TIỆT TRÙNG DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG LÀM VIỆC CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY VI SINH VẬT
Tổng quan phòng thí nghiệm vi sinh
1 Hệ thống phòng thí nghiệm vi sinh:
- Phòng nhận và trữ mẫu
2 Thiết bị phòng thí nghiệm:
Thiết bị tiệt trùng bao gồm nồi hấp, autoclave và tủ sấy, giúp tiệt trùng dụng cụ bằng phương pháp khô và ẩm ở nhiệt độ và áp suất an toàn Tủ sấy được sử dụng để sấy khô dụng cụ trước khi tiến hành tiệt trùng, đảm bảo hiệu quả tối ưu trong quy trình khử trùng.
- Máy lắc: Cho ống nuôi cấy vào đĩa, máy lắc có tác dụng làm tăng hàm lượng oxy vào mẫu, dùng cho vi sinh vật hiếu khí.
- Thiết bị nuôi cấy yếm khí: Đặt thêm mẫu hóa chất bên trong để hút CO2 sinh ra.
- Tủ ấm: hoạt động ở 25-60 o C, nhưng thường thì người ta sử dụng từ 30-40 o C. Trong phòng thí nghiệm: 37 o C.
- Tủ cấy: gồm phòng cấy, hệ thống tiệt trùng dùng tia UV: 200-290nm hoặc bơm lọc không khí.
Bể điều nhiệt là thiết bị dùng để truyền nhiệt cho môi trường và vi sinh vật, sử dụng nước ở nhiệt độ dưới 100 oC Đối với nhiệt độ vượt quá 100 oC, dầu sẽ được sử dụng làm chất truyền nhiệt Thiết bị này còn được trang bị bộ phận điều chỉnh nhiệt và hệ thống lắc để đảm bảo hiệu suất tối ưu trong quá trình điều nhiệt.
- pH kế: điều chỉnh pH trong môi trường nuôi cấy.
Ngoài ra còn có các thiết bị như: máy phá mẫu, máy trộn mẫu, kính hiển vi, cân, nhiệt kế….
Hình 1.1: Máy lắc Hình 1.2: Tủ cấy vi sinh vật
3 Dụng cụ thí nghiệm vi sinh:
- Dụng cụ chứa mẫu và nuôi trồng: erlen , bercher , pipet, bình định mức, ống nghiệm có nắp hoặc không nắp…
+ Ống nghiệm: thường có đường kính d=8-15 mm, thường thì sử dụng dmm + Đĩa petri: có d=8-12 cm, gồm có một nắp nhỏ và một nắp lớn.
Que cấy là dụng cụ quan trọng trong vi sinh vật học, bao gồm que thẳng dùng để cấy điểm và lấy mẫu vi sinh vật, que vòng dùng cho cấy chuyền và cấy ria, cùng với que mốc để lấy khuẩn lạc và khuẩn ty.
+ Que trang: có một đầu tam giác, được làm bằng thủy tinh.
+ Đũa thủy tinh: Dùng để khuấy dung dịch.
+ Lam kính có dạng hình chữ nhật
+ Lamen có dạng hình vuông, mỏng hơn lam kính
+ Buồng đếm vi sinh vật
+ Màng lọc vi sinh vật.
Hình 1.3: Đĩa petri Hình 1.4: Que cấy vòng bằng kim loại
Sơ lược lý thuyết
1 Tiệt trùng dụng cụ và môi trường làm việc: a Tiệt trùng bề mặt và môi trường làm việc:
Khi làm việc với vi sinh vật, việc đảm bảo môi trường và bề mặt làm việc vô khuẩn là rất quan trọng để tránh lây nhiễm vi sinh vật không mong muốn Sự vô trùng không chỉ phụ thuộc vào phương pháp tiệt trùng mà còn liên quan đến điều kiện và thông gió của nơi làm việc.
+ Cửa sổ và cửa ra vào phải được đóng chặt trước thời điểm làm việc
Để tiệt trùng không khí trong phòng, bạn có thể sử dụng đèn UV lắp trên trần nhà, bật trong 15 phút Quá trình chiếu UV sẽ tạo ra ozone, do đó, không khí sẽ có mùi đặc trưng ngay sau đó.
+ Bề mặt làm việc được tiệt trùng bằng cách lau ethanol 70% Khi lau cồn, lưu ý không được bật đèn cồn vì có thể xảy ra hỏa hoạn.
+ Thực tế nếu môi trường làm việc không đáp ứng được yêu cầu kín gió và lắp đèn
Để ngăn ngừa nhiễm vi sinh vật cho mẫu thí nghiệm, cần sử dụng tủ sấy hoặc thao tác khéo léo với đèn cồn Đồng thời, việc tiệt trùng dụng cụ làm việc cũng rất quan trọng để đảm bảo độ chính xác và an toàn cho kết quả thí nghiệm.
- Dụng cụ bằng thủy hoặc kim loại:
+ Chuẩn bị trước khi tiệt trùng:
• Trước khi tiệt trùng cần được làm sạch và sấy khô.
Sau khi tiệt trùng dụng cụ, cần gói kín chúng trong giấy, giấy bạc hoặc hộp kín để ngăn chặn sự nhiễm khuẩn từ môi trường bên ngoài.
Ống nghiệm thủy tinh cần được đậy kín bằng nút bông không thấm nước Sau đó, phần đầu ống nghiệm có nút bông phải được gói chặt trong giấy trước khi tiến hành tiệt trùng.
• Hộp petri cần được gói kín trong giấy.
• Pipet thủy tinh cần được gắn một nút bông nhỏ ở phần cuối của pipet, sau đó bọc kín trong giấy.
• Que trang, đũa thủy tinh nếu cần tiệt trùng cũng cần phải gói kín trong giấy. + Phương pháp tiệt trùng:
• Phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt khô: Sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 170-
180 o C, trong thời gian 1-2 giờ đối với vật cần tiệt trùng không có nắp bông. Nếu có nắp bông, sấy ở nhiệt độ 150-160 o C trong khoảng 3 giờ.
• Phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt ẩm: thường thực hiện trong nồi autoclave ở áp suất 1at, nhiệt độ 121 o C
Dụng cụ bằng nhựa chịu nhiệt, bao gồm ống nghiệm có nắp, nắp teflon, nắp cao su và đầu micropipette, được tiệt trùng bằng phương pháp nhiệt ẩm trong nồi autoclave để đảm bảo an toàn và hiệu quả trong các thí nghiệm.
- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật:
+ Môi trường nuôi cấy vi sinh vật thường được tiệt trùng ở 121 o C Thời gian tiệt trùng phù thuộc khối lượng đem tiệt trùng, thường từ 20-30 phút.
Đối với các thành phần dinh dưỡng nhạy cảm với nhiệt độ cao, phương pháp tiệt trùng thông thường không thể áp dụng; thay vào đó, cần sử dụng màng lọc vi khuẩn Phương pháp tiệt trùng Pasteur và Tyndall là những lựa chọn hiệu quả để bảo vệ chất lượng dinh dưỡng mà không làm mất đi giá trị của chúng.
- Phương pháp tiệt trùng Pasteur :
Quá trình tiệt trùng thực phẩm là việc làm nóng chất lỏng đến nhiệt độ nhất định trong thời gian cụ thể, ví dụ như tiệt trùng sữa ở 71°C trong 15 giây, sau đó làm lạnh nhanh chóng Phương pháp này giúp làm chậm quá trình hư hỏng của thực phẩm.
Phương pháp này không tập trung vào việc tiêu diệt hoàn toàn tất cả các tế bào vi sinh vật, mà chủ yếu nhằm kiểm soát và giảm thiểu sự hiện diện của chúng, đồng thời làm chậm quá trình phát triển và sinh sản của vi sinh vật.
Phương pháp đun cách thủy ở nhiệt độ 50-55 độ C trong 1 giờ mỗi ngày hoặc 70-80 độ C trong 30 phút trong 3 ngày liên tiếp có khả năng diệt khuẩn hiệu quả Phương pháp này thường được áp dụng để tiệt khuẩn các dung dịch chứa albumin, dụng cụ chất dẻo và một số dung dịch đặc biệt dùng trong cấy khuẩn.
Phương pháp này hiệu quả trong việc tiêu diệt vi khuẩn và nha bào nhanh chóng, tiệt khuẩn nhiều dụng cụ và vật dụng khác nhau, đồng thời dễ dàng kiểm soát nhiệt độ Tuy nhiên, nếu thao tác không đúng cách hoặc thiếu kinh nghiệm, có thể dẫn đến tai nạn nguy hiểm.
2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh vật: a Khái niệm chung:
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật là hỗn hợp các chất thiết yếu cho sự sống của chúng Để nghiên cứu hoặc ứng dụng vi sinh vật, cần gieo cấy chúng trên môi trường phù hợp.
Để duy trì sự sống, hầu hết vi sinh vật cần các nguyên tố hóa học tương tự nhau, tuy nhiên, khả năng đồng hóa của từng loại vi sinh vật lại khác nhau.
Vì vậy không có một môi trường dinh dưỡng nào thích hợp cho tất cả các loài vi sinh vật.
- Môi trường gieo cấy vi sinh vật đạt được yêu cầu cơ bản sau:
+ Có đầy đủ dinh dưỡng cần thiết.
+ Có pH thích hợp, độ nhớt nhất định.
