1. Xây dựng quy trình và chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột strongyloides stercoralis ở người Đã xây dựng quy trình gồm có bốn bước: + Bước 1: Thiết kế bộ mồi đặc hiệu cho giun lươn đường ruột trên vùng gen 18S rRNA gồm 6 mồi. + Bước 2: Thăm dò và chọn các điều kiện tối ưu cho phản ứng. + Bước 3: Xác định ngưỡng phát hiện LOD 95% của bộ kit là 2,12x100 bản sao genμL + Bước 4: Chế tạo chứng dương bằng cách tạo plasmid tái tổ hợp mang vùng trình tự bảo tồn trên gen 18S rRNA của giun lươn đường ruột sử dụng vector tách dòng pUC19. Đã chế tạo thành công bộ kit LAMP chẩn đoán giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis ở quy mô phòng thí nghiệm với số lượng là 2000 test. 2. Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ kit tại phòng thí nghiệm và thực địa Đánh giá trên 132 mẫu lâm sàng với 32 mẫu dương tính và 100 mẫu âm tính xác định: Độ nhạy bộ kit LAMP chẩn đoán giun lươn đường ruột đạt 96,88%. Độ đặc hiệu bộ kit LAMP chẩn đoán giun lươn đường ruột đạt 97,00%. Bộ kit hoạt động ổn định sau 12 tháng bảo quản ở 200C ±50C và 6 tháng sau khi mở nắp khi bảo quản ở 280C. Bộ kit LAMP chẩn đoán giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis đã được Viện Kiểm định Quốc gia vắc xin và sinh phẩm y tế thẩm định và công nhận đạt yêu cầu theo như tiêu chuẩn cơ sở đã công bố
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Mục tiêu 2: Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ kit tại phòng thí nghiệm và thực địa
Bộ mồi đặc hiệu cho giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis có khả năng nhận diện ADN của loài giun này mà không gây nhầm lẫn với ADN của các sinh vật khác như giun móc hay giun mỏ.
- Các điều kiện phản ứng: Nhiệt độ bắt cặp mồi, nồng độ Mg 2+ , thời gian phản ứng, chất chỉ thị màu
- Ngưỡng phát hiện: Là giới hạn nồng độ ADN của giun lươn
Kỹ thuật LAMP có khả năng phát hiện Strongyloides stercoralis với độ nhạy đạt 100% Ngưỡng phát hiện này tương đương với các nghiên cứu khác liên quan đến việc chẩn đoán giun lươn bằng phương pháp LAMP.
Đánh giá chất lượng chứng dương bao gồm tính chính xác, độ tinh sạch và nồng độ ADN Chứng dương cần được sản xuất với tiêu chuẩn cao để đáp ứng yêu cầu sản xuất test và đảm bảo khả năng lưu trữ cho các nhu cầu sử dụng sau này.
Chúng tôi đã chế tạo 2000 bộ kit để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu tại phòng thí nghiệm và thực địa, cũng như tính ổn định của bộ kit Mỗi hộp được đóng gói 50 test, bao gồm đầy đủ các thành phần cần thiết cho phản ứng LAMP kèm theo hướng dẫn sử dụng chi tiết.
2.2 Mục tiêu 2: Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu, tính ổn định của bộ kit tại phòng thí nghiệm và thực địa
- Bộ kit LAMP sản phẩm của mục tiêu 1
- Mẫu phân thu thập được từ người đã xác định nhiễm, nghi ngờ nhiễm và không nhiễm GLĐR
- Mẫu huyết thanh của người nghi ngờ nhiễm và không nhiễm GLĐR
2.2.2 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
- Thời gian: từ tháng 9 năm 2017 đến tháng 8 năm 2020
+ Thực địa: * Huyện Đức Hòa, tỉnh Long An
* Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch
* Khoa Khám bệnh chuyên ngành, Viện Sốt rét - Ký sinh trùng và Côn trùng Trung ương
* Khoa SHPT Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương
* Bộ môn Vi sinh – Ký sinh, khoa Y, Đại học Y dược TP Hồ Chí Minh
Nghiên cứu thực nghiệm tại phòng thí nghiệm và tại thực địa
- Mẫu dùng để đánh độ nhạy độ, đặc hiệu của bộ kit trong phòng thí nghiệm:
Chúng tôi đã phát triển một bộ mẫu tại phòng thí nghiệm với tỷ lệ dương tính của S stercoralis đạt 25%, nhằm đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kít Mục tiêu của chúng tôi là đạt được độ tin cậy trên 95% trong quá trình đánh giá này.
