TỔNG QUAN
PLURONIC F127
Pluronic là một loại polymer nhạy nhiệt và tương hợp sinh học, được FDA chứng nhận và cho phép sử dụng rộng rãi Hóa học của Pluronic, hay còn gọi là poly (ethylene oxide)–poly (propylene oxide)–poly (ethylene oxide) (PEO-PPO-PEO), có cấu trúc đặc biệt với hai nhóm ưa nước ở bên ngoài và một nhóm kỵ nước ở giữa, nhóm này cũng là thành phần nhạy nhiệt của Pluronic Trong nghiên cứu, Pluronic được biết đến với ký hiệu F127 (Poloxamer 407) ở dạng rắn, có số nhóm EO ưa nước từ 95 đến 105, số nhóm PO kỵ nước từ 54 đến 60, và khối lượng phân tử khoảng từ 9840 đến 14600 Da.
Tất cả các Pluronic có cấu trúc hóa học giống nhau, chỉ khác nhau ở tỷ lệ poly (ethylene oxide) và poly (propylene oxide), dẫn đến sự khác biệt về tính chất, trọng lượng phân tử và đặc tính hoạt động bề mặt Hầu hết Pluronic là chất rắn tan trong nước, với khả năng hòa tan tốt hơn trong nước lạnh so với nước nóng Sự hòa tan này xảy ra do sự gia tăng solvat hóa và liên kết hydro ở nhiệt độ thấp, tạo ra lớp hydrat hóa quanh các phân tử Pluronic, giúp chúng phân tán trong dung dịch Khi nhiệt độ tăng, các chuỗi ưa nước của Pluronic không còn được solvat hóa do sự đứt gãy của các liên kết hydro, dẫn đến việc Pluronic không tan tốt trong nước nóng (> 20 °C).
Pluronic là một hợp chất đặc biệt có khả năng biến đổi trạng thái từ lỏng sang gel rắn khi thay đổi nhiệt độ Ở nhiệt độ thấp từ 0-4 °C, dung dịch Pluronic với nồng độ phù hợp duy trì ở dạng lỏng, nhưng khi nhiệt độ tăng lên 35 °C, nó chuyển thành gel rắn Nhiệt độ tạo gel là điểm tới hạn, nơi mà sự chuyển đổi này xảy ra.
Khi đạt đến 5 độ tới hạn, dung dịch polyme chuyển đổi thành gel do sự tương tác giữa nhóm PEO ưa nước và PPO kỵ nước Khi nhiệt độ tăng, các phân tử tạo thành micelle với lõi PPO và lớp vỏ PEO Sự gia tăng nhiệt độ dẫn đến việc cắt đứt các liên kết trong mạch PPO, gây ra quá trình loại nước tại các nhóm kỵ nước Kết quả là các nhóm PPO mất nước, hình thành lõi với vỏ PEO ngậm nước, tạo ra micelle bền nhiệt động và hình thành gel.
Việc kết hợp các loại thuốc khó tan vào hạt micelle Pluronic có thể nâng cao khả năng hòa tan và ổn định của thuốc, từ đó cải thiện dược tính và tăng cường khả năng phân tán sinh học.
Pluronic được sử dụng để che phủ vết thương và bỏng mô mềm, giúp tăng cường quá trình chữa lành bằng cách kích thích tế bào tại vùng tổn thương sản sinh các yếu tố phát triển mạch máu và thúc đẩy phát triển nguyên bào sợi Với tính chất chuyển pha theo nhiệt độ, dung dịch pluronic có thể tiêm vào các vị trí cần tái tạo mô sụn Ngoài ra, pluronic còn được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như công nghiệp tẩy rửa, tạo bọt bền, nhũ hóa, dầu bôi trơn, mỹ phẩm, mực in và các ứng dụng đặc biệt trong dược phẩm.
TỔNG QUAN VỀ CHITOSAN
1.2.1 Nguồn gốc và cấu tạo của chitosan
Chitosan là một polysaccharide mạch thẳng, được hình thành từ quá trình deacetyl hóa chitin, một hợp chất tự nhiên có mặt trong cả thực vật và động vật như giáp xác, côn trùng, nấm và một số loại tảo Quá trình sản xuất chitosan diễn ra thông qua phương pháp deacetyl hóa bằng nhiệt trong môi trường kiềm.
Hình 1.1 Chitosan có nguồn gốc từ vỏ tôm, cua; phản ứng deacetyl hóa chitin tạo chitosan [15]
Chitosan là một polysaccharide chủ yếu được cấu thành từ glucosamine, với các nhóm chức quan trọng bao gồm một nhóm amino tại vị trí C2 và hai nhóm hydroxyl tại vị trí C3 và C6 Sự biến đổi hóa học của các nhóm chức này tạo ra những vật liệu hữu ích cho nhiều ứng dụng khác nhau Theo quy định của IUPAC, chitosan được gọi là Poly β-(1-4)-2-amino-2-deoxy-D-glucose hoặc Poly β-(1-4)-glucosamine, với công thức phân tử là (C6H11O4N)n.
Chitosan là một hợp chất rắn, xốp nhẹ, thường được sản xuất dưới dạng hình vảy và có thể xay nhỏ với nhiều kích cỡ khác nhau Chất này có màu trắng hoặc vàng nhạt, không mùi và không vị Tính chất của chitosan phụ thuộc vào mức độ deacetyl hóa và trọng lượng phân tử của nó.
Chitosan có chứa các nhóm chức –OH và -NH2, mang lại cho nó các tính chất hóa học đặc trưng của ancol và amin Là một polymer, chitosan được hình thành từ các monomer liên kết với nhau qua các liên kết β-(1,4)-glicozit, những liên kết này dễ bị cắt đứt bởi các chất hóa học như bazơ, các chất oxy hóa và enzyme thủy phân.
Chitosan sở hữu nhiều tính chất sinh học quan trọng như khả năng tương hợp sinh học, phân hủy sinh học, và kết dính sinh học Nó có đặc tính chống oxi hóa, kháng khuẩn, kháng nấm, và kháng khối u, đồng thời kích thích sự phát triển tế bào Chitosan cũng có khả năng hấp thụ kim loại nặng, giảm cholesterol trong máu, và thể hiện hoạt tính kháng virus, hỗ trợ điều trị bệnh thận mãn tính và chống rối loạn nội tiết.
Vào năm 1968, K Arai và các cộng sự đã chứng minh rằng chitosan hầu như không độc hại, với liều tử vong (LD50) khi uống được ghi nhận là 16g/kg trọng lượng cơ thể, không gây độc cho động vật thực nghiệm và con người.
Nghiên cứu tiêm chitosan qua đường tĩnh mạch trên thỏ cho thấy chitosan là vật liệu tương hợp sinh học cao, là chất mang lý tưởng trong hệ thống tải thuốc Chitosan không chỉ được sử dụng cho đường uống mà còn an toàn trong tiêm tĩnh mạch, tiêm bắp, tiêm dưới da và ghép mô.
Chitosan, với đặc tính kết dính sinh học, khi kết hợp với Pluronic F127, sẽ nâng cao độ bền và khả năng bám dính của hydrogel lên bề mặt vết thương.
1.2.3 Ứng dụng của chitosan trong y sinh
Chitosan được sử dụng trong y học như một chất cầm máu hiệu quả, với khả năng kháng khuẩn và không gây dị ứng, nhờ vào muối chitosan được hình thành khi kết hợp với acid hữu cơ như axit succinic hoặc axit lactic Tác nhân cầm máu hoạt động thông qua sự tương tác giữa màng tế bào hồng cầu và chitosan proton, dẫn đến hình thành cụm máu đông Các muối chitosan có thể kết hợp với vật liệu khác để cải thiện khả năng hấp thụ và điều chỉnh tốc độ hòa tan, đồng thời chúng có tính tương thích sinh học và phân hủy sinh học cao Chitosan proton hóa có thể bị phân hủy thành glucosamine trong cơ thể và tương tác với các acid tự nhiên như lactate Trong điều trị bỏng, màng đắp vết thương chứa chitosan cho thấy hiệu quả tốt trong việc kiểm soát trao đổi hơi nước và oxy, cũng như khả năng hút nước, đồng thời cung cấp môi trường ba chiều cho tế bào phát triển Chitosan còn kích thích macrophage tiết ra các yếu tố tăng trưởng, hỗ trợ quá trình tái cấu trúc mô mà không gây phát triển quá mức.
Chitosan, một polymer dương điện với các nhóm amino trong cấu trúc, có khả năng kháng khuẩn và tính bám dính sinh học cao, giúp thúc đẩy quá trình lành vết thương mà không để lại sẹo.
