chuẩn bị dung dịch 100%, cần cân chính xác khoảng 10 mg monotropein chuẩn, sau đó hòa tan và định mức thành 10 ml dung dịch bằng methanol (MeOH) Tiếp theo, lấy chính xác 1 ml dung dịch và pha loãng thành 20 ml bằng nước Quy trình này cần được thực hiện trên 3 mẫu để đảm bảo độ chính xác và tin cậy.