Số mẫu cần có để đánh giá độ nhạy được xác định bằng công thức [105]: nse = Z 1−α/2 2 ×Pse×(1−Pse)
Trong đó: nse: Cỡ mẫu tối thiểu cần nghiên cứu để xác định độ nhạy
Z 2 1- α/2: Hệ số tin cậy, với ngưỡng xác suất α = 0,05, thì Z 2 1- α/2 = 1,96
Pse: Độ nhạy mong đợi của kit LAMP là: 95%
W: Sai số tương đối cho phép là 10% (0,1)
P: Tỉ lệ trường hợp dương tính trong bộ mẫu thử là: 25%
Từ đó, tính được nse= Z α 2 ×P se ×(1−P se )
Số mẫu cần có để đánh giá độ đặc hiệu được xác định bằng công thức [105]: nsp = Zα 2 ×Psp×(1−Psp)
Trong đó: nsp: Cỡ mẫu tối thiểu cần nghiên cứu để xác định độ độ đặc hiệu
Psp: Độ đặc hiệu mong đợi của kit LAMP là: 95%
Từ đó, tính được nsp= 1,96 2 ×0,95×0,05
Để đánh giá độ nhạy trong phòng thí nghiệm, số mẫu cần thiết lớn hơn so với số mẫu dùng để đánh giá độ đặc hiệu Do đó, chúng tôi đã tính toán cỡ mẫu dựa trên yêu cầu cho độ nhạy, và cỡ mẫu cần thiết là 73 mẫu, trong đó 25% là mẫu dương, tương ứng với 19 mẫu.
Chúng tôi đã tiến hành đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit LAMP trên 132 mẫu phân, bao gồm 100 mẫu không nhiễm GLĐR và 32 mẫu có nhiễm GLĐR Kết quả cho thấy bộ mẫu đủ điều kiện để thực hiện đánh giá này trong phòng thí nghiệm.
- Mẫu dùng để đánh giá tính ổn định của bộ kit
Để đánh giá tính ổn định của bộ kit, cần sử dụng tổng cộng 07 mẫu, bao gồm 03 mẫu chứng chuẩn dương (trong đó có 1 mẫu đạt nồng độ ở ngưỡng phát hiện của kỹ thuật LAMP), 02 mẫu dương tính thu thập từ bệnh nhân và 02 mẫu âm tính.
Để đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của bộ kit tại thực địa, chúng tôi đã thu thập 300 mẫu có chủ đích tại tỉnh Long An Mặc dù số lượng mẫu này có hạn chế, nhưng nó phù hợp với khả năng về nhân lực và vật lực trong thời gian nghiên cứu, đồng thời là bước đầu thăm dò hiệu quả của bộ kit tại thực địa.
- Mẫu dùng để so sánh bộ kit với bộ mồi khác có cùng mục đích tương tự:
Sử dụng 50 mẫu gồm 25 mẫu dương tính và 25 mẫu mẫu âm tính đã được xác định bằng phương pháp real-time PCR
- Mẫu dùng để so sánh bộ kit với 2 phương pháp soi phân trực tiếp và ELISA (thường dùng hiện nay trong chẩn đoán giun lươn)
Mẫu nghiên cứu so sánh bộ kit với hai phương pháp chẩn đoán giun lươn, bao gồm soi phân trực tiếp và ELISA, tại Khoa Khám bệnh chuyên ngành, Viện Sốt rét-Ký sinh trùng-Côn trùng Trung ương Nghiên cứu dựa trên các mẫu lưu và mẫu thu thập từ những đối tượng nghi ngờ có triệu chứng lâm sàng Tổng số mẫu thu thập trong thời gian nghiên cứu là 141 mẫu.
