Luận văn tốt nghiệp sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện vibrio anguillarum trên một số loài thuỷ sản nuôi ở việt nam

CHƯƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU

Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

Trong những năm gần đây, hoạt động nuôi trồng thủy sản tại Việt Nam đã phát triển mạnh mẽ Năm 2006, giá trị xuất khẩu thủy sản đạt 3,31 tỷ USD, tăng 24,91% so với năm 2005, và nằm trong 4 nhóm mặt hàng có giá trị xuất khẩu trên 3 tỷ USD của nước ta Tổng sản lượng thủy sản nuôi trồng năm này cũng ghi nhận sự tăng trưởng đáng kể.

Năm 2006, sản lượng nuôi trồng thủy sản đạt 1.694.271 tấn, tăng 17,87% so với năm 2005 và 40,55% so với năm 2004, trong đó diện tích nuôi trồng thủy sản nước mặn, lợ là 585.000 ha, cao hơn nước ngọt 465.000 ha (Các Báo cáo tổng kết năm 2004-2006 của Bộ Thủy sản) Các đối tượng thủy sản chủ yếu bao gồm tôm sú, tôm he chân trắng, tôm rảo, tôm hùm, cua, ghẹ, cùng với các loài cá như cá song, cá giò, cá tráp, cá dỡa, cá vược, cá hồng mỹ, cá hồng đỏ và các loài nhuyễn thể như ốc hương, sò huyết, hầu Nhờ sự phát triển của khoa học công nghệ, các đối tượng thủy sản nuôi mặn, lợ đã được nghiên cứu sản xuất giống thành công và chủ động trong sản xuất Các hình thức nuôi như lồng, bể, ao, rầm và các phương thức nuôi quảng canh, quảng canh cải tiến, bán thâm canh, thâm canh, nuôi tốt (GAP), nuôi có trách nhiệm (CoC) cũng đã được áp dụng để phát triển phù hợp với điều kiện sinh thái của từng vùng.

Sự phát triển của nghề nuôi trồng thủy sản đi kèm với sự gia tăng dịch bệnh trên các đối tượng nuôi, nếu không có biện pháp kiểm soát bệnh hiệu quả, hậu quả sẽ rất nghiêm trọng Nhiều ao nuôi đã bị bỏ hoang do dịch bệnh, trong khi tại nhiều lồng nuôi, cá chết hàng loạt chủ yếu do bệnh tật Các tác nhân gây bệnh nguy hiểm trong nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là virus Taura (TSV), cần được chú ý và quản lý để bảo vệ ngành nuôi trồng thủy sản.

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã nghiên cứu về các bệnh nguy hiểm trong nuôi trồng thủy sản, bao gồm bệnh ủ vàng (YHV), ủ trắng (WSSV), cũi cọc (IHHNV), và hoại tử thần kinh (VNN), cùng với các vi khuẩn như V.parahaemolyticus, V.harveyi, V.anguillarum Những bệnh này đã được Tổ chức Thú y Thế giới (OIE) khuyến cáo đưa vào danh sách các bệnh cần kiểm dịch do chúng gây ra nhiều đợt dịch lớn, dẫn đến thiệt hại nghiêm trọng cho ngành nuôi trồng thủy sản trong những năm qua.

Vibrio spp là nguyên nhân gây bệnh nhiễm khuẩn (Vibriosis) ở cá, động vật hai mảnh và giáp xác Vibrio anguillarum là vi khuẩn chủ yếu gây bệnh trên các loài thủy sản Các tác giả đã phân lập được Vibrio anguillarum và xác định đây là một trong những tác nhân chính gây bệnh cho thủy sản Tại Việt Nam, trong những năm gần đây đã có một số công trình nghiên cứu đề cập đến vấn đề này.

V.anguillarum Tỏc giả Bựi Quang Tề ủó phỏt hiện và phõn loại những loài gây bệnh cho tôm là V alginolyticus, V anguillarum, V ordalii, V salmonicida, V harveyi, V parahaemolyticus và V vulnificus Tỏc giả ủó chỉ rừ cựng với cỏc chủng vibrio khỏc V anguillarum gõy bệnh ủỏ thõn trờn tụm nuụi, ủỏ chõn, ăn mũn vỏ kitin và bệnh ấu trựng trựng nhuyển thể… cựng với

Nghiên cứu gần đây cho thấy Vibrio anguillarum là tác nhân gây bệnh chính ở cỏ biển, đặc biệt là cỏ hồi và cỏ song Trong một cuộc điều tra năm 2002, Bùi Quang Tề đã phân lập thành công V anguillarum, V harveyi và một số loài vi khuẩn khác từ 13 mẫu cá song, 3 mẫu cá giò, 34 mẫu ấu trùng tôm và 103 mẫu tụm sỳ Kết quả thử nghiệm kháng sinh cho thấy V anguillarum có độ nhạy cao với Ciprofloxacin và Erythromycin.

Doxycylin, Acid Nalidixic và cao nhất là Bactrim ðường kính vòng vô khuẩn ủược tỏc giả cụng bố: Ciprofloxacin (28 mm), Erythromycin (24 mm), Doxycylin (26 mm), Acid Nalidixic (24 mm), Bactrim (30 mm)

Tiếp theo, Lờ Lan Hương (2005) [3] ủó tiến hành nghiờn cứu phõn lập ủược V anguillarum trờn ốc hương và sũ huyết tại cỏc tỉnh Khỏnh Hoà, Phỳ

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……… 8

Yên từ năm 2002-2004 Tần số bắt gặp V anguillarum trên các mẫu bệnh phõn tớch ủược thể hiện ở bảng 1-1

Bảng 1-1 Tần số bắt gặp V anguillarum trên ốc hương, sò huyết

Tần số bắt gặp V anguillarum/mẫu phân tích bệnh Ốc hương Sò huyết

Tần số Tỷ lệ % Tần số Tỷ lệ %

Phan Thị Võn và cộng tác viên đã tiến hành điều tra và phân lập V anguillarum trên cá song ở giai đoạn cá giống thương phẩm tại Hải Phòng và Nghệ An trong các năm 2003-2005 Tỷ lệ nhiễm V anguillarum trên các mẫu bệnh phẩm thu được là 20% Vi khuẩn này thường xuất hiện vào các tháng mùa lạnh, từ tháng 8 đến tháng 12 Kết quả thử kháng sinh cho thấy V anguillarum không mẫn cảm với Ampicillin.

Penicillin shows sensitivity to various antibiotics, particularly with the following inhibition zones: Neomycin (8 mm), Rifampin (12 mm), Streptomycin (18 mm), Amoxicillin (19 mm), Erythromycin (18 mm), Novobiocin (16 mm), and most notably Tetracycline (20 mm) and Doxycycline (22 mm).

Lờ Xõn and colleagues have conducted research on five economically valuable species of fish, including the brown-marbled grouper (Epinephelus fuscoguttatus), the giant grouper (Epinephelus lanceolatus), the mouse grouper (Cromileptis altivelis), the silver-spotted snapper (Lutjanus argentimaculatus), and the yellowfin pomfret (Trachinotus blochi) since 2004.

Năm 2006, V anguillarum được phân lập từ mẫu cá song vằn có dấu hiệu lở loét Tuy nhiên, tác giả vẫn chưa xác định được mối liên quan giữa chủng vi khuẩn này và bệnh lý trên cá song vằn, do đó chưa thể khẳng định V anguillarum là tác nhân gây bệnh.

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu và phân loại vi khuẩn V anguillarum tại Việt Nam thông qua các phương pháp vi sinh vật học Các phương pháp bao gồm nuôi cấy, kiểm tra phản ứng sinh lý, nghiên cứu hình thái, kiểm tra phản ứng sinh hóa và định danh vi khuẩn bằng các kỹ thuật như mũi trường phân lập đặc hiệu VAM, hệ thống phân loại theo Bergey’s, kit thương mại API 20E và mô tế bào.

Trên thế giới, nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng Vibrio spp là nguyên nhân gây bệnh nhiễm khuẩn (Vibriosis) ở cá, động vật hai mảnh và giáp xác Theo David R Nelson, Vibrio anguillarum là một trong những tác nhân chính gây bệnh nhiễm khuẩn máu ở cá, ăn mòn vỏ kitin ở giáp xác và gây bệnh trên ấu trùng nhuyễn thể Bệnh nhiễm khuẩn ở cá lây lan rộng rãi và là nguyên nhân chính gây thiệt hại kinh tế cho ngành công nghiệp thủy sản, với thiệt hại hàng năm ước tính trên 30 triệu USD tại Nhật Bản do Vibrios (David R Nelson, 2003) Bệnh nhiễm khuẩn trở thành yếu tố quyết định sự thành bại của ngành công nghiệp nuôi cá hồi.

Các nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật phân tử để nhận dạng vi khuẩn diễn ra muộn hơn so với nghiên cứu về virus Đã có một số công bố phát hiện vi khuẩn gây bệnh cho các đối tượng thủy sản thông qua phương pháp sinh học phân tử, chủ yếu sử dụng kỹ thuật PCR để phát hiện và phân loại vi khuẩn dựa trên gen 16S-23S, như V vulnificus và V fishseri (Brauns 1991; Lee 1992; Ruby 1995) Ngoài ra, kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) được sử dụng để phát hiện V harveyi (Vandenberghe 1998; Aaria 1999), và Lai ADN được áp dụng để phát hiện V anguillarum.

The RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) technique has been effectively utilized to identify Vibrio species in various samples, including food, algae, and mollusks (Martinez Picado, 1996; Martinkearley, 1994; Urkawa, 1998) Additionally, Javiermarti (1996) demonstrated the use of the VaV3 probe for the detection of V anguillarum.

Tổng quan chung về Vibrionaceae

Vibrio là vi khuẩn gram âm, sống trong môi trường nước, có hình dạng que cong và thường gặp ở các vùng bờ biển nóng và ôn hòa trên toàn thế giới Chúng thích nghi với môi trường nước mặn và nước lợ, thường được tìm thấy ở ven bờ biển, trong nước biển và vườn nuôi thủy sản Ngoài ra, Vibrio cũng xuất hiện trong nhiều loài thủy sản như tôm, cá và nhuyễn thể.

Vibrios là những loài vi khuẩn gây bệnh với cả thuỷ sản tự nhiên và thuỷ sản nuôi như V vulnificus; V parahaemolyticus V anguillarum, V ordalli, V salmonicida V harveyi… [16], [20], [33], [38], [39], [40], [41],

Một số loài Vibrios thường tiết ra ủộc tố gõy bệnh ủối với vật chủ ðộc tính của V parahaemolyticus chủ yếu là do protein dung huyết chịu nhiệt

TDH (thermostable direct hemolysin) là ngoại độc tố có hoạt tính β-hemolysis trên môi trường thạch màu, là một trong những tác nhân gây bệnh quan trọng Các chủng như V anguillarum, V ordalli, V salmonicida và V vulnificus biotype 2 gây bệnh xuất huyết ở cá, trong khi V harveyi là nguyên nhân chính gây bệnh nhiễm khuẩn ở tôm nuôi.

Một nghiờn cứu 25 ủợt dịch bệnh ở cỏ vược cho thấy 69% cỏc chủng phân lập từ mẫu bệnh là Vibrio [64]

Cá nhiễm bệnh do Vibrio thường có biểu hiện bỏ ăn hoặc ăn kém, với vùng trên lưng và toàn bộ cơ thể biến màu sẫm Cỏ bị xuất huyết và hoại tử, trong khi mắt có dấu hiệu ủ rũ và lồi Trong những trường hợp cấp tính, cá có thể chết mà không có biểu hiện bệnh lý rõ ràng, ngoại trừ bụng trướng to Đối với cá nhiễm bệnh lâu dài, mang cá sẽ bị bạc màu và xuất hiện các vết thương.

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội cung cấp luận văn thạc sĩ về khoa học Nông nghiệp, trong đó nêu rõ rằng sự xuất hiện của cá có dấu hiệu ủ bệnh trong bể ương có thể là dấu hiệu nhiễm Vibrio Việc phát hiện sớm tình trạng này rất quan trọng để bảo vệ sức khỏe cá và đảm bảo chất lượng giống.

Một số loài Vibrio có hình thái và tính sinh học tương tự, gây khó khăn trong việc phân biệt bằng các phương pháp vi sinh và hóa sinh thông thường, đặc biệt khi xác định loài mang gen gây bệnh Tuy nhiên, với những tiến bộ trong sinh học phân tử, việc phát triển và ứng dụng các phương pháp hiện đại giúp giải quyết những khó khăn này, đồng thời hỗ trợ xác định các chủng Vibrio gây bệnh chủ yếu để thực hiện các biện pháp phòng ngừa kịp thời và hiệu quả.

Tổng quan Vibrio anguillarum

1.3.1 Bệnh lý ở tôm, cá do V.anguillarum gây ra

Vibrio anguillarum là một trong những vi khuẩn gây bệnh nghiêm trọng nhất ở cá trên toàn cầu, đặc biệt trong nghề nuôi cỏ biển Bệnh do V anguillarum gây ra cũng đã được ghi nhận từ giữa các loài nhuyễn thể hai mảnh vỏ và giáp xác Vi khuẩn này thường xuất hiện ở các vùng biển, ven biển và cửa sông, và có thể được phân lập từ nhiều nguồn môi trường khác nhau.

Vibrio anguillarum là một loại vi khuẩn quan trọng trong hệ vi sinh vật của cá biển khỏe mạnh, nhưng đồng thời cũng là tác nhân gây bệnh cho nhiều loại cá ở các vùng địa lý khác nhau Loại vi khuẩn này đã gây ra thiệt hại lớn cho ngành nuôi hải sản toàn cầu, dẫn đến những tổn thất kinh tế đáng kể Bệnh nhiễm khuẩn do Vibrio anguillarum thường được phát hiện ở nhiều nơi, ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất thủy sản.

17 quốc gia và trờn 50 loài cỏ [62] Ở Nauy, V anguillarum ủược phõn lập lần

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã nghiên cứu về vibriosis, một vấn đề quan trọng trong ngành nuôi trồng thủy sản ở Nauy từ năm 1964 Nghiên cứu cho thấy tiêm chủng là biện pháp phòng bệnh hiệu quả đối với vibriosis, và phương pháp này đã được giới thiệu tại Nauy vào năm 1977.

1.3.2 ðặc ủiểm, hỡnh thỏi, phõn loại

Vibrio anguillarum là một loài vi khuẩn Gram âm thuộc chi Vibrio, có hình dạng que và hơi cong, kích thước từ 0,3 - 0,8 µm chiều rộng và 1,4 - 2,6 µm chiều dài Vi khuẩn này có nhiều tiêm mao giúp di chuyển dễ dàng trong môi trường nước và phát triển tốt trên môi trường thạch V anguillarum thích nghi với môi trường nước mặn và lợ, gây ra các bệnh nguy hiểm cho cá biển, giáp xác và nhiễm thể Phân loại taxon của V anguillarum được ký hiệu là 55601.

Hỡnh 1-1 Hỡnh thỏi của V anguillarum chụp qua kớnh hiển vi ủiện tử trên cá cảnh biển non [63]

(a) V anguillarum 811218-5W trên cá chép cảnh non sau 60 phút ủ bệnh

- Thước ủo tại (b) (ỏp dụng cho cả a) = 1 àm

Vibrio anguillarum ủược Macdonell và Cowell xếp vào chi

Vibrio(Listonella) cùng với Vibrio pelagia,Vibrio damsela…vào năm 1985

Theo hệ thống phân loại:

Vibrio anguillarum là vi khuẩn gây ra bệnh nhiễm khuẩn và xuất huyết ở cá, dẫn đến các triệu chứng như mang bạc màu, có vết loét quanh vây, hậu môn và miệng, cùng với bụng trướng Cá bị nhiễm bệnh hoạt động lờ đờ và kém ăn, với tỷ lệ chết lên đến 50% - 100% ở cá nhỏ, trong khi cá lớn có tỷ lệ chết thấp hơn nhưng vẫn bỏ ăn và kém tăng trưởng.

1.3.3 ðặc ủiểm sinh lớ, sinh hoỏ, sinh trưởng

V anguillarum sinh trưởng trong ủiều kiện yếm khớ tuỳ tiện, nhiệt ủộ sinh trưởng tối ưu là 23- 25 0 C, tuy nhiên giới hạn sinh trưởng của các chủng này rất rộng từ 4-42 0 C

Môi trường thạch thích hợp cho V anguillarum là TCBS (Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose), trong khi môi trường lỏng là APW (Alkaline peptone water) với pH lý tưởng là 9,6, dao động từ 6,8 đến 10,2 Trong môi trường lỏng, vi khuẩn có thể phát triển sau 18 giờ ở nhiệt độ 23-25°C mà không sinh khối Chúng có khả năng sinh trưởng ở nồng độ muối từ 3% đến 6%, nhưng một số chủng không phát triển trên môi trường có nồng độ muối từ 8% đến 10% và bị ức chế ở nồng độ cao hơn.

10% Trên môi trường thạch TCBS, V anguillarum, mọc tốt sau 18 giờ ở

28 0 C, tạo khuẩn lạc vàng, trũn, lồi, bờ ủều, rất búng, ủường kớnh khuẩn lạc 2-

Trên môi trường ủ đặc trưng VAM (sử dụng sorbitol, ampicillin 10mg/L, pH=8,6), khuẩn lạc có màu vàng nhạt hoặc nhân sẫm với viền vàng nhạt Ngoài chủng V anguillarum, môi trường TCBS và VAM cũng phát hiện Vibrio harveyi, gây bệnh trên cá và có khuẩn lạc tương tự về màu sắc Tuy nhiên, khi so sánh các đặc điểm sinh lý và sinh hóa, chúng có sự khác biệt rõ rệt.

Cỏc chủng V anguillarum cú cỏc ủặc ủiểm sinh hoỏ như sau:

+ Lờn men acid từ ủường glucose, maltose, sorbitol Vỡ vậy trờn mụi trường TCBS có mặt sucrose các vi khuẩn có màu vàng

+ Khụng lờn men từ ủường rhammose, melibớoe

+ Sử dụng nguồn cacbon sucrose mannitol; không sử dụng: l-lysin, citrate, ornithine

+ Phản ứng dương tính với ONPG (Ortho-nitro-phenyl-β-D- alactopyranoside), urea

+ Phản ứng âm tính: ure, inositol

+ Sinh indol, NO2 và acetoin không sinh H2S

+ Phản ứng oxidase dương tính

1.3.4 Hoạt tớnh enzym và ủộc tố

Các chủng V anguillarum thường có hoạt tính Caseinase, Lipase,

Gelatinase, Chitinase, Lecithinase, Amylase và Hemolysin là những enzyme quan trọng trong vi khuẩn gây bệnh Hoạt tính của proteaza và hemolysin đóng vai trò then chốt, vì chúng được coi là những yếu tố chính gây hại cho vật chủ.