Truyền tải thuốc: Chitosan có điện tích dương trong môi trường acid và điện tích dương này hình thành do proton của nhóm amine tự do của chitosan
Chitosan không tan trong môi trường base và trung tính, nhưng khi tiếp xúc với môi trường acid, nhóm amine sẽ proton hóa, làm tăng khả năng hòa tan Tính chất này rất quan trọng trong ứng dụng y sinh để truyền tải thuốc, vì chitosan có thể được sử dụng làm scaffold để vận chuyển thuốc đến các môi trường acid, nơi nó tan và phóng thích thuốc, như trong trường hợp bao vận chuyển insulin Chitosan cũng được đánh giá cao về tính tương hợp sinh học và có ái lực mạnh với nhiều loại tế bào, vì vậy các vật liệu y sinh dựa trên chitosan đang được nghiên cứu kết hợp với các tác nhân kích thích tái tạo mô như peptide và protein.
TỔNG QUAN VỀ ALGINATE
1.3.1 Nguồn gốc và cấu tạo của Alginate
Alginate (Alg) chủ yếu tồn tại dưới dạng muối natri của acid Alginic, là một trong những polysaccharide anion tự nhiên phong phú nhất, được phát hiện vào cuối thế kỷ XIX bởi dược sĩ E.C.C Stanford Từ khi được phát hiện vào năm 1883, alginate đã trở thành sản phẩm công nghiệp quan trọng từ rong biển, với chất chiết xuất được gọi là "acid Alginic" và sản xuất thương mại bắt đầu từ năm 1929 Hiện nay, sản lượng alginate từ tảo ước tính đạt khoảng 38.000 tấn mỗi năm trên toàn cầu, chủ yếu phục vụ cho ngành công nghiệp thực phẩm và dược phẩm.
Alginate là một copolymer mạch thẳng, được hình thành từ β–D–Mannuronic acid (M) và α–L–Guluronic acid (G), liên kết với nhau qua liên kết glycoside 1,4 Chuỗi alginate bao gồm sự kết hợp của hai loại acid này.
Alginate được phân loại thành ba loại khối: poly–G (G–G–G–G), poly–M (M–M–M–M) và poly–GM (G–M–G–M) với cấu trúc liên kết ngẫu nhiên Hàm lượng và các thuộc tính lý, hóa sinh học của alginate thay đổi tùy thuộc vào loài rong, giai đoạn trưởng thành, mùa vụ và môi trường sống.
Alginate là một polymer có tính chất hòa tan và độ nhớt đặc biệt, phụ thuộc vào pH, lực liên kết ion và sự hiện diện của các ion trong dung dịch Khi có mặt các cation hóa trị hai như Ca²⁺, Sr²⁺ và Ba²⁺, Alginate sẽ tạo gel Đặc biệt, khi kết hợp với các cation hóa trị một như Na⁺, K⁺, NH₄⁺, Alginate tan trong nước và tạo ra dung dịch có độ nhớt cao Sodium Alginate, một dạng muối đơn hóa trị, có khả năng hòa tan tốt và được ứng dụng rộng rãi Độ nhớt của Alginate được xác định bởi trọng lượng phân tử, độ cứng và cấu trúc chuỗi polymer, tạo nên dung dịch có độ nhớt cao nhờ cấu trúc cồng kềnh của phân tử.
Độ nhớt của dung dịch Alg phụ thuộc vào tính chất đa cực của phân tử và lực liên kết ion trong dung dịch Khi lực liên kết ion cao, phân tử Alg có dạng ít chuỗi dài, dẫn đến độ nhớt thấp hơn.
Alginate có khả năng tạo gel bằng cách kết hợp dung dịch Alginate với các cation hóa trị hai như Ca²⁺, tạo thành hydrogel thông qua các liên kết ngang ion Các cation này liên kết với các khối G trong chuỗi Alginate, nhờ vào cấu trúc phối trí cao của chúng Các khối G sẽ tạo thành các điểm nối với các khối G khác, hình thành cấu trúc gel vững chắc Ngoài ra, các khối MG cũng tham gia tạo mối nối yếu, làm cho gel trở nên mạnh mẽ hơn khi hàm lượng khối G cao Ái lực của Alginate với ion hóa trị hai giảm dần theo thứ tự: Pb > Cu > Cd > Ba > Sr > Ca > Co, Ni, Zn > Mn, trong đó Ca²⁺ là cation phổ biến nhất được sử dụng để tạo gel Alginate.
1.3.2.1 Tính tương hợp sinh học
Alginate có tính tương hợp sinh học đã được nghiên cứu nhiều, nhưng vẫn còn tranh cãi về ảnh hưởng của thành phần alginate Hầu hết các tác động này liên quan đến mức độ tinh khiết khác nhau của alginate, vì alginate từ nguồn tự nhiên có thể chứa tạp chất như kim loại nặng, nội độc tố, protein và hợp chất polyphenolic Alginate được tinh chế qua quy trình chiết xuất nhiều bước, đạt độ tinh khiết cao và không gây độc khi cấy ghép vào cơ thể.
Sodium Alginate có độ hòa tan cao trong nước, không độc hại và khả năng phân hủy sinh học, cùng với tính tương hợp sinh học và đặc điểm tạo gel độc đáo Nhờ những đặc tính này, Sodium Alginate được ứng dụng rộng rãi trong y sinh, bao gồm truyền tải thuốc và protein, chữa lành vết thương, nuôi cấy tế bào, và tái tạo mô như tái tạo mạch máu và xương.
TỔNG QUAN VỀ HYDROGEL
Hydrogel được báo cáo lần đầu tiên bởi Wichterle và Lím (1960) Hydrogel là một mạng lưới ba chiều (3D) gồm các polyme ưa nước có thể
Hydrogel có khả năng trương nở và giữ nước lớn, đồng thời duy trì cấu trúc nhờ vào liên kết hóa học hoặc vật lý của các chuỗi polyme Với hàm lượng nước cao, hydrogel có độ mềm dẻo tương tự như mô tự nhiên Tính ưa nước của mạng hydrogel được tạo ra bởi sự hiện diện của các nhóm ưa nước.
Hydrogel thông minh (Smart Hydrogels) được hình thành từ các polymer thông minh có khả năng phản ứng với các kích thích vật lý như nhiệt độ, điện trường, từ trường, áp suất, âm thanh và ánh sáng, cũng như các tác nhân hóa học như pH, lực ionic, thành phần dung môi và dạng polymer Những hydrogel này có thể được thiết kế để kiểm soát sự co và nở ra theo sự thay đổi của môi trường xung quanh, cho phép chúng chuyển đổi thể tích rõ rệt khi tiếp xúc với các tác nhân kích thích.
1.4.2 Phân loại hydrogel thông minh
Hydrogel thông minh được phân loại thành hai loại chính dựa trên khả năng phản ứng với các kích thích: hydrogel đáp ứng kích thích hóa học và hydrogel đáp ứng kích thích vật lý Những đặc tính này của hydrogel thông minh rất quan trọng trong các ứng dụng cấy ghép và tái tạo mô.
1.4.2.1 Hydrogel đáp ứng kích thích hóa học
Hydrogel nhạy pH : Hydrogel nhạy pH chứa các nhóm chức ion hóa cho hoặc nhận proton trong phản ứng với những thay đổi trong môi trường pH
Hydrogel nhạy ion là loại hydrogel có khả năng thay đổi đáng kể và đột ngột về tính chất vật lý hoặc hóa học khi nồng độ ion thay đổi một cách nhỏ.
Hydrogel nhạy glucose là những hệ thống hydrogel có khả năng vận chuyển insulin, phản ứng nhạy bén với môi trường xung quanh Hiện nay, lĩnh vực này đang thu hút sự quan tâm nghiên cứu đáng kể.
1.4.2.2 Hydrogel đáp ứng kích thích vật lý
Hydrogel nhạy nhiệt là loại hydrogel thông minh có khả năng thay đổi cấu trúc để thích ứng với nhiệt độ môi trường Chúng có tiềm năng ứng dụng lớn trong lĩnh vực y sinh học Hydrogel nhạy nhiệt được chia thành hai loại chính: polymer với nhiệt độ tới hạn dưới (LCST) và polymer với nhiệt độ tới hạn trên (UCST) Polymer có LCST sẽ chuyển từ trạng thái hòa tan sang không tan khi nhiệt độ vượt quá LCST, trong khi polymer có UCST chuyển từ trạng thái hòa tan sang không tan khi nhiệt độ thấp hơn UCST.