Mẫu phân thu từ người nhiễm GLĐR đã được xác định chẩn đoán bằng phương pháp hình thái học (soi KHV) và qPCR Kỹ thuật qPCR, theo nghiên cứu của Yasmin Sultana, cho thấy độ đặc hiệu hơn 99% so với phương pháp cấy phân Harada - Mori.
Mẫu phân thu từ người nghi ngờ nhiễm giun lươn khi đến khám tại Khoa khám bệnh chuyên ngành – Viện Sốt rét – Ký sinh trùng côn trùng Trung ương sẽ được thực hiện khi bệnh nhân có triệu chứng nghi ngờ hoặc có kết quả ELISA tìm kháng thể giun lươn dương tính Kỹ thuật ELISA được sử dụng để xác định kháng thể trong huyết thanh người, áp dụng bộ kit SciMedx Strongyloides serology microwell ELISA (SciMedx Corporation, Denville, NJ) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
- Mẫu phân thu từ người khỏe mạnh bình thường, không có triệu chứng hướng đến nhiễm GLĐR
Hoàn thiện quy trình thu thập, bảo quản mẫu gồm:
Mẫu phân được thu thập trong các túi nilon chuyên dụng, loại bỏ không khí và dán nhãn rõ ràng Chúng được bảo quản ở nhiệt độ lạnh từ 4 oC đến 8 oC cho đến khi chuyển về phòng thí nghiệm Một phần mẫu phân được sử dụng để làm tiêu bản soi phát hiện kháng thể trong vòng 24 giờ sau khi lấy mẫu Phần còn lại được bảo quản trong ống 1,5ml chứa đệm PBS và ở nhiệt độ -35 oC cho đến khi thực hiện tách chiết ADN.
- Mẫu huyết thanh: thu thập mẫu máu tĩnh mạch, ly tâm thu khoảng 200àl huyết thanh trong ống 1,5ml, bảo quản ở -35 o C cho đến khi thực hiện phản ứng ELISA
2.2.4.2 Tách chiết ADN tổng số từ mẫu phân
Tách chiết ADN từ ấu trùng S stercoralis trong mẫu phân được thực hiện bằng bộ kit QIAmp DNA Stool Mini Kit của Qiagen, theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
2.2.4.3 Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của bộ kit tại phòng thí nghiệm Đánh giá độ nhạy độ đặc hiệu của bộ kit LAMP chẩn đoán GLĐR trên
Năm 2018, 132 mẫu thu nhận từ Đại học Y khoa Phạm Ngọc Thạch và các mẫu thu thập tại tỉnh Long An đã được xét nghiệm Tất cả các mẫu này đã được kiểm tra bằng phương pháp soi phân trực tiếp để tìm ấu trùng giun lươn và sử dụng qPCR.
Kiểm soát sai số
Kiểm soát quá trình thực nghiệm là yếu tố quan trọng trong phòng thí nghiệm, yêu cầu biên soạn các quy trình chuẩn trước khi thực hiện Việc tuân thủ tiêu chuẩn ISO 15189 đảm bảo chất lượng và độ tin cậy của các kết quả thử nghiệm.
- Mã hóa số liệu: lô thử nghiệm, đợt thử nghiệm, ngày thử nghiệm, người thử nghiệm.
Đạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu tuân thủ đầy đủ các quy định về đạo đức trong nghiên cứu
Nghiên cứu y sinh học được thực hiện theo quy định của Bộ Y tế và đã được hội đồng y đức của Viện Sốt rét – Ký sinh trùng – Côn trùng Trung ương thông qua.
Thiết kế mồi và khảo sát độ đặc hiệu cùng khả năng hoạt động của mồi là rất quan trọng trong việc đánh giá bộ kit tại thực địa Việc so sánh bộ kit này với các bộ mồi khác và phương pháp soi phân, ELISA giúp xác định hiệu quả và độ tin cậy của sản phẩm.
