GIỚI THIỆU
Đặt vấn đề
Mía là cây công nghiệp có giá trị kinh tế cao, được trồng tại hơn 110 quốc gia nhiệt đới và cận nhiệt đới Ngoài sản xuất đường, mía còn cung cấp nhiều sản phẩm giá trị như ethanol, nhựa, xơ sợi, và đặc biệt là nhiên liệu sinh học Do đó, việc nâng cao năng suất mía đã trở thành ưu tiên nghiên cứu của nhiều quốc gia Diện tích trồng mía toàn cầu đã tăng từ 44.000 ha năm 1961 lên 269.434 ha năm 2018.
2003, diện tích trồng mía tăng hơn 300 nghìn ha Tuy nhiên, trong những năm gần đây diện tích trồng mía đường có phần giảm nhẹ (FAOSTAT, 2020)
Trong ngành công nghiệp sản xuất đường, đường mía chiếm hơn 60% tổng sản lượng đường thô toàn cầu Tại Việt Nam, nghề trồng mía để sản xuất đường đã bắt đầu từ những năm 1990 và cây mía có khả năng thích nghi tốt với điều kiện tự nhiên, cho phép trồng ở nhiều vùng miền trên cả nước Năm 2018, năng suất mía bình quân đạt khoảng 66,6 tấn/ha, với tổng sản lượng đạt 17.945.204 tấn.
Năm 2018, tổng diện tích trồng mía ở Đông Nam Bộ đạt khoảng 24.494 ha, trong đó Tây Ninh dẫn đầu với 14.669 ha Số liệu này từ Cục thống kê tỉnh Tây Ninh và Tổng cục thống kê cho thấy Tây Ninh có tiềm năng trở thành vùng mía đường quan trọng không chỉ của khu vực mà còn của cả nước.
Hiện nay, Việt Nam đã áp dụng thành công nhiều phương thức tổ chức sản xuất và cải tiến kỹ thuật để tăng năng suất mía, bao gồm sản xuất tập trung chuyên canh, cải thiện giống mía, hóa học hóa, thủy lợi hóa và cơ giới hóa, với sự chú trọng đặc biệt đến nghiên cứu khoa học Tuy nhiên, theo nghiên cứu của Thaweenut và cộng sự (2011), nhiều nước đang phát triển vẫn duy trì thói quen bón nhiều phân hóa học cho cây mía ở giai đoạn đầu để nâng cao sản lượng và chữ đường Cụ thể, tại Việt Nam, nghiên cứu cho thấy năng suất mía tơ tăng tỷ lệ thuận với lượng phân bón, với lượng phân NPK cần thiết cho 1 ha mía tơ đạt năng suất 70 – 80 tấn là khoảng 180 kg.
Để đạt năng suất từ 90 đến 100 tấn/ha, cần sử dụng lượng phân bón tương ứng là 200 – 250 kg N, 80 – 100 kg P2O5 và 180 – 220 kg K2O Mức độ sử dụng phân bón hóa học còn phụ thuộc vào loại đất và mức độ thâm canh Đối với đất xám cát và đất xám bạc màu có thâm canh cao, khuyến cáo lượng NPK/ha là khoảng 200 – 250 kg N và 90 – 100 kg P2O5.
P2O5 và 180 – 200 kg K2O (Viện Nghiên cứu mía đường, 2020)
Việc lạm dụng phân hóa học và chất bảo vệ thực vật không chỉ làm tăng chi phí sản xuất mà còn gây hại cho cây trồng, hệ sinh thái, môi trường và sức khỏe con người Do đó, nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn có lợi đang trở thành một phần quan trọng trong chiến lược nông nghiệp sinh thái Theo nghiên cứu của Singh và Singh (2012), vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật có thể thay thế hoặc bổ sung cho phân bón hóa học và thuốc trừ sâu, đồng thời duy trì tính bền vững của năng suất cây trồng và an toàn môi trường Thực tế cho thấy, việc sử dụng phân bón hợp lý và vi khuẩn có lợi, đặc biệt là vi khuẩn cố định đạm, đã mang lại hiệu quả tích cực cho các cây không họ Đậu như lúa, khoai lang và mía Brazil là một ví dụ điển hình với việc sử dụng phân đạm hóa học ở mức thấp trong sản xuất mía (Ridge, 2013; Yoneyama et al., 2017).
Mặc dù phân bón vi sinh có tiềm năng lớn trong nông nghiệp bền vững, nhưng nghiên cứu về vi khuẩn liên kết thực vật trên cây mía, đặc biệt là trên đất xám, vẫn còn hạn chế Đề tài luận án tiến sĩ “Phân lập, tuyển chọn, nhận diện vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía (Saccharum spp L.) trồng trên đất xám tỉnh Tây Ninh” nhằm tìm kiếm các dòng vi khuẩn bản địa với khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA Những dòng vi khuẩn này sẽ là nguồn giống cho nghiên cứu sản xuất phân bón sinh học, cung cấp các nguyên tố đa lượng như N và P, đồng thời thúc đẩy sự tăng trưởng của cây mía thông qua sản xuất hormone thực vật Đây là một hướng nghiên cứu quan trọng để đảm bảo sử dụng bền vững các nguồn tài nguyên thiên nhiên trong chiến lược phát triển nông nghiệp bền vững.
Mục tiêu và phạm vi nghiên cứu
Nghiên cứu tập trung vào việc khai thác tiềm năng của các giống vi khuẩn bản địa nhằm thúc đẩy sự tăng trưởng của cây mía Mục tiêu là phát triển sản xuất phân bón vi sinh, góp phần vào nền nông nghiệp bền vững.
1.2.1.2 Mục tiêu cụ thể của nghiên cứu
Phân lập và nhận diện các dòng vi khuẩn nội sinh từ vùng rễ cây mía có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và sản xuất hormone tăng trưởng thực vật IAA là một nghiên cứu quan trọng Việc tuyển chọn các vi khuẩn này không chỉ giúp cải thiện sự phát triển của cây mía mà còn góp phần tăng năng suất nông nghiệp bền vững.
Thử nghiệm hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên cây mía trồng trong chậu và ngoài đồng
Vi khuẩn đã được phân lập từ các mẫu đất vùng rễ cùng với mẫu mô thân và rễ của cây mía, được thu thập từ 7 huyện của tỉnh Tây Ninh, ngoại trừ huyện Hoà Thành và thành phố Tây Ninh.
Thử nghiệm hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên cây mía nuôi cấy mô, giống VN-85-1859, trồng trong điều kiện nhà lưới ở giai đoạn 3 tháng tuổi
Nghiên cứu đã thử nghiệm hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn đối với các yếu tố cấu thành năng suất, năng suất và chữ đường của cây mía giống K95-156 Thí nghiệm được thực hiện cả trong chậu và ngoài đồng tại Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Mía đường Thành Thành Công, ấp Bình Hòa, xã Thái Bình, huyện Châu Thành, tỉnh Tây Ninh.
Nội dung nghiên cứu
Phân lập các dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân trong đất vùng rễ và nội sinh cây mía được thực hiện trên môi trường LGI, Burk’s không đạm và NBRIP.
(2) Định lượng khả năng cố định đạm và hòa tan lân in vitro của các dòng vi khuẩn đã phân lập
(3) Đánh giá hoạt tính sản xuất IAA và siderophore in vitro của một số dòng vi khuẩn có cả hai khả năng cố định đạm và hòa tan lân
Nhận diện và nghiên cứu mối quan hệ phát sinh của các dòng vi sinh vật có đặc tính tốt thông qua việc kết hợp hình thái tế bào, khuẩn lạc, sinh học phân tử và các công cụ tin sinh học.
Nhân giống in vitro giống mía VN-85-1859 nhằm tạo ra nguồn cây mía con sạch khuẩn Nghiên cứu đánh giá hiệu quả của các vi khuẩn có đặc tính tốt trên cây mía con trồng trong bình Leonard dưới điều kiện nhà lưới.
Đánh giá hiệu quả của các dòng vi khuẩn sau thí nghiệm cho thấy chúng có tác động tích cực đến năng suất và chất lượng đường của mía Các yếu tố cấu thành năng suất được phân tích từ mía trồng trong chậu và ngoài đồng, cho thấy sự khác biệt rõ rệt giữa hai phương pháp trồng.
Ý nghĩa nghiên cứu
Nghiên cứu này nhằm xác định vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh có khả năng thúc đẩy sự tăng trưởng của cây mía trồng trên đất xám tại tỉnh Tây Ninh Sử dụng trình tự gene 16S rRNA để xây dựng cây phả hệ, nghiên cứu tìm hiểu mối quan hệ giữa các dòng vi khuẩn từ cây mía ở các địa phương khác nhau trong tỉnh Kết quả nghiên cứu sẽ đóng góp vào cơ sở dữ liệu nông học của Tây Ninh và khu vực Đông Nam Bộ, làm rõ mối quan hệ tương tác giữa đất, cây trồng và vi sinh vật đất.
