1. Trang chủ
  2. » Luận Văn - Báo Cáo

Luận văn thạc sĩ ứng dụng phương pháp giải trình tự thế hệ mới (ngs) để phân tích gen hbb ở người

67 74 0

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Tiêu đề Ứng Dụng Phương Pháp Giải Trình Tự Thế Hệ Mới (NGS) Để Phân Tích Gen HBB Ở Người Nghi Ngờ Mang Đột Biến Gây Bệnh β-Thalassemia
Tác giả Ngô Kim Ngân
Người hướng dẫn TS. Dương Quốc Chính, TS. Trần Đức Long
Trường học Đại học Quốc gia Hà Nội
Chuyên ngành Di truyền học
Thể loại luận văn thạc sĩ
Năm xuất bản 2020
Thành phố Hà Nội
Định dạng
Số trang 67
Dung lượng 1,74 MB

Cấu trúc

  • Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

    • 1.1. Đại cương về β-thalassemia

      • 1.1.1. Đặc điểm và cơ chế sinh bệnh Thalassemia

      • 1.1.2. Đặc điểm và phân loại bệnh β-thalassemia

      • 1.1.3. Dịch tễ học bệnh β-thalassemia

        • a. β-thalassemia trên thế giới

        • b. β-thalassemia ở Việt Nam

        • Bệnh hemoglobin nói chung và thalassemia nói riêng đã được chú ý khá sớm ở Việt Nam. Những nghiên cứu ban đầu từ thập kỷ 70, 80 và 90 ở thế kỷ XX, đều hướng về nghiên cứu dịch tễ học và lâm sàng. Tiếp theo những năm gần đây đã có một số nghiên cứu tiế...

      • 1.1.4. Cơ sở phân tử bệnh β-thalassemia

        • 1.1.4.1. Vị trí, cấu trúc gen HBB

        • 1.1.4.2. Cơ chế đột biến trên gen HBB gây bệnh β-thalassemia

        • 1.1.4.3. Một số dạng đột biến thường gặp ở Việt Nam

      • 1.1.5. Các phương pháp chẩn đoán bệnh β-thalassemia

        • 1.1.5.1. Phân tích tế bào máu ngoại vi

        • 1.1.5.2. Điện di huyết sắc tố

    • 1.2. Các kỹ thuật sinh học phân tử chẩn đoán bệnh β-thalassemia

      • 1.2.1. Kỹ thuật ARMS-PCR (Amplification Refractory Mutation System)

        • 1.2.1.1. Nguyên lý kỹ thuật ARMS-PCR

        • 1.2.1.2. Ưu điểm

        • 1.2.1.3. Nhược điểm

      • 1.2.2. Kỹ thuật lai điểm ngược (Reverse hybridization - kit Strip Assay)

        • 1.2.2.1. Nguyên lý:

        • 1.2.2.2. Ưu điểm [4], [38]:

        • 1.2.2.3. Nhược điểm:

      • 1.2.3. Giải trình tự

        • 1.2.3.1. Nguyên lý chung

        • 1.2.3.2. Các phương pháp giải trình tự

          • a. Phương pháp giải trình tự Sanger

          •  Giải trình tự Sanger cải tiến

          • b. Giải trình tự thế hệ mới (Next- generation sequencing)

    • 1.3. Hệ thống giải trình tự thế hệ mới của Illumina - MiSeq .

      • 1.3.1. Lịch sử phát triển

      • 1.3.2. Nguyên tắc hoạt động

        • 1.3.2.1. Quy trình thực hiện

          • a. Chuẩn bị thư viện (Library Preparation) [28], [29].