Protease là enzym có khả năng thủy phân protein thành các đoạn polypeptid Ở nhiều vi sinh vật, protease hoạt động như enzym ngoại bào, đóng vai trò quan trọng trong sự sống và hoạt động của chúng Người ta đã tận dụng đặc điểm này trong sản xuất các chế phẩm sinh học Đối với vi sinh vật gây bệnh, protease và protein huyết thanh thường là yếu tố gây hại đối với vật chủ.

Trong nghiên cứu về sự phụ thuộc và đặc tính của enzym metalloprotease phụ thuộc kim loại kẽm từ Vibrio anguillarum, các nhà khoa học Thụy Điển đã chỉ ra rằng protease có vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy chất hữu cơ Nghiên cứu này được thực hiện trên mẫu từ đường tiêu hóa của cá, mở ra hướng đi mới trong việc ứng dụng enzym này trong công nghiệp thực phẩm và bảo quản.

Vibrio anguillarum có hai dạng là Pa và Pb, trong đó Pa là protease được tiết ra nhiều khi cá ở tầng nước sâu, còn Pb chiếm ưu thế khi cá ở tầng nước mặt Cả hai loại enzym này hoạt động hiệu quả ở nhiệt độ 4 °C, phụ thuộc vào Zn và bền với ion Ca²⁺ EmpA, một metalloprotease có trọng lượng phân tử 44,6 kDa, thực tế có thể nhỏ hơn khoảng 36 kDa do cấu trúc bậc ba của chuỗi polypeptid Protease này không chỉ là enzym ngoại bào mà còn đóng vai trò là nhân tố gây hại cho vật chủ của một số loài.

Vibrio spp, bao gồm V anguillarum, V cholerae, V vulnificus và V harveyi, có khả năng tiết EmpA mạnh khi tiếp xúc với tế bào niêm mạc ruột Nghiên cứu của T Garcia, K Otto và S Kjelleberg đã chỉ ra rằng dịch chiết từ niêm mạc ruột cá có vai trò quan trọng trong việc kích thích tiết proteaza ngoại bào của V anguillarum Đồng thời, Steven M Denkin và David R Nelson cũng nhận thấy rằng việc bổ sung dịch chiết từ màng nhầy ruột cá vào môi trường nuôi cấy làm tăng khả năng tiết enzym ngoại bào - proteaza của vi khuẩn này.

V.anguillarum, ủồng thời họ cũng chỉ ra một số yếu tố ảnh hưởng khỏc như nồng ủộ ion kim loại hoỏ trị 2, pH…ủều cú ảnh hưởng khỏc nhau lờn quỏ trình tiết enzym của vi khuẩn

Hemolysin là một loại protein có khả năng gây tan rã các tế bào hồng cầu, dẫn đến sự giải phóng hemoglobin Quá trình này được gọi là hemolysis và được phân loại thành ba loại: α, β và γ.

Phương pháp phát hiện Vibrio anguillarum

1.4.1 Phương pháp vi sinh vật học

Dựa trên đặc điểm sinh học của V anguillarum, Anicet R Blanch đã chỉ ra môi trường phân lập hiệu quả cho vi khuẩn này vào năm 1994, đó là môi trường VAM (Vibrio anguillarum Medium) Để xác định tên cụ thể, hệ thống phân loại theo Bergey’s đã được áp dụng, kết hợp với các chỉ tiêu sinh lý và bộ kit thương mại API 20E.

Trên cơ sở hệ thống phân loại của Châu Âu, Vibrio anguillarum gồm

23 kiểu huyết thanh (O1-O23 trong ủú chỉ cú cỏc kiểu huyết thanh O1; O2; O3 liờn quan ủến vibriosis ở cỏ)

Alicia E Toranzo và Juan L Barja đã công bố hai kiểu huyết thanh của Vibrio anguillarum vào năm 1990, gây bệnh nhiễm khuẩn máu trên cá, bao gồm kiểu huyết thanh O1 và O2, được phân lập từ cá nhiễm bệnh Kể từ đó, nghiên cứu về dịch tễ học và vắcxin cho cá biển liên quan đến loài vi khuẩn này chủ yếu tập trung vào hai kiểu huyết thanh O1 và O2.

Tác giả E Myhr và cộng sự từ trường đại học Na Uy đã xác định 264 vi khuẩn Vibrio anguillarum phân lập từ cá tại Na Uy, trong đó có các kiểu huyết thanh O1 (n=2), O2 (n), O4 (n=2) Các vi khuẩn khác được phát hiện bao gồm Vibrio splendidus, Vibrio tubiashii và Vibrio fischerii.

Ngoài ra cũn nhiều cỏch ủể ủịnh loại V.anguillarum Năm 1995,

B.Austin [19] ủó sử dụng typ huyết thanh ủể nhận dạng và phõn loại vi khuẩn Cựng thời gian ủú, Javier Martines-Picado và cỏc nhà khoa học Tõy Ban Nha

[45] ủó ủịnh loại V anguillarum dựa vào mụi trường ủặc hiệu và phương pháp lai ADN - ADN từ gen 16S

Dựa vào hình dạng và màu sắc của khuẩn lạc trên môi trường ủ, kết hợp với các kiểm tra sinh lý và sinh hóa, chúng ta có thể xác định chính xác loài vi khuẩn cần tìm.

Phân lập vi khuẩn từ mẫu thủy sản bị nhiễm bệnh được thực hiện trên môi trường TCBS và VAM Sau khi ủ, các khuẩn lạc màu vàng trên môi trường TCBS sẽ được chọn để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.

Nhuộm Gram là phương pháp quan trọng trong vi sinh vật học, cho phép phân biệt và chọn lọc vi khuẩn gram âm thông qua kỹ thuật nhuộm Gram cải tiến của Hucker Việc quan sát và chụp ảnh hình dạng vi khuẩn dưới kính hiển vi điện tử giúp xác định đặc điểm hình thái của chúng Hệ thống phân loại vi khuẩn theo Bergey’s được áp dụng để phân loại và nhận diện các loại vi khuẩn một cách chính xác.

Phương pháp kiểm tra đặc điểm sinh lý và sinh hóa của các chủng V anguillarum bao gồm đánh giá khả năng chịu muối ở các nồng độ 4%, 6%, 8% và 10%, cũng như tốc độ sinh trưởng của chúng Nghiên cứu cũng kiểm tra khả năng sinh trưởng của vi khuẩn ở các nhiệt độ khác nhau Đặc tính sinh hóa được xác định thông qua 20 phản ứng sinh hóa sử dụng Kit thương mại API 20E để phân loại một số loài vi khuẩn Ngoài ra, hoạt tính enzym Amylase, Caseinase, Lipase, Gelatinase và Lecithinase của vi khuẩn được kiểm tra trên các môi trường bổ sung các loại cơ chất tương ứng với từng loại enzym.

1.4.2 Phương pháp sinh học phân tử

Trong hai thập kỷ qua bằng phương pháp sinh học phân tử, các nhà khoa học ủó xỏc ủịnh ủược hơn 20 loại virỳt khỏc nhau ở ủộng vật nuụi thủy

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đang nghiên cứu về các loại virus ảnh hưởng đến ngành nông nghiệp, bao gồm nhóm virus ADN như baculovirus (BNV, BP, MBV và WSSV) và virus gây hoại tử máu (IHHNV) Ngoài ra, nhóm virus ARN cũng được đề cập, bao gồm Taura virus (TSV), Yellow head virus (YHV), aquareovirus (REO), nodavirus và Rhabdovirus Dự báo rằng số lượng virus này sẽ không thay đổi trong những năm tới.

Nghiên cứu nhận dạng vi khuẩn bằng kỹ thuật phân tử đã được tiến hành, bắt đầu bằng việc xác định trình tự gen 16S-23S để hỗ trợ phân loại vi khuẩn chính xác hơn (Brauns 1991; Lee 1992; Ruby 1995) Phương pháp AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) đã được sử dụng để phát hiện V harveyi.

(Vandenberghe 1998; Aaria 1999); Lai ADN-ADN phát hiện V anguilarum

Kỹ thuật RAPD (Randomly Amplified Polymorphic DNA) đã được sử dụng để phát hiện các chủng Vibrio spp trong thực phẩm, tảo và nhuyễn thể (Martinez Picado, 1996; Martinkearley 1994; Urkawa 1998; Javiermarti 1996) Các nghiên cứu sau đó đã tập trung vào việc xác định các gen đặc hiệu để nhận diện các chủng gây bệnh, như phát hiện gen tdh của V parahaemolyticus (Susan, 2000) và gen toxR.

(Conejero M and Hedreyda 2003), VhhA-B của V.harveyi (Zhang X.H,

Trong các phương pháp được OIE liệt kê, phương pháp sử dụng chỉ thị gen (lai ADN-ADN và PCR) được đánh giá cao nhờ khả năng phát hiện sớm mầm bệnh trước khi có biểu hiện bệnh lý Nguyên lý của phương pháp này là tìm đoạn gen đặc trưng cho chủng gây bệnh, giúp phát hiện mầm bệnh rất sớm, đặc biệt có giá trị trong chẩn đoán và hiệu quả phòng bệnh cao Hiện nay, nhiều quốc gia đã phát triển kỹ thuật non stop-one step PCR, cho phép thực hiện liên tục ba bước PCR mà không cần dừng phản ứng, nâng cao độ nhạy của phương pháp hàng trăm lần và đơn giản hóa thao tác, tiết kiệm thời gian và hạn chế nguy cơ bội nhiễm và sai số trong quá trình thực hiện.