Đất xám, chiếm hơn 81% diện tích tự nhiên tỉnh Tây Ninh, có hàm lượng dinh dưỡng thấp và thường được sử dụng để trồng hoa màu và cây công nghiệp như mía Chi phí phân bón cho sản xuất mía trên loại đất này cao hơn so với các loại đất khác Do đó, việc thu thập nguồn vi khuẩn bản địa cùng với các thông tin nghiên cứu cơ bản sẽ tạo điều kiện cho việc chế tạo và sản xuất phân bón sinh học thân thiện với cây trồng và môi trường địa phương.
Thời gian thực hiện và địa điểm nghiên cứu
Nghiên cứu về mẫu mía và phân lập, tuyển chọn các dòng vi khuẩn đất vùng rễ cùng vi khuẩn nội sinh cây mía có khả năng cố định đạm và hòa tan lân được thực hiện từ tháng 10/2015 đến tháng 4/2017 Đánh giá hiệu quả của các dòng vi khuẩn này trên cây mía nhân giống in vitro trong điều kiện nhà lưới diễn ra từ tháng 4/2017 đến tháng 5/2018 Tiếp theo, từ tháng 5/2019 đến tháng 1/2020, việc đánh giá hiệu quả của vi khuẩn tuyển chọn trên cây mía trồng trong chậu và ngoài đồng được thực hiện.
Nghiên cứu về việc phân lập, tuyển chọn và nhận diện vi khuẩn có khả năng thúc đẩy sự tăng trưởng thực vật đã được thực hiện tại các phòng thí nghiệm Vi sinh vật học, Sinh hóa và Nuôi cấy mô của trường Đại học Sài Gòn, cũng như tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, bao gồm các phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất, Vi sinh vật môi trường và Sinh học phân tử.
Thử nghiệm hiệu quả của các dòng vi khuẩn tuyển chọn trên cây mía được thực hiện tại Đại học Sài Gòn với cây 3 tháng tuổi trong điều kiện nhà lưới Ngoài ra, các thử nghiệm trên cây mía 6 tháng và 12 tháng tuổi được tiến hành tại Trung tâm Nghiên cứu ứng dụng Mía đường Thành Thành Công, với diện tích khoảng 3.000m2, bao gồm trồng trong chậu và ngoài đồng tại xã Thái Bình, huyện Châu Thành, tỉnh Tây Ninh.
Các điểm mới của nghiên cứu
Phương pháp thu thập mẫu vi khuẩn đất vùng rễ và vi khuẩn nội sinh cây mía được thực hiện trên hầu hết các huyện của tỉnh Tây Ninh, ngoại trừ Hòa Thành và TP Tây Ninh Vì mía không được gieo trồng bằng hạt, quy trình nuôi cấy mô cây mía đã được tiến hành nhằm cung cấp nguyên liệu cho nghiên cứu khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật in vivo trong điều kiện nhà lưới, trước khi thử nghiệm ở quy mô bán thực địa và thực địa Việc nuôi cấy mô cũng tạo ra điều kiện kiểm soát vi sinh vật (gnotobiotic), giúp loại trừ ảnh hưởng của các vi khuẩn ngoại nhiễm đến sự tăng trưởng của cây.
Kết quả nghiên cứu cho thấy đã phân lập được 422 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và hòa tan lân, trong đó có 101 dòng có khả năng tổng hợp IAA và 81 dòng tổng hợp siderophore Đặc biệt, 36 dòng vi khuẩn với đặc tính tốt đã được xác định dựa trên trình tự gene 16S rRNA Một trong những dòng vi khuẩn đáng chú ý là CT4bd, được phát hiện trong cây mía trồng tại Hảo Đước, huyện Châu Thành, tỉnh Tây Ninh.
Serratia oryzae sp nov., một loài mới được phát hiện nội sinh cây lúa trồng ở
Năm 2017, Zhang và cộng sự đã công bố dòng CT4bd (Serratia oryzae) và TPD3b (Bacillus subtilis) có khả năng thay thế 25% phân hóa học N và P, giúp nâng cao năng suất mía Thí nghiệm trên cây mía trồng ngoài đồng cho thấy sự gia tăng 14% chữ đường, chứng minh hiệu quả của các dòng vi sinh vật này trong canh tác mía.
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
Hiện trạng sản xuất mía đường của tỉnh Tây Ninh
Viện Nghiên cứu mía đường đã phân tích các đặc điểm tự nhiên và xã hội của 7 vùng sinh thái nông nghiệp tại Việt Nam để đánh giá tiềm năng ngành mía đường “hiện đại” Kết quả cho thấy vùng Duyên hải miền Trung và Đông Nam Bộ là hai vùng có tiềm năng tốt nhất Đông Nam Bộ, bao gồm 6 tỉnh: Bà Rịa - Vũng Tàu, Đồng Nai, Bình Dương, Bình Phước, Tây Ninh, và TP Hồ Chí Minh, nổi bật với đất đai dày (trên 70 cm chiếm 80%), bằng phẳng (độ dốc dưới 15° chiếm 92%) và ít chia cắt, tạo điều kiện thuận lợi cho cơ giới hóa và giao thông Vùng này có 3 nhóm đất chính quan trọng cho canh tác mía: đất xám bạc màu, đất đỏ Bazal và đất phù sa Tỉnh Tây Ninh, được xem là thủ phủ đất xám của Đông Nam Bộ, có hơn 81% diện tích tự nhiên là đất xám.
2.1.1 Đặc điểm khí hậu, đất đai của tỉnh Tây Ninh
Tây Ninh, một trong 6 tỉnh miền Đông Nam Bộ, tọa lạc tại vĩ độ 10°57’08” đến 11°46’36” Bắc và kinh độ 105°48’43” đến 106°22’48” Đông, có khí hậu ôn hòa với hai mùa rõ rệt: mùa nắng từ tháng 12 đến tháng 4 và mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 11 Nhiệt độ trung bình năm tại Tây Ninh là 27,4°C, với lượng bức xạ và ánh sáng dồi dào, trung bình 6 giờ nắng mỗi ngày Hàng năm, lượng mưa tại đây dao động từ 1.800 đến 2.200 mm, và độ ẩm trung bình khoảng 70-80%.
Ninh chịu tác động từ hai loại gió chính: gió Tây – Tây Nam trong mùa mưa và gió Bắc – Đông Bắc trong mùa khô Gió ở đây có tốc độ trung bình khoảng 1,7 m/s, góp phần tạo ra sự điều hòa khí hậu trong suốt cả năm (Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp, 2004).
Tỉnh Tây Ninh có tổng diện tích tự nhiên là 402.960 ha, trong đó diện tích các thuỷ vực như ao hồ và sông suối là 29.770 ha Đất đai chiếm 373.190 ha, bao gồm 4 nhóm đất và 12 loại đất, được phân loại theo hệ thống của Việt Nam và tương ứng với danh pháp của WRB/FAO Nhóm đất xám bạc màu là nhóm lớn nhất với diện tích 330.033 ha, chiếm 88,4% tổng diện tích đất và 81,9% tổng diện tích tự nhiên của tỉnh.
Đất xám là loại đất phổ biến tại tất cả các huyện của tỉnh Tây Ninh, chủ yếu được sử dụng cho nông nghiệp, đặc biệt là trồng mía Bài viết này sẽ cung cấp cái nhìn tổng quan về đất xám tại tỉnh Tây Ninh, nhằm phục vụ cho đề tài luận án.
Bảng 2.1: Diện tích đất xám bạc màu theo địa giới hành chính tỉnh Tây Ninh
Huyện/thành phố Diện tích (ha) Huyện/thành phố Diện tích (ha)
Dương Minh Châu 42,294 Hòa Thành 7,114
(Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp, 2004)
Các loại đất hình thành trên đá mẹ lớn tuổi thường có thành phần cơ giới nhẹ, đặc biệt là đất xám phân bố trong điều kiện khí hậu nhiệt đới ẩm Quá trình phá hủy khoáng sét và rửa trôi-tích tụ sét diễn ra, giữ lại một phần cát và thịt trong lớp bề mặt, tạo màu xám chủ đạo Đất xám ở Tây Ninh hình thành trên nền phù sa cổ từ Pliocene đến Pleistocene thượng, với thành phần cơ giới chủ yếu là cát-thịt-sét gắn kết yếu, có thể kèm cuội-sỏi hoặc kết von laterite Địa hình, chế độ thoát nước và tác động của các quá trình ngoại sinh đã dẫn đến biến đổi thứ cấp, từ đó phân chia đất xám ở Tây Ninh thành các loại khác nhau.