Hydrogel nhạy quang là một loại hydrogel thông minh có khả năng phản ứng với ánh sáng, được cấu tạo từ mạng lưới polymer chứa các nhóm nhạy quang Khi tiếp xúc với ánh sáng, các hydrogel này sẽ thay đổi các tính chất vật lý và hóa học như độ đàn hồi, độ nhớt và hình dạng, mang lại nhiều ứng dụng tiềm năng trong công nghệ và y học.
Hydrogel nhạy điện là loại hydrogel thông minh có khả năng giãn nở, co lại, kéo dài và uốn cong khi chịu tác động của điện trường Hình dạng và vị trí của hydrogel sẽ thay đổi tùy thuộc vào điện trường và vị trí của các điện cực.
Khả năng trương nở của hydrogel phụ thuộc vào không gian bên trong để chứa nước và các lực tương tác giữa polymer và nước Tính ưa nước của hydrogel làm tăng cường lực tương tác này, dẫn đến sự trương nở khi tiếp xúc với nước Độ trương nở của hydrogel còn bị ảnh hưởng bởi mật độ liên kết ngang, mật độ điện tích và nồng độ liên kết ngang trong polymer sau khi gel hình thành.
1.4.3.2 Tính phân hủy sinh học
Sự phân hủy của hydrogel rất cần thiết trong quá trình tái tạo mô, khối
Lượng phân hủy của vật liệu cấy ghép cần phải tương thích với tốc độ hình thành mô mới, đồng thời các phân tử giải phóng trong quá trình này phải không độc hại với tế bào Hydrogel có ba cơ chế suy giảm chính: thủy phân, suy giảm bởi enzyme và suy giảm do hòa tan Phần lớn hydrogel tổng hợp suy giảm chủ yếu qua quá trình thủy phân các liên kết ester Các hydrogel suy giảm bởi enzyme cho thấy sự khác biệt về khối lượng suy giảm trong các nghiên cứu in vitro và in vivo, do sự hiện diện của nhiều loại enzyme trong cơ thể động vật.
1.4.3.3 Tính tương hợp sinh học
Hydrogel với tính tương hợp sinh học và không gây độc là yếu tố then chốt trong ứng dụng y sinh Các polymer sử dụng trong lĩnh vực này cần được thử nghiệm để đảm bảo không gây độc hại cho cơ thể Hydrogel tạo ra môi trường lý tưởng cho tế bào di chuyển, tăng trưởng và biệt hóa, đồng thời thúc đẩy chức năng tế bào cho những ứng dụng đặc biệt như tăng cường độ bám dính và phát triển mô Để đạt được điều này, các polymer cấu thành hydrogel phải không gây độc cho tế bào và không kích hoạt phản ứng miễn dịch, nhưng vẫn cần hỗ trợ sự bám dính và phát triển của tế bào.
1.4.4 Ứng dụng của hydrogel nhạy nhiệt
1.4.4.1 Ứng dụng trong lĩnh vực tái tạo mô
Kỹ nghệ mô nhằm thay thế mô hoặc cơ quan bị hư hỏng để hỗ trợ tái tạo mô mới Vật liệu làm bộ khung thường có tính tương hợp sinh học, phân hủy sinh học và độ bền cơ học Các polymer nhạy nhiệt được nghiên cứu để làm chất nền cho tế bào phát triển, hoặc gel tiêm vào vị trí tổn thương như da và xương, tạo thành bộ khung ngay tại chỗ khiếm khuyết.
Scaffold từ hydrogel dextran chuyển đổi từ dạng lỏng sang dạng gel khi tiếp xúc với ánh sáng, hỗ trợ quá trình tạo mạch máu và tái tạo da.
1.4.4.2 Ứng dụng chữa lành vết thương
Hydrogel có khả năng hấp thu và giữ nước hiệu quả, giúp duy trì độ ẩm cho vết thương Đặc tính này cho phép hydrogel, đặc biệt là hydrogel nhạy nhiệt, hấp thu dịch tiết từ vết thương và thúc đẩy sự tăng sinh nguyên bào Bằng cách giảm thiểu mất nước và tạo lớp màng bảo vệ, hydrogel ngăn chặn vi sinh vật gây hại xâm nhập Tác động giữ ẩm của hydrogel cũng hỗ trợ sự di chuyển của tế bào sừng trên bề mặt vết thương Ngoài ra, hydrogel có thể trong suốt, giúp dễ dàng giám sát vết thương mà không cần tháo băng.
1.4.4.3 Ứng dụng trong mang nhả thuốc
Quá trình phân phối thuốc cần đảm bảo đưa thuốc đến đúng vị trí, vào đúng thời điểm và đúng nồng độ Để đáp ứng yêu cầu này, các polymer thông minh được nghiên cứu làm chất mang thuốc, cho phép đưa thuốc đến đúng vị trí và giải phóng khi có kích thích từ môi trường Chẳng hạn, trong điều trị đái tháo đường tuýp 1, insulin có thể được tiêm dưới da, trong khi hydrogel sẽ từ từ giải phóng insulin, thay thế cho việc tiêm truyền thống.
TỔNG QUAN VỀ QUERCETIN VÀ RESVERATROL
Quercetin (QU) (3,3’,4’,5,7-pentahydroxyflavone) thuộc nhóm polyphenol được tìm thấy phổ biến ở thực vật QU thường xuyên ở dạng glycosides (các chất dẫn xuất của đường) [37]
1.5.1.1 Cấu trúc hóa học và một số tính chất lý hóa của QU
Tên IUPAC của hợp chất là 2-(3,4-dihydroxyphenyl)-3,5,7-trihydroxy-4H-chromen-4-one, còn được gọi là Sophoretin, Meletin, Quercetin, Xanthaurine, Quercerol, Quercitin, Quertine, và Flavin meletin Hợp chất này có công thức phân tử C15H10O7, tồn tại dưới dạng bột mịn màu vàng với khối lượng mol 302,236 g/mol và tỷ trọng 1,799 g/cm³ Nhiệt độ nóng chảy của nó đạt 316 °C, và độ hòa tan trong nước là 60 mg/L tại 16 °C Hợp chất này tan rất tốt trong Ether và Methanol, cũng như tan tốt trong Ethanol, Acetone, Pyridine và Acetic Acid.
Hình 1.4 Quercetin và cấu trúc Quercetin
QU không bền dưới ánh sáng, vì vậy cần bảo quản trong lọ sẫm màu và nơi thoáng mát, tránh ánh sáng trực tiếp QU là chất rắn tinh thể màu vàng, có vị đắng, không hòa tan trong nước, ít hòa tan trong rượu, nhưng có thể hòa tan trong acetic acid lạnh và dung dịch kiềm loãng.
1.5.1.2 Hoạt tính sinh học của QU
QU là một flavonoid phổ biến có mặt trong nhiều loại thực vật và trái cây như nho đỏ, cam, cà chua, bông cải xanh và rau lá xanh, cũng như một số loại quả mọng như quả mâm xôi và nam việt quất Aglycone quercetin, hay QU, không phải là thành phần dinh dưỡng phổ biến, trong khi quercetin glycoside được chuyển hóa thành axit phenolic trong quá trình tiêu hóa Hiện tại, QU chưa được khoa học công nhận là liệu pháp điều trị cho bất kỳ tình trạng nào và cũng chưa được các cơ quan quản lý phê duyệt.
Một số nghiên cứu của Brown và Griffiths (1983) cho chuột và thỏ uống
QU được bài tiết qua nước tiểu dưới dạng 3,4-acid dihydroxyphenylacetic, acid 3-methoxy-4-hydroxy phenylacetic (acid homovanillic), và axit m-hydroxyphenylacetic, với nguồn gốc hình thành từ gan Nghiên cứu cho thấy tốc độ đào thải QU được phát hiện sau 48 giờ, trong khi sau 3 giờ sử dụng QU với liều 2,3 mg/kg trọng lượng cơ thể trên 5 tình nguyện viên, không có QU nào được phát hiện trong huyết tương hoặc nước tiểu.
QU được coi là một chất chống oxy hóa mạnh mẽ nhờ khả năng phát hiện và liên kết với các gốc tự do cũng như các ion kim loại chuyển tiếp Tính chất này giúp QU ức chế quá trình peroxid hóa lipid, trong đó các axit béo chưa bão hòa chuyển đổi thành gốc tự do thông qua sự tách hydro Quá trình lipid peroxidation có thể gây ra những tác động tiêu cực đến sức khỏe, đặc biệt là đối với tim mạch.