Tùy theo tác nhân gây bệnh và khả năng kỹ thuật, việc lựa chọn phương pháp phát hiện là rất quan trọng để đạt hiệu quả cao nhất Thông thường, để phát hiện các chủng vi khuẩn, kỹ thuật lai ADN-ADN (dot blot) cho hiệu quả cao và chi phí thấp hơn so với các phương pháp vi sinh truyền thống Đối với các tác nhân gây bệnh do virus, kỹ thuật PCR (RT-PCR) mang lại hiệu quả cao và độ chính xác đặc hiệu Trong tương lai, việc kết hợp kỹ thuật PCR và lai ADN thay cho phương pháp phát hiện sản phẩm PCR bằng kỹ thuật điện di sẽ nâng cao độ nhạy phát hiện hơn nữa.

Kỹ thuật PCR khuếch ủại gen và ứng dụng

1.5.1 Nguyên lý và kỹ thuật PCR ðược phỏt minh từ năm 1985 và ủược thừa nhận chớnh thức năm 1993 qua Giải thưởng Nobel y dược và sinh lý cho Kary Mullis - người phát minh ra nú, PCR hiện ủang ủược ứng dụng tại Việt Nam Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) là kỹ thuật sử dụng chuỗi các phản ứng nối tiếp nhau dựng ủể khuếch ủại số lượng bản sao của một trỡnh tự ADN ủớch thụng qua các chu kỳ gồm ba bước: biến tính ADN, bắt cặp bổ sung với mồi và tổng hợp mạch mới nhờ enzym Taq-ADN polymerase [2], [16]

Phương pháp PCR có khả năng tạo ra khoảng 10 triệu bản sao từ một vài phân tử ADN khuôn Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình PCR bao gồm ADN khuôn, mồi (primer) và thiết bị thực hiện Hình 1.3 mô tả sơ đồ của phương pháp này.

Hỡnh 1-3- Phản ứng khuếch ủại PCR

• Thành phần phản ứng PCR:

Bảng 1-3 Thành phần phản ứng PCR

Thành phần Nồng ủộ cuối

MgCL 2 25mM 1-4mM dNTP 2mM 0.2mM

Tổng thể tớch phản ứng 50àl

• Các bước tiến hành phản ứng PCR

Phản ứng PCR là một chuỗi gồm nhiều chu kỳ và mỗi chu kỳ gồm ba bước [2] (hình 1.4)

Khuếch ủại theo luật số mũ gen mong muốn chu kỳ 1 chu kỳ 35

Bước đầu tiên trong quá trình biến tính ADN là đưa ADN vào dung dịch phản ứng có chứa các thành phần cần thiết cho sự sao chép, sau đó tăng nhiệt độ lên 90-98 độ C trong khoảng 1-3 phút Nếu tỷ lệ G-C trong ADN khuôn vượt quá 50%, thời gian ủ có thể kéo dài thêm 10 phút Ở nhiệt độ này, các phân tử ADN mạch kép sẽ bị tách ra do liên kết hydro bị đứt, tạo ra các sợi đơn để làm khuôn tổng hợp sợi mới.

Hình 1-4 Các bước thực hiện phản ứng PCR một chu kỳ

Nhiệt ủộ bắt cặp chuỗi ADN ủược tớnh theo cụng thức:

SƠ ðỒ 3 BƯỚC TRONG 1 CHU KỲ

Bước 1: Biến tính 90-98 o C : 30giây -1 phút

37-68 o C : 30giây-1phút Mồi xuôi và mồi ngược

Trong ủú G, C, A, T là cỏc nucleotit cú trong thành phần mồi

Sau bước 1, ngay lập tức nhiệt ủộ ủược hạ xuống từ từ và thực tế thường nhỏ hơn nhiệt ủộ tớnh toỏn Tm của mồi khoảng 5 0 C, vào khoảng 37-

Nhiệt độ 68 độ C và thời gian lưu từ 30 giây đến 1 phút là điều kiện tối ưu cho quá trình tổng hợp ADN Mồi được gắn vào ADN khuôn để bắt đầu tổng hợp chuỗi dài mạch Mồi bao gồm mồi xuôi và mồi ngược, với một đầu 3'-OH tự do giúp Taq-ADN polymerase khởi động quá trình tổng hợp mạch mới.

Quá trình nhân chuỗi ADN thường được thực hiện ở nhiệt độ 70-75°C, đây là mức nhiệt tối ưu cho Taq-ADN Polymerase Thời gian cho quá trình này là 1 phút đối với đoạn PCR nhỏ hơn 2Kb, và nếu đoạn ADN cần tổng hợp lớn hơn, thời gian sẽ tăng thêm 1 phút cho mỗi 1.000 bp.

Sau mỗi một chu kỳ từ một ADN kép mẹ tổng hợp hai sợi ADN con

Số chu kỳ trong phản ứng phụ thuộc vào lượng ADN khuôn có trong hỗn hợp Nếu ADN khuôn ít, có thể cần lên đến 40 chu kỳ, trong khi nếu lượng ADN khuôn nhiều, chỉ cần từ 25 đến 35 chu kỳ là đủ.

Sau chu trình cuối cùng, mẫu thường được ủ ở 72°C trong 5-15 phút để các sợi DNA xoắn lại, tạo nên sản phẩm của PCR Nếu sản phẩm PCR được sử dụng để tạo dựng (cloning), cần kéo dài thời gian ủ lên đến 30 phút để tổng hợp Adenine ở đầu 3’.

Sau ủú hạ xuống 40 0 C ủể bảo quản sản phẩm [18], [23]

1.5.2 Ý nghĩa và ứng dụng của phương pháp PCR

Kể từ khi được phát minh vào năm 1985, phương pháp PCR đã trở nên phổ biến và được ứng dụng rộng rãi trên toàn thế giới Phương pháp này đóng vai trò quan trọng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu và đời sống, bao gồm kiểm tra huyết thống, chẩn đoán bệnh di truyền, gây đột biến điểm, và phân tích mẫu ADN cổ.

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đang nghiên cứu về luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp, tập trung vào việc định kiểu gen của các đột biến, so sánh mức độ biểu hiện, định danh và phân loại vi khuẩn trong kỹ thuật vân tay di truyền Một ứng dụng quan trọng và cơ bản hiện nay là kỹ thuật tách dòng gen, nhằm thu được một lượng lớn bản sao của một trình tự ADN xác định và tinh sạch nhất.

1.5.3 Phương phỏp xỏc ủịnh trỡnh tự nucleotit:

- Xỏc ủịnh trỡnh tự nucleotit trờn mỏy tự ủộng ABI 3100 ủược xử lý bằng các phần mềm ABI PRISM 3100- Avant Data Collection v1.0, DNA Sequencing Analysis, ClustalX, BioEdit

- Xử lý và so sánh trình tự nucleotit trên cây phân loại trình tự gen quốc tế (BLAST) ở trang web www.ncbi.nlm.nih.gov.

CHƯƠNG II ðỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ðối tượng, thời gian và ủịa ủiểm tiến hành nghiờn cứu

- ðịa ủiểm lấy mẫu bệnh phẩm:

+ Quảng Ninh: Yờn Hưng, Võn ðồn (Trường Cao ủẳng Thuỷ sản)

+ Hải Phòng: Cát Bà (Trung tâm quốc gia giống hải sản miền Bắc)

+ Bà Rịa-Vũng tầu:Vũng Tầu (Trung tâm quốc gia giống hải sản nam Bộ)

- ðịa ủiểm phõn tớch mẫu: Viện Cụng nghệ sinh học, Viện Khoa học và Cụng nghệ Việt Nam, 18 Hoàng Quốc Việt, Hà Nội

Vibrio species isolated from various marine organisms, including shrimp (Penaeus monodon and Penaeus vannamei), grouper (Epinephelus coioides), golden trevally (Trachinotus blochi), red snapper (Lutjanus erythropterus), and yellowfin seabream (Sparus latus), highlight the significance of monitoring these bacteria in aquaculture and marine ecosystems.

(Paralichthys lethostigma), cá cảnh biển, ốc hương (Babylonia areolata) nuôi tại Việt Nam từ các nguồn khác nhau

6 thỏng từ thỏng 5 ủến thỏng 11 năm 2007

Vật liệu nghiên cứu

2.2.1 Chủng giống vi khuẩn dùng trong nghiên cứu

- Chủng Vibrio sp phân lập từ mẫu cá, tôm bệnh

- Chủng V anguillarum từ sưu tập của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản 1,2, 3 và Viện Công nghệ sinh học

- Chủng vi khuẩn chuẩn dùng so sánh V anguillarum (HW-72), V.harveyi (ATCC14126, VIB 395) do phòng thí nghiệm vi sinh vật biển - Trường ðại học Thanh ðảo (Trung Quốc) cung cấp

• Môi tr ườ ng l ỏ ng APW (Allaline Pepton Water): Môi trường làm giàu vi khuẩn

Chỉnh pH=8,6 bằng dung dịch NaOH

• Môi tr ườ ng 2216 E MA- marine agar: (g/l)

• Môi tr ườ ng TCBS - Thiosulfate Citrate Bile Salt Sucrose (g/l)

• Môi tr ườ ng VAM (V anguillarum Medium) (g/l)

2.2.3 Mụi trường xỏc ủịnh hoạt tớnh enzym

• Mụi tr ườ ng xỏc ủị nh ho ạ t tớnh Amylase (g/l)

• Môi tr ườ ng Test ho ạ t tính Lipase (g/l)

Chỉnh pH= 7,4 bằng NaOH Sau khi khử trựng ủể nguội tới 50 0 C, thờm Tween-80 với tỉ lệ thể tích 1%

• Môi tr ườ ng Test ho ạ t tính Gelatinase (g/l)

• Môi tr ườ ng Test Caseinase (g/l):

• Môi tr ườ ng Test Lecithinase

Mụi trường 2216E cú bổ sung 1% (v/v) lũng ủỏ trứng gà

• Môi tr ườ ng th ạ ch máu

Mụi trường T1N3 sau ủú bổ xung 5% hồng cầu mỏu ngựa

+ Bộ kit tách ADN tổng số (Genomic DNA Purification kit- Fermentas)

- Tủ cấy vô trùng, tủ nuôi

- Mỏy soi gel và chụp ảnh ủiện di GEL-DOC (Pharmacia Biotech)

- Cõn phõn tớch, cõn ủiện.