Môi trường nuôi cấy có thể được đặt tên theo tên của người phát hiện, như môi trường Endo, Saburo, hay Raulin Tuy nhiên, cách đặt tên tốt nhất là dựa vào nguồn carbon và nitơ có trong môi trường, ví dụ như môi trường saccharose nitrat và pepton glucose.
Dựa vào thành phần, nguồn gốc, cấu trúc, mục đích sử dụng mà có nhiều cách để phân loại môi trường.
- Phân loại theo thành phần và nguồn gốc:
Môi trường tự nhiên chứa nhiều hợp chất có thành phần chưa xác định và không có công thức hóa học rõ ràng, điển hình là pepton và cao thịt.
Tiến hành làm môi trường
Nghiên cứu sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật là một trong những khâu quan trọng nhất, đòi hỏi sự cẩn thận và chính xác trong từng bước thực hiện Quá trình làm môi trường cần được tiến hành theo các bước cụ thể để đảm bảo kết quả nghiên cứu chính xác.
1 Chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm, nguyên liệu đã vô trùng:
- Rửa sạch với xà phòng
- Tráng lại với nước cất
- Làm nút bông, nút giấy cho ống nghiệm, erlen, gói giấy cho đĩa petri,pipette, que trang….Sau đó đem đi tiệt trùng ở 121 o C, 1 at, 15-20 phút
- Nguyên liệu vật liệu làm môi trường cần được sử lí thích hợp.
Từ công thức, thành phần môi trường nuôi cấy nấm men cho 250 ml, pH=6
Cân chính xác từng thành phần bằng cân 4 số lẻ, cho vào erlen , thêm nước vừa đủ 250ml.
3 Phân phối vào dụng cụ chứa:
- Môi trường được chứa vào trong ống nghiệm đã được chuẩn bị trước( sạch, khô, có nút đậy, vô khuẩn )
Để tiến hành phân phối, hãy giữ ống nghiệm bằng tay trái và nhẹ nhàng xoay nút bộng bằng tay phải Kẹp chặt nút bộng giữa hai ngón út và áp út, sau đó kéo ra và giữ nút bông ở vị trí đó Đặt phễu lên ống nghiệm và đổ môi trường vào Tiến hành lần lượt cho vào 8 ống nghiệm chứa môi trường chiếm ẵ thể tớch và 8 ống nghiệm chứa ẳ thể tớch.
- Đậy nút bông, nút giấy lại và để vào giá đỡ.
- Khi phân phối môi trường cần phải cẩn thận, tuyệt đối không để môi trường dây lên miệng dụng cụ chứa hoặc dính vào nút bông.
Sau khi phân phối, các ống nghiệm cần được tiệt trùng ngay lập tức để ngăn chặn sự phát triển của vi sinh vật, vì chúng có thể làm thay đổi thành phần dinh dưỡng Quá trình tiệt trùng được thực hiện bằng nồi hấp autoclave sử dụng hơi bão hòa.
Để làm thạch đứng, bạn cần chuẩn bị 8 ống nghiệm và đổ vào đó một lượng mụi trường đặc vừa đủ Sau khi đổ thạch còn lỏng vào ống, hãy để chúng đứng yên Khi thạch nguội, nó sẽ đông lại và tạo thành thạch đứng.
Để làm thạch nghiêng, bạn cần 8 ống nghiệm với mụi trường chiếm đầy thể tích ống nghiệm Sau khi vô khuẩn, để thạch lỏng vào ống nghiệm và nghiêng ở vị trí thích hợp cho đến khi thạch đông lại hoàn toàn Lưu ý rằng đầu trên của mặt nghiêng không được vượt quá 2/3 chiều dài ống nghiệm và không để thạch chạm vào nút bông Mặt nghiêng cần phải bằng phẳng, không bị đứt và có chiều dài vừa phải.
- Bảo quản các ống nghiệm đã đông đặc trong tủ, không để môi trường bị khô hay bị tác động của ánh sáng.
Trước khi sử dụng, cần kiểm tra độ vô khuẩn của môi trường Để thực hiện điều này, hãy đặt môi trường vào tủ ấm với nhiệt độ 37-38 độ C trong 2 đến 3 ngày Sau thời gian này, hãy lấy ra và quan sát, loại bỏ những ống môi trường có sự phát triển của vi sinh vật.
Kết quả và nhận xét
- Dung dịch môi trường màu hơi đà.
Mặt thạch cần phải phẳng, liên tục và có chiều dài vừa phải, không tiếp xúc với nút bông Độ cứng của thạch phải đủ để hỗ trợ sự phát triển của vi sinh vật, đồng thời thuận lợi cho việc định hình và nuôi cấy.
- Có 1 ống nghiệm bị nhiếm khuẩn và đã được loại bỏ tránh nhiễm khuẩn cho các ống nghiệm còn lại.
KỸ THUẬT GIEO CẤY – NUÔI CẤY VI SINH VẬT
Mục tiêu bài thí nghiệm
- Biết được phương pháp tiệt trùng, khử trùng dụng cụ và môi trường làm việc.
- Biết cách bao gói và vô trùng dụng cụ thí nghiệm.
- Biết cách làm môi trường để nuôi cấy vi sinh vật, môi trường nấm men.
II Tổng quan phòng thí nghiệm vi sinh:
1 Hệ thống phòng thí nghiệm vi sinh:
- Phòng nhận và trữ mẫu
2 Thiết bị phòng thí nghiệm:
Thiết bị tiệt trùng bao gồm nồi hấp để tiệt trùng khô và ẩm ở nhiệt độ và áp suất an toàn, autoclave, cùng với tủ sấy để làm khô dụng cụ trước khi tiến hành tiệt trùng.
- Máy lắc: Cho ống nuôi cấy vào đĩa, máy lắc có tác dụng làm tăng hàm lượng oxy vào mẫu, dùng cho vi sinh vật hiếu khí.
- Thiết bị nuôi cấy yếm khí: Đặt thêm mẫu hóa chất bên trong để hút CO2 sinh ra.
- Tủ ấm: hoạt động ở 25-60 o C, nhưng thường thì người ta sử dụng từ 30-40 o C. Trong phòng thí nghiệm: 37 o C.
- Tủ cấy: gồm phòng cấy, hệ thống tiệt trùng dùng tia UV: 200-290nm hoặc bơm lọc không khí.
Bể điều nhiệt là thiết bị dùng để truyền nhiệt cho môi trường và vi sinh vật, hoạt động hiệu quả với nước ở nhiệt độ dưới 100 độ C Khi nhiệt độ vượt quá 100 độ C, thiết bị sẽ sử dụng dầu để đảm bảo hiệu suất Bể còn được trang bị bộ phận điều chỉnh nhiệt và hệ thống lắc, giúp duy trì sự đồng nhất trong quá trình điều nhiệt.
- pH kế: điều chỉnh pH trong môi trường nuôi cấy.
Ngoài ra còn có các thiết bị như: máy phá mẫu, máy trộn mẫu, kính hiển vi, cân, nhiệt kế….
Hình 1.1: Máy lắc Hình 1.2: Tủ cấy vi sinh vật
3 Dụng cụ thí nghiệm vi sinh:
- Dụng cụ chứa mẫu và nuôi trồng: erlen , bercher , pipet, bình định mức, ống nghiệm có nắp hoặc không nắp…
+ Ống nghiệm: thường có đường kính d=8-15 mm, thường thì sử dụng dmm + Đĩa petri: có d=8-12 cm, gồm có một nắp nhỏ và một nắp lớn.
Que cấy bao gồm que thẳng để cấy điểm và lấy mẫu vi sinh vật, que vòng dùng cho cấy chuyền, cấy ria và lấy mẫu vi sinh vật, cùng với que mốc để lấy khuẩn lạc, khuẩn ty và gieo cấy.
+ Que trang: có một đầu tam giác, được làm bằng thủy tinh.
+ Đũa thủy tinh: Dùng để khuấy dung dịch.
+ Lam kính có dạng hình chữ nhật
+ Lamen có dạng hình vuông, mỏng hơn lam kính
+ Buồng đếm vi sinh vật
+ Màng lọc vi sinh vật.
Hình 1.3: Đĩa petri Hình 1.4: Que cấy vòng bằng kim loại
III Sơ lược lý thuyết:
1 Tiệt trùng dụng cụ và môi trường làm việc: a Tiệt trùng bề mặt và môi trường làm việc:
Khi làm việc với vi sinh vật, việc duy trì môi trường và bề mặt làm việc vô khuẩn là rất quan trọng để ngăn ngừa lây nhiễm từ các vi sinh vật không mong muốn Sự vô trùng không chỉ phụ thuộc vào phương pháp tiệt trùng mà còn liên quan đến điều kiện và sự thông gió của khu vực làm việc.
+ Cửa sổ và cửa ra vào phải được đóng chặt trước thời điểm làm việc
Để tiệt trùng không khí trong phòng, bạn có thể lắp đặt đèn UV trên trần nhà và bật trong 15 phút Quá trình chiếu UV sẽ sinh ra ozone, tạo ra mùi đặc trưng trong không khí ngay sau đó.
+ Bề mặt làm việc được tiệt trùng bằng cách lau ethanol 70% Khi lau cồn, lưu ý không được bật đèn cồn vì có thể xảy ra hỏa hoạn.