          • b. Tạo Cluster

          • c. Giải trình tự

          • d. Phân tích kết quả

    • 1.4. Các nghiên cứu về các đột biến gây bệnh β-thalassemia ở Việt Nam

      • 1.4.1. Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật multiplex ARMS- PCR

      • 1.4.2. Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật lai phân tử

  • Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP

    • 2.1. Đối tượng, hóa chất và thiết bị

      • 2.1.1. Đối tượng

      • 2.1.2. Hóa chất

      • 2.1.3. Trình tự mồi sử dụng

      • 2.1.4. Thiết bị

    • 2.2. Phương pháp nghiên cứu

      • 2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu

      • 2.2.2. Quy trình thí nghiệm

        • 2.2.2.1. Tách DNA tổng số

        • 2.2.2.2. Đo nồng độ DNA bằng phương pháp đo độ hấp thu quang phổ ở bước sóng A260nm (sử dụng máy Nanodrop)

        • 2.2.2.3. Thực hiện phản ứng PCR

        • 2.2.2.4. Kiểm tra sản phẩm bằng điện di và tinh sạch sản phẩm

          • a. Kiểm tra sản phẩm sau PCR bằng điện di:

          • b. Tinh sạch sản phầm:

        • 2.2.2.5. Chuẩn bị thư viện giải trình tự

          • a. Kiểm tra nồng độ DNA:

          • b. Cắt DNA thành các đoạn ngắn (Nextera XT sample Prep kit):

          • c. Chuẩn bị PCR (Nextera XT index kit, 24 index)

          • d. Tinh sạch sản phẩm PCR:

        • 2.2.2.6. Chạy giải trình tự

        • 2.2.2.7. Phân tích kết quả

        • 2.2.2.8. Kiểm chứng những mẫu dương tính bằng phương pháp Sanger

  • Chương 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

    • 3.1. Kết quả tối ưu quy trình giải trình tự gen HBB trên hệ thống NGS

      • 3.1.1. Thiết kế mồi và tối ưu phản ứng PCR

        • 3.1.1.1. Thiết kế mồi

        • 3.1.1.2. Tối ưu phản ứng PCR

      • 3.1.2. Tối ưu quy trình chuẩn hóa mẫu

    • 3.2. Kết quả phân tích đột biến trên gen HBB ở các mẫu nghiên cứu

      • 3.2.1. Thông tin lần chạy máy MiSeq.

      • 3.2.2. Kết quả phân tích đột biến gen HBB

      • 3.2.3. Kết quả phân tích đột biến trên gen HBB kiểm chứng lại bằng phương pháp giải trình tự gen Sanger

      • 3.2.4. Giá trị của các chỉ số sàng lọc trong nghiên cứu

        • 3.2.4.1. Giá trị của chỉ số MCH và MCV

        • 3.2.4.2. Giá trị của các thành phần Hb

  • KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

  • PHỤ LỤC 1: KẾT QUẢ PHẢN ỨNG PCR KHUẾCH ĐẠI GEN HBB

  • PHỤ LỤC 2: KẾT QUẢ XÉT NGHIỆM CẬN LÂM SÀNG CỦA ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

Nội dung

T Ổ NG QUAN TÀI LI Ệ U

Đạ i cương về β -thalassemia

1.1.1 Đặc điểm và cơ chế sinh bệnh Thalassemia

Thalassemia là một nhóm bệnh tan máu di truyền do đột biến gen ảnh hưởng đến sản xuất hemoglobin, thành phần chính trong hồng cầu, có vai trò vận chuyển oxy trong cơ thể Phân tử hemoglobin bình thường gồm 2 chuỗi α-globin và 2 chuỗi β-globin, có khả năng vận chuyển bốn phân tử oxy Bệnh thalassemia xảy ra do sự mất cân bằng trong tổng hợp chuỗi α và β-globin, dẫn đến thiếu hụt một chuỗi và thừa chuỗi còn lại, làm thay đổi tỷ lệ huyết sắc tố và gây ra các thể vùi huyết sắc tố Những thể vùi này không vận chuyển oxy, làm thay đổi tính thấm và tính mềm dẻo của màng hồng cầu, khiến hồng cầu dễ bị phá hủy và dẫn đến hiện tượng tan máu Ở tủy xương, các thể vùi gắn lên hồng cầu non, làm chết trước khi trưởng thành, dẫn đến tăng sinh hồng cầu non và biến dạng xương, đồng thời gây ra tình trạng nhiễm sắt Thalassemia là bệnh di truyền phổ biến nhất trên thế giới, với khoảng 7% dân số mang gen bệnh, và tại Việt Nam, ước tính có khoảng 12 triệu người mang gen bệnh, chiếm khoảng 12% dân số.

