ĐỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
- Chủng nấm men: Saccharomyces cerevisiae – NBRC104019(Deparment of Biotech National Irstitute of tech and Evaluation 258 KayushaKamatari, Kisharayu – SHI, Chiba pres, 292-0818 Japan.)
Nội dung nghiên cứu
- Khảo sát xây dựng đường cong sinh trưởng của chủng S cerevisiae
- Ảnh hưởng của mật độ tế bào gieo cấy ban đầu lên lượng sinh khối của
S cerevisiae NBRC104019 thu được sau thời gian nuôi cấy
- Ảnh hưởng của nhiệt độ lên lượng sinh khối của S cerevisiae NBRC104019 thu được sau thời gian nuôi cấy.
- Ảnh hưởng của tốc độ cánh khuấy lên lượng sinh khối của S cerevisiae NBRC104019 thu được sau thời gian nuôi cấy
- Ảnh hưởng của nồng độ oxi lên lượng sinh khối của S cerevisiae NBRC104019 thu được sau thời gian nuôi cấy
- Xác định thời gian nuôi cấy trong điều kiện thích hợp để thu nhận lượng sinh khối S cerevisiae NBRC104019 cao.
Thiết bị, hóa chất sử dụng
Bảng 3.1: Các thiết bị sử dụng
Thiết bị thí nghiệm Nhãn hiệu Nước sản xuất
Lò vi sóng Sanyo Nhật
Máy li tâm Labnet Mỹ
Tủ ấm Pol – Eko Ba Lan
Tủ lạnh Sanaky Việt Nam
Nồi hấp khử trùng Yuin Việt – Hàn
Cân phân tích Shinko Nhật
Máy đếm khuẩn lạc Interscience Pháp
Thiết bị lên men 15 lít Biocanvas Hàn
Tủ âm sâu Daihan Hàn
Tủ sấy Pol – Eko Ba Lan
Kính hiển vi Kruss Đức
Hình 3.1: Thiết bị lên men 15 lít 3.3.2 Môi trường
-Môi trường: môi trường hansen gồm:
Bảng 3.2: Thành phần môi trường Hansen [8]
Thành phần Khối lượng (gam/ lit) Đường glucose 50
Phương pháp nghiên cứu
Nguyên tắc bảo quản giống vi sinh vật là duy trì đặc tính ban đầu của chúng bằng cách làm chậm quá trình hô hấp và trao đổi chất Điều này giúp ngăn cản sự sinh sản của vi sinh vật trước khi được cất giữ.
- Giữ giống bằng phương pháp lạnh sâu (-100 o C đến -80 o C) Đưa vi sinh vật vào môi giữ giống Hansen lỏng có chứa 30% glycerol, dùng pipetman hút
Cho 200 μL chủng gốc vào ống Eppendorf có chứa 800 μL môi trường Hansen lỏng, sau đó nuôi cấy trong tủ ấm ở 30°C trong 24 giờ Cuối cùng, chuyển mẫu vào tủ lạnh sâu để bảo quản.
Để giữ giống trong ống thạch nghiêng, trước tiên, dùng que cấy đã được khử trùng bằng lửa đèn cồn và để nguội Sau đó, gạt nhẹ lên khuẩn lạc trên đĩa thạch đã được hoạt hóa từ giống bảo quản trong tủ đông sâu, rồi ria lên mặt thạch của ống theo đường ziczac Miệng ống phải được đậy kín bằng nút bông đã khử trùng và đầu ống được gói kín bằng giấy báo khử trùng Ghi ngày tháng cấy lên ống và để vào tủ ấm ở 30°C Sau 1-2 ngày, khi khuẩn lạc đã phát triển mạnh, gói bọc ống giống và để vào tủ lạnh ở 0-4°C Các ống giống có thể được bảo quản trong 1-2 tháng và cần phải cấy truyền giữ giống trong khoảng thời gian này.
3.4.1.2 Phương pháp nuôi cấy tăng sinh khối trên môi trường Hansen lỏng
Trong môi trường lỏng, vi khuẩn dễ dàng tiếp xúc với nguồn dinh dưỡng, giúp chúng phát triển ổn định và thu được sinh khối Điều này tạo điều kiện thuận lợi cho các công đoạn nghiên cứu tiếp theo.