+ Thực tế nếu môi trường làm việc không đáp ứng được yêu cầu kín gió và lắp đèn
Để ngăn ngừa nhiễm vi sinh vật trong mẫu thí nghiệm, có thể sử dụng tủ sấy hoặc thao tác khéo léo với đèn cồn Đồng thời, việc tiệt trùng dụng cụ làm việc cũng rất quan trọng để đảm bảo độ chính xác và an toàn cho thí nghiệm.
- Dụng cụ bằng thủy hoặc kim loại:
+ Chuẩn bị trước khi tiệt trùng:
• Trước khi tiệt trùng cần được làm sạch và sấy khô.
Sau khi tiệt trùng dụng cụ, cần gói kín chúng trong giấy, giấy bạc hoặc hộp kín để ngăn chặn sự nhiễm bẩn vi sinh vật từ môi trường bên ngoài.
Ống nghiệm thủy tinh cần được đậy kín bằng nút bông không thấm nước và sau đó, phần đầu ống nghiệm có nút bông cần được gói chặt bằng giấy trước khi tiến hành tiệt trùng.
• Hộp petri cần được gói kín trong giấy.
• Pipet thủy tinh cần được gắn một nút bông nhỏ ở phần cuối của pipet, sau đó bọc kín trong giấy.
• Que trang, đũa thủy tinh nếu cần tiệt trùng cũng cần phải gói kín trong giấy. + Phương pháp tiệt trùng:
• Phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt khô: Sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 170-
180 o C, trong thời gian 1-2 giờ đối với vật cần tiệt trùng không có nắp bông. Nếu có nắp bông, sấy ở nhiệt độ 150-160 o C trong khoảng 3 giờ.
• Phương pháp tiệt trùng bằng nhiệt ẩm: thường thực hiện trong nồi autoclave ở áp suất 1at, nhiệt độ 121 o C
Dụng cụ bằng plastic chịu nhiệt bao gồm ống nghiệm có nắp chứa chịu nhiệt, với nắp làm từ teflon hoặc cao su, cùng với đầu micropipette Những dụng cụ này được tiệt trùng bằng nhiệt ẩm trong nồi autoclave, đảm bảo an toàn và hiệu quả trong các ứng dụng phòng thí nghiệm.
- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật:
+ Môi trường nuôi cấy vi sinh vật thường được tiệt trùng ở 121 o C Thời gian tiệt trùng phù thuộc khối lượng đem tiệt trùng, thường từ 20-30 phút.
Đối với các thành phần dinh dưỡng nhạy cảm với nhiệt độ cao, phương pháp tiệt trùng không phù hợp và cần áp dụng màng lọc vi khuẩn Hai phương pháp tiệt trùng phổ biến là Pasteur và Tyndall, mỗi phương pháp có những ưu điểm riêng trong việc bảo vệ chất lượng thực phẩm và dinh dưỡng.
- Phương pháp tiệt trùng Pasteur :
Tiệt trùng là quy trình làm nóng thực phẩm, thường là chất lỏng, đến nhiệt độ nhất định trong thời gian cụ thể, như tiệt trùng sữa ở 71 độ C trong 15 giây, sau đó làm lạnh nhanh chóng Phương pháp này giúp làm chậm quá trình hư hỏng của thực phẩm.
Phương pháp này không nhằm tiêu diệt hoàn toàn tất cả các tế bào vi sinh vật, mà chủ yếu tập trung vào việc kiểm soát và giảm số lượng vi sinh vật, đồng thời làm chậm sự phát triển và sinh sản của chúng.
Phương pháp đun cách thủy ở nhiệt độ 50-55 độ C trong 1 giờ mỗi ngày hoặc 70-80 độ C trong 30 phút trong 3 ngày liên tiếp có khả năng diệt vi khuẩn hiệu quả Phương pháp này thường được áp dụng để tiệt khuẩn các dung dịch chứa albumin, dụng cụ chất dẻo và một số dung dịch đặc biệt dùng trong cấy khuẩn.
Phương pháp này hiệu quả trong việc tiêu diệt vi khuẩn và nha bào nhanh chóng, đồng thời có khả năng tiệt khuẩn nhiều dụng cụ, vật dụng khác nhau Ngoài ra, nó cũng cho phép kiểm soát nhiệt độ một cách dễ dàng Tuy nhiên, nếu không thực hiện đúng cách và thiếu kinh nghiệm, có thể dẫn đến những tai nạn nguy hiểm.
2 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy vi sinh vật: a Khái niệm chung:
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật là hỗn hợp các chất thiết yếu cho sự sống của chúng Để nghiên cứu hoặc ứng dụng vi sinh vật, cần gieo cấy chúng trên môi trường phù hợp.
Kỹ thuật gieo cấy
- Nhân giống vi sinh vật
Nuôi cấy vi sinh vật từ mẫu vào môi trường nuôi cấy phù hợp giúp phát hiện sự hiện diện của vi sinh vật trong mẫu.
- Bảo tồn giống: chuyền giống từ ống này sang ống khác có đầy đủ chất dinh dưỡng để vi sinh vật được bảo tồn
- Nghiên cứu hình thái, đặc điểm và đặc tính vi sinh vật
- Môi trường thích hợp cho vi sinh vật
- Môi trường làm việc, gieo cấy vô khuẩn
- Que cấy thẳng: dùng để cấy điểm
- Que cấy vòng: dùng để cấy chuyền từ canh trường này sang môi trường khác
- Que cấy móc: lấy sợi khuẩn ty của nấm mốc cấy sang một môi trường mới
Hình 2.3: Que cấy móc b Môi trường:
- Theo thành phần: + Tự nhiên
+ Tổng hợp + Bán tổng hợp
- Theo tính chất vật lý:
+ Lỏng: ẳ đến ẵ ống nghiệm, tối đa là 2/3 ống, khụng cú nỳt bụng
+ Rắn: thêm vào agar, gelatin
• Thạch đứng: sử dụng cho cấy điểm
• Thạch nghiờng: ẳ ống nghiệm, phần nghiờng trờn cựng ống khụng chạm nỳt bông
• Đổ hộp mụi trường: đổ ẳ 1/3 hộp thạch rắn
+ Bán rắn: gắn giá đỡ giữ vi sinh vật c Chất và dụng cụ vô khuẩn: dung chất và dụng cụ phải được hấp diệt khuẩn trước khi gieo cấy
4 Kiểu gieo cấy: a Cấy chuyền:
Gieo cấy vi sinh vật từ một canh trường thạch nghiêng sang một canh trường thạch nghiêng mới bằng cách sử dụng que cấy vòng Đầu tiên, nhúng que cấy vào canh trường vi sinh vật để lấy một vòng vi sinh vật, sau đó chuyển nó sang canh trường thạch mới để phát triển.
Để chuyển từ môi trường lỏng sang môi trường lỏng, trước tiên cần lấy một vòng vi sinh vật bằng que cấy đã được tiệt trùng trên ngọn lửa đèn cồn Sau đó, đốt đỏ que cấy trên 2/3 chiều dài của nó bằng lửa cồn để đảm bảo tính vô trùng.
+ Canh trường đặc thạch nghiêng: để que cấy vào trong ống nghiệm, không để que cấy dịnh vào thành, ria que cấy trong môi trường mới
- Tất cả các thao tác đều phải làm gần ngọn lửa đèn cồn
Hình 2.4: Một số kiểu gieo cấy chuyền trên ống thạch nghiêng b Cấy điểm:
- Sử dụng que cấy thẳng lấy một điểm vi sinh vật và cấy trên mặt thạch hoặc cấy trên mặt đứng
Gieo cấy vi sinh vật trên hộp Petri là một phương pháp hiệu quả, trong đó thạch chiếm 1/3 chiều cao của đĩa Sau khi cho vi sinh vật vào, môi trường được thêm vào để tách biệt các khuẩn lạc.
Để thực hiện quy trình trải, lấy 0,1ml canh trường nhỏ lên bề mặt đĩa Petri đã chứa sẵn môi trường Sử dụng que trải để phân phối đều canh trường trên bề mặt thạch, đảm bảo que trải và pipet đều phải được vô khuẩn.
Để thực hiện quá trình đổ hộp, đầu tiên bạn cần cho 0,2-1ml canh trường vào đáy hộp Petri Sau đó, đổ môi trường vào khoảng 1/3 hộp và xoay đều trên mặt bàn Khi thạch còn hơi ấm (45-50 o C), việc trộn vi sinh vật vào sẽ giúp chúng không bị chết.
- Dùng để phân lập, tách vi sinh vật
- Sử dụng que cấy vòng đã được tiệt trùng trên ngọn lửa đèn cồn
Cấy vi sinh vật thành nhiều đường là quy trình quan trọng trong vi sinh học Đầu tiên, lấy toàn bộ vi sinh vật và đốt trên lửa cồn để khử trùng Tiếp theo, lấy một ít vi sinh vật từ đuôi đường đầu tiên và tiếp tục đốt trên lửa cồn Quy trình này được lặp lại từ 3-4 lần tùy thuộc vào từng loại vi sinh vật, và đường cuối cùng sẽ cho ra những khuẩn lạc rời rạc.