Mạch máu và thoái hóa thần kinh là hai vấn đề sức khỏe nghiêm trọng Tuy nhiên, các bệnh này có thể được ngăn chặn nhờ vào các chất chống oxy hóa, như QU, có khả năng can thiệp vào sự hình thành các gốc tự do.
1.5.2.1 Cấu trúc hóa học và một số tính chất lý hóa của RE
RE là một hợp chất giống như chất chống oxy hóa được tìm thấy trong rượu vang đỏ, quả mọng và đậu phộng [41]
Trọng lượng phân tử của chất này là 228,24 g/mol, tồn tại dưới dạng bột trắng rắn Nó có điểm nóng chảy khoảng 254 °C và độ hòa tan trong nước là 3 mg/100 mL Chất này cũng hòa tan trong các dung môi hữu cơ như ethanol, DMSO và dimethyl formamide với nồng độ khoảng 65 mg/mL, trong khi độ hòa tan trong dung dịch muối đệm phốt phát (PBS) ở pH 7,2 xấp xỉ.
Hình 1.5 Resveratrol và cấu trúc Resveratrol
RE là một phytoalexin polyphenolic, thuộc nhóm stilbene, được sản xuất trong thực vật nhờ enzyme stilbene Hàm lượng RE trong thực phẩm rất khác nhau, với rượu vang đỏ chứa từ 0,2 đến 5,8 mg/L tùy vào giống nho, trong khi rượu vang trắng có ít hơn nhiều do quá trình lên men khác nhau RE cũng được cung cấp dưới dạng bổ sung dinh dưỡng và đã được ghi nhận với nhiều lợi ích sức khỏe, bao gồm khả năng chống ung thư, kháng vi-rút, bảo vệ thần kinh, chống lão hóa, chống viêm và kéo dài tuổi thọ.
Nho đỏ, thành phần chính của rượu vang đỏ, có thể giải thích cho "nghịch lý Pháp", khi tỷ lệ mắc bệnh tim mạch vành ở miền Nam Pháp tương đối thấp mặc dù chế độ ăn giàu chất béo bão hòa Resveratrol (RE) được cho là mang lại lợi ích bảo vệ tim mạch thông qua nhiều cơ chế, bao gồm ức chế biểu hiện phân tử tế bào bám dính mạch máu, ức chế sự tăng sinh tế bào cơ trơn mạch máu, kích thích nội tiết tổng hợp oxit nitric (eNOS), ức chế kết tập tiểu cầu và ức chế peroxid hóa LDL.
1.5.2.2 Hoạt tính sinh học của RE
Bổ sung RE có thể giúp giảm huyết áp bằng cách tăng sản xuất oxit nitric, một chất chống oxy hóa, và giảm sự hòa tan cholesterol LDL, từ đó kéo dài tuổi thọ trong các nghiên cứu trên động vật Mặc dù chưa rõ liệu tác dụng này có tương tự ở người hay không, RE, với tính chất chống oxy hóa và chống viêm mạnh mẽ, cho thấy tiềm năng bảo vệ các tế bào não khỏi hư hại Ngoài ra, RE còn có khả năng giảm đau khớp bằng cách ngăn chặn sự phá vỡ sụn, và đã cho thấy hoạt động ngăn chặn ung thư thú vị trong các thí nghiệm in vitro và in vivo.
RE có khả năng bảo vệ chống lại stress oxy hóa, giúp ngăn ngừa các biến chứng liên quan đến bệnh tiểu đường (ĐTĐ) Nó cũng được cho là làm giảm viêm, một yếu tố chính gây ra các bệnh mãn tính, bao gồm ĐTĐ Bên cạnh đó, RE kích hoạt AMPK, một loại protein quan trọng trong việc chuyển hóa glucose, giúp duy trì mức đường huyết ổn định Nghiên cứu trên động vật cho thấy, rượu vang đỏ và RE mang lại hiệu quả chống oxy hóa tốt hơn cho những con chuột mắc ĐTĐ so với những con không mắc bệnh này.
Nghiên cứu cho thấy liệu pháp RE đã cải thiện độ nhạy insulin ở chuột và hỗ trợ chống lại các biến chứng của bệnh tiểu đường Trong tương lai, những người mắc bệnh tiểu đường có thể nhận được lợi ích từ liệu pháp này.
TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU
1.6.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Các nghiên cứu về phương pháp điều trị vết thương hiện nay chủ yếu tập trung vào việc phát triển các hệ hydrogel hoạt tính, trong đó hydrogel dựa trên Pluronic F127 đang được chú ý đặc biệt vì đã được FDA phê duyệt cho ứng dụng lâm sàng Pluronic F127 và Pluronic P123 gần đây đã được sử dụng trong các hệ thống phân phối thuốc, thường được áp dụng trong điều trị táo bón như chất làm ướt và bôi trơn, cũng như trong các dạng thuốc nhỏ mắt và gel kháng khuẩn cho điều trị bỏng.
Nghiên cứu của Palumbo và các đồng nghiệp, công bố năm 2016 trên tạp chí Wounds, đã khảo sát 1036 bệnh nhân mắc bệnh tiểu đường (ĐTĐ) tại nhiều địa điểm ở Châu Âu, tất cả đều có vết thương không lành do nhiều nguyên nhân khác nhau Nhóm nghiên cứu đã cung cấp bằng chứng cho thấy gel poloxame kết hợp với các hoạt chất hỗ trợ điều trị có hiệu quả trong việc chữa lành vết thương, nhờ vào khả năng loại bỏ mô hoại tử, ngăn chặn sự hình thành biofilm do vi khuẩn và đặc biệt là hỗ trợ quá trình tái tạo mô bị tổn thương.
Việc sử dụng Pluronic trong việc điều chế hydrogel có những nhược điểm về cơ tính Để khắc phục những hạn chế này, Pluronic thường được biến tính hoặc thay đổi cấu trúc thông qua việc gắn thêm các nhóm chức năng.
Polymer tự nhiên như collagen, gelatin, chitosan, alginate và agarose đang được sử dụng rộng rãi trong lĩnh vực vật liệu sinh học tái tạo mô Các polymer sinh học này, đặc biệt là chitosan, gelatin và alginate, thu hút sự chú ý lớn nhờ vào hoạt tính sinh học của chúng.
Trong những năm gần đây, nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng các hoạt chất thiên nhiên từ thực vật như curcumin, quercetin và resveratrol (RE) không chỉ thúc đẩy quá trình lành vết thương qua cơ chế tín hiệu tế bào mà còn có tác dụng kháng viêm, kháng khuẩn và chống oxy hóa Giáo sư Sinclair từ đại học Harvard đã phát hiện rằng chuột ăn chế độ ăn nhiều mỡ động vật nhưng sử dụng RE với liều lượng 20 mg/kg/ngày có tuổi thọ cao hơn và không xuất hiện triệu chứng bệnh tiểu đường type 2 Nghiên cứu cũng cho thấy RE có khả năng giảm trọng lượng cơ thể và mỡ ở động vật béo phì thông qua việc điều chỉnh biểu hiện gen và hoạt động enzyme Bằng chứng cho thấy RE ảnh hưởng đến bài tiết insulin và nồng độ insulin trong máu, giảm insulin máu ở động vật có tình trạng tăng insulin Đặc biệt, RE đã được chứng minh có khả năng giảm đường huyết ở chuột mắc tiểu đường, với cơ chế hoạt động phức tạp liên quan đến tác dụng phụ thuộc insulin và độc lập với insulin, đồng thời hỗ trợ trong việc ngăn ngừa và điều trị bệnh tiểu đường.
Nghiên cứu của H Elbe và các cộng sự đã chỉ ra tác dụng chống oxy hóa của melatonin, QU và RE đối với bệnh nhân tiểu đường, với kết quả thử nghiệm in vivo cho thấy giảm tổn thương do tiểu đường Hiện tại, có hơn tám nghiên cứu đang được tiến hành để đánh giá hiệu quả và độ an toàn của các công thức RE cho người lớn mắc tiểu đường týp 2.
