Tổng quan vấn đề nghiên cứu
khai thác và nuôi thành thục trứng bò trong ống nghiệm
1.1.1 Các ph−ơng pháp khai thác trứng bò
1.1.1.1 Khai thác trứng bò in vitro
Phương pháp khai thác in vitro, tức là khai thác trứng trực tiếp từ buồng trứng, là kỹ thuật chính trong việc thu trứng bò phục vụ cho công nghệ phôi động vật, được áp dụng rộng rãi tại nhiều phòng thí nghiệm trên toàn thế giới Nghiên cứu từ các tác giả như Fukushima và cộng sự (1985), Fukuda và cộng sự (1990), Keskintepe và cộng sự (1995), Mizushima và cộng sự (2000), cùng Paloma Duque và cộng sự (2003) đã chứng minh rằng phương pháp này không chỉ cung cấp số lượng trứng lớn mà còn đảm bảo chất lượng ổn định.
Ph−ơng pháp khai thác trứng bò in vitro gồm các b−ớc sau:
Buồng trứng bò đ−ợc thu ngay khi con vật bị chết Dùng panh cố định buồng trứng và sử dụng kéo để cắt lấy buồng trứng
Bảo quản và vận chuyển buồng trứng
Buồng trứng được rửa sạch 3-4 lần bằng dung dịch nước muối sinh lý có bổ sung kháng sinh Penicillin 100.000 đơn vị và Streptomycin 50mg/lít, sau đó được bảo quản trong môi trường Phosphate Buffered Saline (PBS) ở nhiệt độ 30-35 oC Việc chuyển giao các buồng trứng về phòng thí nghiệm cần được thực hiện trong vòng 2-4 giờ.
Hút trứng từ các nang trứng
Buồng trứng sau khi về phòng thí nghiệm sẽ được rửa sạch 3-4 lần bằng môi trường PBS Tiếp theo, sử dụng bơm tiêm hoặc máy hút chuyên dụng với kích thước kim 18G để chọc hút các nang trứng Từ giai đoạn này, tất cả các bước tiếp theo sẽ được thực hiện trong tủ vô trùng Thông thường, các nang trứng có đường kính từ 2-6mm sẽ được chọc hút.
Rửa và chọn lọc trứng
Dịch nang trứng được bơm vào đĩa petri NUNC (CHLB Đức) để tiến hành soi tìm trứng bằng kính hiển vi soi nổi với độ phóng đại từ 40-100 lần Sau khi phát hiện, trứng sẽ được gắp ra bằng pipet thủy tinh và rửa nhiều lần trong môi trường DPBS hoặc các môi trường thích hợp khác.
1.1.1.2 Khai thác trứng bò in vivo
Ngoài phương pháp khai thác trứng in vitro đã được đề cập, nghiên cứu hiện nay đang tập trung vào một phương pháp mới có tên gọi là Ovum Pick.
Phương pháp OPU (Oocyte Pick-Up) được phát triển dựa trên kỹ thuật hút trứng, sử dụng máy siêu âm trong các quy trình hỗ trợ sinh sản ở con người.
Phương pháp OPU (Oocyte Pick Up) được áp dụng để thu thập trứng từ các cá thể có tiềm năng di truyền cao trong lĩnh vực sữa và thịt Kết hợp với công nghệ thụ tinh ống nghiệm, phương pháp này cho phép tạo ra các phôi chất lượng tốt bằng cách sử dụng nguồn tinh trùng giống chủ động Các phôi này sau đó được cấy vào bò nhận đồng pha, nhằm sinh ra bê con có tiềm năng năng suất cao.
Các thí nghiệm về thu trứng bò bằng phương pháp siêu âm được khởi xướng bởi Callesen và cộng sự vào năm 1987 Tiếp theo, Pieterse và cộng sự vào năm 1988 đã lần đầu tiên áp dụng phương pháp OPU, đánh dấu bước tiến quan trọng trong việc khai thác trứng bò một cách hiệu quả và đều đặn.
Phương pháp OPU yêu cầu sử dụng các thiết bị chuyên dụng như máy siêu âm, đầu dò và kim chọc hút, đồng thời cần có tay nghề cao của người thực hiện.