3 đơn vị phân loại, gồm đất xám trên phù sa cổ, đất xám có tầng loang lổ
Đất gley và đất xám gley là hai loại đất quan trọng được nghiên cứu bởi Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp vào năm 2004 Phân loại và quy mô của các loại đất xám tại tỉnh Tây Ninh được thể hiện rõ ràng trong Bảng 2.2.
Bảng 2.2: Phân loại và quy mô của các loại đất xám ở Tây Ninh
Loại đất Tên tương đương
Tỷ lệ (%) Đất xám trên phù sa cổ Haplic Acrisols X 230,323 69,79 Đất xám có tầng loang lổ gley
Xf 50,526 15,31 Đất xám gley Gleyic Acrisols Xg 49,184 14,90
(Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp, 2004) (có hiệu chỉnh) Đất xám trên phù sa cổ có sự phân bố trên toàn tỉnh Tây Ninh Trong đó,
Hai huyện có diện tích lớn nhất là Tân Châu (70.770 ha, chiếm 31%) và Tân Biên (63.505 ha, chiếm 28%) Đất ở đây có thành phần cơ giới nhẹ, chua và thường có hàm lượng dinh dưỡng thấp, với pH nước từ 4,4 – 4,7 Tầng đất mặt có khoảng 58 – 64% hạt cát và 30 – 33% hạt sét, tỷ lệ mùn chỉ đạt 1,4 – 2,2% OM, trong khi đạm, lân và kali tổng số rất thấp Đặc biệt, đạm tổng số chỉ đạt 0,06 – 0,10% và lân tổng số từ 0,018 – 0,046% Mặc dù đất có khả năng cải tạo và phù hợp cho cây trồng nhiệt đới, cần chú ý bổ sung phân hữu cơ và phân hóa học theo nhu cầu cây trồng Đất xám có tầng loang lổ gley, phân bố chủ yếu ở phía Nam, có diện tích lớn nhất tại Châu Thành (11.623 ha; chiếm 23%) và Dương Minh Châu (10.002 ha; chiếm 19,8%) Loại đất này có thành phần cơ giới trung bình đến nhẹ, pH từ 4,6 – 5,0 và độ phì khá, với cấp hạt sét khoảng 29 – 33% và hạt cát từ 40 – 60%.
Đất xám gley có đặc điểm mùn và đạm ở mức khá đến giàu (4,3 – 8,5% OM và 0,21 – 0,22%), lân ở mức trung bình thấp (0,05 – 0,13% P2O5), và kali ở mức thấp (0,022 – 0,041% K2O) Loại đất này có nhiều ưu điểm về đặc tính lý-hóa học và phân bố ở địa hình bằng phẳng, thuận lợi cho việc tưới tiêu và canh tác nông nghiệp Hiện nay, phần lớn diện tích đất xám gley được sử dụng để trồng lúa 2 – 3 vụ có tưới, một số ít trồng mía và hoa màu, và rất ít diện tích dành cho cây ăn quả Tại Tây Ninh, đất xám gley chủ yếu phân bố ở các thung lũng ven suối và trũng thấp, với tỷ lệ phân bố cao nhất ở các huyện Tân Biên (21%), Châu Thành (18,6%) và Trảng Bàng (12%) Đặc điểm địa hình của đất xám gley là thấp, có mực nước ngầm nông và thường bị đọng nước trong vài tháng mỗi năm.
Đất xám gley có độ sâu từ 0 – 50 cm, thường chứa mùn và đạm cao, với các đặc tính tương tự như đất xám có tầng loang lổ gley Thành phần cơ giới của đất thường ở mức trung bình đến nhẹ, độ pH nước khoảng 4,5 – 4,6 và độ chua vừa phải Cấp hạt sét ở tầng đất mặt dao động từ 30 – 36%, trong khi cấp hạt cát nằm trong khoảng 50 – 52% Mặc dù mùn và đạm đạt mức khá đến giàu (2,1 – 17,5% OM; 0,14 – 0,50% N), nhưng thành phần dinh dưỡng trong đất thường không cân đối, với lân ở mức trung bình thấp (0,15 – 0,16%).
Đất xám gley có hàm lượng dinh dưỡng đa dạng, với kali nghèo (0,025 – 0,036% K2O) và sự khác biệt rõ rệt về mùn và đạm giữa các khoanh đất Loại đất này mang lại nhiều lợi ích cho nông nghiệp nhờ vào độ chua vừa phải và hàm lượng dinh dưỡng cao, thường xuất hiện ở những vùng địa hình thấp và bằng phẳng, thuận tiện cho việc tưới nước Hiện tại, phần lớn diện tích đất xám gley ở Tây Ninh được sử dụng cho canh tác lúa hoặc luân canh lúa-màu, trong khi một phần nhỏ được dành cho đất chuyên màu Việc đầu tư vào thủy lợi cho trồng lúa và lúa-màu, đặc biệt ở khu vực phía Bắc tỉnh, là rất cần thiết (Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp, 2004).
Tại Tây Ninh, đất xám trên phù sa cổ chiếm diện tích lớn nhất nhưng lại nghèo dinh dưỡng Hai loại đất xám khác là đất xám có tầng loang lổ gley và đất xám gley, nhờ vào địa hình trũng và đọng nước, có hàm lượng mùn và đạm khá cao Cả ba loại đất xám đều có thành phần cơ giới nhẹ, tính chua và thiếu lân, kali Đất xám gley thích hợp cho việc trồng lúa và màu, trong khi đất xám có tầng loang lổ gley và đất xám trên phù sa cổ có thể được dùng cho canh tác mía và các cây trồng cạn khác.
2.1.2 Đặc điểm vùng mía đường Tây Ninh Ở Tây Ninh có hai vụ mía chính: vụ đông-xuân và vụ hè-thu Trong vụ đông-xuân, mía thường được trồng vào cuối mùa mưa, khoảng từ tháng 11 đến tháng 2 Thời điểm cụ thể tùy thuộc vào điều kiện độ cao của đất, ẩm độ đất, khả năng tiêu thoát nước, điều kiện tưới Mía trồng ở vụ này tuy có thời gian sinh trưởng dài nhưng thường cho năng suất cao Ở vụ hè-thu, mía thường được trồng vào đầu mùa mưa, khoảng từ tháng 4 đến tháng 6 và chỉ trồng được trên các vùng đất triền gò không ngập nước Đây là nguồn hom giống cho vụ đông-xuân tiếp theo Những nơi đất trũng thấp thường không trồng vụ hè-thu (Viện Quy hoạch và thiết kế Nông nghiệp, 2004)
Theo Cục Thống kê Tây Ninh (2019), diện tích trồng mía trên toàn tỉnh đạt 14.668 ha, đứng thứ ba sau lúa và khoai mì, chiếm 5,4% tổng diện tích mía cả nước và 60% diện tích mía khu vực Đông Nam Bộ Mía đường đóng vai trò quan trọng trong phát triển kinh tế của tỉnh Mặc dù diện tích mía năm 2018 giảm so với năm 2017, nhưng tăng khoảng 2.000 ha so với năm 2016 Trong 9 đơn vị hành chính của tỉnh, Châu Thành và Tân Châu là hai huyện có diện tích trồng mía lớn nhất, lần lượt là 6.044 ha và 4.053 ha, trong khi Tân Biên và Bến Cầu có diện tích trên 1.000 ha, với 2.341 ha và 1.254 ha.
Bảng 2.3: Diện tích trồng mía của tỉnh Tây Ninh qua các năm (2015 – 2018), phân theo đơn vị hành chính
Huyện/thành phố Diện tích (ha)
(Cục thống kê tỉnh Tây Ninh, 2019)
Năm 2018, tỉnh Tây Ninh ghi nhận năng suất mía bình quân đạt khoảng 77,18 tấn/ha, vượt trội so với mức trung bình của cả nước là 66,6 tấn/ha và khu vực Đông Nam Bộ với 72,6 tấn/ha, theo số liệu từ Cục thống kê tỉnh Tây Ninh.
Các vấn đề về môi trường và sức khoẻ phát sinh từ việc trồng mía13 1 Đối với thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ
Nghề trồng mía ở Việt Nam hiện chưa ổn định do giá đường mía nhập khẩu thấp hơn nhiều so với sản xuất trong nước Trong khi đó, các nước sản xuất mía hàng đầu như Brazil không chỉ tập trung vào sản xuất đường mà còn mở rộng sang các sản phẩm có giá trị kinh tế như ethanol và nhiên liệu sinh học Điều này cho thấy họ đã thực hiện nghiên cứu toàn diện về công nghiệp sản xuất mía đường, bao gồm cả tác động tiêu cực của canh tác mía đối với môi trường sinh thái.