Có 800 người tham gia tình nguyện trong hai nghiên cứu đang chờ đánh giá và công bố, nhằm củng cố kết quả về sự an toàn và hiệu quả của RE cho người lớn mắc bệnh tiểu đường typ 2 Hiệu quả và an toàn của RE cũng đã được chứng minh ở bệnh nhân tiểu đường loại 1 Trong mô hình xenograft melanoma, hàm lượng RE trong da chuột được đo 5 phút sau khi sử dụng liều 75 mg/kg là 21 nmol/g và 4,67 nmol/g ở dạng liên hợp glucuronide Mặc dù một lượng RE có thể đo được đã được tìm thấy trong các khối u, nhưng nó thấp hơn so với hàm lượng trong da Thời gian bán hủy của RE trong huyết tương dao động từ 8 đến 14 phút, trong khi các chất chuyển hóa như trans-resveratrol-3-O-glucuronide và trans-resveratrol-3-O-sulfate có thời gian bán hủy khoảng 9,2 giờ Thời gian bán hủy của trans-resveratrol trong huyết tương người là từ 1-3 giờ sau khi dùng liều đơn và 2-5 giờ sau khi dùng liều lặp lại.
Trung tâm y tế Đại học Boston, Mỹ đã công bố một thử nghiệm điều trị kết hợp giữa QU và RE trên bệnh nhân ĐTĐ tình nguyện vào năm 2010 Nghiên cứu này nhằm kiểm nghiệm hiệu quả của QU và RE trong việc ngăn chặn quá trình viêm và hỗ trợ tiếp nhận insulin ở tế bào mô mỡ của bệnh nhân ĐTĐ, được điều trị với yếu tố hoại tử khối u-alpha (TNF-alpha) TNF-alpha là một cytokine tiền viêm quan trọng, đóng vai trò trong phản ứng viêm và có chức năng miễn dịch bẩm sinh, giúp đáp ứng chống lại các tác nhân gây nhiễm trùng Các nghiên cứu cũng được thực hiện trên mô hình vết thương ở chuột bị ĐTĐ do Streptozotocin gây ra.
Việc kết hợp QU và RE cho thấy hiệu quả đáng kể trong việc giảm kích hoạt các gene gây viêm như IL-6, IL-1b, IL-8 và MCP-1, từ đó hỗ trợ quá trình chữa lành vết thương thông qua việc cải thiện sự hấp dẫn của tế bào đơn nhân và điều hòa tăng sinh mạch máu Nghiên cứu cho thấy QU và RE có tác dụng tích cực lên chỉ số đường huyết, insulin và lipid ở chuột mắc ĐTĐ, đồng thời duy trì hoạt động của các enzyme chuyển hóa glucose ở gan Điều trị bằng QU và RE cũng cho thấy khả năng phòng ngừa cao nhất đối với biến chứng của ĐTĐ, trong đó loét chân ảnh hưởng đến 15% người bệnh Các biến chứng khác của ĐTĐ bao gồm bệnh về mắt, thận, mạch máu, và tăng nguy cơ nhiễm trùng Hiện nay, các phương pháp điều trị loét chân bao gồm phẫu thuật, kỹ thuật ướt, và hydrogel, một kỹ thuật mới đang được phát triển.
Gel này có tính trơ về mặt sinh học và chứa nhiều nước, giúp tạo môi trường ẩm ướt cho quá trình tự phân hủy tự nhiên của cơ thể Chúng hỗ trợ trong việc bảo tồn các mô khỏe mạnh trong khi thúc đẩy quá trình lành vết thương ẩm Gel có thể được áp dụng cho vết thương ở bất kỳ giai đoạn nào mà không gây hại, yêu cầu mức độ kỹ năng tối thiểu.
1.6.2 Tình hình nghiên cứu trong nước
Nghiên cứu về hydrogel làm màng băng vết thương và mang các hoạt chất hỗ trợ điều trị đang trở thành xu hướng mới Năm 1997, nhóm nghiên cứu của PGS TS Nguyễn Thị Ngọc Tú tại Viện Hóa học đã phát triển kem Pokysan từ chitosan, có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, cầm máu và kích thích tái tạo da, mang lại hiệu quả tốt trong điều trị vết thương bỏng Đồng thời, nghiên cứu của Trần Hữu Dũng về gel Pluronic F127 nhạy nhiệt cho thấy khả năng chữa lành vết thương hở hiệu quả và có thể sử dụng để phóng thích thuốc tại chỗ Tuy nhiên, gel Pluronic có tính chất thân nước, dẫn đến lớp màng không bền vững Để khắc phục, nhóm nghiên cứu của Lê Thị Thu Hương đã cải tiến Pluronic bằng cách gắn kết nhóm carbonyl của p-nitrophenyl chloroformat vào nhóm hydroxyl.
Gel Pluronic, được nghiên cứu nhằm giảm tính thân nước, cho thấy hiệu quả vượt trội trong việc điều trị tổn thương bỏng Ở nhiệt độ 4 – 8 °C, gel này ở dạng lỏng, có khả năng trải đều trên vết thương và tạo thành một lớp màng bền vững Lớp màng này không chỉ che phủ vết thương, ngăn ngừa mất dịch và chất điện giải mà còn bảo vệ khỏi bội nhiễm từ bên ngoài, đồng thời phóng thích kháng sinh và chất tăng sinh niêm mạc da Đặc biệt, màng Pluronic có thể dễ dàng loại bỏ khi cần thiết, tạo điều kiện thuận lợi cho việc điều trị và theo dõi hàng ngày.
Năm 2016, nhóm nghiên cứu của PGS.TS Trần Ngọc Quyển đã phát triển gel nhạy nhiệt từ Pluronic F127 và chitosan, cho phép chuyển đổi giữa gel và dung dịch theo nhiệt độ Gel này có khả năng mang curcumin với hàm lượng lên đến 14,45±0,2 mg/mL, thể hiện tính trương nở, khả năng hấp thụ tốt, tốc độ phân hủy hợp lý, và tính tương hợp sinh học cao mà không ảnh hưởng đến hình thái học Các đặc tính lý hóa vẫn ổn định khi có nanocurcumin Thử nghiệm kháng khuẩn cho thấy gel hiệu quả với cả vi khuẩn gram âm và dương, đặc biệt trên bề mặt vết thương của bệnh nhân ĐTĐ Kết quả từ mô hình bỏng độ 2 và 3 cho thấy gel này giúp làm lành và tái cấu trúc mô nhanh hơn so với các mẫu đối chứng và thuốc thương mại như Biafine và Silvirin.
Gần đây, Newtech Pharm đã giới thiệu gel Nacurgo, chứa Nano Curcumin và tinh chất trà xanh Camellia Sinensis, hỗ trợ trong việc chữa lành vết thương Nghiên cứu về vết thương ở bệnh nhân tiểu đường tại Việt Nam vẫn còn mới mẻ Các bác sĩ chuyên khoa khuyến cáo cần rửa và khử trùng vết thương để đảm bảo quá trình hồi phục hiệu quả.
Sử dụng nước muối sinh lý hoặc povidon iod, kết hợp với thuốc kháng sinh đường uống hoặc kem bôi tại chỗ chứa kháng sinh, sẽ giúp tiêu diệt vi khuẩn và thúc đẩy quá trình lành vết thương nhanh chóng.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nguyên liệu – hóa chất
Bảng 2.1 Nguyên liệu và hóa chất STT Tên nguyên liệu – hóa chất Xuất xứ Mục đích sử dụng
Fisher Scientific Nguyên liệu tổng hợp
Acros Organics Nguyên liệu tổng hợp
Acros Organics Nguyên liệu tổng hợp
5 Khí nitơ tinh khiết phân tích Việt Nam Nguyên liệu tổng hợp
6 Quercetin Sigma Hoạt chất thử nghiệm
7 Nước cất Việt Nam Dung môi
Acros Organics Nguyên liệu tổng hợp
Acros Organics Nguyên liệu tổng hợp
10 Resveratrol Sigma Hoạt chất thử nghiệm
Chitosan from shrimp shells with low-viscosity (Cs, code
Sigma Nguyên liệu tổng hợp
Dụng cụ và trang thiết bị
Bảng 2.2 Danh mục các trang thiết bị và dụng cụ
Máy cô quay Buchi Rotavapor R-
Bể siêu âm Elmasonic S 80H, Đức
Máy đông khô EYELA FDU-1200,
Máy li tâm lạnh Hermle Z32HK, Đức
Cân phân tích 4 số lẻ OHAUS pioneer PA114, Mỹ
Máy khuấy từ gia nhiệt VELP
Máy quang phổ tử ngoại khả kiến
Máy quang phổ hồng ngoại FTIR
Bình cầu 1 cổ Duran 100 mL Bình cầu cổ nhám Duran 250 mL ống falcon ly tâm 50mL Cá từ, kim tiêm
Micro pipet Giấy đo pH
Hủ bi Bình định mức, ống đong
Các phương pháp phân tích
2.1.3.1 Đánh giá cấu trúc của hệ copolymer bằng 1 H-NMR Để chứng minh tổng hợp thành công copolymer vật liệu được hòa tan trong dung môi deuterated chloroform (CDCl3) hoặc nước D2O khảo sát cấu trúc bằng máy phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Bruker Advance 500MHz, USA, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam) với chất chuẩn là tetramethyl silane (TMS) có độ dịch chuyển hóa học δ (ppm) bằng không Dựa vào sự xuất hiện độ chuyển dịch hóa học của các proton trên phổ đồ sẽ biết được sự có mặt của các proton trên các nhóm thế khác nhau
2.1.3.2 Phổ hồng ngoại (FT-IR)
Phương pháp nén viên KBr được áp dụng để xác định phổ hấp thụ hồng ngoại trong khoảng từ 4000 đến 500 cm-1, sử dụng thiết bị FT-IR/NIR Spectroscopy Frontier tại Viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, thuộc Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
Để chuẩn bị mẫu thử cho phân tích IR, nghiền 2 mg mẫu với 100 mg bột KBr đã sấy khô cho đến khi tạo thành viên nén đường kính 13 mm và có cường độ phổ phù hợp Hỗn hợp cần được nghiền kỹ và trải đều trên khuôn thích hợp, sau đó nén với áp suất khoảng 800 Mpa trong điều kiện chân không trước khi tiến hành đo phổ IR.