Phương pháp nghiên cứu

2.3.1 Phương phỏp phõn lập V.anguillarum trờn mụi trường ủặc trưng

+ ðối với tụm: búc vỏ ủầu tụm, lấy xoang tiờu hoỏ nghiền với dung dịch NaCl 0,9%, tỷ lệ 1:10

+ ðối với cá: lấy gan, thận, lá lách, ruột cá và những chỗ lở loét nghiền với dung dịch NaCl 0,9%, tỷ lệ 1:10

Sau ủú theo quy trỡnh sau:

- Làm giầu dịch có chứa vi khuẩn với dung dịch lỏng APW từ 6 ÷ 8 giờ ở 28°C

- Trải dịch vi khuẩn pha loóng lờn ủĩa mụi trường TCBS, VAM (0,1 ml dịch loóng/ủĩa Petri), ủ 28°C

- Quan sỏt sau 24 ữ 28 giờ, chọn những khuẩn lạc màu vàng ủể thực hiện tiếp thí nghiệm làm sạch trên môi trường 2216 E MA

Các chủng vi khuẩn từ Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản và Viện Công nghệ Sinh học đã được chúng tôi cấy chuyển sang môi trường TCBS và VAM để nghiên cứu.

2.3.2 Phương phỏp ủịnh danh Vibrio anguillarum bằng bộ kit

Trỡnh tự cỏc bước ủược tiến hành như sau:

- Vi khuẩn ủược nuụi cấy qua ủờm trờn mụi trường 2216E MA

- Lấy 1 khuẩn lạc hoà tan ủều vào 5 ml dung dịch NaCl 0,9%

- Nhỏ dịch vi khuẩn vào các giếng chứa các cơ chất của Kit

Quan sát sự ủi mầu của từng giếng và so sánh kết quả với bảng hướng dẫn của nhà sản xuất để xác định các phản ứng âm tính và dương tính.

2.3.3 Phương phỏp xỏc ủịnh hoạt tớnh enzym của vi khuẩn

- Chuẩn bị cỏc mụi trường xỏc ủịnh hoạt tớnh [5] (mục 2.2.3)

- Cấy vi khuẩn ủó ủược làm giầu lờn cỏc mụi trường ủú, ủ cỏc ủĩa vi khuẩn ở 28 0 C qua ủờm và quan sỏt kết quả thớ nghiệm

- Kiểm tra hoạt tớnh amylase bằng cỏch nhuộm Iốt vào ủĩa thạch Quan sỏt kết quả nếu thấy xuất hiện vựng trắng xung quanh khuẩn lạc thỡ xỏc ủịnh

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã nghiên cứu 33 chủng vi khuẩn có khả năng sản xuất enzym amylase Nghiên cứu này chỉ ra rằng một số chủng vi khuẩn không có hoạt tính enzym amylase.

Để kiểm tra hoạt tính của Caseinase và Gelatinase, tiến hành nhuộm ủĩa thạch với Trichloroacetic acid Nếu quan sát thấy vùng trong suốt xung quanh khuẩn lạc, điều này cho thấy chủng vi khuẩn có hoạt tính của các enzyme này.

- Kiểm tra hoạt tính Lipase và Lecithinase, nếu thấy xung quanh khuẩn lạc ủục lờn thỡ cú nghĩa rằng cỏc chủng vi khuẩn cú hoạt tớnh enzym ủú

Kiểm tra hoạt tính hemolysis bằng cách quan sát kết quả xung quanh khuẩn lạc Nếu thấy xuất hiện vùng trắng, chứng tỏ vi khuẩn có hoạt tính β-hemolysis Ngược lại, nếu có màu xanh (green) xung quanh khuẩn lạc, vi khuẩn sẽ có hoạt tính α-hemolysis.

2.3.4 Phương pháp tách chiết ADN tổng số

Tách ADN tổng số của vi khuẩn có thể thực hiện bằng bộ Kit Genomic DNA Purification Kit của Fermentas Quy trình bắt đầu bằng cách thu sinh khối vi khuẩn từ dịch nuôi cấy, lấy 1,5 ml dịch vi khuẩn cho vào ống Eppendorf 1,5 ml và ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 5 phút Sau đó, loại bỏ dịch nổi, rửa cặn tế bào bằng dung dịch TE 1x, thêm 500 µl TE 1x và ly tâm lại Tiếp theo, thêm 200 µl TE 1x, tránh tạo bọt, và thêm 400 µl dung dịch Lysis Solution, ủ trong 10 phút Sau đó, thêm 600 µl dung dịch chloroform, lắc nhẹ và ly tâm ở 10.000 vòng trong 3 phút Cuối cùng, chuyển toàn bộ dịch sang ống mới và thêm 800 µl dung dịch tủa ADN, gồm 720 µl dung dịch H2O khử ion và 80 µl dung dịch Supplied 10x, để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút.

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội tiến hành nghiên cứu luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp với quy trình tách chiết ADN Đầu tiên, hòa tủa ADN trong 100 µl dung dịch NaCl 1,2M, sau đó thêm 2 µl Rnase 10mg/ml và ủ ở 37°C trong 1 giờ Tiếp theo, thêm 300 µl cồn tuyệt đối vào ống và ủ ở -20°C trong 3 giờ hoặc qua đêm Cuối cùng, ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 15 phút để thu tủa và rửa ADN hai lần bằng cồn 70%.

- Thờm 500 àl cồn 70 0 , trộn ủều

- Ly tâm 12.000 vòng trong 5 phút

- Làm khô ADN bằng máy hút chân không

- Hoà tủa ADN trong 50 àl TAE1x và kiểm tra ủộ sạch bằng ủiện di trên gel agrose 1%

2.3.5 Phương phỏp PCR khuếch ủại gen

Nguyên tắc của phản ứng PCR là tổng hợp mạch ADN mới từ mạch khuôn bằng cách sử dụng mồi chuyên biệt và enzym Taq polymerase, với sự tham gia của các dNTP và ion Mg 2+ Sau khi thực hiện phản ứng PCR, mẫu ADN cần được giữ ở nhiệt độ 4°C cho đến khi tiến hành phân tích.

2.3.6 Phương phỏp ủiện di ADN trờn gel agrose

Nguyên tắc hoạt động của ADN trong môi trường pH trung tính là do sự tĩnh điện từ các nhóm phosphate Khi có sự tác động của dòng điện một chiều, các phân tử ADN sẽ di chuyển về phía cực dương.

- Lấy 1,5g Agarose, cho vào bỡnh, thờm ủệm TAE 1x cho ủủ 100ml

- ðun sụi kỹ, ủể nguội ủến 50-60 o C

Đổ gel vào khay ủiện đã cài sẵn lược để tạo giếng, với độ dày gel khoảng 3 - 4 mm Để gel ổn định trong khoảng 30 phút, sau đó lấy ra và đặt vào khay ủiện có chứa dung dịch TAE 1x.

- Cho 1àl Loading dye 6x vào thiết bị trộn mẫu

- Cho tiếp 5àl mẫu ADN vào, lắc ủều

Tra mẫu và ủiện di

- Dựng pipet 10àl tra mẫu vào giếng, tra marker (nếu cần)

- éiện di trong thời gian 30 phỳt ở ủiện thế 100V và cường ủộ 50mA

- Sau khi ủó dừng ủiện di Lấy bản gel nhuộm trong Ethidium bromide khoảng 5-10 phỳt và tiến hành ủọc kết quả

- Kết quả ủược ủọc trờn bàn ủọc với tia UV bước súng 302 nm hoặc trờn chụp ảnh trên máy Gel-DOC

2.3.7 Phương phỏp xỏc ủịnh trỡnh tự nucleotit

+ Làm sạch sản phẩm PCR (theo bộ kit Concert Matrix Gel Extraction System):

- ðiện di sản phẩm PCR trên gel agrose Cắt phần gen có chứa ADN cho vào ống Eppendofr và thờm dung dịch L1 với tỷ lệ là 30 àl/10mg gel

- Thêm silica và ủ ống ở 50 0 C trong 15 phút

- Lý tâm 12.000 vòng/phút trong 30 giây, bỏ dịch nổi và rửa cặn 2 lần bằng dung dịch L1 Tiếp tục rửa cặn bằng dung dịch L2

- ðể khụ ADN trong khụng khớ và thờm 20àl TE 1x, ủ ở 50 0 C trong 5 phỳt

- Lý tâm 12.000 vòng/phút trong 30 giây, hút dịch nổi sang ống mới

Sau khi làm sạch, sản phẩm PCR ủược ủiện di ủể kiểm tra ủộ tinh khiết trờn gel agrose 1,5 %, ủệm TAE 1x

2.3.8 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu

Cỏc số liệu thớ nghiệm ủược xử lý theo phương phỏp thống kờ sinh học

Trỡnh tự nucleotit ủược xử lý bằng cỏc phần mềm ABI PRISM 3100- Avant Data Collection v1.0, DNA Sequencing Analysis, ClustalX, BioEdit

So sánh trình tự gen tại ngân hàng gen quốc tế bằng chương trình Blast ở trang web www.ncbi.nlm.nih.gov

CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

Kết quả thu mẫu, phân lập Vibrio anguillarum trên một số loại hải sản nuôi

3.1.1 Kết quả thu mẫu bệnh phẩm và phân lập vi khuẩn

Chúng tôi đã thu thập các mẫu bệnh phẩm để phân lập vi khuẩn từ nhiều loại hải sản, bao gồm tôm sú (Penaeus monodon) với 4 mẫu, cá song (Epinephelus coioides) 13 mẫu, cá tráp vàng (Sparus latus) 4 mẫu, cá chim vây vàng (Trachinotus blochi) 5 mẫu, cá hồng ỏ (Lutjanus erythropterus) 6 mẫu, và cá bơn (Paralichthys lethostigma).