Hình 2.5: Gieo cấy ria trên hộp Petri
Thực hành
1 Chuẩn bị dụng cụ thí nghiệm:
- Rửa sạch tất cả dụng cụ với xà phòng
- Tráng lại với nước cất
- Sấy (5 ống nghiệm và 2 erlen)
2 Chuẩn bị môi trường: môi trường cho chủng nấm men
- 5 ống nghiệm: mỗi ống cho vào 9ml nước cất có đánh số thứ tự từ 1 đến 5
- Erlen 250ml: cho vào 95ml nước cất
- 4 ống nghiệm mụi trường, mỗi ống chứa ẵ ống (cú sẵn từ bài thớ nghiệm 1) đem làm lỏng, để nguội về khoảng 50 o C
Bài thí nghiệm yêu cầu sử dụng 8 ống nghiệm mũi trường, mỗi ống chứa môi trường thạch nghiêng Đặc biệt, đầu trên cùng của thạch không được chạm vào nút bông để đảm bảo môi trường phát triển tối ưu cho vi sinh vật.
- 2 ống nghiệm canh trường có sẵn chủng nấm men
3 Gieo cấy trên môi trường thạch nghiêng:
Để tiệt trùng que cấy vòng, cần đốt ở vị trí 1/3 ngọn lửa đèn cồn từ dưới lên cho đến khi vòng kim loại nóng đỏ Sau đó, dựng đứng que cấy để đảm bảo vô khuẩn.
Cầm 1 ống canh trường và 1 ống mụi trường, đặt ống mụi trường ở trong và ống canh trường ở ngoài Gỡ bỏ nút giấy và nút bông, sau đó hơ đầu bông gần ngọn lửa cồn để tiệt trùng Tiếp theo, hơ đầu ống canh trường và môi trường nhằm đảm bảo vệ sinh.
- Để que cấy nguội, đưa que cấy vòng vào thẳng cuối ống nghiệm canh trường, đặt nhẹ vào canh trường để lấy một vòng nấm men rồi lấy ra.
Đưa que cấy vào ống môi trường và ria hình zic zắc trên mặt thạch nghiêng, chú ý thực hiện nhẹ nhàng để không làm hư mặt thạch Sau đó, lấy que cấy ra, hơ đầu bông và đầu ống nghiệm, rồi đậy lại cẩn thận.
- Chú ý khi đưa que cấy vào và ra 2 ống canh trường và môi trường không để vòng cấy chạm vào thành ống nghiệm
- Làm tiếp tục với 3 ống ẳ tiếp theo để quen thao tỏc
- Dựng ống canh trường thứ 2 và 4 ống mụi trường ẳ cũn lại để gieo cấy thật
- Sau cùng mỗi lần cấy phải hơ tiệt trùng que cấy để bỏ vi sinh vật còn sót lại rồi mới gieo cấy tiếp
4 Gieo cấy trên hộp Petri
Sau khi làm lỏng 4 ống nghiệm môi trường (ống ẵ) và để nguội khoảng 50°C, tiến hành đổ lần lượt vào các nắp nhỏ của 4 hộp Petri, với chiều cao môi trường đạt khoảng 1/3 hộp Petri, nhằm cho môi trường đặc lại.
Sau khi thực hiện thí nghiệm gieo cấy trên thạch nghiêng, hãy thêm khoảng 5-10ml nước cất vào ống canh trường Tiếp theo, lắc nhẹ để đảm bảo rằng chủng nấm men được phân bố đều trong nước.
- Lấy 5ml dung dịch trong ống canh trường cho vào erlen chứa 95ml nước cất, lắc nhẹ
Sử dụng pipet, lấy 1ml dung dịch từ erlen và cho vào ống nghiệm 1 có chứa 9ml nước cất để thực hiện pha loãng 10 lần Sau đó, đặt ống nghiệm 1 vào máy lắc và lắc trong vài giây.
Sử dụng pipet khác, lấy 1ml dung dịch từ ống nghiệm 1 và cho vào ống nghiệm 2 chứa 9ml nước cất để pha loãng với tỷ lệ 10 lần Sau đó, đặt ống nghiệm 2 vào máy lắc và lắc trong vài giây.
- Tiếp tục pha loãng thao tác như trên với ống nghiệm 3, 4, 5
Sử dụng pipet để lấy 0,1ml dung dịch trong ống nghiệm 3, giữ pipet bằng ngón trỏ và đưa gần ngọn lửa cồn Khi hộp Petri chứa môi trường đã đông đặc, hé miệng hộp Petri để tránh nhiễm vi sinh vật từ không khí, sau đó hơ nhẹ miệng hộp Petri và đưa pipet vào trong, thả pipet để dung dịch chảy lên bề mặt thạch Tiếp theo, dùng que trang đã được tiệt trùng bằng cách hơ trên lửa cồn, hé miệng hộp Petri (hơ lửa cồn) và đặt que trang lên mặt hộp để làm tan nước đọng, sau đó dùng que trang để phân bố đều dung dịch trên bề mặt thạch, mỗi lần trang cần xoay góc hộp.
Sau khi trang đều mặt thạch ở nhiệt độ 90 độ, hãy đậy hộp Petri lại và hơ lửa cồn xung quanh để tiệt trùng Trước khi gieo cấy lần tiếp theo, nhúng que trang vào cồn 70 độ và đốt để đảm bảo vệ sinh Gói giấy đĩa Petri cần được đặt nắp lớn ở dưới để khi nuôi cấy, nước không đọng lại, tránh làm hỏng kết quả thí nghiệm.
- Làm tiếp tục thao tác như trên với ống nghiệm 4 (2 lần) và ống nghiệm 5 (1 lần)
- Sau khi gieo cấy xong, đem các hộp Petri đã gói giấy đi ủ ở 37 o C
Khi sử dụng hộp Petri, cần lưu ý rằng mỗi lần mở và đóng nắp đều phải hơ lửa cồn để đảm bảo vệ sinh Ngoài ra, que cấy cũng cần được nhúng vào cồn 70 độ và đốt cho đến khi cháy hết trước và sau mỗi lần cấy để tiệt trùng hiệu quả.
Kết quả và nhận xét
1 Gieo cấy trên môi trường thạch nghiêng:
Hình 2.6: Kết quả gieo cấy chuyền
Tất cả bốn ống nghiệm đều được gieo cấy thành công mà không bị nhiễm mốc, nhờ vào việc miệng ống tiếp xúc với không khí ít Điều này cho thấy rằng khi thực hiện cấy đúng kỹ thuật, đảm bảo vô trùng tốt và tắt quạt, khả năng nhiễm khuẩn sẽ được giảm thiểu.
Phương pháp cấy nghiêng là một kỹ thuật đơn giản và dễ thực hiện, nhưng chủ yếu phù hợp cho các thí nghiệm và nghiên cứu quy mô nhỏ Để thực hiện cấy với số lượng lớn, phương pháp cấy trộn trên đĩa Petri là lựa chọn hiệu quả hơn.
- Tuy nhiên kết quả cấy bị lan ít Nguyên nhân:
+ Vết cấy ziczac không đồng đều tay, chỗ quá thưa, chỗ quá dày làm vi sinh vật phát triển chồng lên nhau
+ Thao tác mạnh tay khiến mặt thạch bị rách
Khi thực hiện quá trình vô khuẩn que cấy, cần lưu ý rằng nếu lấy vi sinh vật khi que cấy còn nóng, vi sinh vật sẽ chết Ngược lại, nếu để que cấy nguội trong không khí, nó sẽ dễ bị nhiễm khuẩn Để làm nguội que cấy một cách an toàn, bạn có thể đặt que cấy lên thành bên trong ống nghiệm ở vị trí không có thạch và cảm nhận nhiệt độ qua thành ống nghiệm.
- Các loại nấm mốc trắng dễ bị nhiễm vào: mốc trắng (Rhizopus), mốc xám (Mucor), mốc xanh (Penicillium)…
2 Gieo cấy trên hộp Petri
Tất cả bốn ống nghiệm ở ba nồng độ khác nhau đều cho kết quả gieo cấy nấm men thành công, không bị nhiễm Điều này đạt được nhờ thao tác đúng cách khi mở hộp Petri, bao gồm việc mở nắp hộp vừa phải và thực hiện gần ngọn lửa đèn cồn.
- Ống nghiệm 3 có nồng độ môi trường cao nên lượng nấm men nhiều
- 2 ống nghiệm 4 có nồng độ môi trường thấp hơn nên nấm men dù phát triển nhưng ít dày đặc hơn so với ống nghiệm 3
- Ống nghiệm 5 có nồng độ môi trường thấp nhất nên lượng nấm men sau khi gieo cấy cũng là ít nhất
Hình 2.7: Kết quả gieo cấy từ ống nghiệm 3 Hình 2.8: Kết quả gieo cấy từ ống nghiệm 5
Hình 2.9: Kết quả gieo cấy từ ống nghiệm 4
PHÂN LẬP VSV VÀ ĐỊNH LƯỢNG VSV BẰNG PP GIÁN TIẾP
Nội dung thí nghiệm
1 Kỹ thuật phân lập a Định nghĩa
Phân lập vi sinh vật là quá trình tách riêng các loài vi sinh vật từ quần thể ban đầu để thu được dạng thuần khiết Quá trình này đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật.
Vi sinh vật thuần khiết là giống vi sinh vật được tạo ra từ một tế bào ban đầu.
Trong tự nhiên và các vật phẩm nghiên cứu, vi sinh vật thường xuất hiện dưới dạng hỗn hợp nhiều loài khác nhau Để nghiên cứu hình thái, sinh lý, sinh hóa hoặc ứng dụng thực tiễn của một loài cụ thể, cần thiết phải tách chúng ra thành dạng thuần khiết.