2.2.1 Đối với thuốc trừ sâu và thuốc diệt cỏ
Canh tác mía đường quy mô công nghiệp gây ra nhiều vấn đề môi trường nghiêm trọng, bao gồm tiêu thụ năng lượng cao trong sản xuất, phát thải khí nhà kính như methane và nitrogen oxide, và sự thay đổi tính chất vật lý, hóa học, sinh học của đất trồng Ngoài ra, việc sử dụng phân bón vô cơ gia tăng cũng dẫn đến ô nhiễm đất, cùng với sự suy giảm chất lượng nước mặt và không khí.
Cây mía có thời gian mùa vụ dài và thường bị cỏ dại cạnh tranh, dẫn đến thiệt hại năng suất từ 20-25% (Hussain et al., 2017) Hiện nay, khoảng 50% thuốc diệt cỏ trên thế giới được sử dụng cho mía đường thương mại, với atrazine, diuron, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) và alachlor là những loại phổ biến nhất Những thuốc diệt cỏ này có khả năng hòa tan trong nước, gây ô nhiễm đất, đới nông và nguồn nước bề mặt cũng như nước ngầm (Hartemink).
Atrazine và ametryne chủ yếu bị phân hủy bởi ánh sáng mặt trời, trong khi alachlor bị phân hủy nhanh hơn atrazine Nghiên cứu của Southwick và cộng sự (1992) cho thấy nồng độ atrazine trong đất trồng mía ở Louisiana đạt mức tối đa từ 82 đến 403 mg/L trong vòng 11 ngày sau khi phun.
Nghiên cứu của Southwick và cộng sự (1992) cho thấy nồng độ atrazine trong nước đã giảm xuống còn 3 mg/L sau 30 ngày, đạt giới hạn cho phép của Hoa Kỳ Các nghiên cứu tiếp theo (Southwick et al., 1995, 2002) chỉ ra rằng mặc dù nồng độ metribuzin trong nước ở vùng trồng mía chưa vượt ngưỡng cho phép, nhưng atrazine đã vượt mức gây ô nhiễm nước uống Tại Brazil, Lanchote và cộng sự (2000) phát hiện dư lượng atrazine, simazin và ametryne trong nước ở khu vực trồng mía gần Sao Paulo, với 17/250 mẫu có chứa atrazine, nhưng nồng độ vẫn thấp hơn khuyến cáo Bengtson và cộng sự (1998) nhấn mạnh rằng phương pháp sử dụng là yếu tố quyết định tỷ lệ thất thoát của thuốc diệt cỏ.
Trong canh tác mía, việc sử dụng thuốc trừ sâu ít phổ biến hơn so với thuốc diệt cỏ, với thành phần hoạt chất của thuốc trừ sâu ở Úc thấp hơn khoảng 11 lần so với thuốc diệt cỏ (Arthington et al., 1997) Mặc dù thuốc trừ sâu chứa chlorine hữu cơ từng được sử dụng rộng rãi từ thập niên 1950 đến 1980, nhưng đã bị cấm sau đó Hiện tại, mặc dù các mẫu bề mặt và lõi trầm tích không phát hiện chlorine hữu cơ ở mức độ cao, vẫn có lo ngại về sự di chuyển của chúng từ đất trồng mía đến môi trường biển gần bờ do hiện tượng tràn nước và xói mòn đất (Cavanagh et al.).
Tại Brazil, cho đến năm 1985, các hoạt chất chlorine hữu cơ như aldrin và heptachlor được sử dụng phổ biến để trừ sâu cho mía Dấu vết của những chất này đã được phát hiện trong đất, lở tích, trầm tích lắng và các sinh vật như giun và ấu trùng ở các lưu vực mía Sau năm 1999, các hợp chất chlorine hữu cơ và các hoạt chất trừ sâu khác vẫn tiếp tục được lưu hành trên thị trường.
Năm 1985, sự hiện diện của các hóa chất độc hại trong môi trường đã chỉ ra sự cần thiết phải cấm lưu hành để ngăn chặn sự lan rộng của chúng (Sparovek et al., 2001) Nghiên cứu của Lerro và cộng sự (2017) cho thấy việc tiếp xúc với thuốc diệt cỏ chứa atrazine và 2,4-D trong quá trình canh tác có thể gây ra các bệnh mãn tính liên quan đến stress oxy hóa, bao gồm cả tổn thương DNA do 2,4-D Đối với cả động vật và con người, tác động độc hại của 2,4-D phụ thuộc vào liều lượng, tần suất tiếp xúc và độ nhạy cảm (Islam et al., 2018) Tương tự, Singh và cộng sự (2016) đã chỉ ra rằng các loại thuốc trừ sâu chứa chlorine hữu cơ có khả năng gây đột biến, u bướu, và chết tế bào, cũng như gây ngộ độc cấp tính ở gan, thận và tinh hoàn của chuột thí nghiệm.
Nghiên cứu của Islam và cộng sự (2018) chỉ ra rằng việc tiếp xúc với 2,4-D có thể gây ra nguy cơ tiềm ẩn từ các chất độc hại trong thuốc diệt cỏ và trừ sâu, ngay cả khi ở hàm lượng thấp Do đó, cần tiến hành các nghiên cứu sâu hơn về sự chuyển hóa, tích lũy và tác động của các chất này để xây dựng cơ sở dữ liệu đáng tin cậy Điều này là cần thiết để phát triển các quy định và chính sách mới nhằm bảo vệ sức khỏe con người và môi trường khỏi sự phơi nhiễm.
2.2.2 Đối với phân bón hoá học
Việc bón phân NPK không cân đối và không hợp lý là một trong những nguyên nhân gây ra năng suất và chất lượng cây trồng kém, đặc biệt là cây mía Tại Pakistan, chỉ 4% người trồng mía sử dụng phân NPK, trong khi 73% chỉ dùng phân N và P Nghiên cứu cho thấy phân kali đóng vai trò quan trọng trong việc cải thiện chất lượng cây trồng và giảm ô nhiễm môi trường Việc bón phân cân đối giúp tăng cường hấp thụ N và P, từ đó nâng cao chất lượng nông sản Tuy nhiên, việc tăng cường phân bón có thể dẫn đến chất lượng cây trồng thấp hơn và thất thoát dinh dưỡng lớn, ảnh hưởng đến chi phí sản xuất và môi trường Bón thiếu N làm giảm năng suất, trong khi bón thừa gây ra dư lượng N trong mía và giảm chất lượng nước ép Tình trạng rửa trôi N xảy ra phổ biến ở những vùng có lượng mưa cao, dẫn đến ô nhiễm nguồn nước và phát thải khí nhà kính Tại Úc, việc bón N vượt quá 150-180 kg/ha đã gây ra ô nhiễm nước và gia tăng khí N2O, ảnh hưởng xấu đến môi trường.
Tại vùng trồng mía ở Mauritius, phương pháp tưới nhỏ giọt đã giúp giảm 30% lượng phân bón N, nhưng đầu tư cho hệ thống này rất lớn và có thể không khả thi về mặt kinh tế cho tất cả các vùng sản xuất mía Việc tiêu thụ nước uống hoặc nông sản có hàm lượng nitrate cao có thể làm tăng nguy cơ mắc bệnh tăng methemoglobin huyết và dị tật ống thần kinh ở trẻ sơ sinh Nghiên cứu tại Hoa Kỳ cũng chỉ ra rằng sự tiếp xúc với nitrate trong nước uống có liên quan đến sự gia tăng các bệnh ung thư như đại trực tràng, bàng quang và ung thư vú, cũng như các vấn đề về tuyến giáp và giảm chức năng sinh sản ở người trưởng thành.
Theo Hartemink (2008), tỷ lệ áp dụng phân lân thường không tính đến tính chất của đất, một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng phát tán và hấp thụ photpho (P) Tại Úc, mức bón phân lân thường vượt quá mức khuyến cáo là 15.
Việc bón phân lân với mức 50 kg P/ha được áp dụng để giảm nguy cơ ảnh hưởng đến sản lượng (Hartemink, 2008) Một nghiên cứu tại 105 khu vực trồng mía ở Úc cho thấy 84% mẫu đất có dư lượng P cao khi bón 20 kg P/ha, và việc giảm lượng P này sẽ mất thời gian dài (Bloesch and Rayment, 2006) Phân lân vô cơ thường bị cố định thành các dạng khó tan như nhôm phosphate, sắt phosphate trong đất chua phèn, hoặc calcium phosphate trong đất kiềm (Cao Ngọc Điệp, 2011) Tại Brazil, việc bón phân P liên tục đã làm tăng hàm lượng lân vô cơ và hữu cơ ở lớp đất mặt (Ball-Coelho et al., 1993) Ở Hoa Kỳ, nghiên cứu cho thấy mức P cao có thể làm gia tăng mức độ nghiêm trọng của bệnh gỉ sắt (Johnson et al., 2007) Thất thoát phân bón P qua xói mòn đất và thấm lọc vào nước ngầm có thể dẫn đến sự phát triển quá mức của vi khuẩn lam và tảo trong các thuỷ vực (Arthington et al., 1997).