6 mẫu lấy từ các vùng nuôi khác nhau (Quảng Ninh, Cát Bà)

Cá nhiễm bệnh thường có dấu hiệu bỏ ăn hoặc ăn kém, với từng vùng trên lưng có màu sắc sẫm hơn hoặc toàn bộ cơ thể cũng bị biến đổi màu Ngoài ra, cá còn có thể xuất hiện các vết xuất huyết trên các vùng cơ thể, hoại tử vùng vây, và mắt có dấu hiệu ủ rũ hoặc lồi ra.

Mẫu tụm: là tụm nhiễm bệnh ủỏ thõn, bỏ ăn, chết rải rỏc là dấu hiệu của nhiễm Vibrio

Một số chủng giống vi khuẩn được cung cấp từ sưu tập của Viện Công nghệ sinh học và Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản 1, 2, 3 bao gồm: 16 mẫu tôm sú (Penaeus monodon), 6 mẫu tôm chân trắng (Penaeus vannamei), 3 mẫu cá song (Epinephelus coioides), 4 mẫu ốc hương (Babylonia areolata) và 1 mẫu cá cảnh biển.

Chủng chuẩn dùng so sánh 03 chủng gồm: V harveyi (ACCT 14126,

VIB 395), V anguillarum (HW 72) ủược cung cấp từ ðại học Thanh ðảo- Trung Quốc

Danh mục vi khuẩn, nguồn và ủịa ủiểm thu mẫu ủược trỡnh bày trờn bảng 3.1

Bảng 3-1 Danh mục vi khuẩn, nguồn và ủịa ủiểm thu nhận

TT ðối tượng Tên, kớ hiệu Số lượng ðịa ủiểm Thời gian

C19-20 2 Nha Trang 28/6/2007 C27-30 4 Quảng Ninh 1/8/2007 C59-68 10 Vũng tầu 28/8/2007

3 Tôm chân trắng(Penaeus vannamei) 6

4 Ốc hương (Babylonia areolata) C14-17 4 Nha Trang 28/6/2007

5 Cá cảnh biển C18 1 Nha Trang 28/6/2007

6 Cá tráp (Sparus latus) C38-41 4 Quảng Ninh 22/8/2007

7 Cỏ hồng ủỏ (Lutjanus erythropterus) C42-47 6

Hình 3.1 là một số hình ảnh về mẫu cá, tôm bệnh thu thập tại các cơ sở nuôi và sử dụng làm mẫu vật ủể phõn lập vibrio

Cá song hổ (Cát Bà) Cá tráp vây vàng (Yên Hưng)

Tôm thẻ chân trắng Ốc hương

Tôm sú Cá bơn (Yên Hưng)

Hỡnh 3-1 Bệnh phẩm một số loài hải sản thu ủược

3.1.2 Kết quả phõn lập vi khuẩn trờn mụi trường ủặc trưng

Bảng 3-2 Kết quả phân lập vi khuẩn trên môi trường TCBS ,VAM

Khuẩn lạc trên TCBS Chủng cho khuẩn lạc vàng trên

TT ðặc ủiểm/ủối tượng thuỷ sản phân lập

Tổng số mẫu Xanh, các mầu khác Vàng VAM

Các mẫu bệnh phẩm được xử lý theo phương pháp tại mục 2.3.1 Trên môi trường VAM, V anguillarum và V harveyi đều cho khuẩn lạc màu vàng Kết quả phân lập từ 71 mẫu vi khuẩn thu được 30 chủng cho khuẩn lạc vàng trên TCBS Từ các khuẩn lạc vàng, hòa trong dung dịch NaCl 0,85% và cấy trải lên đĩa thạch với môi trường VAM, nuôi ở 28°C trong 24-48 giờ, chọn trên đĩa thạch các khuẩn lạc màu vàng, lớn tròn bóng Sau đó, chọn cấy chuyển vài lần trên môi trường 2216E để thu các chủng thuần nhất, giữ trong glycerol 15% ở -70°C để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.

Hình 3-2: Khuẩn lạc V.anguillarum trên môi trường TCBS

Hình 3-3 Khuẩn lạc của HW 72 trên môi trường VAM

Hình 3-4 Khuẩn lạc của chủng (Va5) trên môi trường VAM

Hình 3-5 : Khuẩn lạc V.anguillarum trên môi trường TCBS

Hình 3-6: Khuẩn lạc của chủng ( Va3) trên môi trường VAM

Hình 3-7: Khuẩn lạc của chủng (Va7) trên môi trường VAM

Trong môi trường TCBS, các khuẩn lạc phát triển tốt với màu vàng, nhờ vào việc sử dụng đường sucrose và lên men axit, làm cho môi trường chuyển từ xanh sang vàng Ngược lại, trong môi trường VAM, các khuẩn lạc có hình thái lớn, tròn và màu vàng, không có sự khác biệt đáng kể giữa các chủng thử nghiệm và chủng chuẩn Các chủng này sử dụng đường sorbitol và cũng lên men axit, dẫn đến sự thay đổi màu sắc của môi trường từ xanh sang vàng Do đó, các chủng được phân lập có hình thái và kích thước tương đồng với các chủng khác.

V.anguillarum hoặc V harveyi và ủược ký hiệu Va và Vh.

Kết quả nghiờn cứu xỏc ủịnh V.anguillarum bằng phương phỏp

pháp sinh học phân tử

3.2.1 Kết quả nghiờn cứu khuếch ủại ủoạn gen empA của Vibrio anguillarum

- PCR khuếch ủại gen empA chủng chuẩn

Sử dụng 3 chủng V anguillarum (HW72), V.harveyi (ATCC4126, VIB 395) làm mẫu chuẩn ủể thiết lập cỏc ủiều kiện phản ứng và chu trỡnh nhiệt khuếch ủại gen empA

Cặp mồi F và R được thiết kế dựa trên trình tự gen empA Metalloproteaza của chủng Vibrio anguillarum (mã số AY091854) do tác giả Chen J.X công bố Phản ứng khuếch đại gen bằng phương pháp PCR được thực hiện với cặp mồi có trình tự đã nêu.

Các chủng V anguillarum (HW72), V.harveyi (ATCC4126, VIB 395) từ trong ống giữ - 70 0 C ủược lấy ra và làm giàu trong dung dịch APW lỏng

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tiến hành thu sinh khối và tách ADN từ các chủng vi khuẩn bằng Kit Genomic DNA Purification Kit của Fermentas Kết quả được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%, cho thấy sản phẩm thu được chỉ có một vạch duy nhất, đại diện cho ADN tổng số của các chủng vi khuẩn phân lập, không bị đứt gãy và không chứa ARN, phù hợp để sử dụng trong phản ứng PCR.

Hình 3-8: ADN tổng số của các chủng chuẩn ðường 1: HW72; ðường 2: ATCC14126, ðường 3: VIB 395

Bảng 3-3: Thành phần phản ứng PCR

Thành phần Nồng ủộ Thể tớch (àl)

- Quá trình chuẩn bị hỗn hợp phản ứng:

+ Lắc nhẹ trên máy Vortex và li tâm nhanh tất cả các thành phần dung dịch sau khi ủó ủược làm tan

+ Cho vào trong 1 ống typ PCR các thành phần phản ứng sau (bảng 3-3):

H2O ion ủó khử trựng, ủệm PCR, dNTP, primer F, primer R, MgCl2, Taq-ADN Polymeraza, ADN khuôn Toàn bộ quá trình trên tiến hành trờn khay nước ủỏ

Lắc nhẹ trên mỏy Vortex và li tõm typ PCR để hỗn hợp các thành phần được trộn đều Đặt mẫu vào máy, kiểm tra chu trình nhiệt và bắt đầu thực hiện phản ứng PCR.

+ Lặp lại 35 chu kì : 94 0 C: 1 phút; 56 0 C: 30 giây; 72 0 C: 30 giây

+ Bước tổng hợp kéo dài ở chu kỳ cuối cùng (72 0 C) trong 10 phút

+ Sau ủú giữ mẫu ở 4 0 C cho ủến khi phõn tớch

Nhiệt độ ủ mồi được khảo sát trong khoảng từ 54°C đến 60°C, và nhiệt độ tối ưu được chọn là 56°C Sản phẩm PCR của đoạn gen empA có kích thước 248 bp đã được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1,5% trong dung dịch TAE 1x.

