Nội dung và phương pháp nghiên cứu
Nội dung nghiên cứu
Đề tài gồm 3 nội dung nghiên cứu:
- Tình hình chăn nuôi và dịch PRRS ở lợn tại huyện Thanh Hà tỉnh Hải Dương năm 2014
- Một số đặc điểm dịch tễ của PRRS ở lợn tại huyện Thanh Hà tỉnh Hải Dương năm 2014
- Nghiên cứu đặc tính sinh học sinh học phân tử chung virus KTY-PRRS-07
Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
3.2.1 Tình hình chăn nuôi và dịch PRRS ở lợn tại Thanh Hà năm 2014
Thu thập và phân tích số liệu về tình hình chăn nuôi lợn và dịch PRRS được thực hiện thông qua các tài liệu lưu trữ của Cục Thống kê, Chi cục Thú y và Trạm Thú y, sử dụng số liệu thứ cấp để đánh giá các chỉ tiêu liên quan.
Số lợn mắc PRRS (con)
Số lợn bị tiêu hủy (con)
Để thu thập thông tin hiệu quả, chúng tôi đã tiến hành sử dụng bảng hỏi (phiếu điều tra) nhằm khảo sát các hộ chăn nuôi Đồng thời, kết hợp phỏng vấn sâu với cán bộ thú y cơ sở để bổ sung thêm dữ liệu cần thiết.
3.2.2 Nghiên cứu đặc sinh học phân tử của chủng virus KTY-PRRS-07
Chủng virus KTY-PRRS-07 phân lập được tại Thái Bình năm 2014
Dụng cụ : Máy PCR , máy ly tâm, bộ điện di, buồng đếm Neubauer, tủ ấm, lò vi sóng
Hóa chất: DMEM, FBS, PBS, Trypsin − EDTA, DMSO, Agarose 1.2%
Phương pháp nuôi cấy tế bào Để chuẩn bị cho các bước nghiên cứu tiếp theo, cần phải chuẩn bị lượng tế bào Marc-145 buồng đếm Neubauer cần thiết
- “Gọi” tế bào từ dạng tế bào bảo quản
Chuẩn bị môi trường nuôi cấy: môi trường DMEM bổ sung 5% FBS làm ấm trong tủ 37 0 C trong 30 phút, trước khi lấy tế bào ra nuôi cấy
Bước 1: Giải đông tế bào ở nhiệt độ phòng
Bước 2: Ly tâm 1000 vòng/phút trong 5 phút, loại bỏ dung dịch bảo quản và giữ lại cặn tế bào
Bước 3: Hòa tan cặn tế bào trong dung dịch DMEM + 5% FBS, chuyển tế bào và bình nuôi cấy chứa 5 ml môi trường DMEM + 5% FBS
Giữ tế bào trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C với 5% CO2 và theo dõi sự phát triển hàng ngày Khi tế bào phát triển dày đặc, che phủ hoàn toàn bề mặt đáy bình, có thể thu hoạch tế bào để bảo quản hoặc chuyển sang bình nuôi cấy mới.
Cấy chuyển tế bào nhằm nhân số lượng tế bào lên một lượng nhất định để phục vụ nghiên cứu
Bước 1: Loại bỏ môi trường đang nuôi, rửa tế bào bằng PBS
Bước 2: Trypsin hóa tách tế bào, sử dụng Trypsin − EDTA Thêm 7 ml môi trường không đầy đủ, trộn đều chuyển sang ống ly tâm
Bước 3: Loại bỏ trypsin, ly tâm loại bỏ phần dung dịch và giữ lại cặn màu trắng
Bước 4: Cân bằng môi trường và đếm số tế bào bằng cách hòa tan tế bào trong 6 ml môi trường đầy đủ Tiến hành đếm tế bào sau khi pha loãng 100 lần (10 µl tế bào trong 990 µl môi trường không đầy đủ), sau đó sử dụng buồng đếm trên kính hiển vi để xác định số lượng tế bào trong 1 ml.
Bước 5 trong quy trình cấy chuyển tế bào yêu cầu pha loãng tế bào đến nồng độ 2x10^5 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ Sau đó, chia huyễn dịch tế bào vào các bình nuôi, cụ thể là 6 ml cho bình T25 và 15 ml cho bình T75.
Bước 6: Nuôi tế bào và kiểm tra sự phát triển, giữ tế bào ở 37 0 C, 5% CO 2 hàng ngày theo dõi sự phát triển của tế bào
Sau khi thu thập đủ số lượng tế bào cần thiết, chúng được bảo quản để sử dụng cho các lần sau Mỗi loại tế bào thường có giới hạn về số lần nuôi cấy, tương ứng với số lần phân chia tế bào, ngoại trừ tế bào ung thư, có khả năng phân chia không giới hạn.
Việc phân chia tế bào là quá trình vô hạn, do đó, trong các lần cấy chuyển và thu hoạch, cần phải ghi chép hồ sơ theo dõi tế bào để đảm bảo chất lượng tế bào phục vụ cho nghiên cứu.