Hình 1.1: Các dụng cụ chuyên dùng trong kỹ thuật OPU a
- Hệ kim hút có nối dây để thu trứng từ nang vào tube đựng bên ngoài
- Bộ đầu dò siêu âm và dây chuyền tín hiệu b
- Phần nhựa cố định đầu dò
- ống kim loại bao ngoài toàn bộ hệ thống kim, dây hút, đầu dò, dây truyền tín hiệu
Phương pháp OPU (Oocyte Pick Up) cho phép thu hoạch trứng từ buồng trứng của động vật sống Trong quá trình thực hiện, động vật được giữ cố định trong một giá đỡ, trong khi người thao tác sử dụng một tay để đưa vào trực tràng nhằm kiểm soát buồng trứng và áp sát buồng trứng vào đầu dò, tay còn lại điều khiển kim hút để lấy trứng.
Khi nang trứng xuất hiện trên màn hình siêu âm, một tay giữ buồng trứng qua đường trực tràng, trong khi tay kia nhẹ nhàng ấn kim chọc hút vào nang trứng Thao tác này diễn ra một cách nhẹ nhàng, với hình ảnh kim chọc vào nang rõ nét trên màn hình, giúp người thao tác điều chỉnh kim hút một cách chính xác và nhịp nhàng.
Hình ảnh từ máy siêu âm cho phép chúng ta xác định hướng đi của kim, vị trí nang trứng và vị trí đầu kim chọc vào nang (hình 2a, 2b, 2c) (Bols và cs, 1995)[34].
H−ớng kim hút sẽ đi vào Nang trứng Đầu kim bắt đầu vào nang
Khi thao tác, máy siêu âm thường được đặt ở tần số 5-7,5Mhz; kim dùng chọc hút khá dài, khoảng 30-50cm với góc vát của đầu kim dao động
25 o -45 o Thông th−ờng ng−ời ta chọc hút các nang có kích th−ớc 2-6 mm (Pieterse và cs, 1988)[150]
Toàn bộ dịch hút ra được chuyển vào các ống (50ml) trong máy ổn nhiệt (35-37 o C), chứa sẵn môi trường PBS (15-25ml) Để ngăn ngừa hiện tượng kết đông, có thể thêm heparin với nồng độ 2-5UI/ml, nhưng cần lưu ý rằng heparin có thể ảnh hưởng tiêu cực đến trứng nếu thời gian thao tác kéo dài Sau đó, các ống chứa dịch nang được đưa về phòng thí nghiệm để tìm và chọn lọc trứng, sau đó sẽ được nuôi cấy và thụ tinh ống nghiệm để sản xuất phôi (De Roover cs, 2005)[52].
Phương pháp khai thác trứng bò từ buồng trứng, bao gồm phương pháp in vitro và OPU, cung cấp số lượng lớn trứng chất lượng tốt cho công nghệ phôi Phương pháp thu trứng in vitro được áp dụng rộng rãi trong các nghiên cứu cơ bản tại nhiều phòng thí nghiệm trên toàn thế giới Trong khi đó, phương pháp OPU kết hợp thụ tinh ống nghiệm và cấy phôi, mang lại giá trị đặc biệt trong việc nhân nhanh các cá thể bò có tiềm năng năng suất cao.
Sau khi trứng bò được khai thác từ buồng trứng bằng các phương pháp đã nêu, chúng sẽ được phân loại và ngay lập tức chuyển vào các môi trường nuôi dưỡng giàu dinh dưỡng.
1.1.1.3 Phân loại chất l − ợng trứng bò
thụ tinh trứng bò trong ống nghiệm
1.2.1 Nguyên lý thụ tinh ống nghiệm và các giai đoạn của quá trình thô tinh
Thụ tinh in vitro (IVF) lần đầu tiên được thực hiện cho noãn bào của loài có vú vào năm 1954 với thỏ, khi các tinh trùng đã kiện toàn năng lực thụ tinh trong tử cung kết hợp với noãn bào mới rụng trứng Năm 1959, sự ra đời của những thỏ con đã khẳng định tính chất bình thường sinh học của kỹ thuật thụ tinh in vitro.