Sau khi kích hoạt giống vi sinh vật được bảo quản trong ống thạch nghiêng, sử dụng que cấy vô trùng để lấy khuẩn lạc từ thạch nghiêng và chuyển vào bình tam giác chứa 200 mL môi trường Hansen lỏng Tiến hành nuôi cấy trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong thời gian 24 giờ.
3.4.1.3 Xác định số lượng tế bào sống bằng phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch
Hỳt chớnh xỏc 100 àL mẫu vào đĩa peptri (cú mụi trường Hansen + agar) vô trùng và trải đều trên bề mặt thạch Thực hiện pha loãng mẫu trong nước cất, đảm bảo mọi dụng cụ thí nghiệm đều vô trùng và các thao tác được tiến hành trong điều kiện vô trùng Thí nghiệm được thực hiện ở ba độ pha loãng liên tiếp, mỗi độ pha loãng sử dụng 3 đĩa peptri và lặp lại ba lần, ủ trong 24 giờ Sau đó, đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên các đĩa, với số khuẩn lạc từ 25 đến 250.
Lượng vi sinh vật có trong mẫu được tính như sau:
N: (Colony Forming Unit/mL): đơn vị hình thành khuẩn lạc trong 1 mL mẫu A: tổng số khuẩn lạc đếm được trên các đĩa được chọn
V: thể tích mẫu cấy vào mỗi đĩa (mL). ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i. fi: độ pha loãng tương ứng
Phương pháp pha loãng dung dịch:
Để chuẩn bị ống nghiệm, đầu tiên cần hút 9 mL nước cất vô trùng vào các ống nghiệm đã được vô trùng Tiếp theo, hút 1 mL dung dịch mẫu cho vào ống nghiệm đầu tiên và lắc đều Sau đó, chuyển 1 mL dung dịch từ ống thứ nhất sang ống thứ hai, lắc đều và tiếp tục quá trình này cho đến khi đạt được nồng độ mong muốn Khi đã có dung dịch với nồng độ cần thiết, tiến hành cấy trải lên các đĩa petri.
- Xác định pH của môi trường nuôi cấy bằng máy đo pH điện tử
- Số liệu trong các thí nghiệm được xử lý sai khác thống kê (Duncan’s test) bằng phần mềm SPSS 16.0, excel 2010
3.4.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm thực hiện nội dung nghiên cứu
3.4.4.1 Xây dựng đường cong sinh trưởng của nấm men S cerevisiea NBRC 104019
Mục đích: Xác định thời điểm nấm men S cerevisiae NBRC104019 có mật độ tế bào sống đạt được cao nhất để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo
Hình 3.2: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xây dựng đường cong sinh trưởng của nấm men S cerevisiea NBRC104019
Chuẩn bị môi trường Hansen cho quá trình nhân giống cấp 1 theo thành phần trong bảng 3.2, sau đó điều chỉnh pH về 6,8 Tiến hành cho môi trường vào các bình tam giác, đảm bảo rằng cả môi trường và dụng cụ đều được tiệt trùng để đảm bảo tính chính xác của thí nghiệm.
Khuẩn lạc nấm men trên thạch nghiêng
Nhân giống cấp 1 trong bình tam giác
Lên men thu sinh khối trong bình lên men 15 Lít
(mật độ ban đầu: 10 8 CFU/mL,
32 o C, 150 vòng/phút, nồng độ oxy 100%, pH 6,8)
Lấy mẫu kiểm tra 4giờ/1 lần để kiểm tra mật độ tế bào sống
Tế bào nấm men trong ống thạch nghiêng sau khi hoạt hóa trong tủ ấm ở
30 o C, tiến hành cấp giống cho môi trường cấp 1 trong bình tam giác Nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ phòng 25 – 30 o C, trên máy lắc ở 150 vòng/phút, trong
Bình lên men 15 lít vô trùng có khả năng chứa 9 lít môi trường và 1 lít canh trường sau khi thực hiện nhân giống cấp 1 để thu sinh khối Quá trình nuôi cấy diễn ra ở nhiệt độ 32 độ C, pH 6,8, tốc độ khuấy 150 vòng/phút và nồng độ oxy đạt 100%.
