VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHÊN CỨU
Vật liệu nghiên cứu
Lá Trầu không được thu hái tại nhà người dân ở Lưu Nhân Chú, Hương Sơn, Thành phố Thái Nguyên.
Các chủng vi khuẩn Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella được cung cấp bởi Phòng thí nghiệm vi sinh – Khoa CNSH-CNTP.
Dụng cụ và hóa chất
Bảng 3.1 Danh mục thiết bị sử dụng
Thiết bị Xuất xứ Thiết bị Xuất xứ
Micropipet Mỹ Tủ ấm Trung Quốc
Máy đo pH Hanna Trung Quốc Tủ sấy Trung Quốc
Cân điện tử PA 214 OHAUS Mỹ Tủ cấy vi sinh LV- Trung Quốc
Nồi chiết tinh dầu Trung Quốc Máy lắc Shaking Trung Quốc
Incubator NB-205 Nồi hấp thanh trùng Paster Nhật Bản
Các dụng cụ thí nghiệm cần thiết bao gồm cuvet thủy tinh, ống nghiệm, bình tam giác, đèn cồn, bình định mức, các loại cốc đong, ống đong, micropipet, đĩa petri, que trang, que đầu tròn và dụng cụ đục lỗ thạch.
Bảng 3.2 Danh mục hóa chất sử dụng
Hóa chất Xuất xứ Hóa chất Xuất xứ
NaCl Trung Quốc Agar Trung Quốc
Cao thịt Trung Quốc Pepton Trung Quốc
BaCl 2 2H 2 O Trung Quốc H 2 SO 4 Trung Quốc
Địa điểm, thời gian nghiên cứu
- Địa điểm: Phòng thí nghiệm vi sinh - Khoa CNSH - CNTP, trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên
- Thời gian: Từ tháng 12/2019 đến tháng 06/2020.
Nội dung nghiên cứu
Nội dung 1: Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng (nhiệt độ, thời gian và nồng độ muối NaCl ) đến khả năng chiết tách tinh dầu từ lá Trầu không.
Nội dung 2: Nghiên cứu các thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá
Phương pháp nghiên cứu
3.4.1 Phương pháp xử lý nguyên liệu
Lá cây Trầu (Piper betel L.) được thu hái từ nhà dân ở Lưu Nhân Chú, Hương Sơn, Thành phố Thái Nguyên Sau khi thu hái, những lá to, dày và đẹp được lựa chọn và làm sạch bằng nước Sau đó, lá được bọc kín qua ba lớp túi bóng để tránh dập nát và tổn thất tinh dầu, rồi được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 8°C - 12°C để sử dụng cho các nghiên cứu sau này.
3.4.2 Phương pháp xác định hàm lượng tinh dầu theo Dược điển Việt Nam III
Lá Trầu không tươi, bánh tẻ, dày được thu hái vào sáng sớm hoặc chiều muộn và cần được thí nghiệm trong vòng 24 giờ sau khi thu hoạch Sau khi sơ chế và làm sạch, lá trầu được cắt nhỏ để dung môi dễ dàng thẩm thấu vào tế bào, tối ưu hóa việc thu nhận tinh dầu Quá trình chiết xuất tinh dầu được thực hiện bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước, kết hợp với muối NaCl để tăng cường sự khuếch tán của tinh dầu Hàm lượng tinh dầu (X%) thu được được tính theo công thức của Dược điển Việt Nam III khi tinh dầu có tỷ trọng nhỏ hơn 1.
X: Hàm lương tinh dầu (%) a: Thể tích tinh dầu đạt được sau khi chưng cất (ml) b: Khối lượng mẫu đem phân tích – độ ẩm của mẫu (ml)
3.4.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm
3.4.3.1 Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chiết tách tinh dầu từ lá Trầu không.
Phương pháp nghiên cứu đơn yếu tố được áp dụng trong thí nghiệm này, kế thừa từ kết quả nghiên cứu trước đó Thí nghiệm 1 tập trung vào việc nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hàm lượng tinh dầu, với 4 công thức được bố trí và lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác của kết quả.