Thụ tinh in vitro các noãn bào thành thục đã đợc thực hiện thành công trên nhiều loài và đợc tóm tắt qua bảng 1.3:
Bảng 1.3: Lịch sử thụ tinh in vitro ở các loài có vú
Năm xác nhận qua đánh giá mô bào học hoặc sự phân chia của trứng Sinh con
1990 : Ngùa Các giai đoạn chính của quá trình thụ tinh in vitro và in vivo có những điểm tơng đồng nh phần trình bày dới đây
1.2.1.1 Các giai đoạn của quá trình thụ tinh
Tinh trùng có khả năng xuyên qua lớp tế bào cumulus bao quanh trứng ở nhiều loài động vật có vú có nhau thai Trứng rụng (thành thục in vivo) hoặc trứng chín (thành thục in vitro) được bảo vệ bởi một ma trận giàu axít hyaluronic Ở một số loài như bò, cừu, và dê, lớp tế bào cumulus này nhanh chóng tan rã sau khi trứng rụng và đi vào vòi trứng, cho phép tinh trùng tiếp xúc trực tiếp với vùng trong suốt của trứng Tuy nhiên, trong trường hợp nuôi cấy in vitro, lớp tế bào cumulus vẫn giữ nguyên xung quanh trứng đã được nuôi thành thục.
Chỉ những tinh trùng đã phát triển đầy đủ khả năng thụ tinh mới có thể vượt qua lớp tế bào cumulus Tất cả tinh trùng khi tiếp cận vùng trong suốt, sau khi vượt qua đám tế bào cumulus, đều giữ nguyên acrosom của chúng (Cherr và cs, 1986).
Hyaluronidaza với một lợng ít ỏi, liên kết với màng ngoài của tinh trùng, có thể tạo cho chúng xuyên qua lớp tế bào cumulus một cách thuận lợi
Tơng tác của tinh trùng với màng trong suốt
Trớc khi xuyên qua màng trong suốt của trứng, tinh trùng sẽ bám vào bề mặt màng trong suốt và thực hiện phản ứng acrosom
Vùng trong suốt được hình thành chủ yếu từ glycoprotein, với nhiều dạng đồng phân đã được xác định ở nhiều loài khác nhau Ba glycoprotein chính bao gồm ZP1, ZP2 và ZP3.
ZP3 là một polypeptit có cấu trúc đặc biệt với các chuỗi oligosaccharit chứa fucose và N-acetyl glucosamin ZP2 và ZP3 kết hợp với nhau, tạo ra các sợi được kết nối bởi ZP1, hình thành nên cấu trúc ba chiều của vùng trong suốt.
Tinh trùng gắn vào vùng trong suốt
Vùng trong suốt có khả năng nhận biết và cố định đặc hiệu các tinh trùng cùng loài sau khi chúng đã hoàn thiện năng lực thụ tinh Sự kết dính này xảy ra nhờ vào tương tác giữa các phân tử trên bề mặt tinh trùng và vùng trong suốt của trứng.
Tinh trùng, khi đợc gắn vào vùng trong suốt, sẽ thực hiện phản ứng thể đỉnh của nó Điều này nhằm bộc lộ màng trong của acrosom
Hình 1.3: Gắn kết ban đầu của tinh trùng vào vùng trong suốt (Shur và Hall, 1982)[162]
Một galactosyltransferaza màng tinh trùng đảm bảo cho cầu nối với gốc N-acetylglucosamin của ZP3
Sự gắn kết của tinh trùng với màng trong acrosom được đảm bảo bởi chuỗi glucide của ZP3, trong khi phản ứng thể đỉnh diễn ra nhờ vào protein của ZP3 Quá trình này cũng liên quan đến ZP2 và acrosin, cho phép tinh trùng gắn kết hiệu quả trong giai đoạn phản ứng thể đỉnh.
Theo quan điểm hình thái học, phản ứng thể đỉnh của tinh trùng được đặc trưng bởi sự dung giải từ từ màng sinh chất và màng ngoài acrosom Quá trình này không chỉ hình thành các bọng màng mà còn tạo ra những lỗ trống, cho phép các chất trong acrosom được giải phóng ra ngoài.
Phản ứng thể đỉnh diễn ra nhanh chóng và phụ thuộc vào nồng độ Ca +2 Phản ứng này luôn đi kèm với sự gia tăng nồng độ Ca +2 nội bào và không thể xảy ra trong môi trường thiếu Ca +2.