2.1.3.3 Phổ tử ngoại – khả kiến (UV-Vis)
Phương pháp phân tích định lượng dựa trên hiệu ứng hấp thụ khi các phân tử tương tác với bức xạ điện từ Kỹ thuật này sử dụng vùng bức xạ tử ngoại gần và khả kiến, với bước sóng từ 200 đến 800 nm.
Phổ UV-Vis được đo trên thiết bị UV-1800 Shimadzu đặt tại viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
TỔNG HỢP HYDROGEL NHẠY NHIỆT TRÊN CƠ SỞ CHITOSAN VÀ PLURONIC F127
Trong nghiên cứu này, chúng tôi tổng hợp hydrogel nhạy nhiệt từ chitosan và Pluronic F127 thông qua liên kết giữa nhóm amine của chitosan và nhóm (–C=O) của hợp chất carbonate (NPC) Sản phẩm phản ứng Pluronic sau khi được kích hoạt bằng p-nitrophenyl chloroformate (NPC) đã được xác định cấu trúc bằng phương pháp phổ 1HNMR và FT-IR.
Hydrogel chitosan- Pluronic (CP) được tổng hợp qua 3 giai đoạn trung gian hình 2.1 thể hiện sơ đồ tổng hợp chitosan- Pluronic F127 (CS -F127),
Hình 2.1 Quy trình tổng hợp hệ hydrogel CS -F127 2.2.1 Tổng hợp NPC-F127-NPC
Hình 2.2 Phương trình phản ứng tổng hợp NPC-F127-NPC
Hình 2.3 Quy trình tổng hợp NPC-F127-NPC
Quy trình phản ứng
Cân 15 gam F127 (1,2 mmol) nóng chảy trong bình cầu 250 mL ở nhiệt độ 65 °C trong môi trường hút chân không khoảng 1 giờ 30 phút để F127 tan chảy hoàn toàn và đồng thời không có độ ẩm trong mẫu Sau đó 0,5 g NPC (2,4 mmol) cho vào bình cầu, khuấy ở nhiệt độ 65 °C, môi trường khí N2 trong 5 giờ Giảm nhiệt độ xuống, cho 40 mL THF vào khuấy ở nhiệt độ phòng qua đêm Dung dịch được tủa với 250 mL diethyl ether Tủa thu được thông qua lọc hút chân không, tiếp tục rửa lại với diethyl ether khoảng 2-3 lần Sau đó, đem sản phẩm đi cô quay loại bỏ hết dung môi Sản phẩm thu được có dạng bột màu trắng mịn, cấu trúc pluronic F127 sau khi hoạt hoá được xác định bằng phổ 1 H-NMR
2.2.2 Tổng hợp NPC-F127-OH Để ngăn sự hình thành F127–dimer do nhóm NPC rất dễ dàng bị thay thế, một lượng dư 3-amino-1-propanol được sử dụng để khoá một đầu NPC trên mạch của Pluronic đã được hoạt hoá
Hình 2.4 Phương trình phản ứng tổng hợp NPC-F127-OH
Hình 2.5 Quy trình tổng hợp NPC-F127-OH
Quy trình phản ứng
Cân 15 g NPC-F127-NPC hòa tan với 50 ml THF trong bình cầu, cho 0,1 mL 3-amino-1-propanol (1,2 mmol và d = 0,982 gam/L) pha loãng dung dịch bằng 40 mL THF, nhỏ giọt từ từ vào bình cầu, khuấy từ trong 24 giờ ở nhiệt độ phòng Dung dịch thu được đem đi tủa trong 250 mL diethyl ether Sau đó, hỗn hợp được lọc hút chân không, sản phẩm được đem đi cô quay để loại hoàn toàn dung môi còn sót lại đến khối lượng không đổi Sản phẩm thu được có màu trắng mịn, cấu trúc NPC-F127-NPC sau khi gắn với 3-amino-1-propanol được xác định bằng phổ 1 H-NMR
2.2.3 Tổng hợp hệ copolymer ghép chitosan-g- Pluronic F127 (CS -
Tổng hợp chitosan- Pluronic F127 ( CS -F127) với các tỷ lệ khác nhau
Cân 0,5 g chitosan và hòa tan trong 20 mL nước DI, sau đó sử dụng axit HCl (1M) để điều chỉnh pH xuống 4 Khuấy đều cho đến khi chitosan tan hoàn toàn Tỷ lệ ghép chitosan với Pluronic được thực hiện theo các tỷ lệ 1:5, 1:10, 1:15 và 1:20, với NPC–F127.
OH được hòa tan trong nước cất ở nhiệt độ 4 °C với các khối lượng 2,5; 5,0; 7,5; 10 g, khuấy trong 1 giờ và giữ ở 4 °C trong 12 giờ Dung dịch NPC-F127-OH sau đó được trộn với dung dịch chitosan và giữ lạnh ít nhất 24 giờ trước khi tiến hành thẩm tách qua màng cellulose (12.000-14.000 Da) Quá trình thẩm tách trong nước cất diễn ra trong khoảng một tuần, sau đó mẫu được đông khô và đo phổ 1 H-NMR để xác định cấu trúc.
2.3 TỔNG HỢP HYDROGEL NHẠY NHIỆT TRÊN CƠ SỞ ALGINATE
2.3.1 Tổng hợp dẫn xuất Alginate-cystamine (Na-Alg-Cys)
Tổng hợp dẫn xuất Alginate-cystamine (Na-Alg-Cys) được thể hiện qua sơ đồ phản ứng hình 2.6
Hình 2.6.Sơ đồ phản ứng của quá trình tổng hợp Na-Alg-Cys
Quy trình tổng hợp bắt đầu bằng việc hòa tan 1g Sodium alginate (Alg) trong dung dịch DMSO: H2O với tỷ lệ 1:1, sau đó điều chỉnh pH về khoảng 5,5 bằng HCl 0,1M Tiếp theo, hỗn hợp N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride (EDC) và N-hydroxysuccinimide (NHS) với tỷ lệ mol 1:1 (4,6 mmol) được thêm vào dung dịch Alg để kích hoạt trong 30 phút Sau đó, 4,6 mmol Cystamine (Cys) được hòa tan trong nước và nhỏ giọt vào hỗn hợp Alg/EDC/NHS đang khuấy với tốc độ 1000 vòng/phút ở nhiệt độ phòng Hỗn hợp này được khuấy liên tục trong 24 giờ, sau đó sử dụng phương pháp thẩm tách bằng màng cellulose (MCWO~12-14KDa) trong nước cất để loại bỏ Cys không phản ứng, chất hoạt hóa và dung môi Cuối cùng, dung dịch trong túi thẩm tách được sấy thăng hoa để thu được sản phẩm dạng bột, sau đó được phân tích cấu trúc bằng FTIR và 1H-NMR.
2.3.2 Tổng hợp copolymer ghép alginate-g- Pluronic F127(Alg -F127)
Quy trình tổng hợp giống quy trình đã được trình bày ở chitosan hình 2.5
Hình 2.7 mô tả sơ đồ tổng hợp copolymer nhạy cảm nhiệt Alg-F127 Đầu tiên, hòa tan 0,5g Na-Alg-Cys vào 20 mL nước cất cho đến khi đồng nhất, sau đó tiếp tục khấy trong môi trường lạnh với nhiệt độ dưới 15 °C Tỷ lệ ghép Alginate : Pluronic được sử dụng là (1:5; 1:10; 1:15; 1:20) và cân NPC–F127.