Nguyên tắc cơ bản trong nuôi cấy vi sinh vật là tách rời các tế bào, sau đó nuôi cấy chúng trong môi trường dinh dưỡng đặc trưng Điều này giúp khuẩn lạc phát triển một cách riêng rẽ và cách biệt, đảm bảo tính chính xác trong nghiên cứu và ứng dụng vi sinh vật.
Các bước phân lập: b Các phương pháp phân lập
Vi sinh vật được pha loãng và trộn đều với môi trường agar nóng chảy, sau đó được đổ vào hộp petri vô khuẩn Sau thời gian nuôi cấy ở nhiệt độ thích hợp, vi sinh vật sẽ phát triển thành các khuẩn lạc riêng biệt, mỗi khuẩn lạc chỉ chứa một loài vi sinh vật thuần chủng.
• Cách tiến hành thí nghiệm
+ Nấu chảy ống nghiệm có chứa 15ml môi trường dinh dưỡng đặc
+ Đặt 4 ống nghiệm có chứa môi trường vào bể điều nhiệt 45-50 0 C
+ Chuẩn bị 4 hộp petri đã vô khuẩn, ghi độ pha loãng lên mỗi hộp
+ Hút 5ml dung dịch chứa Bacillus Subtillis cho vào Erlen chứa 95ml nước cất đã được vô khuẩn
+ Hút 1ml dung dịch từ Erlen cho vào ống nghiệm thứ nhất có chứa 9ml nước cất, lắc kĩ trên Vortex, ta có độ pha loãng 10 -1
+ Hút 1 ml từ ống nghiệm thứ nhất, cho vào ống nghiệm thứ hai có chứa 9ml nước cất, lắc kĩ trên Vortex, ta có độ pha loãng 10 -2
+ Hút 1 ml từ ống nghiệm thứ hai, cho vào ống nghiệm thứ ba có chứa 9ml nước cất, lắc kĩ trên Vortex, ta có độ pha loãng 10 -3
+ Hút 1 ml từ ống nghiệm thứ ba, cho vào ống nghiệm thứ tư có chứa 9ml nước cất, lắc kĩ trên Vortex, ta có độ pha loãng 10 -4
+ Hút 1 ml từ ống nghiệm thứ tư, cho vào ống nghiệm thứ năm có chứa 9ml nước cất, lắc kĩ trên Vortex, ta có độ pha loãng 10 -5
Hình 3.1: Các bước tiến hành thí nghiệm của phương pháp đổ đĩa
+ Ta thực hiện đổ hộp petri bao gồm: 1 hộp 10 -3 , 2 hộp 10 -4 và 1 hộp 10 -5
Lấy 0.2 ml canh trường cho vào hộp petri, sau đó đặt vào hộp 15ml môi trường Đậy nắp và hơ mép hộp trên ngọn lửa đèn cồn Để hộp lên mặt bàn và xoay đều để lực quán tính cuốn vi sinh vật vào môi trường Chờ cho môi trường đông lại, lật úp, gói giấy và ủ ở nhiệt độ 30-32°C.
+ Thực hiện thao tác với 4 hộp petri
V: thể tích cấy ở mỗi đĩa, tính bằng ml n1, n2: số đĩa ở đậm độ pha loãng liên tiếp đã chọn thứ 1 và thứ 2 được giữ lại D: hệ số pha loãng
+ Kết quả thí nghiệm Đậm độ pha loãng 10 -3 : 120 khuẩn lạc Đậm độ pha loãng 10 -4 : 75 khuẩn lạc (đĩa1), 78 khuẩn lạc (đĩa2) Đậm độ pha loãng 10 -5 : 5 khuẩn lạc (đĩa1)
Vậy tổng số vi sinh vật trong mẫu:
Que cấy được sử dụng để phân lập vi sinh vật bằng cách cấy ria hỗn hợp lên bề mặt môi trường đặc trong hộp petri Qua từng lần cấy, các vi sinh vật sẽ được tách ra khỏi hỗn hợp và phát triển thành các khuẩn lạc riêng biệt.
• Cách tiến hành thì nghiệm:
+ Nấu chảy ống nghiệm có chứa 15ml môi trường dinh dưỡng đặc
+ Đặt 4 ống nghiệm có chứa môi trường vào bể điều nhiệt 45-50 0 C
+ Đổ môi trường vào hộp petri, chờ môi trường đặc lại
Hơ đỏ que cấy và làm nguội, sau đó lấy một vòng que cấy đầy hỗn hợp vi sinh vật đã phân lập Tiếp theo, nghiêng hé mở hộp petri và sử dụng que cấy để gạch những đường song song ở góc phần tư thứ nhất của hộp petri.
+ Hơ đỏ que cấy, làm nguội, xoay hộp petri và gạch những đường song song ở góc phần tư thứ 2 của hộp petri
+ Hơ đỏ que cấy, làm nguội, xoay hộp petri và gạch những đường song song ở góc phần tư thứ 3 của hộp petri
+ Hơ đỏ que cấy, làm nguội và gạch những đường song song ở góc phần tư thứ 4 của hộp petri
Để tiến hành thí nghiệm, hãy lật úp hộp petri chứa vi sinh vật, gói kín lại và đặt vào tủ ấm ở nhiệt độ 37 độ C trong 48 giờ Việc không giữ vệ sinh có thể dẫn đến việc bào tử mốc xâm nhập vào mẫu.
+ Sau đó tách rời các khuẩn lạc, soi kính hiển vi xem lại hình thái
+ Nuôi cấy trên môi trường đặc thù
Hình 3.2: Kết quả cấy ria
+ Thao tác chưa quen nên mặt thạch có một số chỗ bị vỡ
Trên các đường vạch đầu, vi sinh vật tạo thành những lớp dày màu trắng, không phân tách thành các khuẩn lạc riêng lẻ Tuy nhiên, ở góc phần tư thứ 3 và 4, hầu như không có khuẩn lạc nào xuất hiện, và một số khuẩn lạc quan sát được là do tình cờ.
+ Một số mẫu bị nhiễm mốc.
+ Nguyên nhân của các vấn đề trên:
Có thể kết quả không như mong muốn là do que cấy quá nóng và chưa được làm nguội, dẫn đến vi sinh vật chết trong quá trình cấy ở giữa hộp.
Hộp bị nhiễm mốc xảy ra khi nắp hộp mở quá lớn, khiến khoảng cách xa với ngọn lửa đèn cồn, tạo điều kiện cho bào tử mốc trong không khí xâm nhập và phát triển bên trong hộp.
Khi thực hiện cấy vi sinh lần đầu, các vết cấy thường không đều và có thể chồng chéo lên nhau Sau khi hoàn thành một góc phần tư của hộp petri, việc xoay hộp để tiếp tục cấy có thể khiến người thực hiện quên vị trí kết thúc của vệt cấy trước đó, dẫn đến kết quả không đạt yêu cầu.
Phân lập được ứng dụng rộng rãi trong việc tách vi sinh vật mong muốn từ đó đi sâu nghiên cứu về chúng.
Viện Thổ nhưỡng – Nông hóa đã thành công trong việc nghiên cứu các chế phẩm vi sinh vật nhằm nâng cao năng suất và chất lượng nông sản Họ đã phân lập các chủng nấm men sinh IAA và GA3 để phát triển chế phẩm kích thích sinh trưởng cây trồng, giúp tăng năng suất cải ngọt từ 20-44% và giảm lượng NO3 - trong thân và lá từ 4-16% Ngoài ra, chế phẩm còn giúp tăng năng suất chè từ 18-33% và cải thiện chất lượng chè.
2 Kỹ thuật định lượng a Định nghĩa Định lượng vi sinh vật là quá trình đếm vi sinh vật trong canh trường
Việc định lượng vi sinh vật là rất quan trọng để đánh giá chất lượng vệ sinh an toàn thực phẩm Các chỉ tiêu vi sinh trong thực phẩm thường liên quan đến hàm lượng của các loài vi sinh vật hoại sinh và vi sinh vật gây bệnh Ngoài ra, từ các chỉ tiêu vi sinh, chúng ta có thể đánh giá tình trạng vệ sinh trong quá trình chế biến và sản xuất tại các cơ sở Các phương pháp định lượng vi sinh vật đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo an toàn thực phẩm.
Phương pháp đếm số tế bào bằng buồng đếm hồng ngoại
Buồng đếm là một phiến kính dày hình chữ nhật với phần lõm phẳng ở giữa Trên bề mặt của buồng đếm, có một lưới gồm 400 hình vuông nhỏ, tổng diện tích đạt 1 mm².
25 ô vuông lớn, mỗi ô vuông lớn có 16 ô vuông Vì thế diện tích 1 ô vuông nhỏ là 1/400 mm 2 , diện tích 1 ô vuông lớn là 1/25 mm 2
Tùy từng loại vi sinh vật mà h khác nhau:
H thấp: 0.01 mm: buồng đếm Pertroff – Hauser dùng để đếm vi khuẩn
H cao: 0.1 – 0.2 mm: buồng đếm Thomas và Malassez dùng để đếm nấm men, tảo
Hình 3.3: Buồng đếm hồng ngoại
Phương pháp MPN (most probable number)
+ Phương pháp MPN dựa trên nguyên tắc xác suất thống kê sự phân bố VSV trong các độ pha loãng khác nhau của mẫu.