Trong điều kiện thông thường, cơ chế đưa ion Ca +2 vào tham gia giai đoạn đầu của phản ứng vẫn chưa được làm rõ.
Màng trong acrosom §ai xÝch đạo
Hình 1.4 mô tả sơ đồ phản ứng thể đỉnh (Yanagimachi, 1988) với ba giai đoạn chính: a Trước khi phản ứng, tinh trùng có acrosom nguyên vẹn; b Khi phản ứng xảy ra, màng sinh chất và màng ngoài acrosom bị dung giải, tạo thành các bọng màng và lỗ thủng, cho phép chất chứa trong acrosom phóng thích do sự thủy phân của enzym; c Sau khi phản ứng thể đỉnh hoàn tất, tinh trùng bỏ lại các bọng màng, và màng trong acrosom lộ ra, trong khi đai xích đạo vẫn còn nguyên vẹn.
Cảm ứng phản ứng thể đỉnh của tinh trùng diễn ra khi tiếp xúc với màng trong suốt của trứng ở nhiều loài gia súc, trong đó vùng màng này bị hòa tan có khả năng kích thích phản ứng thể đỉnh của tinh trùng cùng loài (Ehrenwald và cs, 1988).
ZP3 có hai chức năng quan trọng: đầu tiên, nó giúp gắn kết tinh trùng, và thứ hai, nó kích hoạt phản ứng thể đỉnh của tinh trùng.
Sự gắn kết của phối tử ZP3 với thể tiếp nhận của tinh trùng khởi động các phân tử và tế bào, dẫn đến phản ứng thể đỉnh và đặc biệt là sự gia tăng luồng Ca +2, đánh dấu một trong những giai đoạn đầu của quá trình phản ứng.
Tinh trùng xuyên qua vùng trong suốt
Trong quá trình phản ứng thể đỉnh, tinh trùng giải phóng các bọng màng lên bề mặt vùng trong suốt, sau đó di chuyển qua lớp vỏ bọc này theo một đường chéo.
Đối t−ợng và Nội dung nghiên cứu
Luận án này tập trung nghiên cứu trứng bò vàng và bò lai Sind, sử dụng tinh trùng bò đực giống Holstein Friesian có chất lượng tốt để thực hiện thụ tinh ống nghiệm Mục tiêu là tạo ra các phôi ống nghiệm trong môi trường tổng hợp và điều kiện nuôi in vitro phù hợp.
Nghiên cứu này đánh giá số lượng và chất lượng trứng được khai thác từ buồng trứng bò nội, tập trung vào ảnh hưởng của phương pháp khai thác, yếu tố mùa và giống bò Kết quả sẽ giúp hiểu rõ hơn về các yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả khai thác trứng, từ đó cải thiện quy trình và nâng cao chất lượng trứng bò.
Nghiên cứu khả năng thành thục của trứng bò trong ống nghiệm được thực hiện từ trứng khai thác từ buồng trứng, tập trung vào các yếu tố như môi trường nuôi, thời gian nuôi, chất lượng trứng và ảnh hưởng của mùa.
Nghiên cứu khả năng thụ tinh trong ống nghiệm của trứng bò nội sau khi nuôi thành thục trong ống nghiệm đã đánh giá các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thụ tinh, bao gồm phương pháp xử lý tinh trùng qua phân lớp percoll và bơi ngược (swim-up) Nghiên cứu cũng xem xét chất lượng trứng, nồng độ tinh trùng, yếu tố đực giống, thời gian thụ tinh, và môi trường thụ tinh, nhằm xác định ảnh hưởng của những yếu tố này đến khả năng phân chia của phôi ở giai đoạn 2-4 tế bào.
Nghiên cứu khả năng phát triển của phôi bò trong ống nghiệm bao gồm các giai đoạn thu buồng trứng, khai thác trứng, nuôi trứng thành thục và thụ tinh ống nghiệm Nghiên cứu này đánh giá ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi, chất lượng trứng, yếu tố đực giống, mật độ nuôi phôi và thành phần khí nuôi đến khả năng thu nhận phôi ở các giai đoạn phát triển sau, như phôi dâu và phôi nang.