Mỗi năm, có khoảng 8.000 trẻ em được sinh ra với các bệnh di truyền, trong đó hơn 2.000 trẻ mắc bệnh nặng cần điều trị suốt đời Hiện nay, hơn 20.000 bệnh nhân đang cần điều trị theo loại gen bị ảnh hưởng, được phân thành hai loại chính là alpha thalassemia (α-thalassemia) và beta thalassemia (β-thalassemia).

1.1.2 Đặc điểm và phân loại bệnh β-thalassemia

Bệnh β-thalassemia là một rối loạn di truyền do đột biến gen HBB, dẫn đến việc không sản xuất chuỗi globin β (β 0 -thalassemia), giảm sản xuất chuỗi globin β (β + -thalassemia) hoặc sản xuất chuỗi globin β rất ít (β ++ -thalassemia).

Theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), khoảng 1,5% dân số toàn cầu mang gen bệnh β-thalassemia Bệnh này được phân loại thành ba thể dựa trên đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và số lượng alen bị đột biến: thể nặng, thể trung bình và thể nhẹ Các đặc điểm của từng thể bệnh được trình bày chi tiết trong bảng 1.

B ảng 1: Đặc điểm của các thể bệnh β–thalassemia [3] , [31]

Chẩn đoán Kiểu gen đột biến Huyết đồ Đặc điểm Hb Triệu chứng đặc trưng β-thalassemia thể nặng β + /β + β 0 /β 0 β + /β 0

Hb < 7g/dL MCV 50-60 fL MCH 14-20 pg

Bệnh nặng, thiếu máu, phụ thuộc truyền máu lâu dài β-thalassemia thể trung bình β + /β ++ β + /β 0 β 0 /β 0 + yếu tố ảnh hưởng

Hb 6-10g/dL MCV 55-70 fL MCH 15-23 pg

HbA2 tăng HbF tăng đến 100%

Bệnh vừa, mức độ phụ thuộc truyền máu thay đổi β-thalassemia thể nhẹ β ++ / β β + / β β 0 / β

Hb nữ 9-13 g/dL MCV 55-75 fL MCH 19 - 25 pg

Thiếu máu nhẹ β-thalassemia thể nặng thường xuất hiện trong 2 năm đầu đời, gây ra tình trạng thiếu máu nặng và cần truyền hồng cầu thường xuyên Những người không được điều trị có thể gặp phải các triệu chứng như chậm phát triển, xanh xao, vàng da, cơ bắp yếu, viêm gan, loét chân, và biến dạng hộp sọ, mặt.

β-thalassemia thể trung gian có biểu hiện lâm sàng nhẹ hơn và thường xuất hiện muộn hơn thể nặng, không yêu cầu hoặc chỉ thỉnh thoảng cần truyền máu Trong khi đó, người mắc β-thalassemia thể nhẹ thường không có triệu chứng lâm sàng hoặc chỉ bị thiếu máu nhẹ Khi cả hai cha mẹ đều mắc β-thalassemia thể nhẹ, nguy cơ 25% cho mỗi lần mang thai có thể sinh con mắc bệnh β-thalassemia đồng hợp tử.

Ngoài ra, còn có các thểβ-thalassemia khác như: thể phối hợp Hemoglobin E (HbE) và β-thalassemia; thể phối hợp β-thalassemia và α-thalassemia

Thể phối hợp β-thalassemia và Hemoglobin E (HbE) xảy ra khi gen HBB bị đột biến ở codon thứ 26, dẫn đến sự thay đổi acid amin từ Glutamic thành Lysin Những người mang kiểu gen dị hợp tử hoặc đồng hợp tử HbE mà không kết hợp với β-thalassemia thường chỉ biểu hiện thiếu máu nhẹ và chậm phát triển ở mức vừa phải Tuy nhiên, ở thể phối hợp với β-thalassemia, mức độ biểu hiện của bệnh có thể rất đa dạng, phụ thuộc vào loại β-thalassemia, như được mô tả trong bảng 2.