CT1: Nồng độ muối NaCl là 10%
CT2: Nồng độ muối NaCl là 15%
CT3: Nồng độ muối NaCl là 20%
CT4: Nồng độ muối NaCl là 25%
Các thông số cố định trong thí nghiệm bao gồm nhiệt độ chiết 100°C, thời gian chiết 3 giờ, và tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 2,5/1 Nồng độ NaCl được xác định là yếu tố quan trọng để đạt được hàm lượng tinh dầu và khả năng kháng khuẩn tối ưu Để đánh giá tác động của nồng độ NaCl, thí nghiệm được thiết kế một cách cụ thể.
Trích ly ở các nồng độ NaCl (10%, 15%, 20%, 25%)
Phân tíchKết quả của thí nghiệm được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo. b Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu
Thí nghiệm được bố trí gồm 4 công thức được lặp lại 3 lần bao gồm:
CT1: tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 2/1
CT2: tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 2,5/1
CT3: tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 3/1
CT4: tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu là 3,5/1
Thí nghiệm được thực hiện với nồng độ dung môi tối ưu đã được xác định từ thí nghiệm trước, trong thời gian chiết 3 giờ và ở nhiệt độ 100 độ C Kết thúc thí nghiệm, chúng tôi đã xác định được tỷ lệ dung môi/nguyên liệu tốt nhất cho các thí nghiệm tiếp theo.
Trích ly ở các tỷ lệ dung môi/ nguyên liệu (2/1, 2,5/1, 3/1, 3,5/1)
Phân tích Kết quả của thí nghiệm được sử dụng cho thí nghiệm tiếp theo. c Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian chiết
Thời gian chiết là yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hàm lượng tinh dầu Để đánh giá tác động của thời gian đến hiệu suất thu hồi tinh dầu, thí nghiệm đã được thiết kế một cách cụ thể.
CT1: thời gian chiết là 2,5h
CT2: thời gian chiết là 3h
CT3: thời gian chiết là 3,5h
CT4: thời gian chiết là 4h
Thí nghiệm được tiến hành dựa trên kết quả của thí nghiệm 1, 2, nhiệt độ chiết là 100 0 C.
Trích ly ở các khoảng thời gian (2,5 giờ; 3 giờ; 3,5 giờ, 4 giờ)
Dựa trên kết quả phân tích chỉ tiêu, lựa chọn dung môi tối ưu cho quá trình chiết xuất Kết quả thí nghiệm này sẽ được áp dụng cho các thí nghiệm tiếp theo Thí nghiệm 4 sẽ tập trung vào việc tối ưu hóa điều kiện tách chiết tinh dầu từ lá Trầu không.
Lá trầu được chưng cất ở nhiệt độ từ 100 o C đến 105 o C trong khoảng thời gian từ 2,5 đến 4 giờ, với tỷ lệ dung môi/nguyên liệu là 2, 2,5, 3 và 3,5 (v/w) Nồng độ muối NaCl được sử dụng là 10%, 15%, 20% và 25% Sau khi khảo sát các yếu tố đơn lẻ, chúng tôi đã chọn ra 3 yếu tố có ảnh hưởng lớn nhất đến hàm lượng tinh dầu Để đánh giá khả năng ảnh hưởng của những yếu tố này, chúng tôi áp dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm Box – Behnken với ba yếu tố và ba cấp độ.
Sau khi khảo sát các yếu tố, chúng tôi đã chọn ba yếu tố A, B, C có ảnh hưởng lớn nhất đến hàm lượng tinh dầu từ lá Trầu không Để đánh giá tác động của các yếu tố này, chúng tôi sử dụng phương pháp bề mặt chỉ tiêu theo thiết kế thí nghiệm Box-Behnken với ba yếu tố và ba cấp độ.
Bảng 3.3 Bảng mã hóa các điều kiện tối ưu
Biến chữ Yếu tố Đơn vị Mức -1 Mức +1
C Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu l/kg 2/1 3/1
Ma trận thực nghiệm Box-Behnken bao gồm 17 thí nghiệm, trong đó các yếu tố được kết hợp với 3 mức: +1 (mức cao nhất), -1 (mức thấp nhất) và 0 (mức trung bình) Đặc biệt, có 5 thí nghiệm lặp lại ở tâm, tức là các yếu tố đều ở mức 0.