2.1.3 Các chỉ tiêu nghiên cứu
Các chỉ tiêu đ−ợc ghi nhận là số l−ợng trứng tổng số, số trứng loại A,
B và C thu được trung bình một số trứng thành thục từ một buồng trứng, được xác định qua việc kiểm tra sự xuất hiện của cực cầu thứ nhất hoặc nhiễm sắc thể ở trạng thái Metaphase II Sau thời gian nuôi trong các môi trường tổng hợp, số lượng phôi phân chia ở các giai đoạn 2-4 tế bào (ngày thứ 2), phôi dâu (ngày thứ 5) và phôi nang (ngày thứ 7) được ghi nhận, với ngày thụ tinh ống nghiệm được tính là ngày 0.
Trứng bò vàng là nguồn nguyên liệu quan trọng trong các thí nghiệm nhằm phát triển phương pháp nuôi thành thục, thụ tinh ống nghiệm và nuôi phôi Các nghiên cứu này giúp kiểm chứng và đánh giá ảnh hưởng của nhiều yếu tố như phương pháp khai thác trứng, mùa vụ, giống bò, thời gian nuôi thành thục, hormone bổ sung trong môi trường nuôi, phương pháp chọn lọc tinh trùng, cá thể đực giống, cũng như các điều kiện thụ tinh và nuôi phôi.
Trứng bò lai Sind chỉ dùng cho các nghiên cứu so sánh trên nền của một phương pháp đã ổn định ở trứng bò vàng
Các thí nghiệm được thực hiện từ nguyên liệu ban đầu là trứng và tinh trùng, nhằm tạo ra các phôi chất lượng tốt Quy trình bao gồm khai thác trứng in vitro từ buồng trứng, phân loại trứng, nuôi trứng thành thục trong ống nghiệm, xử lý tinh trùng, thụ tinh ống nghiệm và nuôi phôi trong ống nghiệm.
Tất cả hóa chất, môi trường, hormone và vật liệu khác đều đạt tiêu chuẩn cho thí nghiệm in-vitro từ các hãng uy tín như Sigma, Gibco, Merck và NUNC Các thiết bị nghiên cứu cũng đảm bảo chất lượng cao, đáp ứng tiêu chuẩn cho các nghiên cứu chuyên sâu trong công nghệ tế bào động vật, bao gồm kính hiển vi NIKON, OLYMPUS, tủ nuôi SANYO và máy ly tâm SIGMA.
2.2 Ph−ơng pháp nghiên cứu
2.2.1 Thu và bảo quản buồng trứng
Buồng trứng của các bò bình th−ờng về sinh sản đ−ợc thu và rửa sạch
Sau khi bảo quản 3-5 lần bằng dung dịch nước muối sinh lý, buồng trứng được giữ trong môi trường Phosphate Buffered Saline (PBS) ở nhiệt độ 30-35°C Tiếp theo, buồng trứng sẽ được chuyển đến phòng thí nghiệm trong khoảng thời gian 2-4 giờ.
Môi tr−ờng PBS có thành phần nh− sau (dùng pha 1 lít):
Hóa chất Khối l−ợng (gram)
2.2.2 Khai thác trứng từ buồng trứng
Ph−ơng pháp hút: Buồng trứng đ−ợc rửa lại 4 lần bằng môi tr−ờng
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline (DPBS) được sử dụng ở nhiệt độ 37°C để hút trứng từ các nang trên bề mặt buồng trứng, sử dụng bơm tiêm 5 ml Chỉ hút những nang có đường kính từ 0,2-0,6 cm.
Phương pháp hút kết hợp cắt lớp là kỹ thuật thu trứng từ các nang, sau đó tiến hành cắt lớp buồng trứng trong môi trường DPBS để tối ưu hóa số lượng trứng có thể thu hoạch.
Phần hút ra có chứa trứng lẫn với dịch nang đ−ợc đ−a vào môi tr−ờng
199 (Gibco) Trứng đ−ợc soi tìm trên kính hiển vi soi nổi WILD (Thuỵ Sĩ)
Các trứng tìm thấy đ−ợc rửa sạch lại bằng môi tr−ờng trên 4 lần
Môi tr−ờng DPBS cải tiến có thành phần nh− sau (dùng pha 10 lít):
Hóa chất Khối l−ợng (gram) NaCl 80,0 KCl 2,0
2.2.3 Phân loại chất l−ợng trứng
Sau khi rửa sạch trong môi trường DPBS, trứng được phân loại bằng kính hiển vi soi nổi dựa vào đặc điểm hình thái của lớp tế bào cumulus bao quanh, cũng như tính đồng nhất và màu sắc của nguyên sinh chất, theo tiêu chuẩn đã được thiết lập.