B ảng 2: Đặc điểm của các thể HbE phối hợp β-thalassemia [3] [31]

Thể bệnh Kiểu gen Huyết đồ Đặc điềm Hb

HbE phối hợp β + -thalassemia HbE/β + Hb thấp

Thiếu máu nhược sắc vừa

HbE phối hợp β 0 -thalassemia HbE/β 0

Hb

Ngày đăng: 19/08/2021, 09:07

Nguồn tham khảo

Tài liệu tham khảo Loại Chi tiết
2. Lê Th ị Thu Hà, (2017), Phát hi ện các đột biến trên gen Beta globin bằng kỹ thu ật ARMS-PCR và lai điểm ngược (Reverse dot blot) Đạ i h ọ c Khoa h ọ c t ự nhiên, Đạ i h ọ c qu ố c gia Hà N ộ i, Lu ận văn thạc sĩ Sách, tạp chí
Tiêu đề: Phát hiện các đột biến trên gen Beta globin bằng kỹ thuật ARMS-PCR và lai điểm ngược (Reverse dot blot)
Tác giả: Lê Th ị Thu Hà
Năm: 2017
3. Nguy ễ n Kh ắ c Hân Hoan, (2013), Nghiên c ứu tầm soát và chẩn đoán trước sinh b ệnh alpha và bêta thalassemia, Đạ i h ọc Y Dượ c Thành ph ố H ồ Chí Minh, Lu ậ n án Ti ến sĩ y họ c Sách, tạp chí
Tiêu đề: Nghiên cứu tầm soát và chẩn đoán trước sinh bệnh alpha và bêta thalassemia
Tác giả: Nguy ễ n Kh ắ c Hân Hoan
Năm: 2013
4. Nguy ễ n Th ị Thu Hà, (2017), Nghiên c ứu đặc điểm đột biến gen globin và theo dõi điều trị thải sắt ở bệnh nhân thalassemia tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung Ương giai đoạn 2013 - 2016, Đạ i h ọ c Y Hà N ộ i, Lu ậ n án Ti ến sĩ Y họ c Sách, tạp chí
Tiêu đề: Nghiên cứu đặc điểm đột biến gen globin và theo dõi điều trị thải sắt ở bệnh nhân thalassemia tại Viện Huyết học - Truyền máu Trung Ương giai đoạn 2013 - 2016
Tác giả: Nguy ễ n Th ị Thu Hà
Năm: 2017
5. Tr ầ n Th ị Thuý Minh, (2015), T ỷ lệ mắc và kiểu hình gen bệnh alpha và beta thalassemia ở trẻ em dân tộc Ê đê và M’nông tỉnh Đắk Lắk, Đạ i h ọc Y dượ c Thành ph ố H ồ Chí Minh, Lu ậ n án Ti ến sĩ Y họ c Sách, tạp chí
Tiêu đề: Tỷ lệ mắc và kiểu hình gen bệnh alpha và beta thalassemia ở trẻ em dân tộc Ê đê và M’nông tỉnh Đắk Lắk
Tác giả: Tr ầ n Th ị Thuý Minh
Năm: 2015
6. Tr ầ n Vân Khánh, Ph ạ m Thanh Loan, H ồ C ẩ m Tú, Tr ầ n Th ị Oanh, Nguy ễ n Đứ c Hinh, Tr ầ n Huy Th ị nh, T ạ Thành Văn, (2014),"Phát hiện độ t bi ế n gen gây b ệ nh beta thalassemia b ằ ng k ỹ thu ậ t multiplex ARMS-PCR", T ạp chí Nghiên cứu Y h ọc, 90 (5) pp.17-25.Ti ế ng Anh Sách, tạp chí
Tiêu đề: Phát hiện đột biến gen gây bệnh beta thalassemia bằng kỹ thuật multiplex ARMS-PCR
Tác giả: Tr ầ n Vân Khánh, Ph ạ m Thanh Loan, H ồ C ẩ m Tú, Tr ầ n Th ị Oanh, Nguy ễ n Đứ c Hinh, Tr ầ n Huy Th ị nh, T ạ Thành Văn
Năm: 2014
7. Birgens Henrik and Ljung Rolf, (2007),"The thalassaemia syndromes", Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation, 67 (1), pp.11-26 Sách, tạp chí
Tiêu đề: The thalassaemia syndromes
Tác giả: Birgens Henrik and Ljung Rolf
Năm: 2007
8. BORGNA ‐ PIGNATTI Caterina, Cappellini M.D., De Stefano P., Del Vecchio G.C., Forni G.L., Gamberini M.R., Ghilardi R., Origa R., Piga A. and Romeo M.A., (2005),"Survival and complications in thalassemia", Annals of the New York Academy of Sciences, 1054 (1), pp.40-47 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Survival and complications in thalassemia