Sự nở hoa của nước ở các vùng mía của Everglades (Hoa Kỳ) gia tăng do hiện tượng giảm dòng chảy, liên quan đến sự tích tụ P từ phân bón (Anderson và Rosendahl, 1997) Nghiên cứu cho thấy nồng độ cadmium (Cd) trong đất trồng mía cao gấp 7 lần so với đất không canh tác (Arthington et al., 1997), với nguồn ô nhiễm Cd chủ yếu đến từ phân bón P vô cơ (Kirkham, 2006) Một tấn super lân có thể chứa từ 50 – 170 g Cd (Phạm Thị Thùy, 2010), và thời gian bán hủy của Cd trong cơ thể kéo dài từ 7 – 30 năm Cadmium có khả năng gây ra các bệnh về hô hấp và tiêu hóa, với tiếp xúc lâu dài có thể dẫn đến các bệnh ở phổi, xương, và thậm chí ung thư (Nguyễn Đức Khiển, 2002).
Hạn chế chính trong sản xuất mía đường hiện nay là vấn đề liên quan đến phân bón, đặc biệt là phân N hóa học Cần xem xét các phương pháp tiếp cận nhằm tăng năng suất nông nghiệp và bảo vệ môi trường, bao gồm việc sử dụng cây biến đổi gene và ứng dụng vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật, như Glick (2012) đã nhấn mạnh Đối với mục tiêu sản xuất đường mía bền vững tại Việt Nam, đặc biệt là Tây Ninh, cần tăng cường nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật liên kết với cây mía.
Đa dạng các vi khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật liên kết với cây mía
2.3.1 Các khái niệm vi khuẩn vùng rễ, vi khuẩn nội sinh, vi khuẩn liên kết thực vật và vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật
Vi khuẩn là nhóm vi sinh vật phong phú nhất ở vùng rễ, có ảnh hưởng lớn đến sinh lý thực vật và khả năng cạnh tranh cao trong tương tác với cây chủ Chúng bị thu hút bởi các hợp chất do rễ tiết ra, di chuyển đến vùng rễ, định cư trên bề mặt hoặc xâm nhập vào bên trong rễ và lan tỏa đến các bộ phận khác của cây Tùy thuộc vào mức độ cận kề với đất hoặc rễ cây, mối quan hệ giữa vi khuẩn và thực vật được chia thành các dạng như cộng sinh, nội sinh hoặc liên kết.
Hình 2.1: Các kiểu liên kết giữa vi khuẩn đất có lợi và rễ cây (Souza et al., 2015)
Vi khuẩn liên kết thực vật (PAB) được phân loại thành ba nhóm dựa trên vị trí cư trú: vi khuẩn đất vùng rễ, vi khuẩn biểu sinh rễ và vi khuẩn nội sinh Ngoài ra, PAB cũng có thể chia thành hai nhóm chính: PAB gây bệnh và PAB có lợi, tùy thuộc vào tác động của chúng lên vật chủ Đối với nhóm PAB có lợi, chúng chủ yếu thúc đẩy sự tăng trưởng của cây chủ, mang lại nhiều lợi ích cho nông nghiệp và sinh thái (Fuente và Burdman, 2011; Hardoim et al., 2012; Jha et al., 2013).
Tăng trưởng thực vật (Plant Growth Promoting Bacteria - PGPB) có thể được phân chia thành nhóm nhỏ hơn gọi là “PGPB-kiểm soát sinh học”, bao gồm các lợi khuẩn giúp tăng cường sức khỏe cây trồng Những PGPB sống trong vùng rễ cây được gọi là “vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật” (Plant Growth Promoting Rhizobacteria - PGPR).
Kloepper và Schroth (1978, 1981) lần đầu tiên giới thiệu khái niệm "vi khuẩn vùng rễ" (rhizopheric bacteria) và "vi khuẩn vùng rễ thúc đẩy tăng trưởng thực vật" (Plant Growth Promoting Rhizobacteria - PGPR), là những vi khuẩn sống trong đất có khả năng cạnh tranh cao để xâm chiếm rễ cây, giúp thúc đẩy sự tăng trưởng thực vật và giảm tỷ lệ nhiễm bệnh (Bhattacharyya and Jha, 2012) Ban đầu, vi khuẩn vùng rễ chỉ bao gồm các vi khuẩn sống tự do, nhưng sau này khái niệm PGPR đã được mở rộng để bao gồm cả vi khuẩn cộng sinh và vi khuẩn nội sinh (Agrawal et al., 2014) PGPR được chia thành hai loại: PGPR ngoại bào (extracellular plant growth promoting rhizobacteria) và PGPR nội bào (intracellular plant growth promoting rhizobacteria) Các ePGPR, như Azospirillum, Bacillus, Pseudomonas, thường sống tự do trong vùng rễ, trong khi các iPGPR nằm trong các cấu trúc chuyên biệt của rễ, chẳng hạn như nốt rễ, bao gồm vi khuẩn cộng sinh trong nốt sần của cây họ Đậu.
Rhizobium, Mesorhizobium, Bradyrhizobium, và các vi khuẩn Frankia spp cộng sinh với cây Tống quá sủ (Alnus spp.) (Agrawal et al., 2014; Gupta et al., 2015; Martínez-Viveros et al., 2010)
Vi khuẩn nội sinh (endophytic bacteria) là những vi khuẩn có khả năng xâm nhập vào mô thực vật từ vùng rễ mà không gây ra triệu chứng nhiễm trùng Chúng có thể được phân lập sau khi khử trùng bề mặt thực vật và không gây tác động tiêu cực, mà còn thúc đẩy sự tăng trưởng của cây, được gọi là vi khuẩn thúc đẩy sự phát triển của thực vật (PGPBEs) theo Gaiero và cộng sự (2013) Ngoài vùng rễ, vi khuẩn nội sinh có thể xuất phát từ không khí và vật liệu nhân giống như hạt hay cành giâm Ngoài ra, các vi khuẩn liên kết thực vật cũng có thể cư trú tại vùng đất xung quanh hạt đang nảy mầm (spermosphere) và bề mặt lá cây (phyllosphere) (Compant et al., 2010; Hardoim et al., 2012).
Bài viết này nhấn mạnh sự đa dạng trong định nghĩa và phân loại các lợi khuẩn tương tác với thực vật Tập trung vào vi vùng rễ và vi khuẩn nội sinh, nghiên cứu sẽ xem xét tác động tích cực của chúng đến sự tăng trưởng của cây, đặc biệt là cây mía Phương pháp phân lập được áp dụng không bao gồm các vi khuẩn biểu sinh rễ.
Vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ có nguồn gốc từ đất nhưng khác biệt về thành phần loài, sức chống chịu với các yếu tố sinh thái và tác động lên thực vật Mỗi loài và chủng vi khuẩn có những cơ chế tương tác riêng với vi sinh vật khác và cây chủ Vì vậy, quá trình phân lập, dò tìm, tuyển chọn và phối hợp các chủng vi khuẩn để ứng dụng cần trải qua nhiều nghiên cứu cơ bản.
2.3.2 Các vi khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật liên kết với cây mía
Theo nghiên cứu của Gupta và cộng sự (2015), sơ đồ dưới đây tóm tắt các đặc tính của vi khuẩn có khả năng thúc đẩy sự tăng trưởng thực vật, ảnh hưởng trực tiếp hoặc gián tiếp đến sự sinh trưởng và phát triển của cây chủ (Hình 2.2).
Hình 2.2: Sơ đồ về các cơ chế thúc đẩy tăng trưởng thực vật của vi khuẩn
Cơ chế tác động trực tiếp đến cây trồng thông qua việc cung cấp dinh dưỡng như N, P, K và các khoáng chất khác, cũng như điều chỉnh hormone thực vật Đồng thời, cơ chế gián tiếp được thực hiện qua kiểm soát sinh học, giảm thiểu tác hại từ mầm bệnh và hình thành hệ vi sinh vật có lợi ở rễ, giúp ức chế sự cạnh tranh từ sinh vật có hại (Gupta et al., 2015) Nhiều vi khuẩn vùng rễ còn hỗ trợ cây chống chịu với stress, góp phần thúc đẩy tăng trưởng trong điều kiện bất lợi như nhiễm mặn hay kim loại nặng (Jha et al., 2013) Những đặc tính này được ứng dụng trong lĩnh vực phục hồi sinh học (bioremediation) nhằm khử độc môi trường.
Mehnaz (2011) đã tổng hợp danh sách 81 loài vi khuẩn liên kết với cây mía, bao gồm tên Latin, nguồn phân lập và xuất xứ, từ nhiều quốc gia như Tây Ban Nha, Philippines, Brazil, Ấn Độ và Ai Cập (Phụ lục 2.3) Các vi khuẩn này được phân lập từ vùng rễ, kẽ gian bào và nội mô của cây mía Một số chi vi khuẩn tiêu biểu được liệt kê bao gồm Azospirillum, Azotobacter, Herbaspirillum, Bacillus, Burkholderia, Pseudomonas và Rhizobium.