+ Mỗi độ pha loãng được nuôi cấy lập lại nhiều lần (3 – 10 lần)
+ Các độ pha loãng được chọn lựa sao cho trong các lần lặp lại có một số lần dương tính và có một số lần âm tính.
+ Số lần dương tính được ghi nhận và so sánh với bảng thống kê => giá trị ước đoán số lượng VSV trong mẫu.
• Vi sinh vật mục tiêu phải có những biểu hiện đặc trưng trên môi trường nuôi cấy như: Sự tạo hơi: Coliforms …, sự đổi màu: S aureus
• Cho phép định lượng được mật độ VSV thấp trong thể tích mẫu lớn
Hình 3.4: Hai hệ thống MPN
+ Bước 1: chuẩn bị các ống nghiệm có chứa môi trường thích hợp cho sự tăng trưởng của đối tượng VSV cần định lượng
Hình 3.5: Phân chia môi trường vào ống nghiệm
+ Bước 2: cấy một thể tích chính xác dung dịch mẫu ở 3 nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp
+ Bước 3: đem ống nghiệm ủ ở điều kiện thích hợp
+ Bước 4: quan sát các biểu hiện chứng minh sự phát triển của vi sinh vật cần kiểm định
+ Bước 5: ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính ở từng độ pha loãng
Hình 3.7: Ghi nhận số lượng các ống nghiệm dương tính
+ Bước 6: tra bảng Mac Crady để suy ra mật độ vi sinh vật
QUAN SÁT VI SINH VẬT
Kính hiển vi
Hình 4.1: Cấu tạo kính hiển vi Cấu tạo kính hiển vi: gồm 2 phần:
- Phần cơ học: + Thân kính
+ Ống kính + Đế kính + Bàn kính
+ Thị kính: 7x, 15x: độ phóng đại của vi sinh vật = độ phóng đại của vật kính x độ phóng đại của thị kính
+ Bộ tụ quang: tụ quang Khi ánh sáng được chiếu vào có tác dụng tập trung ánh sáng
+ Chắn sáng: vòng ở dưới có thể xoay được để điều chỉnh ánh sáng nhiều hay ít lại Kính hiển vi càng hiện đại thì càng nhìn rõ vật hơn
Vật kính là hệ thống gồm nhiều thấu kính ghép lại, giúp tìm kiếm và quan sát vi sinh vật nhằm xác định hình thái của chúng Các mức độ phóng đại của vật kính bao gồm 4x, 8x, 10x, 40x, 90x, và 100x, trong đó kính hiển vi thường sử dụng các mức 4x, 10x, 40x và 100x.
+ Ốc chỉnh thô: Tìm vi sinh vật Cho lam kính chạm nhẹ vật kính rồi thả ống chỉnh thô ra
+ Ốc chỉnh tinh: Chỉnh để nhìn rõ vi sinh vật Không chỉnh quá nửa vòng
Quan sát vi sinh vật
Đặc điểm Vi khuẩn Nấm men Nấm mốc
Kích thước Rất nhỏ ( 0.5-5.0 μm) Nhỏ (6-10μm) Lớn (5-10 mm)
Hình cầu, kết thành chùm; hình que (cầu khuẩn, trực khuẩn), phẩy khuẩn, xoắn khuẩn
Hình dạng của bào tử có thể là hình cầu, hình ovan, hình trứng hoặc hình tròn Đối với bào tử đơn bào, chúng có cấu trúc sợi trong suốt, trong khi bào tử đa bào có sợi trong suốt và có vách ngăn Cuống bào tử có thể là đơn bào hoặc đa bào, tùy thuộc vào loại hình bào tử.
Nhân Đơn bào, nhân giả Đơn bào, có nhân thật, có màng, có nguyên sinh chất Đa hoặc đơn bào
Trong điều kiện khắc nghiệt có thể sinh bào tử, gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển bình thường
+ Nhân đôi (ít gặp) + Nảy chồi
Sinh bào tử Bào tử nằm trong túi gọi là bào tử kín
+ Trực khuẩn: di chuyển nhanh
+ Phấy khuẩn: di chuyển rất nhanh
Không di chuyển Không di chuyển
Bảng 1: So sánh các đặc điểm của vi khuẩn, nấm men, nấm mốc
Thực hành quan sát tiêu bản sống
Hình 4.2: Phiến kính làm tiêu bản giọt ép Hình 4.3: Phiến kính làm tiêu bản giọt treo
- Ống canh trường đã pha loãng bằng nước cất
2 Cách tiến hành: a Tiêu bản giọt ép:
Để tiệt trùng lam kính, bạn cần nhúng chúng vào cồn 70 độ, sau đó dùng kẹp để gắp lam kính và đốt trên ngọn lửa của đèn cồn Cuối cùng, hãy đặt lam kính lên giá để chúng nguội bớt, thường thì giá sẽ được đặt trên hộp vô-ca.
Để làm sạch lá kính, hãy nhúng nó vào cồn 70 độ và dùng tay cầm lá kính hơ gần ngọn lửa đèn cồn Lưu ý không được đốt trực tiếp trên ngọn lửa cồn và tránh sử dụng kẹp gắp vì lá kính rất mỏng và dễ bị bể.
Sử dụng đũa thủy tinh để lấy một giọt canh trường đã pha loãng và đặt lên lam kính Nghiêng lá kính khoảng 45 độ và nhẹ nhàng phủ lên giọt canh trường để tránh tràn dịch ra ngoài Nếu có dịch tràn ra, có thể dùng giấy thấm để hút bớt Lưu ý không tạo bọt khí khi đặt lá kính.
Hình 4.4: Cách để lá kính lên phiến kinh trong tiêu bản giọt ép
Đặt phiến kính có lá kính lên bàn kính hiển vi và điều chỉnh bàn kính bằng núm chỉnh thô cho đến khi thấy bóng của vi sinh vật lướt qua Sau đó, sử dụng núm chỉnh tinh để quan sát rõ vi sinh vật Đối với vi khuẩn, hãy sử dụng 40x để có được hình ảnh sắc nét.
Thao tác tiệt trùng lam kính và lá kính tương tự như quy trình tiêu bản giọt ép Đặc biệt, lam kính dùng trong tiêu bản giọt treo có thiết kế lõm nhẹ ở giữa, giúp tối ưu hóa việc quan sát mẫu.
Sử dụng đũa thủy tinh, lấy một giọt canh trường đã được pha loãng và đặt lên lá kính Sau đó, úp ngược lá kính chứa giọt canh trường lên bề lõm của lam kính.
Hình 4.5: Cách để lá kính lên phiến kính trong tiêu bản giọt treo
- Đem đi quan sát dưới kính hiển vi, thao tác giống như làm tiêu bản giọt ép
Nhuộm màu vi sinh vật bằng dung dịch xanh methylene giúp dễ dàng quan sát chúng Khi sử dụng phương pháp này, dịch canh trường sẽ có màu xanh, trong khi tế bào nấm men vẫn giữ nguyên trạng thái trong suốt Phương pháp nhuộm cho phép xác định tình trạng sống chết của vi sinh vật: nếu tế bào còn sống, màng tế bào sẽ ngăn cản thuốc nhuộm thẩm thấu, giữ cho tế bào trong suốt; ngược lại, nếu tế bào đã chết, thuốc nhuộm sẽ thẩm thấu vào tế bào, làm chúng chuyển sang màu của thuốc nhuộm Qua đó, phương pháp này cũng giúp đếm số lượng tế bào sống và chết.
V Kết quả và nhận xét:
Hình 4.6: Kết quả quan sát tế bào nấm men
Tế bào nấm men là những tế bào nhỏ, không có khả năng di chuyển Khi quan sát dưới kính hiển vi, hiện tượng nấm men bị trôi là do sự chuyển động của nước trong môi trường xung quanh.
- Tế bào vi khuẩn rất nhỏ, có chuyển động
- Khi thực hiện thao tác với kính hiển vi phải rất thận trọng
QUAN SÁT NẤM MEN
Sơ lược lý thuyết
1 Nấm men a Khái quát về nấm men
Nấm men là nhóm vi sinh vật chủ yếu được sử dụng trong công nghiệp, với đặc điểm là đơn bào và không có khả năng di chuyển Hình dạng và kích thước của nấm men thay đổi theo điều kiện môi trường, thường có hình cầu, hình trứng hoặc hình bầu dục Kích thước của nấm men tương đối lớn, chiều dài dao động từ 6-10μm, thậm chí có thể lên đến 12-18μm, trong khi chiều ngang từ 4-8μm.
- Về cấu tạo tế bào: Gồm màng nguyên sinh chất, hạch Trong nguyên sinh chất có không bào và các chất chứa đựng khác.
Hình 5.1: Cấu tạo nấm men
- Về sinh sản, nấm men có thể sinh sản theo các hình thức:
+ Nảy chồi: Tế bào mẹ nảy sinh ra một chồi nhỏ rồi lớn dần lên và sẽ tách ra, quá trình nảy chồi diễn ra trong khoảng 2 giờ.
+ Tạo bào tử: Bào tử khi nảy ra ngoài gặp điều kiện sẽ phát triển thành một nấm men mới.
- Trong quá trình phát triển, hình thái nấm men có thể thay đổi
Nấm men trẻ từ 12-16 giờ nuôi cấy có màng mỏng, căng và nguyên sinh chất đồng nhất Trong giai đoạn này, bào quan chưa xuất hiện hoặc mới bắt đầu hình thành, và tế bào sinh sản chiếm tỉ lệ cao.