Tác giả: BORGNA ‐ PIGNATTI Caterina, Cappellini M.D., De Stefano P., Del Vecchio G.C., Forni G.L., Gamberini M.R., Ghilardi R., Origa R., Piga A. and Romeo M.A
Năm: 2005
9. Buermans HPJ and Den Dunnen JT, (2014),"Next generation sequencing technology: advances and applications", Biochimica et Biophysica Acta (BBA)- Molecular Basis of Disease, 1842 (10), pp.1932-1941 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Next generation sequencing technology: advances and applications
Tác giả: Buermans HPJ and Den Dunnen JT
Năm: 2014
10. Bulger Michael, Bender MA, Van Doorninck J Hikke, Wertman Brett, Farrell Catherine M, Felsenfeld Gary, Groudine Mark and Hardison Ross, (2000),"Comparative structural and functional analysis of the olfactory receptor genes flanking the human and mouse β -globin gene clusters", Proceedings of the National Academy of Sciences, 97 (26), pp.14560-14565 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Comparative structural and functional analysis of the olfactory receptor genes flanking the human and mouse β-globin gene clusters
Tác giả: Bulger Michael, Bender MA, Van Doorninck J Hikke, Wertman Brett, Farrell Catherine M, Felsenfeld Gary, Groudine Mark and Hardison Ross
Năm: 2000
11. Cai Liuhong, Bai Hao, Mahairaki Vasiliki, Gao Yongxing, He Chaoxia, Wen Yanfei, Jin You ‐ Chuan, Wang You, Pan Rachel L and Qasba Armaan, (2018),"A universal approach to correct various HBB gene mutations in human stem cells for gene therapy of beta ‐ thalassemia and sickle cell disease", Stem cells translational medicine, 7 (1), pp.87-97 Sách, tạp chí
Tiêu đề: A universal approach to correct various HBB gene mutations in human stem cells for gene therapy of beta‐thalassemia and sickle cell disease
Tác giả: Cai Liuhong, Bai Hao, Mahairaki Vasiliki, Gao Yongxing, He Chaoxia, Wen Yanfei, Jin You ‐ Chuan, Wang You, Pan Rachel L and Qasba Armaan
Năm: 2018
12. Cai SP, Zhang JZ, Doherty M and Kan YW, (1989),"A new TAT3A box mutation detected at prenatal diagnosis for beta-thalassemia", American journal of human genetics, 45 (1), pp.112 Sách, tạp chí
Tiêu đề: A new TAT3A box mutation detected at prenatal diagnosis for beta-thalassemia
Tác giả: Cai SP, Zhang JZ, Doherty M and Kan YW
Năm: 1989
13. Capellini M., Cohen A., Eleftheriou A., Piga A., Porter J. and Taher A., (2008),"Guidelines for the clinical management of thalassemia", Thalassaemia International Federation (TIF) April 2000 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Guidelines for the clinical management of thalassemia
Tác giả: Capellini M., Cohen A., Eleftheriou A., Piga A., Porter J. and Taher A
Năm: 2008
14. Cappellini Maria-Domenica, Cohen A., Porter J., Taher A. and Viprakasit V., (2014), Guidelines for the management of transfusion dependent thalassaemia (TDT), Thalassaemia International Federation Nicosia, Cyprus Sách, tạp chí
Tiêu đề: Guidelines for the management of transfusion dependent thalassaemia (TDT)
Tác giả: Cappellini Maria-Domenica, Cohen A., Porter J., Taher A. and Viprakasit V
Năm: 2014