Bảng 3.4 Ma trận thực nghiệm Box-Behnken ba yếu tố và hàm lượng tinh dầu từ lá Trầ u không
Công Biến mã hóa thức A Thời gian B Nồng độ NaCl C Tỷ lệ dung môi/nguyên liệu
Dựa vào kết quả của thí nghiệm, lựa chọn được điều kiện tối ưu sao cho có hàm lượng tinh dầu là cao nhất.
3.4.3.2 Phương pháp nghiên cứu nội dung 2: Nghiên cứu hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không [9], [19], [27]
Phương pháp nhân giống vi khuẩn
Vi khuẩn được lấy từ ống gốc được đem đi hoạt hóa lại trong 5 ml môi trường
MP lỏng được nuôi cấy trên máy lắc trong 24 giờ ở nhiệt độ 37°C để đạt mật độ 10^8 tế bào/ml, tương ứng với độ đục 0,5 McFarland Để chuẩn bị độ đục chuẩn 0,5 McFarland, cần trộn 0,5ml dung dịch BaCl2.2H2O 1% với 99,5ml dung dịch H2SO4 1% Nếu dịch vi khuẩn có độ đục cao hơn mức chuẩn, có thể điều chỉnh bằng cách thêm nước muối sinh lý Khi đạt độ đục tương ứng với tiêu chuẩn, thu dịch vi khuẩn để thử nghiệm khả năng kháng của dịch chiết.
Phương pháp bảo quản giống
Phương pháp bảo quản giống vi sinh vật trên môi trường thạch nghiêng bao gồm việc kích hoạt vi sinh vật trong môi trường MP, sau đó cấy chuyển sang thạch nghiêng và nuôi trong 24 giờ ở nhiệt độ 37°C Sau khi nuôi, giống vi sinh vật được giữ trong tủ lạnh để phục vụ cho các nghiên cứu tiếp theo Để duy trì giống, cần thực hiện cấy chuyển trên thạch nghiêng định kỳ mỗi 2 tuần.
Phương pháp thử khả năng kháng khuẩn
Nghiên cứu khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không được thực hiện bằng phương pháp khuếch tán trên đĩa thạch trong điều kiện vô trùng Sau khi đạt mật độ vi khuẩn 108 tế bào/ml, 100μl dịch vi khuẩn được đưa vào giữa đĩa thạch chứa môi trường MPA và được phân bố đều Sau 15 phút, các lỗ có đường kính 6 mm được tạo ra với khoảng cách 2 - 3 cm, và 10μl tinh dầu được nhỏ vào mỗi giếng, sử dụng nước cất làm đối chứng Các đĩa thạch được bảo quản trong tủ lạnh 30 phút để tinh dầu khuếch tán, sau đó được nuôi cấy ở 37°C trong 24 giờ để đo kích thước vòng kháng khuẩn.
Hoạt tính kháng khuẩn được xác định bằng cách đo kích thước vùng kháng khuẩn (BK) bằng công thức:
+ D là đường kính vòng kháng khuẩn (mm)+ d là đường kính giếng thạch (mm)
Phương pháp xử lý số liệu
Phần mềm bố trí thí nghiệm
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
Kết quả nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng chiết tách tinh dầu từ lá Trầu không
4.1.1 Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hàm lượng tinh dầu
Trong quá trình chưng cất, việc thêm muối vào hỗn hợp giúp tạo ra hệ nhũ tương ổn định, giảm thiểu mất mát tinh dầu và hạn chế sự tan của các thành phần không phân cực vào nước Muối, với vai trò là chất điện ly, làm tăng tỷ trọng và độ phân cực của nước, giúp tinh dầu dễ dàng phân lớp Tuy nhiên, nồng độ muối cao có thể làm giảm lượng tinh dầu thu được, do nước trong tế bào sẽ thoát ra ngoài, khiến lớp biểu bì chứa tinh dầu co lại và ngăn cản sự thoát tinh dầu Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hàm lượng tinh dầu được thể hiện trong bảng 4.1.
Bảng 4.1 Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ muối NaCl đến hàm lượng tinh dầu
Công thức Nồng độ NaCl Hàm lượng tinh dầu
Ghi chú: các chữ số trong cùng một cột biểu thị sự sai khác có ý nghĩa thống kê ở mức α