+ Ở nấm men trưởng thành (24-48 giờ nuôi cấy), kích thước điển hình, không bào lớn, tế bào sinh sản chiếm 10-15%.
Nấm men già, được nuôi cấy từ 72 giờ trở lên, có đặc điểm là màng dày nhẵn và nguyên sinh chất không đồng nhất Trong giai đoạn này, tế bào không còn khả năng sinh sản, không có bào lớn và lượng chất béo tăng lên Đặc biệt, nấm men không chứa glycogen và tỷ lệ tế bào chết chiếm ưu thế Việc quan sát nấm men sống và chết giúp hiểu rõ hơn về sự phát triển và trạng thái của chúng.
Nguyên tắc nhuộm tế bào dựa trên việc tế bào chết hấp thụ thuốc nhuộm dễ dàng hơn so với tế bào sống Điều này cho phép chúng ta sử dụng xanh methylen để nhuộm và phân biệt giữa các loại tế bào.
Để tiến hành quan sát tế bào, bạn cần nhỏ vài giọt dung dịch nấm men Saccharomyces cerevisiae và một giọt thuốc nhuộm xanh methylen (đã pha loãng 10 lần) lên phiến kính Sau đó, nhẹ nhàng trộn đều và đậy lá kính lại Để yên trong 2-3 phút trước khi quan sát Tế bào chết sẽ bắt màu xanh, trong khi tế bào sống sẽ không bắt màu.
Để xác định tỉ lệ tế bào sống và chết, cần đếm tổng số tế bào trên 5 kính trường và tính toán phần trăm tế bào chết Trong giai đoạn sinh trưởng của nấm men, tỉ lệ tế bào chết thường không vượt quá 2-4% Bên cạnh đó, việc quan sát lượng nấm men nảy chồi cũng là một yếu tố quan trọng trong quá trình đánh giá sức khỏe của chúng.
Đánh giá chất lượng canh trường nấm men là bước quan trọng trước khi đưa vào thùng men Để đảm bảo hiệu quả, lượng tế bào nảy chồi trong canh trường nấm men cần đạt ít nhất 10-15%.
- Cách tiến hành: Cho một giọt canh trường nấm men và một giọt NaOH hoặc
Trộn đều H2SO4 10% trên phiến kính, sau đó đậy lá kính lại và đặt lên kính hiển vi để quan sát Tiến hành đếm số lượng tế bào chung và số tế bào đang nảy chồi để tính toán phần trăm.
Tế bào được coi là đang nảy chồi khi chúng có kích thước lớn hơn hoặc bằng tế bào mẹ Nếu tế bào mới lớn hơn tế bào mẹ, thì cần tính là hai tế bào.
Buồng đếm là thiết bị quan trọng trong việc đếm các loại nấm men và vi khuẩn, thường được sử dụng để theo dõi sự phát triển của vi sinh vật trong các quá trình lên men diễn ra trong môi trường lỏng.
Buồng đếm là một phiến kính dày hình chữ nhật, với 4 rãnh song song chia thành 3 khoang chính A, B, C Chiều cao của khoang B thấp hơn hai khoang A và C một đoạn h, được gọi là chiều cao của buồng đếm Khoang B lại được chia thành 2 khoang nhỏ B1 và B2, mỗi khoang có lưới đếm với nhiều ô lớn hình vuông, trong đó một số ô lớn được chia thành các ô nhỏ hơn Bề mặt lá kính đậy là hình vuông và rất phẳng, với chiều cao của buồng đếm và diện tích một ô lớn thường được ghi ở một góc trên bề mặt.
- Thông thường buồng đếm có chiều cao h= 0.01-0,2 mm
Hình 5.2: Cấu tạo buồng đếm vi sinh vật.
Tiến hành thí nghiệm
- Lấy 1ml canh trường pha với 9ml nước cất, ta được dung dịch 10 -1
- Lấy vài giọt dung dịch 10 -1 và dung dịch xanh methylene theo tỉ lệ 1:5, chờ 1-2 phút để vi sinh vật bắt màu.
Đậy lá kính và sử dụng giấy thấm để lau khô bên ngoài, sau đó quan sát dưới 5 trường kính Đếm số lượng tế bào bị nhuộm xanh (tế bào chết) và số tế bào không bị nhuộm xanh (tế bào sống) để tính toán tỷ lệ sống và chết.
- Quan sát tiêu bản tại 5 trường kính.
- Đếm số tế bào nảy chồi và không nảy chồi
1 Đếm tổng số tế bào nấm men có trong 1ml canh trường:
Để pha loãng mẫu dịch 10-2, trước tiên lấy 1ml dung dịch 10-1 và pha với 9ml nước cất, tạo thành dung dịch 10-1 Tiếp theo, lấy 1ml dung dịch 10-1 và pha loãng với 9ml nước cất để thu được dung dịch 10-2.
Để tiến hành thí nghiệm, bạn hãy đậy lá kính lên buồng đếm Sử dụng pipet, lấy vài giọt dung dịch 10 -2 và nhỏ lên gần mép lá kính Điều này giúp dịch tự động lan đều giữa buồng đếm và lá kính.
- Quan sát, đếm và ghi kết quả ở 5 ô lớn.
Kết quả
Hình 5.3: Kết quả sau khi nhuộm
Bảng 2: Kết quả đếm nấm men
- Tỉ lệ tế bào chết trên tổng số tế bào: 11/293= 0.0375= 3.75%
- Tính số tế bào trong 1ml canh trường:
TB chết TB sống Nảy chồi Tổng tế bào Tỉ lệ
Tỉ lệ nảy chồi/tổng Ô 1 1 46 2 47 1/46 2/47 Ô 2 2 55 5 57 2/55 5/57 Ô 3 0 17 3 17 0 3/17 Ô 4 3 51 13 54 3/51 13/54 Ô 5 5 113 38 118 5/113 38/118
(tế bào/ml) Với a: số tế bào đếm được trong các ô lớn b: hệ số pha loãng , b=1/10 -2
1000: hệ số chuyển đổi từ mm 3 sang cm 3 h ; chiều cao của buồng đếm, mm
C: số ô nhỏ trong các ô lớn đếm được, C= 16*5
Nhận xét
- Kết quả tỉ lệ tế bào chết của nhóm = 3.75% < 5% như vậy là đạt yêu cầu, thao tác đúng.
- Số tế bào nảy chồi của nhóm là 20,8%, có thể đưa vào sản xuất tuy nhiên đây không phải là điều kiện tối ưu.
- Đếm vi sinh vật trên buồng đếm cần lưu ý chỉ đếm một lần các tế bào nằm trên đường ranh giới của 2 ô.
Ứng dụng
Nấm men đóng vai trò thiết yếu trong quá trình chuyển hóa vật chất tự nhiên, giúp vô cơ hóa các chất cặn bã và xử lý ô nhiễm, góp phần bảo vệ môi trường sinh thái.
- Nhiều loại nấm men có khả năng lên men rượu, bia, sản xuất cồn, glycerin…
Sản xuất các chất có hoạt tính sinh học cao như enzyme và acid amin, đồng thời tạo ra sinh khối giàu protein và vitamin một cách nhanh chóng, là lý do chính khiến chúng được sử dụng phổ biến trong ngành công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc.
- Ứng dụng làm nở bột mì, tạo hương cho nước chấm, sản xuất lipid…
QUAN SÁT VI KHUẨN
Đặc điểm hình dạng vi khuẩn
- Cầu khuẩn: là những vi khuẩn có dạng hình cầu, rất phổ biến trong tự nhiên, bao gồm:
Đơn cầu khuẩn là vi sinh vật có kích thước rất nhỏ, có khả năng phân chia tế bào theo một mặt phẳng duy nhất, và sau khi phân chia, hai tế bào con sẽ tách rời nhau Chúng chủ yếu là những loài sống hoại sinh, thường xuất hiện nhiều trong đất, nước và không khí.
Song cầu là loại vi khuẩn phân chia tế bào theo một mặt duy nhất, và sau khi phân chia, hai tế bào vẫn dính lại với nhau Chúng chủ yếu là những tác nhân gây bệnh.
Hình 6.1 mô tả cấu trúc của song cầu khuẩn, trong khi tứ cầu khuẩn là dạng phân chia từ một tế bào thành bốn tế bào liên kết với nhau Loại hình này ít gặp trong tự nhiên và quá trình phân chia diễn ra theo hai mặt phẳng vuông góc.
Bát cầu khuẩn, phân chia theo ba mặt phẳng vuông góc, từ một tế bào có thể tạo thành tám tế bào Chúng thường sống hoại sinh trong đất và đóng vai trò quan trọng trong nông nghiệp Chẳng hạn, Sarsina urea có khả năng tổng hợp urease, trong khi một số loài khác lại là ký sinh trên thực vật, gây hư hỏng cho rau quả.
Liên cầu khuẩn (Streptococcus) là vi khuẩn hình cầu, hình thành từ quá trình phân cắt tế bào theo một hướng, tạo thành chuỗi liên kết Chúng phổ biến trong tự nhiên, đặc biệt là trong rau quả và thực phẩm Liên cầu khuẩn có vai trò quan trọng trong công nghiệp như sản xuất acid lactic, chế biến sữa chua, phô mai và rau quả muối chua Tuy nhiên, một số loại liên cầu khuẩn cũng có thể gây ra các bệnh hô hấp và viêm khớp.