Trong quá trình nuôi cấy, mẫu được lấy mỗi 4 giờ để thực hiện phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa thạch bằng máy đếm khuẩn lạc, nhằm xác định mật độ tế bào nấm sống Thí nghiệm này được lặp lại ba lần để đảm bảo tính chính xác của kết quả.
3.4.4.2 Khảo sát ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên sự phát triển sinh khối S cerevisiae NBRC104019 thu được sau thời gian nuôi cấy
Mục đích: nhằm khảo sát sự ảnh hưởng của mật độ giống cấp ban đầu lên lượng sinh khối của S cerevisiae NBRC104019 thu được sau thời gian nuôi cấy
Kết quả đo mật độ tế bào sống của canh trường nhân giống cấp 1 là: 2×10 9 (CFU/mL)
Như vậy ta tính được mật độ tế bào nấm men S cerevisiae NBRC104019 như bảng sau:
Bảng 3.3 Mật độ tế bào nấm men S cerevisiae NBRC104019 nuôi cấy ban đầu ứng với thể tích canh trường nhân giống cấp 1 bổ sung.
Thể tích canh trường nhân giống cấp 1 bổ sung (Lít)
Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của mật độ tế bào ban đầu lên sự phát triển sinh khối S cerevisiae NBRC104019
Sau khi xác định thời điểm nấm men S cerevisiae NBRC104019 đạt sức sống mạnh và số lượng tối đa, chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ nuôi cấy ban đầu đến lượng sinh khối của S cerevisiae NBRC104019 thu được sau thời gian nuôi cấy.
Để thực hiện quy trình cấp giống cho môi trường nuôi cấy thu sinh khối, cần chuẩn bị lượng canh trường nhân giống cấp 1 với các thể tích 0,5 L, 1 L và 1,5 L cho vào bình lên men Mẫu sẽ được lấy tại thời điểm nấm men S cerevisiae NBRC104019 đạt sức sống mạnh mẽ và số lượng tối đa, nhằm kiểm tra mật độ tế bào sống Mỗi thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo độ chính xác.
3.4.4.3 Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển sinh khối S. cerevisiae NBRC104019 thu được sau thời gian nuôi cấy
Khuẩn lạc nấm men trên thạch nghiêng
Nhân giống cấp 1 trong bình tam giác
Lên men thu sinh khối trong bình lên men 15 Lít ở 32 o C, khuấy 150 vòng/phút, nồng độ oxy 100%, pH 6,8, thời gian nuối cấy là kết qủa của phần 3.4.4.1
Lấy mẫu kiểm tra mật độ tế bào sống
Cấp giống ở mật độ 10 8 CFU/mL
Cấp giống ở mật độ 3×10 8 CFU/mL Cấp giống ở mật độ
Mục đích: nhằm khảo sát sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên lượng sinh khối của S cerevisiae NBRC104019 thu được sau thời gian nuôi cấy
Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm sự ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự phát triển sinh khối S cerevisiae NBRC104019 thu được sau thời gian nuôi cấy
Sau khi khảo sát và xác định thời gian cùng mật độ tế bào ban đầu tối ưu, nghiên cứu đã tiến hành đánh giá tác động của nhiệt độ nuôi cấy đến lượng sinh khối của S cerevisiae NBRC104019 thu được sau quá trình nuôi cấy.
Thực hiện quy trình nuôi cấy tương tự, cung cấp giống cho môi trường nuôi cấy với mật độ thích hợp Khuấy với tốc độ 150 vòng/phút, đảm bảo nồng độ oxy đạt 100%, duy trì pH ở mức 6,8 và nhiệt độ nuôi cấy là 25 độ C.
Mẫu được thu thập ở nhiệt độ 30°C và 35°C, khi nấm men S cerevisiae NBRC104019 đạt sức sống mạnh nhất và số lượng tối ưu (theo kết quả phần 3.4.4.1) để kiểm tra mật độ tế bào sống Mỗi thí nghiệm được tiến hành lặp lại ba lần để đảm bảo tính chính xác.
Khuẩn lạc nấm men trên thạch nghiêng
Nhân giống cấp 1 trong bình tam giác