Leibfried và cs, (1979)[106] (đã trình bày tại bảng 1.1, trang 8)
2.2.4 Đánh giá các giai đoạn phát triển của trứng
Sau khi trứng được nuôi đến độ thành thục, chúng sẽ được lấy ra khỏi môi trường nuôi và loại bỏ lớp tế bào cumulus bao quanh Tiếp theo, tiến hành nhuộm nhân và nhiễm sắc thể của trứng bằng thuốc nhuộm Orcein 1%.
Trạng thái nhân và nhiễm sắc thể của trứng đ−ợc quan sát trên kính hiển vi Olympus (Nhật Bản) với độ phóng đại khác nhau (x200, x400, x1000)
Trong quá trình phát triển của trứng, có thể quan sát các trạng thái điển hình của nhân và nhiễm sắc thể ở các giai đoạn như bóng mầm, tan màng nhân, anaphase, telophase, metaphase II và thể cực thứ nhất Trứng được coi là thành thục khi nhiễm sắc thể đạt đến giai đoạn Metaphase II hoặc khi xuất hiện thể cực thứ nhất.
2.2.5 Nuôi trứng thành thục trong ống nghiệm
Khai thác trứng bò từ buồng trứng
Mục đích của thí nghiệm là đánh giá khả năng khai thác trứng bò từ buồng trứng của bò nội, với nội dung nghiên cứu tập trung vào ảnh hưởng của phương pháp khai thác, yếu tố mùa và giống bò đến số lượng và chất lượng trứng thu được Các chỉ tiêu được ghi nhận bao gồm tổng số trứng, số lượng trứng loại A, B và C trung bình từ một buồng trứng.
Trong phần nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng 1738 buồng trứng bò với số trứng khai thác và dùng trong các thí nghiệm là 15935 trứng
3.1.1 ảnh hưởng của phương pháp khai thác đến số và chất lượng trứng bò vàng
Trong nghiên cứu, số buồng trứng bò được sử dụng và số trứng khai thác từ hai phương pháp hút (PPH) và hút kết hợp cắt lớp (PPHC) lần lượt là 171 buồng trứng với 1064 trứng và 185 buồng trứng với 1606 trứng Việc thu thập buồng trứng diễn ra trong mùa hè, từ tháng 5 đến tháng 7 Kết quả chi tiết được trình bày trong bảng 3.1, cho thấy số lượng và chất lượng trứng khai thác từ buồng trứng bò vàng bằng hai phương pháp này.
Ph−ơng pháp hút+cắt lớp
Số trứng / buồng trứng (M + SD) 5,91 + 2,08 a 8,35 + 2,38 b
Số trứng chất l−ợng loại A (M + SD) 2,06 + 0,88 c 2,59 + 1,04 c
Số trứng chất l−ợng loại B (M + SD) 1,33 + 0,64 d 2,39 + 0,63 c
Số trứng chất l−ợng loại C (M + SD) 2,52 + 1,44 c 3,37 + 1,30 c a, b, c, d (P < 0,001)
Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy sự khác biệt rõ rệt về số lượng trứng thu được trung bình trên mỗi buồng trứng giữa hai phương pháp khai thác Cụ thể, phương pháp PPHC đạt trung bình 8,35 trứng/buồng trứng, cao hơn đáng kể so với phương pháp PPH với chỉ 5,91 trứng/buồng trứng (P0,05) Tương tự, trứng loại C cũng cho thấy không có sự khác biệt rõ rệt, với trung bình 2,52 trứng/buồng trứng cho PPH và 3,37 trứng/buồng trứng cho PPHC Tuy nhiên, trứng loại C thường không được sử dụng trong nghiên cứu do chất lượng kém.
Trong nghiên cứu về trứng loại B, có sự khác biệt rõ rệt (P