Tụ cầu khuẩn (Staphylococcus) là loại vi khuẩn có đặc điểm phân chia tế bào không theo một hướng nhất định, dẫn đến sự sắp xếp hỗn độn của các tế bào sau khi phân chia Trong tự nhiên, chúng chủ yếu là những vi khuẩn gây bệnh.
Trực khuẩn là loại vi khuẩn có hình dạng giống như que, với chiều dài lớn hơn chiều rộng Chúng thường có tiêm mao và di chuyển nhờ vào cấu trúc này Mặc dù phần lớn trực khuẩn tồn tại riêng lẻ, một số loài lại liên kết với nhau hoặc sắp xếp thành chuỗi.
- Xoắn khuẩn: là những vi khuẩn mà tế bào có hình dạng lò xo hay một nửa vòng xoắn Gồm 2 loại chính
+ Phẩy khuẩn: là loại tế bào nửa vòng xoắn
Hình 6.5: Phẩy khuẩn + Spirilium: là loại tế bào có nhiều vòng xoắn
Xoắn khuẩn, như hình 6.6, có khả năng di động thông qua tiêm mao hoặc uốn vặn vòng xoắn Phần lớn chúng là sinh vật sống hoại sinh, nhưng một số loài lại là kí sinh và gây bệnh.
Hình thức sinh sản, phân đôi ở vi khuẩn
- Sinh sản ở vi khuẩn phổ biến nhất là sinh sản vô tính bằng cách phân cắt ngang tế bào với sự tạo thành vách ngăn Các giai đoạn:
Giai đoạn 1 là giai đoạn chuẩn bị quan trọng, trong đó tế bào phát triển nhanh chóng cả về chất lượng và kích thước Tế bào hoàn thiện các bộ phận bên trong và tập trung các chất dự trữ cần thiết để hình thành bộ máy hạt nhân cùng các cấu trúc cho sự ra đời của tế bào con.
Giai đoạn 2 của quá trình phân chia tế bào là giai đoạn hình thành màng ngăn, trong đó hai mấu xuất hiện ở giữa tế bào, đánh dấu vị trí phân đôi Hai mấu này sẽ phát triển tiến gần vào nhau, trong khi cơ sở vật chất của tế bào cũng được tách đôi Quá trình này kết thúc khi hai màng ngăn tiến sát vào nhau, tạo thành hai tế bào con độc lập, mặc dù hai màng vẫn còn dính vào nhau.
Giai đoạn 3 của quá trình phân chia tế bào diễn ra với sự tách rời của hai tế bào con Trong trường hợp phân chia đẳng hình, hai tế bào con sẽ giống nhau, trong khi phân chia dị hình dẫn đến sự không đồng đều giữa chúng Khả năng phân chia của các nhóm vi khuẩn khác nhau cũng có sự khác biệt rõ rệt.
• Cầu khuẩn phân tách 1, 2 hay 3 mặt phẩng trực giao cho 2, 4 hay 8 tế bào con
• Trực khuẩn, xoắn khuẩn chỉ có hình thức cắt ngang tế bào
Vi khuẩn có tốc độ sinh sản nhanh chóng, với thời gian phân chia khoảng 20-30 phút cho mỗi lần Đối với vi khuẩn chịu nhiệt, thời gian này có thể rút ngắn còn 5-10 phút, trong khi vi khuẩn chịu lạnh lại cần từ 10-18 giờ để phân chia một lần.
Quan sát vi khuẩn
- Đối với tiêu bản vi sinh vật sống:
Nhuộm màu đơn là quá trình sử dụng thuốc nhuộm an toàn hoặc ít độc hại cho vi sinh vật, được pha loãng ở nồng độ thích hợp để đảm bảo tế bào vi sinh vật vẫn sống và hoạt động sau khi nhuộm Qua đó, có thể xác định tỷ lệ sống và chết của tế bào vi khuẩn.
+ Không nhuộm màu: làm tiêu bản giọt ép, giọt treo: quan sát hình thái, cấu tạo, chuyển động của vi khuẩn
- Đối với tiêu bản vi sinh vật chết:
• Dùng một loại thuốc nhuộm, một màu duy nhất sao cho thuốc nhuộm gắn chặt vào tế bào vi sinh vật
• Các thuốc nhuộm thường dùng: Blue methylene, Fuchsin, Crytal violet: gential violet
• Quan sát hình thái vi sinh vật
• Kích thước, vi sinh vật sống khó nhầm lẫn
+ Nhuộm màu phức: Sử dụng từ 2 thuốc nhuộm trở lên
• Quan sát hình thái vi sinh vật
• Kích thước vi sinh vật
• Không phân biệt tế bào sống/ chết
• Dùng cho các vi sinh vật có màng nhầy, có nhân, bào tử, phân biệt gram âm và gram dương
Bảng 3: So sánh gram (+) và gram (-)
Kỹ thuật này có nhiều ưu điểm nổi bật, bao gồm khả năng quan sát hình thái cụ thể và cấu tạo bên trong của tế bào như tiêm mao, nhân và không bào Nó cho phép đo kích thước tế bào chính xác, phân biệt được các loại vi khuẩn theo tên gọi, và đặc biệt, không gây hại cho người nghiên cứu vì các mẫu đã được xử lý và chết.
• Nhược điểm: tốn hóa chất, các thao tác phải đúng mới quan sát được
Thực hành nhuộm màu cho tiêu bản vi khuẩn
- Dùng đũa thủy tinh lấy một giọt canh trường lên trên lam kính
Sử dụng que cấy để bôi một lớp chất lỏng hình tròn với độ dày vừa phải Nếu lớp bôi quá mỏng, vi sinh vật có thể bị rửa trôi khi sử dụng nước cất hoặc cồn Ngược lại, nếu lớp bôi quá dày, việc phân biệt giữa vi khuẩn gram âm và gram dương sẽ gặp khó khăn khi nhuộm màu.
Lam kính sau khi đã được làm vết bôi sẽ được để khô tự nhiên
- Cho vài giọt cồn 96 o lên vết bôi đã khô
- Đưa nhanh lam kính vào ngọn lửa cồn để đốt cháy rồi dập tắt nhanh
- Lập lại thao tác đốt cồn và dập tắt nhanh thêm một lần nữa
Trong nhuộm màu thường sử dụng một số màu:
- Gentinal violet, lugol: dùng cho vi khuẩn gram (+)
- Fuchsin: dùng cho vi khuẩn gram (-) a Nhuộm màu lần 1:
- Trên vết bôi đã cố định, cho 2-3 giọt gentinel violet vào (gentinel violet được chuẩn bị từ thuốc tím tinh thể)
Để nhuộm vi khuẩn gram (-) và gram (+), đầu tiên để yên trong 1-2 phút để cả hai loại vi khuẩn đều bắt màu Sau đó, đổ thuốc màu đi và cho vài giọt lugol lên lam kính để tạo phức với gentian violet, để yên khoảng 1 phút Tiếp theo, rửa nhẹ bằng nước cất, nghiêng lam kính để dòng nước chảy qua Tiến hành rửa bằng cồn 96 độ, vài giọt cồn sẽ giúp vi khuẩn gram (-) tách màu khỏi thành tế bào, làm mất màu tím trong khoảng 30-40 giây Cuối cùng, rửa lại bằng nước và chuẩn bị cho bước nhuộm màu lần 2.
- Cho 2-3 giọt Fuchsin lên lam kính Fuchsin sẽ nhuộm màu cho vi khuẩn gram (-)
- Để yên trong 1 phút h Rửa nhẹ bằng nước i Làm khô tự nhiên k Đem lam kính đi quan sát dưới kính hiển vi
- Khi nhuộm màu thường sử dụng tế bào trẻ để gram (-) và gram (+) dễ bắt màu
- Rửa cồn cần rửa nhanh, nếu để lâu gram (+) sẽ bắt màu gram (-)
Có thể sử dụng phương pháp nhuộm màu muối hoặc nhuộm màu ảnh dựa trên màu sắc của thành tế bào vi sinh vật Phương pháp này giúp vi khuẩn nổi bật trên nền, tạo điều kiện thuận lợi cho việc quan sát và phân tích.
Kết quả thí nghiệm
Hình 6.7: Kết quả thí nghiệm nhuộm màu phức
- Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím, Gram (-) bắt màu đỏ
- Vi khuẩn Gram (+) có thể làm mất khả năng giữ màu tím khi tế bào già nên cho kết quả kém chính xác
- Nếu làm vết bôi quá dày, các tế bào sẽ chồng lên nhau, khó quan sát từng tế bào riêng rẽ
- Sử dụng quá nhiều cồn cũng có thể gây mất màu tím
Nhuộm Gram là phương pháp được thực hiện trên cơ thể hoặc mẫu dịch từ thiết bị nghi ngờ nhiễm khuẩn Phương pháp này cung cấp kết quả nhanh chóng và chính xác, giúp phân biệt bệnh do nhiễm khuẩn với các tình trạng khác.
- Tham gia vào quá trình chuyển hóa các chất trong tự nhiên, vô cơ hóa các chất cặn bã, xử lý ô nhiễm, bảo vệ môi trường sinh thái
- Sản xuất các acid hữu cơ và dung môi hữu cơ, các hợp chất có hoạt tính sinh học cao như enzyme, vitamin…
- Có ý nghĩa quan trọng trong lên men thực phẩm Ví dụ: nem chua, yaourt…