Kết quả trình bày trên hình 3-9 cho thấy đoạn gen empA Metalloproteaza được khuếch đại với độ dài khoảng 248 bp, dựa trên tính toán lý thuyết Chủng vi khuẩn được xác định là Vibrio anguillarum, được coi là chủng chuẩn.

Kết quả PCR cho thấy mẫu Hw72 dương tính với các chủng V harveyi, có hình thái khuẩn lạc vàng trên môi trường TCBS và VAM; tuy nhiên, khi khuếch đại gen empA, kết quả lại cho thấy âm tính.

Cặp mồi ủặc hiệu được sử dụng để phát hiện gen empA của Vibrio anguillarum, với chu trình nhiệt và các điều kiện phản ứng tối ưu Các chủng Vibrio đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu này.

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã thực hiện nghiên cứu về luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp, trong đó phát hiện rằng vi khuẩn 45 harveyi chuẩn có hình thái tương tự trên môi trường VAM và TCBS, nhưng khi tiến hành PCR gen empA lại cho kết quả âm tính.

Hình 3-9 Sản phẩm PCR gen empA của các chủng chuẩn

M- thang chuẩn 1 Kb: 250 bp; 500 bp, 750 bp… ðường1: HW 72; ðường 2: ATCC14126; ðường 3: VIB 395

- PCR khuếch ủại gen empA cỏc chủng mẫu phõn lập

Dựa trên kết quả thu được từ chủng chuẩn, chúng tôi đã tiến hành tách ADN của tất cả các chủng vi khuẩn lạc vàng trên VAM và kiểm tra độ sạch trước khi thực hiện PCR khuếch đại gen empA Kết quả cho thấy trong số 30 chủng vi khuẩn phân lập từ mẫu tôm sú, tôm chân trắng, cá song và cá bơn, có 14 mẫu dương tính với sản phẩm PCR có kích thước 248 bp, tương ứng với sản phẩm PCR của chủng chuẩn HW 72 Cụ thể, hình 3-10 hiển thị 10 mẫu vi khuẩn phân lập từ tôm với kết quả dương tính, trong khi hình 3-11 cho thấy 4 mẫu dương tính từ các chủng phân lập từ cá song.

Hình 3-10 Sản phẩm PCR gen empA của các chủng phân lập từ mẫu tôm

M: thang chuẩn 50 bp; ðường 1- 10 các chủng cho kết quả dương tính; ðường 11: âm tính

Hình 3-11 Sản phẩm PCR gen empA của các chủng phân lập từ mẫu cá

M: thang chuẩn 2 kb; ðường 1: ADN chủng chuẩn HW 72 ðường 3,4,5,6: dương tính (các chủng phân lập từ cá song) ðường 2: Kết quả âm tính

3.2.2 Kết quả nghiên cứu giải trình tự và phân tích gen empA của V anguillarum

Sau khi có sản phẩm PCR chúng tôi tiến hành làm sạch bằng Kit bioneer, Kiểm tra trờn ủiện di 1,5% agarose (hỡnh 3-12)

- Hình 3-12 Sản phẩm PCR gen empA làm sạch

Tiến hành xỏc ủịnh trỡnh tự gen empA của chủng V.anguillarum Va3 phõn lập từ tụm tại Việt Nam trờn mỏy xỏc ủịnh trỡnh tự nucleotit tự ủộng ABI 3100

Hình ả nh chrroma (Trình t ự s ắ p x ế p các Nucleotit)

CGATTTGTAAGGGCGACAATCCACGAAGAAGTGGAAGGTTTGGCTGCCGGGCT TTGACATACAAATCAGCATCACCTGAGCCCAAACTGATCGAAACTTTAGCGCT GGTTGAGCTTGCGACCGTAAAGGTATAGAAGGCTTCGGAGCTTCGCGTACCTT GTAACCCTATTACTGGTTTACCTTTTTCTAGTACATTCTCCGTTGGAGGCACTAC GCCACAGCTAGCATTTACGCCCACTTGGTTAAAGG

Sử dụng phần mềm BLAST tại trang web www.ncbi.nlm.nih.gov, chúng tôi đã so sánh trình tự gen empA của chủng V anguillarum Va3 với các trình tự AY428808, AY091854, AY046320 và L02528 được công bố trên ngân hàng dữ liệu gen Quốc tế Kết quả cho thấy trình tự nucleotít của gen empA của Va3 có độ tương đồng lên tới 97% với gen empA của các chủng V anguillarum đã so sánh Các thông số kỹ thuật được trình bày dưới đây.

SeqA Name Len(nt) SeqB Name Len(nt) Score

==================================================== AY046320 CGATTTGTAAGGGCGACAATCCCACGAAGAAGTGGTTGGTTT-GCTGCC-GGCTTTGACA 58 L02528 CGATTTGTAAGGGCGACAATCCCACGAAGAAGTGGTTGGTTT-GCTGCC-GGCTTTGACA 58 AY091854 CGATTTGTAAGGGCGACAATCCCACGAAGAAGTGGTTGGTTT-GCTGCC-GGCTTTGACA 58 AY428808 CGATTTGTAAGGGCGACAATCCCACGAAGAAGTGGTTGGTTT-GCTGCC-GGCTTTGACA 58 Va3 CGATTTGTAAGGGCGACAATCC-ACGAAGAAGTGGAAGGTTTGGCTGCCGGGCTTTGACA 59 ********************** ************ ***** ****** **********

AY046320 TACAAATCAGCATCACCTGAGCCCAAACTAATCGAAACTTTAGCGCTGGTTGAGCTTGCG 118 L02528 TACAAATCAGCATCACCTGAGCCCAAACTAATCGAAACTTTAGCGCTGGTTGAGCTTGCG 118 AY091854 TACAAATCAGCATCACCTGAGCCCAAACTGATCGAAACTTTAGCGCTGGTTGAGCTTGCG 118 AY428808 TACAAATCAGCATCACCTGAGCCCAAACTGATCGAAACTTTAGCGCTGGTTGAGCTTGCG 118 Va3 TACAAATCAGCATCACCTGAGCCCAAACTGATCGAAACTTTAGCGCTGGTTGAGCTTGCG 119 ***************************** ******************************

AY046320 ACCGTAAAGGTATAGAAGGCTTCGGAGCTTCGCGTACCTTGTAACCCTATTACTGGTTTG 178 L02528 ACCGTAAAGGTATAGAAGGCTTCGGAGCTTCGCGTACCTTGTAACCCTATTACTGGTTTG 178 AY091854 ACCGTAAAGGTATAGAAGGCTTCGGAGCTTCGCGTACCTTGTAACCCTATTACTGGTTTG 178 AY428808 ACCGTAAAGGTATAGAAGGCTTCGGAGCTTCGCGTACCTTGTAACCCTATTACTGGTTTG 178 Va3 ACCGTAAAGGTATAGAAGGCTTCGGAGCTTCGCGTACCTTGTAACCCTATTACTGGTTTA 179

AY046320 CCTTTTTCTAGCACATTCTCCGTTGGAGGCACTACGCCACAGCTAGCATTTACGCCCACT 238 L02528 CCTTTTTCTAGCACATTCTCCGTTGGAGGCACTACGCCACAGCTAGCATTTACGCCCACT 238 AY091854 CCTTTTTCTAGCACATTCTCCGTTGGAGGCACTACGCCACAGCTAGCATTTACGCCCACT 238 AY428808 CCTTTTTCTAGCACATTCTCCGTTGGAGGCACTACGCCACAGCTAGCATTTACGCCCACT 238 Va3 CCTTTTTCTAGTACATTCTCCGTTGGAGGCACTACGCCACAGCTAGCATTTACGCCCACT 239 *********** ************************************************

anguillarum và harveyi

Quy trỡnh xỏc ủịnh vi khuẩn V anguillarum bằng kỹ thuật

Polymerase chain reaction (PCR) a Thiết bị, dụng cụ

Bộ nghiền mẫu vô trùng và tủ thao tác vô trùng là những thiết bị quan trọng trong phòng thí nghiệm Máy trộn mẫu và máy khuấy từ giúp trộn đều các thành phần Mỏy ly tâm với tốc độ 13.000 vòng/phút và máy PCR hỗ trợ trong quá trình phân tích ADN Bộ ủ nhiệt di động và bàn ủ kết quả với tia UV bước sóng 312 nm đảm bảo kết quả chính xác Mỏy chụp ảnh lưu kết quả giúp ghi lại thông tin quan trọng Tủ lạnh nhiệt độ -20°C hoặc thấp hơn và tủ lạnh 4°C bảo quản mẫu tốt nhất Lũ vi súng (microwave) cùng với micropipette các loại và ống Eppendorf chuyên dùng cho PCR (1,5 ml và 0,5 ml) là những dụng cụ không thể thiếu Các đầu tớp 1-5, 10, 100 và 1000 µl cùng với mồi và hóa chất hỗ trợ cho các thí nghiệm.

M ồ i chuyên bi ệ t: empA - F 5’ CCT TTA ACC AAG TGG GCG TA-3’ empA - R 5’ CGA TTT GTA AGG GCG AAC AT-3’

- Hoá chất dùng cho PCR

- Agarose 1,5% trong dung dịch TAE

- Dung dịch nạp mẫu (bromophenol blue và glycerol) 6X gồm:

+ Dung dịch ethidium bromide (10 mg/ml)

+ Thang ADN chuẩn: 1.000 bp c Chuẩn bị mẫu

Từ các chủng vi khuẩn thu nhận trên môi trường VAM, cấy trên ống thạch nghiêng môi trường 2216E và ủ ở 28°C trong 18-24 giờ Sau đó, thêm 2 ml đệm PBS và li tâm ở 12.000 vòng/phút trong 15 phút để thu tủa ADN tổng số từ vi khuẩn được tách chiết theo bộ Kit Purification DNA Genomic của Fermentas.