15. Chang Judy C and Kan Yuet Wai, (1979),"beta 0 thalassemia, a nonsense mutation in man", Proceedings of the National Academy of Sciences, 76 (6), pp.2886-2889 Sách, tạp chí
Tiêu đề: beta 0 thalassemia, a nonsense mutation in man
Tác giả: Chang Judy C and Kan Yuet Wai
Năm: 1979
16. Colah Roshan, Gorakshakar Ajit and Nadkarni Anita, (2010),"Global burden, distribution and prevention of β -thalassemias and hemoglobin E disorders", Expert review of hematology, 3 (1), pp.103-117 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Global burden, distribution and prevention of β-thalassemias and hemoglobin E disorders
Tác giả: Colah Roshan, Gorakshakar Ajit and Nadkarni Anita
Năm: 2010
18. Efstratiadis Argiris, Posakony James W, Maniatis Tom, Lawn Richard M, O'Connell Catherine, Spritz Richard A, Deriel Jon K, Forget Bernard G, Weissman Sherman M and Slightom Jerry L, (1980),"The structure and evolution of the human β -globin gene family", Cell, 21 (3), pp.653-668 Sách, tạp chí
Tiêu đề: The structure and evolution of the human β-globin gene family
Tác giả: Efstratiadis Argiris, Posakony James W, Maniatis Tom, Lawn Richard M, O'Connell Catherine, Spritz Richard A, Deriel Jon K, Forget Bernard G, Weissman Sherman M and Slightom Jerry L
Năm: 1980
19. Fucharoen Goonnapa, Fucharoen Supan, Jetsrisuparb Arunee and Fukumaki Yasuyuki, (1990),"Molecular basis of HbE- β -thalassemia and the origin of HbE in northeast Thailand: Identification of one novel mutation using amplified DNA from buffy coat specimens", Biochemical and biophysical research communications, 170 (2), pp.698-704 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Molecular basis of HbE-β-thalassemia and the origin of HbE in northeast Thailand: Identification of one novel mutation using amplified DNA from buffy coat specimens
Tác giả: Fucharoen Goonnapa, Fucharoen Supan, Jetsrisuparb Arunee and Fukumaki Yasuyuki
Năm: 1990
20. Galanello Renzo and Origa Raffaella, (2010),"Beta-thalassemia", Orphanet journal of rare diseases, 5 (1), pp.11 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Beta-thalassemia
Tác giả: Galanello Renzo and Origa Raffaella
Năm: 2010
21. Goodwin Sara, McPherson John D and McCombie W Richard, (2016),"Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies", Nature Reviews Genetics, 17 (6), pp.333 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Coming of age: ten years of next-generation sequencing technologies
Tác giả: Goodwin Sara, McPherson John D and McCombie W Richard
Năm: 2016
22. Gray GR, Manson HE, Gu L ‐ H, Ye. Leonova J and Huisman THJ, (1995),"Hb lulu island (α2β2107 [G9] Gly→ Asp) ‐ β° ‐ thalassemia (codon 15;TGG→ TAG), a form of thalassemia intermedia", American journal of hematology, 50 (1), pp.26-29 Sách, tạp chí
Tiêu đề: Hb lulu island (α2β2107 [G9] Gly→ Asp)‐β°‐thalassemia (codon 15; TGG→ TAG), a form of thalassemia intermedia
Tác giả: Gray GR, Manson HE, Gu L ‐ H, Ye. Leonova J and Huisman THJ
Năm: 1995

TỪ KHÓA LIÊN QUAN

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w