OH được hòa tan trong nước cất ở nhiệt độ 4 °C với các khối lượng 2,5; 5,0; 7,5; và 10 g, khuấy cho đến khi tan hoàn toàn Dung dịch NPC-F127-OH sau đó được thêm vào dung dịch Na-Alg-Cys, khuấy và giữ lạnh ít nhất 24 giờ trước khi thực hiện thẩm tách qua màng cellulose với trọng lượng phân tử 12.000-14.000 Da Quá trình thẩm tách trong nước cất kéo dài khoảng 7 ngày, sau đó mẫu được đông khô Cuối cùng, sản phẩm thu được được phân tích bằng phổ 1H-NMR để xác định cấu trúc.
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ POLYMER LÊN NHIỆT ĐỘ TẠO GEL
2.4.1 Khảo sát đặc tính nhạy nhiệt của copolymer ghép CS -F127
Copolymer ghép CS-F127 được hòa tan hoàn toàn trong nước cất với các nồng độ khác nhau (5, 8, 10, 12, 15 và 20 % w/v) để khảo sát đặc tính nhạy nhiệt Đánh giá khả năng nhạy nhiệt của dung dịch copolymer được thực hiện thông qua việc khảo sát sự chuyển trạng thái sol-gel của dung dịch chitosan-Pluronic F127 trong khoảng nhiệt độ từ 15 đến 50 °C Các hydrogel được điều chế với tỷ lệ Pluronic F127 khác nhau, trong khi hàm lượng chitosan được cố định, với các mẫu hydrogel có tỷ lệ chitosan so với Pluronic là 1:5, 1:10, 1:15 và 1:20 %wt/wt Các vật liệu này được pha trong nước lạnh dưới 10 °C để đảm bảo sự hòa tan hoàn toàn.
37 tan hoàn toàn thành dung dịch nhớt Bể ổn nhiệt được chỉnh ở các nhiệt độ từ
Nhiệt độ thử nghiệm dao động từ 15 °C đến 50 °C, với mỗi phép đo cách nhau 5 °C Trước khi tiến hành ngâm ống nghiệm, bể nhiệt cần được ổn định ít nhất 5 phút Tại mỗi nhiệt độ, ống nghiệm sẽ được ủ trong 10 phút trước khi khảo nghiệm, sau đó được chuyển về nhiệt độ 4 °C để kiểm tra khả năng phục hồi của dung dịch Nếu dung dịch không chảy khi đảo ngược ống, trạng thái được ghi nhận là gel; ngược lại, nếu dung dịch chảy, mẫu được xác định là dung dịch.
2.4.2 Khảo sát đặc tính nhạy nhiệt của copolymer ghép Alg -F127
Nghiên cứu sự chuyển pha của dung dịch Alg-F127 được thực hiện thông qua phương pháp đảo ống nghiệm, với các mẫu Alg-F127 được điều chế từ Pluronic F127 theo các tỷ lệ khác nhau là 5, 10, 15 và 20 lần so với trọng lượng của Na-Alg-Cys Các mẫu này được đặt tên tương ứng là Alg-F127 (5), Alg-F127 (10), Alg-F127 (15) và Alg-F127 (20) Kết quả cho thấy sự chuyển pha của các mẫu dung dịch Alg-F127 phụ thuộc vào nhiệt độ và hàm lượng Pluronic trong từng mẫu.
2.4.3 Khảo sát thời gian giảm cấp của các hydrogel copolymer ghép
Nghiên cứu này tập trung vào các hydrogel Alg-F127 và CS-F127 có nhiệt độ chuyển pha sol-gel từ 30 °C đến dưới 37 °C Khả năng hấp thụ nước và sự thay đổi cấu trúc của các hydrogel được đánh giá trong ba môi trường khác nhau: PBS 1X không chứa Mg2+ và Ca2+, PBS 1X có 1% collagenase, và môi trường DMEM bổ sung 10% FBS Thí nghiệm được thực hiện trong điều kiện vô khuẩn ở nhiệt độ 37 °C Trước khi sử dụng, 0,5 mL gel được đặt trong ống nghiệm 5 mL và ổn định ở 2-8 °C trong một ngày Sau đó, các ống nghiệm được đưa vào tủ 37 °C trong 3 giờ để đảm bảo gel hình thành Môi trường được ủ ấm trước khi sử dụng, và các ống nghiệm được cân trước khi thêm 4,5 mL môi trường ngâm Tại các thời điểm đã chọn, môi trường ngâm được loại bỏ và cân để ghi nhận kết quả, từ đó tính toán khả năng hấp thụ nước.
Hàm lượng nước hấp thụ = (𝑚2−𝑚1)
𝑚1 𝑥100% (2.1) Tốc độ phân rã của hydrogel được tính bằng công thức:
Khối lượng tối thiểu còn lại trước khi phân rã hoàn toàn được ký hiệu là mf, trong khi tf là thời gian cần thiết để đạt được giá trị mf Khối lượng tối đa của hydrogel thu được được gọi là mm, và tm là thời điểm mà hydrogel đạt khối lượng tối đa trong môi trường ngâm.
ĐIỀU CHẾ, KHẢO SÁT VÀ ĐÁNH GIÁ CÁC HỆ HYDROGEL NHẠY NHIỆT MANG, NHẢ CÁC HOẠT CHẤT SINH HỌC
2.5.1 Điều chế hệ hydrogel có mang các loại thuốc/hoạt chất sinh học
Nghiên cứu dựa trên các công bố trước về tác động của các hoạt chất lên hiệu quả tăng sinh nguyên bào sợi và quá trình chữa lành vết thương tiểu đường Hai hoạt chất được nang hóa trong hai nền hydrogel, cụ thể là hệ CS - F127(15) và Alg -F127(10) với nồng độ 20%, được điều chế nhằm mang các hoạt chất này.
Bảng 2.3 Hàm lượng 2 hoạt chất được nang hóa trong 2 nền hydrogel
Hoạt chất Nồng độ trong hydrogel (àM/ppm)
2.5.1.1 Điều chế hệ hydrogel CS -F127 và Alg -F127 mang QU
Hòa tan hoàn toàn 4,5 g CS -F127/ Alg -F127 trong 20,5 mL nước DI ở 4°C (tạo dung dịch 18% CS -F127/ Alg -F127 ) Cho vào dung dịch trờn 123àg
QU hoạt chất Khấy đều trong 30 phút tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 0°C Đông khô mẫu được sản phẩm cuối cùng chứa 6ppm QU trong hệ gel 18% CS -F127/ Alg -F127
2.5.1.2 Điều chế hệ hydrogel CS -F127 và Alg -F127 mang RE
Hòa tan hoàn toàn 4,5 g CS-F127/Alg-F127 trong 20,5 mL nước DI ở 4 °C để tạo dung dịch 18% CS-F127/Alg-F127 Sau đó, thêm 56,17 µg RE vào dung dịch và khấy đều trong 30 phút với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 0 °C Cuối cùng, đông khô mẫu để thu được sản phẩm chứa 2,74 ppm RE trong hệ gel 18%.
2.5.1.3 Điều chế hệ hydrogel CS -F127 và Alg -F127 mang QU và RE
Hòa tan hoàn toàn 4,5 g CS -F127/ Alg -F127 trong 20,5 mL nước DI ở 4°C (tạo dung dịch 18% CS -F127/ Alg -F127 ) Cho vào dung dịch trờn 123àg
Trong quá trình nghiên cứu, mẫu được khuấy đều trong 30 phút với tốc độ 200 vòng/phút ở nhiệt độ 0°C Sản phẩm cuối cùng sau khi đông khô chứa 2,74 ppm RE và 6 ppm QU trong hệ gel 18% CS-F127/Alg-F127.
2.5.2 Xác định hàm lượng QU và RE được nang hóa trong hệ hydrogel
Hàm lượng RE và QU trong hệ hydrogel CS-F127/Alg-F127 được xác định qua phương pháp quang phổ tử ngoại UV-Vis (Agilent 8453) với bước sóng hấp thu tối đa lần lượt là 324 nm cho RE và 374 nm cho QU RE tinh khiết được hòa tan trong dung dịch DMSO : PBS (1:1) với nồng độ từ 0 - 12 ppm, trong khi QU tinh khiết hòa tan trong ethanol : PBS (1:1) với nồng độ từ 0 - 5 ppm để tạo đường chuẩn Mẫu được đưa vào cuvet và đo bằng máy quang phổ UV-Vis Agilent 8453 Đồ thị thể hiện mối quan hệ giữa nồng độ RE/QU và độ hấp thụ theo phương trình đường thẳng y = ax + b, trong đó y là độ hấp thụ và x là nồng độ.