Gluconacetobacter là một trong những vi khuẩn quan trọng được nghiên cứu trong luận án này Bài viết sẽ tập trung vào các loài vi khuẩn đã được phân lập, đặc biệt là những loài thường gặp ở cây mía.
Các vi khuẩn hiếu khí hình thành nội bào tử (AEFB) như Bacillus, Brevibacillus, và Paenibacillus được biết đến là những vi khuẩn thúc đẩy tăng trưởng thực vật nhờ vào đặc tính thành tế bào dày và khả năng hình thành nội bào tử Những vi khuẩn Gram dương thuộc ngành Firmicutes này có khả năng tổng hợp kháng sinh peptide, phân tử tín hiệu và enzyme ngoại bào, giúp chúng tồn tại trong điều kiện bất lợi Bacillus megaterium, một loài vi khuẩn đất phổ biến, có khả năng hòa tan lân tốt và đã được ứng dụng rộng rãi trong sản xuất phân lân vi sinh Bacillus và Paenibacillus spp cho thấy khả năng ức chế các tác nhân gây bệnh cây cả in vitro và in vivo, mở ra triển vọng ứng dụng trong kiểm soát sinh học Ngoài ra, Bacillus amyloliquefasciens và B methylotrophicus cũng được chứng minh có khả năng đối kháng sinh học và thúc đẩy tăng trưởng thực vật.
Hình 2.3: Ảnh SEM của chủng B amyloliquefaciens TF28 có khả năng kháng nấm
Nhiều loài vi khuẩn thuộc nhóm AEFB như Bacillus cereus, B pumilus, B subtilis, Paenibacillus azotofixans và P polymyxa đã được phân lập từ rễ, thân và apoplast của cây mía đường (Mehnaz, 2011) Ngoài ra, Brevibacillus sp cũng được tìm thấy trong thân và lá của các giống mía trồng ở Brazil (Magnani et al., 2010) Đặc biệt, vào năm 2008, Rivas và cộng sự đã phát hiện một loài vi khuẩn mới từ dịch apoplast của cây mía, được đặt tên là Saccharibacillus sacchari, cho thấy mối quan hệ gần gũi với chi Saccharibacillus.
Nghiên cứu về vi khuẩn Paenibacillus cho thấy, sử dụng kỹ thuật khuếch đại trình tự 16S rDNA từ DNA tổng số trong mẫu đất trồng mía tại Brazil, Dini-Andreote và cộng sự (2010) phát hiện 10,2% tổng trình tự thuộc về Firmicutes, với Bacillus chiếm ưu thế (19,7%) Tại Việt Nam, Ngô Hồng Thanh và cộng sự (2014) đã nhận diện 10 dòng vi khuẩn trong 28 dòng vi khuẩn nội sinh cây mía tại Bến Tre và Long An bằng kỹ thuật PCR đoạn 16S rDNA, cho thấy 10 dòng này có tỷ lệ tương đồng 98-100% với các loài Bacillus trong cơ sở dữ liệu NCBI như B subtilis, B tequilensis, B cereus và B amyloliquefaciens Đồng thời, nghiên cứu vi khuẩn trong đất vùng rễ cây mía tại Đồng Nai cũng đã được thực hiện bởi Hoang và Cao.
(2015) cũng thu được kết quả là 7 trong số 12 dòng (chiếm 58,3%) là các
Dòng B6 của Bacillus megaterium đã thể hiện khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật in vitro hiệu quả, bao gồm các hoạt động như cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA (Hoang và Cao, 2015).
Các phương pháp thường được sử dụng trong nghiên cứu phân lập, đặc tính hoá và nhận diện vi khuẩn nội sinh và vi khuẩn vùng rễ cây mía
Trong nghiên cứu về vi khuẩn liên kết thực vật, quy trình từ phân lập, xác định đặc tính thúc đẩy tăng trưởng thực vật đến tuyển chọn các dòng vi khuẩn có đặc tính tốt thường trải qua nhiều giai đoạn Mặc dù có thể thay đổi tùy theo đối tượng nghiên cứu, nhiều tác giả đã đề xuất một quy trình cơ bản và thông suốt Bài viết này tổng hợp các tài liệu làm cơ sở cho các phương pháp thí nghiệm đã lựa chọn Nội dung được lược khảo bao gồm phương pháp phân lập và dò tìm vi khuẩn có khả năng thúc đẩy tăng trưởng thực vật thông qua khả năng cố định đạm, hòa tan phosphate vô cơ và sản xuất IAA Đặc biệt, sự sản xuất siderophore không chỉ giúp thực vật tăng cường dinh dưỡng Fe trong điều kiện thiếu hụt mà còn có vai trò trong đối kháng sinh học, khi vi khuẩn cạnh tranh sắt với nấm và tác nhân gây bệnh cây, từ đó ức chế sự phát triển của chúng.
2.5.1 Xử lý mẫu để phân lập vi khuẩn vùng rễ và vi khuẩn nội sinh thực vật
Xử lý mẫu là bước quan trọng đầu tiên trong việc thu thập vi khuẩn, quyết định loại vi khuẩn mà nhà nghiên cứu muốn nghiên cứu Vi khuẩn liên kết với rễ cây được phân thành ba loại: vi khuẩn sống trong đất vùng rễ, vi khuẩn sống trên bề mặt rễ (biểu sinh) và vi khuẩn sống bên trong rễ (nội sinh) Nhiều tài liệu đã đề cập đến các phương pháp xử lý bộ rễ cây, bao gồm cả đất khối, đất vùng rễ và rễ cây, như tài liệu của Luster và Finlay (2006) cùng Viện Thổ nhưỡng Nông hóa (1998) Hirsch và Mauchline (2012) cũng đã cung cấp định nghĩa và hướng dẫn tóm tắt về phương pháp lấy mẫu từ bộ rễ cây.
Hình 2.10: Hệ vi sinh vật liên kết rễ (a) và phương pháp lấy mẫu tương ứng (b)
Năm 2014, Baldani và cộng sự đã công bố một bài điểm báo về các phương pháp phân lập vi khuẩn cố định đạm sinh học (BNF) trên cây mía và các cây không họ Đậu, nhấn mạnh vai trò của môi trường bán đặc không chứa Nitrogen Bài viết trình bày chi tiết quy trình phân lập, xác định mật số và nhận diện vi khuẩn trong đất vùng rễ, bao gồm mô tả hình thái khuẩn lạc và tế bào của các vi khuẩn BNF thường gặp trên cây mía và các loại ngũ cốc ở Brazil Các tác giả cũng tóm tắt quy trình nghiên cứu các vi khuẩn BNF sống nội sinh, liên kết với cây hoặc sống tự do qua sơ đồ Baldani và cộng sự cũng đề cập đến các yếu tố ảnh hưởng đến cấu trúc quần xã vi khuẩn liên kết với thực vật, như loài cây chủ, kiểu gene, tuổi cây và vị trí lấy mẫu Mật số vi khuẩn cao nhất thường được tìm thấy trên bề mặt rễ, tiếp theo là các mô bên trong rễ và cuối cùng là các mô khí sinh, với nồng độ pha loãng từ 10^-7 đến 10^-9 là phù hợp cho việc đếm và phân lập vi khuẩn từ rễ.
10 -5 đến 10 -6 phù hợp cho vi khuẩn sống bên trong các mô khí sinh
(*) môi trường chuyên biệt cho chi vi khuẩn cần dò tìm
Nghiên cứu vi khuẩn cố định đạm ở cây không họ Đậu được thực hiện bằng cách lấy mẫu đất từ vùng rễ, với khối lượng từ 1-10 g để cấy vào môi trường bán đặc không chứa N Ngoài ra, có thể pha loãng dịch đất với dung dịch đệm chứa muối khoáng và FeEDTA, và đôi khi sử dụng dung dịch sucrose 40% cho các cây giàu đường như mía.
Để tạo điều kiện cho sự khuếch tán của vi khuẩn vào dịch đất, 80 có thể được thêm vào với lượng 1 g/L (Baldani et al., 2014 a) Sau khi thu thập, mẫu thực vật sẽ được tách riêng thành các phần thân, lá và rễ, sau đó rửa sạch dưới vòi nước chảy để loại bỏ bụi bẩn Mẫu vật được cắt thành các mảnh nhỏ, thấm khô trên giấy và tiến hành khử trùng bằng Chloramine-T với nồng độ 10 g/L, thời gian ngâm sẽ phụ thuộc vào độ tuổi và loại cây.