Khảo sát, tối ưu hóa các điều kiện phản ứng LAMP, xác định ngưỡng phát hiện
Tạo chứng chuẩn dương (plasmid tái tổ hợp mang gen đích)
Chế tạo bộ kit LAMP chẩn đoán Strongyloides stercoralis ở quy mô phòng thí nghiệm
Xác định điều kiện bảo quản, đánh giá tính ổn định của bộ kit Đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu tại phòng thí nghiệm
Xây dựng tiêu chuẩn cơ sở và đăng ký kiểm định bộ kit
3 Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Trong khoảng thời gian nghiên cứu từ tháng 9/2017 đến tháng 8/2020, tại phòng thí nghiệm và thực địa, các kết quả nghiên cứu được trình bày theo những mục tiêu cụ thể.
3.1 Xây dựng quy trình và chế tạo bộ kit LAMP để chẩn đoán nhiễm giun lươn đường ruột Strongyloides stercoralis ở người
3.1.1 Kết quả thiết kế mồi
3.1.1.1 Kết quả trình tự của bộ mồi
Chúng tôi đã tải xuống 30 trình tự gen 18S rRNA của giống Strongyloides từ ngân hàng dữ liệu NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) và sử dụng phần mềm MEGA 7 với tính năng Clustal W để sắp xếp các trình tự của các loài Mục tiêu là xác định vùng bảo tồn đặc trưng cho S stercoralis.
Hình 3.1 Kết quả gióng hàng của 30 trình tự giun lươn đường ruột trên phần mềm MEGA 7
Kết quả thu được đoạn trình tự bảo tồn cho S stercoralis có kích thước
596bp Sử dụng phần mềm Primer Explorer v.5 (Eiken, Nhật bản) để thiết kế mồi LAMP đặc hiệu cho giun lươn đường ruột trên vùng trình tự bảo tồn này
Hình 3.2 Phần mềm Primer Explorer V5 để thiết kế mồi LAMP
Hình 3.3 Bộ mồi được thiết kế từ phần mềm Primer Explorer V5
Kết quả bộ mồi thu được có trình tự như sau:
Bảng 3.1 Trình tự mồi LAMP thiết kế để chẩn đoán giun lươn đường ruột
Tên mồi Trình tự mồi Độ dài của mồi
Về mặt kích thước, các mồi F3, B3 thiết kế đều đạt yêu cầu về chiều dài (từ 21 đến 25 nucleotit)
Bảng 3.2 Vị trí của các mồi được thiết kế Tên mồi Vị trí đầu 5’ Vị trí đầu 3’ Độ dài (bp)
Sản phẩm khuếch đại sau phản ứng LAMP bằng cặp mồi F3-B3 có kích thước theo lý thuyết là 226 bp < 250 bp
Bảng 3.3 Khoảng cách giữa các mồi được thiết kế
Khoảng cách giữa đầu 5’ của F2 đến đầu 5’ của B2 là 152 bp, nằm trong yêu cầu 120 – 180 bp Khoảng cách từ đầu 5’ của F2 đến đầu 3’ của F1 là 45 bp, đáp ứng yêu cầu 40 – 60 bp Đầu 5’ của B2 đến đầu 3’ của B1 có khoảng cách 50 bp, cũng nằm trong giới hạn 40 – 60 bp Khoảng cách giữa đầu 3’ của F3 đến đầu 5’ của F2 chỉ là 11 bp, thuộc khoảng 0 – 20 bp Cuối cùng, khoảng cách từ đầu 3’ của B3 đến đầu 5’ của B2 là 1 bp, nằm trong yêu cầu 0 – 20 bp.
Khoảng cách giữa các mồi đều thỏa mãn yêu cầu của hệ mồi
Bảng 3.4 Nhiệt độ nóng chảy và khả năng tạo bắt cặp dimer mồi (dG