Ly tâm 1ml huyền dịch tế bào ở tốc độ 5000 vòng/phút trong 5 phút Rửa tế bào hai lần bằng dung dịch PBS 1x, sau đó hòa lại sinh khối vi khuẩn trong 200µl dung dịch TE 1x Thêm 400µl dung dịch phá tế bào và ủ ở 65°C trong 5 phút Cuối cùng, bổ sung 600µl chloroform, lắc nhẹ và ly tâm ở 10.000 vòng/phút trong 2 phút.

Chuyển toàn bộ pha trên sang ống mới, thêm 800 µl dung dịch tủa, lắc nhẹ và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút, sau đó ly tâm 10.000 vòng/phút trong 2 phút Loại bỏ dịch nổi và hòa tủa ADN vào 100 µl dung dịch NaCl 1,2M, trộn đều Ủ với Rnase ở nồng độ cuối cùng 0,2 mg/ml tại 37°C trong 1 giờ để loại ARN Thêm 300 µl cồn tuyệt đối và ủ trong 10 phút ở -20°C Sau đó, ly tâm tủa ở 14.000 vòng/phút trong 15 phút, loại bỏ cồn và rửa tủa 2 lần bằng cồn 70% Cuối cùng, làm khô và hòa tủa trong nước khử ion.

Kiểm tra độ sạch và xác định hàm lượng bằng cách điện di trên gel agarose 1% hoặc sử dụng quang phổ ở bước sóng 280nm và 260nm Thực hiện phản ứng PCR để phân tích mẫu.

Bảng 3-7 Thành phần phản ứng PCR (25 àl.)

TT Thành phần Thể tích

Tổng cộng 25 à à àl à e Chu trình nhiệt cho phản ứng:

Thực hiện phản ứng khuếch ủại: 94 o C trong 3 phỳt (1 chu kỳ); nhiệt ủộ 93 o C trong 1 phỳt; ở nhiệt ủộ 56 o C trong 1 phỳt; ở nhiệt ủộ 72 o C: 1 phỳt; (35 chu

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã thực hiện nghiên cứu liên quan đến luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp, trong đó áp dụng chu kỳ cuối nhiệt ủ ở 72 độ C trong 10 phút và giữ ở nhiệt độ 4 độ C cho đến khi tiến hành phân tích sản phẩm Kết quả nghiên cứu cho thấy những thông tin quan trọng về hiệu quả của quy trình ủ trong lĩnh vực nông nghiệp.

Lấy 5 àl sản phẩm PCR trộn với 1àl dung dịch 6X Loading Dye rồi cho vào cỏc giếng thạch éiện di trờn gel agarose 1,5 % trong ủệm TAE 1X, thời gian

30 phỳt ở ủiện thế 100V và cường ủộ 50mA

− Nhuộm bản gel bằng Ethidium bromide (5-15phỳt); soi bản gel trờn ủốn UV (312nm) rồi xem kết quả

Dựa vào thang ADN và mẫu chuẩn để nhận định kết quả, nếu trên ảnh hiện diện sản phẩm PCR, ADN của mẫu nghiên cứu xuất hiện duy nhất một băng đặc trưng kích thước 249 bp, thì kết luận chủng thu nhận được chính là.

Hỡnh 3-17 Sản phẩm khuếch ủại trờn gel agarose 1,5% trong ủệm TAE 1X

Chỳ thớch - Giếng M thang ADN chuẩn 1.000 bp; Giếng 1-2: sản phẩm khuếch ủại

250 bp; Giếng 3-4: mẫu ủối chứng dương; Giếng 5 : mẫu ủối chứng õm.

Kết quả khảo sát hoạt tính enzym của các chủng Vibrio.sp

Tiến hành thử hoạt tính một số enzyme Amylase, Caseinase, Gelatinase, Lipase, Lecithinase và Hemolysin trên các chủng V.anguillarum,

V harveyi ủó ủược ủịnh danh bằng PCR Trờn bảng 3-8 cho thấy, hầu hết cỏc chủng vi khuẩn ủều cú hoạt tớnh Amylase, Caseinase, Gelatinase, Lipase, Lecithinase và Hemolysis (17-24/30 chủng), trong ủú hoạt tớnh Gelatinase, Lipase, Lecithinase và Hemolysis biểu hiện rất cao ða phần các chủng vi khuẩn nghiờn cứu ủều biểu hiện hoạt tớnh của cỏc enzym ngoại bào ðặc biệt, cỏc chủng V.anguillarum phõn lập ủược ủều thể hiện hoạt tớnh β-hemolysis (++) tương ủương chủng chuẩn Với biểu hiện hoạt tớnh β-hemolysis là hoạt tớnh cú khả năng gõy ủộc tố cao nhất (hơn hoạt tớnh α và γ) cỏc chủng này cú khả năng ứng dụng cho sản xuất chế phẩm sinh học và vắcxin

Hình 3-18 Hoạt hoạt tính enzym của V.anguillarum,

A Hoạt tính Caseinasse B Gelatinase C- Hoạt tính Hemolysis

Hỡnh 3-19 Kết quả xỏc ủịnh hoạt tớnh enzym của V harveyi A - Gelatinase;

Ba chủng Vibrio anguillarum: HW72, Va4, Va6 đều tiết ra enzym phân huỷ như Gelatinase, Caseinase và thạch máu, thể hiện qua sự hình thành các vòng cơ chất xung quanh chúng Trong đó, vòng cơ chất bị tác động bởi chủng HW72 là lớn nhất, trong khi hai chủng còn lại cũng cho thấy hoạt tính enzym nhưng có kích thước nhỏ hơn.

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu về luận văn thạc sĩ khoa học Nông nghiệp, trong đó chỉ ra rằng chủng Va1 không có hoạt tính enzym tác động lên cơ chất xung quanh, dẫn đến việc chủng này không bị biến đổi màu.

Trong hình 3-19, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm hoạt tính enzym của V harveyi trên các cơ chất ủ Tương tự như chủng chuẩn HW72, một số chủng chuẩn như ATCC14126 và VIB 395 cho thấy hoạt động enzym vượt trội trên các cơ chất bị tác động Các chủng này cũng thể hiện khả năng tiết enzym phân huỷ cơ chất một cách hiệu quả.

Bảng 3-8 Hoạt tính enzym của các chủng V anguillarum, V harveyi

A m yl as e C as ei na se G el at in as e L ip as e L ec ith in as e H em ol yy si s

Ghi chú:( -) âm tính; (+) hoạt tính thấp; (++) hoạt tính trung bình;(+++) hoạt tính cao

Trong các chủng Vibrio anguillarum, có ba chủng chính là Va2 (Tôm sú), Va7 (Tôm chân trắng) và Va11 (Cá song) với hoạt tính enzym cao, đặc biệt là hoạt tính β-hemolysis, có khả năng gây bệnh cho vật chủ Bên cạnh đó, một số chủng V harveyi cũng cho thấy hoạt tính α-hemolysis, tạo màu xanh lục quanh khuẩn lạc trên môi trường thạch máu (như Vh21 và Vh25), trong khi một số khác lại thể hiện hoạt tính β-hemolysis, tạo ra vùng trong suốt (như Vh28 và Vh29).

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

Trong quá trình nghiên cứu về phân lập vi khuẩn từ các mẫu sinh vật như tụm sỳ, tụm thẻ chân trắng, cỏ song, cỏ trỏp, cỏ bơn, cỏ hồng ỏ, cỏ chim vẫy vàng, ốc hương và cỏ cảnh biển, chúng tôi đã thu được một số chủng vi khuẩn có tính đặc trưng Kết quả PCR xác định được 15 chủng Vibrio anguillarum.

- Gen empA là gen ủặc trưng của vi khuẩn V anguillarum cú thể sử dụng gen empA làm gen chỉ thị ủể nhận dạng V anguillarum bằng phương phỏp

PCR đã xây dựng ựược quy trình kỹ thuật phương pháp PCR phát hiện chắnh xác vi khuẩn Vibrio anguillarum

Hầu hết các chủng Vibrio anguillarum phân lập từ thủy sản đều có hoạt tính enzym như Amylase, Caseinase, Gelatinase, Lipase và Lecithinase Ngoài ra, chúng cũng biểu hiện hoạt tính β-hemolysis trên môi trường thạch máu Những chủng mang β-hemolysis có tiềm năng cao để sử dụng trong sản xuất chế phẩm phòng bệnh và vắcxin.

- ðề nghị tiếp tục phổ biến áp dụng phương pháp PCR phát hiện Vibrio anguillarum thờm trờn cỏc ủối tượng thủy sản khỏc nhau ủể khẳng ủịnh kết quả

Đầu tư nghiên cứu sâu về dịch tễ học phân tử và tính chất gây bệnh của V anguillarum là cần thiết để phát triển các giải pháp điều trị hiệu quả Nghiên cứu này sẽ định hướng cho việc sản xuất vắc xin phòng bệnh do V anguillarum, góp phần nâng cao hiệu quả kiểm soát dịch bệnh trong nuôi trồng thủy sản.

V.anguillarum gây ra là rất cần thiết

Định dạng
Số trang	76
Dung lượng	5,79 MB