Để khử trùng rễ cây bắp và lúa miến, ngâm trong Chloramine T từ 30 đến 60 phút, trong khi rễ lúa gạo và lúa mì chỉ cần 5 đến 15 phút Sau đó, các mẫu rễ được ngâm trong nước cất vô trùng và dung dịch đệm phosphate, với tổng thời gian ngâm tương đương thời gian khử trùng Mẫu đối chứng được xử lý tương tự nhưng chỉ ngâm trong nước cất Đối với thân cây có sáp như mía, cần rửa sạch và xịt cồn 70% trước khi đốt và tước bỏ lớp mô bên ngoài để đảm bảo khử trùng hiệu quả Kiểm tra sự khử trùng được thực hiện bằng cách bịt hai đầu mẫu và ngâm trong môi trường bán đặc; mẫu không có vi sinh vật phát triển sau 3 ngày được coi là khử trùng thành công Mẫu 10 g được nghiền trong dung dịch NaCl 0,8% có chứa FeEDTA hoặc sucrose 40%, sau đó để yên và khuấy đều để tạo dịch chiết Để xác định vi khuẩn nội sinh "thật", cần phân lập từ mô đã khử trùng và có bằng chứng hiển vi về sự hiện diện của vi khuẩn Vi khuẩn cũng được coi là "thật" nếu có khả năng tái nhiễm vào cây chủ vô trùng Nghiên cứu đã phát triển các phương pháp kiểm tra sự xâm chiếm của các PGPB khi tái chủng, nhấn mạnh tầm quan trọng của việc chọn lựa tổ hợp vi khuẩn phù hợp để tối đa hóa hiệu quả trên cây trồng.
(A): Tổ hợp H seropedicae và H rubrisubalbicans nhuộm với EUB-338-I, II, III-
Fluos, Hsero-445-Cy3 và Hrubri-445-Cy5
(B): Tổ hợp G diazotrophicus, H seropedicae và H rubrisubalbicans nhuộm với
ALF-1B-Fluos, Hrubri-445-Cy5 và Herso-445-Cy3
Hình 2.12: Ảnh hiển vi laser quét kết quả lai tại chỗ phát huỳnh quang của một số vi khuẩn liên kết cây mía (Oliveira et al., 2002)
2.5.2 Xác định khả năng cố định đạm của vi khuẩn Đạm (N) là một trong những nguyên tố chính của protein, và chịu trách nhiệm cho sự phát triển và mở rộng của lá Đạm cần thiết cho sự quang hợp và sự tích tụ đường ở mía Khi thiếu N, sự tăng trưởng của toàn bộ cây trồng từ thân, lá, rễ cho đến sự mọc tược đều bị ảnh hưởng (Calcino et al., 2018) Trong canh tác nông nghiệp, phân đạm hóa học chiếm khoảng 30% tổng số phân bón (Mohanta et al., 2010) Trong hầu hết các tình huống, tăng cường bón đạm cho mía có thể cho sản lượng và đường cao hơn so với các loại phân khác Đáp ứng này thường thấy rõ ở mía gốc và thường ít rõ ràng đối với mía trồng xen vụ với đậu (Ridge, 2013) Điều này cho thấy vai trò quan trọng của việc khai thác cố định đạm sinh học nhằm thay thế một phần phân bón urea trong trồng trọt (Canellas et al., 2013) Đây là cơ sở của sự khai thác các vi khuẩn BNF liên kết thực vật từ cây mía và các cây trồng khác
2.5.2.1 Sử dụng môi trường bán đặc và đặc không chứa nitrogen để phân lập và chứng minh khả năng cố định đạm của vi khuẩn
Đến đầu những năm 1970, các nghiên cứu về vi khuẩn BNF chỉ ra rằng chúng có khả năng phát triển trong điều kiện nồng độ oxy khí quyển (pO2 = 0,21 kPa) Tuy nhiên, phức hợp nitrogenase, đóng vai trò quan trọng trong quá trình khử N2 trong khí quyển, rất nhạy cảm với oxy và có thể mất hoạt tính không thể phục hồi khi tiếp xúc với áp suất oxy cao.
Môi trường 41 trường thạch mannitol-nấm men (Yeast Mannitol Agar - YHA) được sử dụng hiệu quả để phân lập các rhizobium cộng sinh Ngoài ra, chỉ có một số ít vi khuẩn sống tự do được ghi nhận là vi khuẩn cố định đạm, chẳng hạn như Beijerinckia fluminensis, Derxia indica và Azotobacter paspali (Baldani et al., 2014 a).
Phương pháp sử dụng môi trường bán đặc trong phân lập vi khuẩn cố định đạm, do Dửbereiner và Day (1976) đề xuất, là thành tựu phát triển từ các nghiên cứu trước đó từ những năm 1920 đến thập niên 1960 Cải tiến quan trọng nhất của họ là giảm nồng độ agar từ 2-3 g/L xuống còn 1,4-1,8 g/L theo gợi ý của Whittenbury (1963) Môi trường thạch mềm này tạo ra gradient nồng độ oxygen từ hiếu khí đến kỵ khí, giúp vi khuẩn tìm thấy vị trí phát triển tối ưu Môi trường NFb mà Dửbereiner và Day (1976) phát triển đã hỗ trợ hiệu quả trong việc phân lập các vi khuẩn này.
Azospirillum đã có một cải tiến quan trọng khi môi trường nuôi cấy không chứa Nitơ, cho phép phân lập và nhận diện nhiều vi khuẩn cố định đạm liên kết với các cây không họ Đậu như cây Hòa thảo (Baldani et al., 2014) Từ môi trường này, nhiều loại môi trường biến đổi đã được phát triển bằng cách điều chỉnh pH, nồng độ thẩm thấu, và bổ sung vitamin, muối, acid amin, chiết xuất thực vật để phù hợp với nhu cầu của vi khuẩn Dựa trên các môi trường không đạm như NFb, JNFb, LGI, LGI-P, JMV, Baz và Bac, nhiều loài vi khuẩn trong các chi Azospirillum, Herbaspirillum, Sphingomonas, Gluconacetobacter, và Burkholderia đã được phân lập và xác định (Baldani et al., 2014a).
Hình 2.13:Màng mỏng (pellicle) do vi khuẩn cố định đạm tạo thành trong môi trường JNFb không N bán đặc sau 7 ngày nuôi cấy (Ribeiro and Cardoso, 2012)
Môi trường bán đặc đóng vai trò quan trọng trong việc phân lập vi khuẩn nội sinh với nhu cầu oxy thấp để thể hiện hoạt tính cố định đạm Nhiều loại môi trường đặc không N như Burk’s không N, Burk’s biến đổi, Winogradsky, Bridges và WAT4C cũng được sử dụng để phân lập vi khuẩn cố định đạm tự do Ngoài ra, bromothymol blue (BTB) thường được bổ sung như chất chỉ thị pH, với sự chuyển màu từ xanh lục sang xanh dương khi có ammonia, cho thấy sự cố định đạm Hiện tượng này cũng được ghi nhận trong sự phát triển của vi khuẩn cố định đạm trong môi trường bán đặc.
Hình 2.14: Sự chuyển màu môi trường trong nuôi cấy trên môi trường đặc (A) và bán đặc (B và C) với chất chỉ thị BTB (Miladiarsi et al., 2017; Baldani et al., 2014 a)
2.5.2.2 Các phương pháp chứng minh khác
Các phương pháp khác nhau đã được phát triển để chứng minh khả năng cố định đạm của vi khuẩn, bên cạnh việc cho phép chúng phát triển trong môi trường không có nitrogen Kỹ thuật biến loãng với N15 là một trong những phương pháp phổ biến để đánh giá hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn khi được cấy ghép vào cây mía (Asis et al., 2002; Umrit et al., 2009) Đồng thời, xét nghiệm khử acetylene (Acetylene Reduction Assay - ARA) được coi là một trong những phương pháp nhạy cảm nhất để chứng minh hoạt động cố định đạm sinh học Phương pháp này thường được sử dụng để so sánh hoạt động của nitrogenase trong các thí nghiệm in vitro cũng như ngoài đồng, tuy nhiên, nó được xem là phương pháp gián tiếp vì không cho phép chuyển đổi định lượng sự khử acetylene thành lượng N2 cố định (Muangthong et al., 2015; Mirza et al., 2001).
Một phương pháp phổ biến để đo hàm lượng ammonia trong nuôi cấy lỏng là sử dụng thuốc thử đặc hiệu như Nessler’s hoặc sodium nitroprusside, được nhiều tác giả áp dụng trong nghiên cứu cố định đạm của các PGPR (Abdelwahab và Nabti, 2017; Cao Ngọc Điệp, 2011; Chrouqi et al., 2017) Bên cạnh đó, các phương pháp dựa trên gene và sinh học phân tử cũng ngày càng được chú trọng, đặc biệt là kỹ thuật PCR để dò tìm và khuếch đại các gene nif mã hóa cho các tiểu phần của nitrogenase như nifH, nifD và nifK Phương pháp này đã được ứng dụng trong nghiên cứu vi khuẩn cố định đạm liên kết với cây mía (Li et al., 2017; Rodrigues et al., 2018; Yoneyama et al., 2017).