2.5.3 Kiểm tra tính nhạy nhiệt và xác định điểm chuyền pha của hệ hydrogel CS -F127/ Alg-F127 mang QU, RE và QU + RE
Phương pháp đảo ngược ống (inverted tube) được sử dụng để khảo sát đặc tính nhạy nhiệt của copolymer ghép mang các hoạt chất, được hòa tan hoàn toàn trong các ống nghiệm chứa nước cất với nồng độ 12, 14, 16, 18 và 20 %w/v Để đánh giá khả năng nhạy nhiệt, nghiên cứu thực hiện khảo sát sự chuyển trạng thái sol-gel của dung dịch CS-F127/Alg-F127 trong khoảng nhiệt độ từ 15 đến 60 °C Các vật liệu này khi pha trộn cho thấy sự thay đổi đáng kể trong tính chất nhiệt.
Để đảm bảo sự hòa tan hoàn toàn thành dung dịch nhớt, 40 ml nước lạnh dưới 10 °C được sử dụng, và các lọ chứa 1 g hydrogel được ủ trong bể nước gia nhiệt ở 15 °C trong 20 phút để cân bằng nhiệt Sau đó, nhiệt độ được tăng lên từ 15 °C đến 60 °C với tốc độ 2 °C/10 phút Trong quá trình này, các mẫu được lấy ra khỏi bể nước (tối đa 30 giây) để quan sát hành vi của chất lỏng/gel Các mẫu được phân loại thành ba loại: (1) chất lỏng khi di chuyển nhanh theo hướng trọng lực; (2) chất lỏng nhớt hoặc gel mềm khi di chuyển chậm; (3) gel cứng khi vẫn ở dưới đáy lọ, với nhiệt độ tại đó được gọi là điểm sol-gel (Tgel) Tất cả thí nghiệm được thực hiện ba lần dưới sự giám sát của một người.
2.5.4 Khảo sát và đánh giá khả năng nhả các hoạt chất ra khỏi hệ hydrogel theo thời gian
2.5.4.1 Khảo sát và đánh giá về khả năng nhả hoạt chất ra khỏi hệ hydrogel
Khả năng phóng thích hoạt chất từ hệ hydrogel được nghiên cứu thông qua phương pháp khuyếch tán trong màng thẩm tách Túi thẩm tách có khối lượng phân tử 3,5 kDa chứa 2 mL mẫu hydrogel nồng độ 18% được đặt trong 20 mL dung dịch phosphate-buffered saline (PBS) pH 7,4, khuấy ở 37 ± 1 °C với tốc độ 100 vòng/phút Hoạt chất RE/QU được hòa tan trong DMSO và EtOH với nồng độ 200ppm Mẫu được lấy ra ở các khoảng thời gian 0h, 1h, 3h, 5h, 7h, 9h, 12h, 24h, 36h, và 48h, đồng thời bổ sung dung dịch PBS để duy trì thể tích không đổi Hàm lượng hoạt chất giải phóng được xác định bằng phương pháp quang phổ tử ngoại Thí nghiệm được lặp lại 3 lần và phần trăm hoạt chất giải phóng được tính theo công thức của Wendy H Chern.
Q: Lượng thuốc được giải phúng từ hệ hydrogel (àg)
Cn: Nồng độ ở thời điểm t (ppm)
Vs: Thể tích của PBS (mL)
Vt: Thể tích mẫu (mL)
∑ 𝑛−1 𝑖=1 𝐶 𝑛−1 : Nồng độ của thuốc được giải phóng theo thời gian (ppm)
2.5.4.2 Nghiên cứu động học giải phóng thuốc khỏi hệ hydrogel Động học giải phóng thuốc đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng mô hình các Zero-order, First-order, Higuchi, Hixson-Crowell, Power law và Ritger-Peppas Trong đó Mô hình Power law và Ritger-Peppas dùng để giải thích rõ cơ chế giải phóng thuốc
Mô hình Power law: M t /M ∞ = Kt n (2.4)
Trong nghiên cứu về giải phóng thuốc, M t / M ∞ thể hiện phần thuốc giải phóng tại thời điểm t, với K là hằng số động học phản ánh cấu trúc và hình học của thiết bị, và n là số mũ giải phóng, chỉ ra cơ chế giải phóng thuốc Phương trình (2.4) có hai trường hợp đặc biệt: khi n = 0,45, cho thấy sự phóng thích thuốc theo cơ chế khuếch tán (động học khuếch tán Fickian), và khi n = 0,89, biểu thị sự phóng thích thuốc theo cơ chế xói mòn (động học II) Giá trị của n trong khoảng 0,45 đến 0,89 cho thấy sự kết hợp của cả hai hiện tượng vận chuyển dị thường.
Mt/M∞ đại diện cho lượng thuốc được giải phóng tại mỗi thời điểm t, với Ka, Kb và m là các hằng số liên quan Phương trình này được đề xuất để mô tả sự giải phóng phân tử từ khối polymer, trong đó khuếch tán không phải là yếu tố duy nhất quyết định quá trình phóng thích Giá trị m được xác định là 0,45 dựa trên nghiên cứu của chúng tôi, dựa vào tỷ lệ 2a/l, trong đó a là đường kính màng và l là chiều dài màng.
42 thẩm tách đem đi giải phóng hoạt chất) giá trị này nhỏ hơn 0,1 thì hệ số m là 0,45 [71-73]
2.5.4.3 Xác định thời gian T 1/2 giải phóng một nửa thuốc in vitro
Khảo sát T1/2 (thời gian một nữa lượng thuốc) đánh giá thời gian cần thiết để một nửa lượng hoạt chất được phóng thích ra khỏi hydrogel Dữ liệu giải phóng thuốc in vitro được áp dụng mô hình động học bậc 1 để tính toán T1/2 của hoạt chất Các thông số quan trọng như C max (nồng độ đỉnh cao nhất) và T max (thời gian đạt C max) cũng được ghi nhận.
2.5.5 Khảo sát và đánh giá thời gian giảm cấp của hệ hydrogel hoạt tính trong môi trường giả sinh học
2 mẫu hydrogel CS -F127/ Alg-F127 chứa 2 hoạt chất (QU, RE) có tổng thể tích 2mL được điều chế trong 2 ống nghiệm Sau đó để ổn định tại nhiệt độ
Để tạo ra mẫu hydrogel đồng nhất, cần giữ ở 4 °C trong 1-2 giờ, sau đó chuyển vào máy ủ nhiệt ở 37 °C trong 30 phút để hình thành gel rắn Tiến hành cân mẫu để xác định khối lượng ban đầu (Wi) và sau đó thêm 5 mL PBS pH 7,4 hoặc DMEM vào mẫu Mỗi 2 ngày, loại bỏ dung dịch PBS, cân mẫu trên cân điện tử và ghi nhận kết quả, sau đó bổ sung lại 5 mL PBS 7,4 hoặc DMEM Quy trình này được lặp lại cho đến khi hydrogel phân rã hoàn toàn.
3 lần trong cùng điều kiện khảo sát
Phần trăm khối lượng suy giảm được tính như sau:
(2.6) Trong đó: Wi khối lượng gel ban đầu (g);
Wt khối lượng gel còn lại sau khoảng thời gian (t) đã bị giảm cấp (g)
2.5.6 Khảo sát và đánh giá độ ổn định của hoạt chất trong hệ hydrogel
Các hoạt chất trong hydrogel được đánh giá độ ổn định theo thời gian bằng cách pha chế mẫu ở nồng độ tạo gel và lưu trữ ở 4 °C (tủ lạnh) và 37 °C (bể điều nhiệt) trong khoảng thời gian 1 tháng, 2 tháng, 3 tháng và 6 tháng Sau thời gian khảo sát, các mẫu sẽ được trích xuất và đo bằng phương pháp UV-Vis để xác định độ ổn định của chúng.
Nồng độ hoạt chất trong hệ hydrogel được khảo sát và so sánh với số liệu ban đầu trước khi lưu trữ Cụ thể, 2 gram mẫu copolymer chứa hai hoạt chất đã được hòa tan hoàn toàn trong 8 mL nước và được bảo quản ở nhiệt độ 4 °C.
37 °C, Sau khoảng thời gian khảo sát, 0,5 mL hydrogel được lấy ra đem đi phân tích xác định hàm lượng hoạt chất có trong mẫu