Các bước thu tế bào giống với các bước cấy chuyển tế bào, chỉ khác ở bước 5 và bước 6
Bước 5: Chia ống tế bào và pha loãng tế bào đến nồng độ 5x10^6 tế bào/ml trong môi trường đầy đủ có bổ sung 10% DMSO Sau đó, chia huyễn dịch tế bào vào các ống bảo quản với thể tích 1 ml mỗi ống.
Bước 6: Bảo quản tế bào, giữ ống tế bào trong hộp lạnh ở -20 0 C trong 2 −
3 giờ, chuyển sang -80 0 C qua đêm, chuyển tế bào vào giữ trong nitơ lỏng
- Phương pháp đếm tế bào
Việc đếm tế bào trước khi nuôi cấy là rất quan trọng để xác định đường cong sinh trưởng của virus, đặc biệt là trong nuôi cấy tế bào một lớp Mật độ tế bào ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình nuôi cấy, do đó, việc đếm tế bào là cần thiết để gây nhiễm virus với tỉ lệ thích hợp Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thực hiện gây nhiễm virus với tỉ lệ MOI = 0,01, tương đương với 1 virus cho mỗi 100 tế bào.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng buồng đếm Neubauer để thực hiện việc đếm tế bào, với vị trí đếm tương tự như khi đếm hồng cầu Số lượng tế bào được đếm trong 5 ô đếm hồng cầu và được tính theo phương pháp của Nguyễn Thị Lan và cộng sự, năm 2005.
Phương pháp xác định hiệu giá virus
Tế bào Marc145 được chuẩn bị trên khay 96 giếng với mật độ 2.0×10^4 tế bào/giếng Sau khi hút bỏ dịch nổi, huyền phù virus được pha loãng theo tỷ lệ 10 và ủ trên bề mặt tế bào trong các giếng đã được đánh dấu trước, với 25 µl/giếng, mỗi độ pha loãng được lặp lại 3 lần Sau 1 giờ ủ, dung dịch DMEM có chứa 10% TBP được bổ sung vào mỗi giếng với 100 µl.
CPE được quan sát hàng ngày cho đến ngày thứ 5 sau khi gây nhiễm TCID 50 được xác định theo phương pháp của Reed-Muench
Phương pháp xác định đường biểu biễn sự nhân lên của virus
Tế bào Marc145 được chuẩn bị vào những khay 96 giếng (5x10 4 tế bào/giếng) và được nuôi như mô tả ở trên
Virus PRRS phân lập được và chủng virus vacxin được gây nhiễm lên tế bào ở MOI 0.01 Sau một giờ ủ, để virus bám vào tế bào, huyễn dịch chứa virus
Sau khi hút bỏ 27, môi trường nuôi dưỡng được rửa sạch bằng 0.5ml PBS Tiếp theo, dung dịch nuôi dưỡng thiết yếu được bổ sung vào mỗi giếng với thể tích 100µl.
Virus được thu thập từ dịch nổi và phần tế bào còn lại sau khi gây nhiễm, tại các thời điểm 12, 24, 36, 48, 60, 72, 84, 96 và 108 giờ.
Để xác định hiệu giá của các ống virus đã thu, cần tiến hành định lượng virus thông qua việc xây dựng đường biểu diễn sự nhân lên của virus, với biến là lg của TCID50 tại từng thời điểm thu virus.
Phương pháp tiến hành phản ứng RT – PCR
- Tiến hành phản ứng RT- PCR
Mẫu RNA sau khi tách chiết sẽ được hỗn hợp với các thành phần được trình bày ở bảng sau:
Thành phần phản ứng Thể tớch cần lấy (àl)
Tiến hành phản ứng khuếch đại sản phẩm trong máy PCR theo chu kỳ nhiệt sau:
Giai đoạn Bước tổng hợp Nhiệt độ ( o C) Thời gian Chu kỳ
Tổng hợp sợi mới 72 1 phút
- Điện di kiểm tra sản phẩm PCR
Để chuẩn bị thạch Agarose 1.2%, cân 1.2g Agarose và hòa tan trong 100ml dung dịch TBE 1X Đun sôi hỗn hợp trong lò vi sóng và để nguội đến khoảng 40°C Sau đó, bổ sung 10µl Syber Green và đổ thạch vào các giếng tương ứng với số mẫu cần điện di.
+ Chuẩn bị mẫu: Thờm 2 àl loading dye vào 8 àl sản phẩm RT-PCR
+ Chuẩn bị bể điện di: Chuyển thạch đã đông vào bể điện di, thêm TBE 1X đến ngập thạch
+ Nhỏ marker và sản phẩm PCR đã trộn với loading dye vào các giếng với thể tớch 6àl maker 100bp và 10àl sản phẩm PCR mỗi giếng
+ Điện di ở hiệu điện thế 100V trong 30 phút
+ Quan sát kết quả điện di sản phẩm PCR trên máy chụp ảnh gel và chụp ảnh
Phương pháp giải trình tự gen