2.5.3 Xác định khả năng hoà tan lân của vi khuẩn
Lân (P) là một nguyên tố dinh dưỡng quan trọng, đứng sau nitơ (N) trong việc hạn chế sự phát triển của thực vật Mặc dù đất chứa một lượng lớn hợp chất hữu cơ và vô cơ chứa P, nhưng tới 95-99% phosphate tồn tại dưới dạng không hòa tan, dẫn đến tình trạng thiếu hụt P cho cây trồng Cây chỉ có khả năng hấp thụ phosphate ở hai dạng ion hòa tan là H2PO4 2- và HPO4 3-.
Nuôi cấy mô thực vật và một số kết quả trong vi nhân giống mía 51 1 Một số nguyên lý và vai trò của nuôi cấy mô thực vật
Thử nghiệm hiệu quả in vivo của các PGPB trên cây mía trồng trong ống nghiệm gặp khó khăn do việc tạo nguồn nguyên liệu gnotobiotic, vì cây mía không gieo trồng bằng hạt Cây mía trong ống nghiệm có thể được tạo ra thông qua các quy trình tạo cây sạch đã được công bố, chẳng hạn như quy trình của Lee và Bressan (2005) Sau khi xác định đặc tính, các dòng vi khuẩn sẽ được tái chủng vào cây mía theo hình thức đơn lẻ hoặc phối hợp Cây mía sau khi chủng có thể được nuôi cấy in vitro hoặc chuyển sang trồng trong bình Leonard trong nhà lưới để nghiên cứu tác động của vi khuẩn ở giai đoạn sớm Đối với thí nghiệm đánh giá năng suất, cây mía được tạo ra từ hom cho kết quả phù hợp hơn.
2.6.1 Một số nguyên lý và vai trò của nuôi cấy mô thực vật
Nuôi cấy mô thực vật, hay còn gọi là vi nhân giống cây, là quá trình nuôi cấy in vitro trong điều kiện vô trùng đối với tế bào, mô, cơ quan hoặc toàn bộ thực vật Phương pháp này bắt đầu từ nguồn vật liệu vô tính và, dưới điều kiện dinh dưỡng và môi trường được kiểm soát, tạo ra các dòng thực vật đồng nhất về kiểu gene và sự tăng trưởng Để đạt được kết quả tốt nhất, môi trường nuôi cấy cần đảm bảo đầy đủ chất dinh dưỡng, độ pH phù hợp, nhiệt độ và môi trường khí lỏng thích hợp, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng và nhân bản của mô thực vật (Hussain et al., 2012).
Nuôi cấy mô thực vật tận dụng tính toàn năng của tế bào thực vật, cho phép chúng phát triển thành cây hoàn chỉnh trong môi trường thích hợp Các tế bào đơn lẻ hoặc bộ phận như lá, thân rễ và chồi ngọn có thể được sử dụng làm nguyên liệu để tái tạo cây mới, với điều kiện cung cấp môi trường dinh dưỡng khoáng và liều lượng phytohormone phù hợp.
Môi trường dinh dưỡng chủ yếu bao gồm khoáng đa lượng và vi lượng, đường, vitamin cùng một số hợp chất hữu cơ khác Agar có thể được bổ sung để tạo môi trường đặc hoặc bán đặc tùy theo mục đích nuôi cấy Môi trường khoáng phổ biến hiện nay là môi trường MS (Murashige and Skoog, 1962) Các phytohormone thường sử dụng trong nuôi cấy mô bao gồm auxin, cytokinin và gibberellin với nồng độ phù hợp Độ pH của môi trường thường được điều chỉnh trong khoảng 5,4 – 5,8 (Hussain et al., 2012).
Việc nuôi cấy mô thực vật để nhân giống mang lại nhiều lợi ích vượt trội so với phương pháp truyền thống, bao gồm khả năng sản xuất số lượng lớn cây con trong thời gian ngắn và đảm bảo cây con sạch bệnh nhờ vào quy trình khử trùng Phương pháp này cũng hiệu quả cho các loại cây có hạt khó nảy mầm hoặc thời gian nảy mầm dài, đồng thời cho phép tạo ra cây con từ các bộ phận khác nhau của cây không có hạt Ngoài ra, vi nhân giống còn được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như cung cấp cây giống cho sản xuất nông nghiệp và nghiên cứu các đặc điểm sinh lý, sinh hóa thực vật cũng như tương tác giữa thực vật và môi trường.
2.6.2 Quy trình và một số kết quả trong vi nhân giống mía
Quy trình nhân giống cây mía bằng nuôi cấy mô bao gồm bốn giai đoạn chính: thiết lập điều kiện nuôi cấy vô trùng, nhân giống vô tính in vitro, chuyển cây ra vườn ươm và trồng cây ngoài đồng ruộng Trong giai đoạn nhân giống in vitro, cây mía trải qua các bước như kích hoạt sự nhân giống từ mô phân, khởi xướng tạo chồi trực tiếp, nhân nhanh chồi để tạo cụm chồi và cảm ứng tạo rễ, sau đó làm cứng cây và tách rời các cây con trước khi đưa ra vườn ươm.
Hình 2.18: Các giai đoạn cơ bản của một quy trình nhân nhanh giống mía
Mục đích chính của vi nhân giống mía là cung cấp số lượng lớn cây con sạch bệnh cho sản xuất và nghiên cứu Nghiên cứu thường tập trung vào phát triển môi trường nuôi cấy, đặc biệt là thành phần và nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng để đạt hệ số nhân chồi cao và cây con phát triển tốt Bài viết này sẽ trình bày một số kết quả đạt được trong nhân giống in vitro cây mía trên thế giới và ở Việt Nam sau năm 2000, từ đó làm cơ sở cho việc lựa chọn nguồn vật liệu ban đầu và chương trình hormone phù hợp cho việc tạo chồi, tạo rễ và phát triển cây hoàn chỉnh.
Vật liệu khởi đầu cho nhân giống mía rất đa dạng, bao gồm mô phân sinh như đỉnh sinh trưởng và đầu rễ, tế bào trục lá, lá non, và mô sẹo Nghiên cứu cho thấy trong chương trình tạo chồi, cytokinin như BAP và kinetin thường được sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp với gibberellin như GA3 Đối với việc tạo rễ, auxin như NAA và IBA thường được áp dụng Khi tạo chồi từ mô sẹo, tổ hợp auxin (2,4-D, IBA, NAA) thường được sử dụng trước, sau đó tái sinh chồi bằng cách kết hợp cytokinin (BAP, kinetin) và auxin (IBA, NAA).
Nồng độ sucrose và thành phần dinh dưỡng khoáng MS có ảnh hưởng đến sự biệt hóa và phát triển chồi, rễ ở cây mía Đối với việc tạo chồi từ đỉnh sinh trưởng, tổ hợp cytokinin hiệu quả nhất là 2 mg/L BAP kết hợp với 0,25 – 0,5 mg/L kinetin, tùy thuộc vào giống mía Trong khi đó, khi tạo chồi từ rễ, tổ hợp giữa cytokinin và gibberellin cho kết quả tốt nhất với nồng độ 0,5 – 1,0 mg/L BAP và 0,1 – 0,5 mg/L GA3, cũng tùy thuộc vào giống mía.
Nghiên cứu về cảm ứng tạo rễ từ cụm chồi cho thấy hormone NAA là phù hợp nhất với nồng độ từ 0,5 – 7,0 mg/L, trong khi IBA cũng có hiệu quả với nồng độ 0,5 – 1,5 mg/L Sự lựa chọn hormone và liều lượng còn phụ thuộc vào nguồn vật liệu và giống mía được khảo sát Tại Việt Nam, nghiên cứu trên giống mía VN84-4137 chỉ ra rằng môi trường MS bổ sung 1 mg/L NAA là tối ưu cho việc tạo rễ từ chồi, trong khi hai giống mía ROC26 và HB1 lại thích hợp với nồng độ NAA 0,5 mg/L.
Nghiên cứu vi nhân giống mía cho thấy chương trình biệt hoá tạo chồi từ mô phân sinh đỉnh cần sự phối hợp giữa BAP và kinetin, trong khi việc tạo rễ từ cụm chồi thường sử dụng NAA Mặc dù Saccharum officinarum L là giống mía đường phổ biến trên thế giới, nhưng các giống khác nhau lại có phản ứng hormone khác nhau Vì vậy, cần tiến hành các nghiên cứu để tìm ra chương trình vi nhân phù hợp với từng giống mía cụ thể của địa phương.